MÉTODO ÓPTICO DE DETECCIÓN DE UNA MOLÉCULA OBJETIVO MEDIANTE AMPLIFICACIÓN EN LA RESPUESTA DE INTERFERENCIA POR ÍNDICE DE

REFRACCIÓN Y DISPERSIÓN

SECTOR TÉCNICO

La presente invención se sitúa en el sector técnico del análisis y/o diagnóstico inmunológico mediante la utilización de biosensores ópticos que funcionan por interferencia óptica de la luz como por ejemplo los descritos en la invención Optica I detection system for labelling-free high-sensitivity bioassays (ES2574138 (T3) — 2016- 06-15) o en la publicación de revisión científica: Emerging applications oflabel-free optical biosensors (G. Zanchetta, et al. Nanophotonics, 6, 1-18 (2017). De forma más específica, la invención que se describe en este documento hace referencia a un método de detección y/o cuantificación de una molécula objetivo (MO), en particular una molécula con reactividad inmunológica o que presenta afinidad bioreceptor-antígeno, donde el método comprende el enriquecimiento de la molécula objetivo (también denominado analito diana) en una muestra mediante la utilización de nanopartículas funcionalizadas, y su posterior análisis mediante la lectura óptica directa de la reflexión y/o transmisión del sistema, cuya respuesta de interferencia se verá afectada por los conjugados de las nanopartículas reconocidos específicamente en su superficie debido a la variación de la parte real del índice de refracción y de la posible pérdida de intensidad por la variación de la parte compleja del índice refracción y/o la dispersión de los mencionados complejos en la luz reflejada o transmitida de forma directa, sin necesidad de utilizar métodos de detección adicionales.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a un método que puede aplicarse a múltiples sistemas de lectura óptica o dispositivos, preferiblemente portátiles, como el que se describe en la invención INTERFEROMETRIC DETECTION METHOD (EP2880396 (A1) — 2015-06-10) y reportado posteriormente por ejemplo en las publicaciones científicas: Towards reliable optical label-free point-of-care (PoC) biosensingdevices (Sensors and Actuators B 236 (2016) 765-772) ó Description ofan Advantageous Optical Label-Free Biosensing Interferometric Read-Out Method to Measure Biological Species (Sensors 2014, 14, 3675-3689), que permite el diagnóstico de enfermedades con base inmunológica en un tiempo razonable. ESTADO DE LA TÉCNICA

Hasta ahora los sistemas más habituales de detección In-Vitro con alta sensibilidad disponibles en el mercado para el análisis de biomoléculas están basados en revelado y amplificación química, siendo la técnica ELISA (por sus siglas en inglés Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) la más habitual y establecida en el mercado. Existen una gran variedad de dispositivos, y por referirnos a un caso concreto, en el sector de alergias pueden destacar el IMMUNOCAP, IMMUNOCAP ISAC, que pueden ofrecer información cuantitativa y principalmente una medición cualitativa (respuesta sí/no) con respecto a la presencia de anticuerpos específicos de alergia IgE, lo que no permite definir el perfil de sensibilización resuelto por componentes para cada paciente necesario para los casos complejos. Además, estos dispositivos ofrecen sólo una gama limitada de alérgenos alimentarios que pueden analizarse, utilizando extractos de alérgenos crudos en lugar de alérgenos individuales, lo que puede dar lugar a información engañosa. Adicionalmente, este tipo de dispositivos requieren de instalaciones y personal altamente cualificado.

El número de referencias bibliográficas relativo al campo de los biosensores ópticos es muy elevado, tanto en la literatura científica como en documentos de patente. En muchos de estos documentos, el principio físico de detección de los biosensores ópticos está basado en los fenómenos de interferencia de la luz, por cambio del índice de refracción cuando en una superficie sensora se acumula material biológico. Sin embargo, estos dispositivos no se han comercializado de manera masiva todavía y, por lo tanto, siguen siendo los métodos tradicionales basados en amplificación o revelado químico los habituales y disponibles en el mercado, tanto las tiras de nitrocelulosa basadas en flujo lateral ( lateral flow) que funciona por colorimetría, como los ya mencionados ELISA. Una de las posibles causas puede estar en la exigencia de una elevada sensibilidad requerida para las diferentes aplicaciones de estos sensores, así como la dificultad en trabajar con muestras biológicas reales de matriz compleja. Entre otros factores, la concentración de las biomoléculas a reconocer generalmente es muy pequeña, la complejidad cuando se trabaja con muestras reales es alta debido al elevado número de otros agentes (biológicos o no) existentes que pueden generar una adsorción inespecífica elevada y a la falta de especificidad, además este problema se amplifica y existe una limitación para poder detectar moléculas de muy baja masa molecular, cuyo impacto en el incremento del índice de refracción en la superficie sensora es mucho más pequeño, siendo por tanto, mucho más exigente el factor sensibilidad del transductor, a la vez que los requerimientos de error o incertidumbre de medida en la lectura del dispositivo son más críticos para alcanzar el límite de detección necesario que se puede estimar como el cociente entre la incertidumbre de medida de la lectura y la sensibilidad del transductor. En definitiva, estas exigencias hacen que, para alcanzar un límite de detección competitivo a las necesidades demandadas, el sistema tenga que ser muy competitivo, la sensibilidad del transductor tenga que ser muy elevada, la incertidumbre de lectura muy pequeña y, adicionalmente, el sistema ha que ser capaz de reconocer específicamente las biomoléculas objetivo, incluidas aquellas de muy baja masa molecular, en muestras reales con multitud de componentes o agentes de manera altamente específica, evitando en la medida que sea posible cualquier detección inespecífica que podría invalidar el análisis.

En resumen, estos requerimientos tan estrictos de especificidad, sensibilidad y límite de detección suponen una gran dificultad a la hora de desarrollar un método y/o sistema para analizar moléculas de naturaleza inmunológica, mediante la utilización de biosensores ópticos basados en los cambios de la interferencia por la variación del índice de refracción en la superficie sensible, en particular a la hora de trabajar con muestras reales donde la eliminación del efecto matriz de la muestra real, debido al elevado número de otros agentes existentes que pueden generar una adsorción inespecífica elevada, conlleva una dificultad añadida muy significativa para poder competir con los sistemas de amplificación y revelado químico convencional, como los basados en ELISA.

En este campo de la detección óptica de biomoléculas, en particular utilizando el principio de interferencia óptica, el proceso de transducción se lleva a cabo sobre una superficie funcionalizada que incorpora receptores moleculares específicos para reconocer exclusivamente la molécula objetivo, y agentes bloqueantes para evitar la adsorción inespecífica de otros componentes que se encuentren en la muestra biológica líquida (G. Zanchetta y col. “Emerging applications of label-free optical biosensors". Nanophotonics 2017; págs. 1-19). Dicha superficie específica forma parte del transductor que, una vez funcionalizado, incrementa su volumen y/o densidad debido a la presencia de los receptores moleculares específicos y agentes bloqueantes mencionados, convirtiéndose el sensor en un biosensor. Este incremento de la cantidad de materia genera un cambio en la respuesta de interferencia que denominamos señal de referencia (ver figura 1 A). Cuando estos receptores moleculares reconocen la biomolécula objetivo, la cantidad de materia vuelve a aumentar (ver figura 1 C), en este caso debido al incremento del material biológico específico que esta superficie ha sido capaz de reconocer. Estas moléculas reconocidas en el transductor forman una capa biológica sobre la superficie del transductor o biosensor, de un espesor de varios nanómetros dependiendo del tipo de moléculas objetivo.

Un problema técnico de gran dificultad es el reconocimiento o detección específica de las moléculas en una muestra real, especialmente cuando estas moléculas objetivo presentan un tamaño reducido. Así mismo los procesos de funcionalización de los receptores (biofuncionalización) son también de elevada dificultad. Sin embargo, a pesar de las dificultades, en la literatura se reportan un elevado número ejemplos para el anclaje de biorreceptores específicos, por ejemplo mediante adsorción directa utilizando materiales de base polimérica mediante anclaje directo de anticuerpos y péptidos, o haciendo uso de reacciones como la estreptavidina y biotina, o utilizando la proteína A y proteína G para orientar anticuerpos en el proceso de biofuncionalización. Otras alternativas para realizar anclajes covalentes de la superficies pueden estar basadas en procesos de silanización, reacciones avidina-biotina, entre otras que pueden ser aplicables a óxidos, nitruro, silicio, etc. Múltiples rutas de biofuncionalzación se pueden consultar en Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Second Edition, 2008, ISBN 978-0-12-370501-3.

En el caso de los transductores ópticos por interferencia objeto de esta invención, los materiales empleados conforman una micro/nano estructura fotónica que genera un patrón de interferencia o resonancia. Este patrón de interferencia o resonancias se verá modificado tanto en longitud de onda, frecuencia o número de onda, como en intensidad o amplitud de la señal por las reacciones de anclaje y reconocimiento molecular, lo cual hace del cambio la base de la lectura en la transducción de sensado bioquímico (M. Holgado y col. “Description of an Advantageous Optica! Label-Free Biosensing Interferometric Read-Out Method to Measure Biological Species. Sensors 2014, 14, 3675- 3689). Las estructuras fotónicas más empleadas para este tipo de sensores son aquellas basadas en interferómetros Match Zehnder, Anillos y discos resonadores, Interferómetros Fabry-Perot, Guías bimodales, redes de nano-resonadores o redes de nano-pilares resonantes, etc, como los que se pueden consultar en G. Zanchetta y col. “Emerging applications oflabel-free optical biosensors’’. Nanophotonics 2017; págs. 1-19.

Tal como se ha mencionado anteriormente, el principio de funcionamiento de un biosensor que trabaja por interferencia se basa en que cuando los bioreceptores se anclan en la superficie del interferómetro, la señal de interferencia cambia, por ejemplo, generándose un cambio en la señal de interferencia ocasionada por el sensor (figura 1A). Cuando este biosensor se somete a un proceso de reconocimiento, los bioreceptores capturan específicamente las moléculas objetivo provocando que dicho perfil de interferencia se modifique de nuevo, por ejemplo, una resonancia o un mínimo de interferencia puede desplazarse y cambiar su posición en longitud de onda (ver figura 1 C). Una manera de medir la sensibilidad puede ser mediante la evaluación del desplazamiento en longitud de onda de un mínimo de interferencias en función de la cantidad de moléculas objetivo detectadas o reconocidas de manera específica en la superficie del sensor. Estas variaciones relativas del modo de resonancia con respecto a su referencia inicial (ver figura 1 C) determinan las moléculas objetivo reconocidas en la superficie, y por tanto, permiten establecer fácilmente la concentración de manera cuantitativa en una muestra analizada, a partir de la realización de una curva de calibración con muestras conocidas de las que se sabe la concentración de origen. Este método de proceder para obtener información cuantitativa es ampliamente reportado, por ejemplo en R.L. Espinosa y col., “A Proof-of-Concept of Label-Free Biosensing System for Food Allergy Diagnostics in Biophotonic Sensing Cells: Performance Comparison with ImmunoCAP. Sensors 2018, 18, 2686.

No obstante, estos cambios de longitud de onda, frecuencia o número de onda relacionados con la concentración de las biomoléculas o moléculas a detectar están limitados por la respuesta de la estructura fotónica empleada para fabricar el sensor que produce la interferencia óptica. Además, el rango dinámico de concentraciones que el sensor puede medir depende de la construcción del mismo, donde el área de detección del sensor juega un papel fundamental. Es un hecho incuestionable que la adsorción inespecífica en la superficie del sensor de los múltiples y diversos componentes que se encuentran en una muestra real representa una dificultad muy relevante que requiere a veces de utilizar agentes bloqueantes, y es aspecto fundamental cuando se trabaja con muestras biológica reales de diversa naturaleza, como por ejemplo: sangre, suero, saliva, lágrima, orina, entre otros, dada la elevada cantidad de componentes o agentes biológicos distintos que se encuentran junto con la molécula concreta que se quiere detectar de manera específica. Por esta razón, la especificidad a la hora de desarrollar un biosensor es uno de los aspectos más críticos, siendo la eliminación de esta adsorción inespecífica, o el ya mencionado anteriormente efecto matriz, un factor clave para poder trabajar con muestras reales. En este sentido una buena y eficiente funcionalización o tapización de la superficie del sensor puede reducir el mencionado efecto matriz, aunque en muchos casos es necesario utilizar agentes bloqueantes de diversos tipos como suero albúmina, etanolamina, entre otros.

La invención que aquí se describe resuelve las limitaciones que presentan los biosensores ópticos basados en interferencia conocidos hasta la fecha en cuanto a su limitada sensibilidad, límite de detección insuficiente, falta de especificidad y dificultad para trabajar con muestras reales debido al efecto matriz. Así, en este documento se describe un método óptico de detección de una molécula objetivo mediante la amplificación de la respuesta de interferencia por índice de refracción y variación de la intensidad de la luz de esta respuesta como consecuencia del cambio del propio índice de refracción y por la posible dispersión producida por el tipo y tamaño de los conjugados basados en las NPs utilizadas para la realización del ensayo. Este método puede utilizarse para la medida de moléculas objetivo de muy baja masa molecular, permite trabajar con muestras reales, es decir, muestras que no han sido sometidas a un tratamiento previo, al incrementarse la especificidad y, sobre todo, permite modificar el rango dinámico de la respuesta y la sensibilidad a demanda de la bio-ampliación a utilizar.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método óptico de detección de al menos una molécula objetivo basado en las interacciones biológicas de dicha molécula. En particular, el método se basa en la amplificación en la respuesta de interferencia por la variación del índice de refracción que generan los conjugados de NPs utilizadas en el proceso de reconocimiento biológico sumado a la posible amplificación adicional ocasionada por el fenómeno de dispersión de dichos conjugados de NPs cuyo número en la superficie sensora depende de las interacciones biológicas de la molécula objetivo en las diferentes etapas del método. En consecuencia, el método que aquí se describe permite el análisis cualitativo y/o cuantitativo de una molécula objetivo en una muestra real, en particular, en una muestra biológica de matriz compleja, mejorando el límite de detección por la amplificación en la señal ocasionado por la variación de la señal de interferencia y la especificidad de los biosensores ópticos basados en interferencia debido a la posibilidad de separación de los conjugados de NPs de la muestra real para evitar los múltiples componentes de la muestra biológica en su origen. El método de la presente invención permite mejorar la detección óptica por interferencia en comparación con los métodos habituales reportados en la literatura para transductores o sensores ópticos basados en interferencia, que en el presente documento también se denomina transductor o sensor interferométrico. A su vez, este método podría ser utilizado total o parcialmente en la mayoría de los biosensores ópticos basados en interferencia o resonancia óptica reportados en la literatura, tales como Interferómetros Fabry-Perot, anillos y discos resonadores, interferómetros Match Zehnder, BICELLs o guías bimodales, entre otros muchos. De forma que estos dispositivos sí que podrán competir y mejorar las prestaciones de los sistemas clásicos de detección de mediante amplificación química o revelado, en general basados en fluorescencia o colorimetría (p.e. ELISA).

En particular, la presente invención proporciona un método óptico de detección de al menos una molécula objetivo (MO, también denominada analito) en una muestra, caracterizado porque el método comprende las siguientes etapas: a) Medir la respuesta de interferencia o señal de referencia de un sensor óptico o transductor interferométrico con su superficie sensora biofuncionalizada (Figura 1A ) con: i. la molécula objetivo (MO), ii. o al menos un bioreceptor específico (BR o BR1) de la molécula objetivo. b) Poner en contacto, en un medio líquido, una muestra a analizar con nanopartículas funcionalizadas con al menos un bioreceptor específico (NP-BR) de la MO (Figura 1 B1 b), preferentemente a una temperatura entre 2 y 37 °C, formándose un conjugado (NP-BR-MO) con las nanopartículas funcionalizadas y aquellas moléculas objetivo presentes en la muestra; c) Separar de la muestra los conjugados NP-BR y, siempre que la muestra comprenda la molécula objetivo, los conjugados NP-BR-MO, ya que ambos conjugados se encontrarán juntos en la mezcla obtenida tras la etapa b (Figura 1B3b); d) Poner en contacto dichos conjugados NP-BR, y si aplica, los conjugados NP-BR- MO obtenidos en la etapa b) con dicha superficie sensora biofuncionalizada del transductor interferométrico (Figura 1C2); e) Determinar la lectura óptica, en particular la respuesta de interferencia por reflexión y/o transmisión, por la variación de dicho perfil de interferencia ocasionado por la variación de la parte real del índice de refracción y/o la variación de intensidad ocasionada bien por la dispersión o variación en la parte compleja del índice de refracción de los mencionados conjugados de NPs, o una combinación de las anteriores, en la superficie sensora del transductor óptico.

Los conjugados citados basados en NPs que son reconocidos en la superficie sensora del transductor provocará un cambio del índice de refracción, principalmente en su parte real, que ocasiona un cambio de la interferencia de la luz reflejada o transmitida, pero también puede ocurrir que se generen cambios en su parte compleja (en función del tipo de NPs utilizadas), generándose por tanto un cambio en el coeficiente de extinción y una reducción de la intensidad de la luz reflejada o transmitida. Se une a este efecto que la dispersión de los complejos citados de NPs puede provocar dispersión de la luz en mayor o menor grado dependiendo del tipo y tamaño de NPs, y por ende, otro cambio de la intensidad de la luz recibida, tanto en transmisión como en reflexión, que se suman a los efectos antes mencionados.

El método de la presente invención permite la detección de cualquier MO, incluyendo aquellas de muy baja masa molecular difícilmente detectables para biosensores ópticos, que tenga al menos un bioreceptor específico. Así, este método puede utilizarse para detectar cualquier molécula objetivo que pueda dar lugar a una reacción inmunológica o presente afinidad bioreceptor-antígeno. En particular, la MO puede ser un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo específico de alergia (IgE) a un alérgeno específico o cualquier otra proteína, hormona, toxina, entre otras. Como uno de los ejemplos prácticos de esta invención, se ha detectado como MO un anticuerpo especifico a una molécula de alergia (IgE), de tal forma que el conjugado NP-antilgE (NP-BR en su notación inicial en la presente invención) que reconocería a la IgE presente en la muestra biológica formando el complejo NP-antilgE-lgE (NP-BR-MO en su notación inicial en la presente invención), y en la superficie del sensor se ha inmovilizado con al menos una molécula alergénica (BR1) que es reconocida por la IgE especifica del mencionado anticuerpo (BR1 en su notación inicial en la presente invención).

El método óptico de detección que en esta invención se describe se puede utilizar para cualquier sector donde se requiera la detección especifica de una molécula in-vitro. Sectores de aplicación de gran relevancia, por tanto, pueden ser, además del clínico, el sector agro-alimentario, donde se requiera la detección de enfermedades en animales, o la detección de agentes patógenos en su alimentación o en su entorno. Adicionalmente, también se puede aplicar en el análisis del agua en acuicultura. Otras aplicaciones del método son, por ejemplo, para el control de proceso y calidad de productos como la leche, el vino, aceites, así como la detección de contaminantes en agricultura y monitorización de agua, entre otros muchos.

Por lo tanto, en el método que aquí se describe, la muestra a analizar puede ser una muestra biológica tal como, por ejemplo, sangre, suero, orina o lágrima entre otras; una muestra agro-alimentaria tal como, aquella que se obtiene directamente de los alimentos, o del entorno donde se encuentran los animales; o una muestra de agua, ya sea para consumo humano, animal o cualquier otro uso. Tal como se ha mencionado anteriormente, el método de la invención se puede aplicar a una muestra real, es decir, una muestra tomada directamente, sin ningún tratamiento previo. Aunque se prefiere la aplicación del método a una muestra líquida, en aquellas realizaciones en las que la muestra a analizar sea una muestra sólida, ésta se someterá a una etapa previa de disolución en un medio líquido.

Las NPs funcionalizadas que se utilizan en el método de la presente invención están tapizadas, es decir, funcionalizadas en su superficie, con al menos un BR específico de la MO, en particular, un BR capaz de interaccionar específicamente con la MO (o analito) mediante una reacción inmunológica, una reacción de afinidad anticuerpo-antígeno o reacción BR-MO en general. Así, en aquellas ocasiones en las que la muestra, preferentemente una muestra biológica sin tratamiento previo, comprende la MO, en la etapa b) del método de la presente invención tiene lugar una reacción de afinidad entre estas MOs y los conjugados NP-BR, dando lugar a la formación de conjugados NP-BR- MOs. Esta etapa del método se puede realizar a una temperatura preferiblemente entre 2 y 37 °C. Dentro de este rango, a mayor temperatura se favorece la reacción inmunológica entre la BR y la MO, siendo necesario menor tiempo de reacción o incubación. Por tanto, este tiempo puede oscilar, en función de la temperatura en el proceso de incubación, entre varios minutos y horas, dependiendo de la constante de asociación y la cinética de la reacción de reconociendo y afinidad del bioreceptor utilizado. En general, se suele establecer un tiempo de incubación de 30 min, aunque dependiendo de la aplicación biológica, temperatura y cinética de la reacción en particular, este tiempo pueda oscilar típicamente en entre menos de 30 min a varias horas.

En la etapa c) del método que aquí se describe tiene lugar la separación de las NP-BR y las NP-BR-MO (también denominados, respectivamente, conjugados NP-BR y conjugados NP-BR-MO en este documento) generadas en la reacción de afinidad que tiene lugar en la etapa a), siempre que la muestra analizada comprenda MOs. Ambos conjugados (NP-BRs y NP-BR-MOs) están presentes en la mezcla resultante en mayor o menor grado. Para dicha separación se puede aprovechar cualquier mecanismo físico de separación de los mencionados conjugados de NPs del medio líquido de la muestra a analizar, como por ejemplo centrifugado, separación por campo eléctrico o magnético, entre otros posibles. En particular, estos conjugados de NPs se pueden separar fácilmente del resto de la muestra por filtrado, mediante uno o varios ciclos de centrifugación.

En realizaciones particulares, las NPs utilizadas pueden ser capaces de atraerse o repelerse en presencia de un campo eléctrico debido a la carga superficial. En este caso, la etapa b) de separación de los conjugados NP-BR y NP-BR-MO del resto de la muestra puede realizarse preferentemente mediante campo eléctrico y electroforesis.

En otras realizaciones particulares, las NPs utilizadas pueden ser atraídas o repelidas por un campo magnético. En este caso la etapa b) de separación de los conjugados NP-BR y NP-BR-MO del resto de la muestra puede realizarse preferentemente mediante aplicación de campo magnético.

Adicionalmente, las NPs utilizadas pueden presentar la capacidad de ser atraídas o repelidas en un campo eléctrico o magnético, por ejemplo, NPs de sílice recubiertas con un material magnético. En estos casos puede utilizarse un mecanismo mixto de separación basado la aplicación de campo eléctrico, campo magnético y, opcionalmente, centrifugación.

Tal como se ha mencionado anteriormente, en la etapa d) del método óptico de detección (in vitro) de una molécula objetivo en una muestra, se pone en contacto las NP-BRs y las NP-BR-MOs, si las hubiera porque se ha producido el reconocimiento de MOs presente en la muestra, obtenidas en la etapa c) con una superficie sensora de un transductor óptico biofuncionalizado (tapizada con MO o BR1) cuya respuesta, en particular, un sensor óptico cuya respuesta está basada en la interferencia, resonancia que genera una determinada estructura fotónica como los citados en las referencias bibliográficas mencionadas de este documento. En particular, se puede utilizar cualquier sensor óptico que funcione por interferencia óptica cuya respuesta cambie en presencia del material reconocido en su superficie sensora (los citados conjugados de NPs en la presente invención). Así mismo esta respuesta de interferencia o resonancia en función de longitud de onda, número de onda o frecuencia, no solo varia por la variación del índice de refracción en su parte real o espesor óptico (referido este al índice de refracción de los conjugados de NPs multiplicado por el incremento de espesor promedio de estas NPs en la superficie sensible del transductor), sino que además su amplitud (medida habitualmente en intensidad óptica) puede cambiar en función de la variación de la componente compleja del índice de refracción y/o de la dispersión ocasionada por los conjugados de NPs reconocidos, y sitos por tanto, en la superficie de dicho sensor.

En realizaciones particulares, el sensor empleado es un sensor interferométrico que funciona midiendo la variación de la interferencia la cual se monitoriza por el cambio de intensidad de luz en un rango espectral determinado. Para ello, se sintoniza dicho transductor para que la medición sea por perdida de intensidad de luz (M. Holgado, et al. Sensors and Actuators B 236 (2016) 765-772).

Adicionalmente, las NPs más el material biológico acumulado o reconocido en su superficie, aumenta el índice de refracción del transductor haciendo que se modifique esta respuesta y, por tanto, la intensidad cambie. Además, las NPS unidas al material biológico, puede generar pérdidas por dispersión (del término en inglés scattering) de tal manera que este fenómeno se puede sumar a la perdida de intensidad generada por el cambio en la interferencia.

Conviene mencionar aquí que en la respuesta óptica por interferencia de los sensores fotónicos, el índice de refracción juega un papel importante en la diversidad de tipos de sensores reportados en la literatura técnica y científica. Cuando en la superficie sensora de un transductor fotónico se reconocen, y debido a este fenómeno de reconocimiento, se adhieren de manera específica un conjugado de NPs, el índice de refracción promedio del transductor se incrementa. En el caso de sensores basados en interferómetros basados en laminas delgadas tipo Fabry-Perot, el producto índice de refracción por el espesor promedio de NPs hace que cambie la respuesta por interferencia (p.e. New Device Based on Interferometric Optica! Detection Method for Label-Free Screening of C- Reactive Protein, IEEE Transactions on Instrumentation and Measurement, 68, 9, 3193 - 3199, 2019 ), y en el caso de aquellos basados en la detección por campo evanescente, habitualmente de interrogación óptica horizontal y basados en guías de onda, la concentración superficial de NPs sobre la superficie incrementa el índice de refracción promedio que la luz ve al propagarse por una determinada guía de onda. En ambos casos se genera, como se ha comentado, un cambio en el perfil de interferencia, como por ejemplo Label-free optical biosensing with slot-waveguides, Optics Letters, 33, 7, 2008. Por otra parte, la parte imaginaria del índice de refracción genera pérdidas de señal que se podrán contabilizar en una pérdida de la amplitud que se observará por reducción intensidad de la señal. Finalmente, y principalmente, para los sensores de interrogación vertical, las perdidas por dispersión también harán que la amplitud de la señal de interferencia se vea reducida y, por tanto, sea objeto de poder utilizarse como mecanismo de detección.

Así, el método que se describe en este documento se puede utilizar principalmente en interferómetros de interrogación óptica vertical, como por ejemplo aquellos basados en interferómetros Fabry-Perot, Celdas sensibles basadas en estructuras nano- estructuradas, Celdas sensibles basadas en redes de Nano-Pilares y Nano Pilares resonantes, entre otros (p.e. Label-free biosensing by means of periodic lattices of high aspect ratio SU-8 nano-pillars, Biosensors and Bioelectronics 25 (2010) 2553-2558; Bio- Photonic Sensing Cells over transparent substrates for anti-gestrinone antibodies biosensing, Biosensors and Bioelectronics 26 (2011) 4842- 4847; o Resonant nanopillars arrays for label-free biosensing, Optics Letter, 41, 23 , 2016). Así mismo, también pueden utilizarse interferómetros de interrogación óptica en el plano, como interferómetros Match- Zehnder, Anillos resonadores, guías bimodales, guías de rejilla, discos resonadores, etc como los descritos en la citada referencia G. Zanchetta y col. “Emerging applications of label-free optical biosensors". Nanophotonics Nanophotonics 2017; 6(4): 627-645. DOI 10.1515/nanoph-2016-0158; o M. C. Estevez, M. Alvarez, and L. M. Lechuga, Láser Photon. Rev. 6, 463 (2012). Debido a su sencillez, se prefiere la utilización de un Interferómetro Fabry-Perot de interrogación vertical.

Esta etapa c) del método se puede realizar a una temperatura entre 0 y 40 °C, preferentemente a una temperatura entre 2 y 37°C, y aun más preferentemente, entre 18 y 37 °C cuando se trabaja en sistemas de flujo continuo donde no hay evaporación. Sin embargo, cuando se trabaja con gotas de muestra y, dependiendo del volumen, se puede a trabajar a temperaturas entre 2 a 37 °C (proceso de incubación) utilizando incubadores para evitar la evaporación y para favorecer la reacción inmunológica reduciendo dicho tiempo de incubación entre los conjugados y la superficie sensora del biosensor. Por otra parte, se puede reducir la temperatura para paliar el factor de la evaporación evitando la necesidad de utilizar incubadores. Dependiendo de la opción elegida, el tiempo de incubación puede oscilar entre varios minutos y horas, dependiendo de la constante de asociación y la cinética de la reacción de reconociendo y afinidad del bioreceptor utilizado.

La superficie sensora del transductor o sensor óptico tal y como se ha citado en la presente invención puede estar funcionalizada para tener, inmovilizados sobre la superficie del sensor, la MO o, alternativamente, al menos un BR1 que también reconoce la MO. Adicionalmente, la superficie de dicho sensor puede o no comprender uno o más agentes bloqueantes (AB) sobre los huecos que no se hubieran cubierto, bien por la MO, bien por el BR1, con objeto de impedir una respuesta inespecífica de otros componentes que puedan estar presentes en la muestra a analizar.

En aquellas realizaciones en las que la superficie sensora comprende la MO, es decir, esta molécula está inmovilizada o tapizada en la superficie del sensor, se obtiene la máxima variación de la señal de lectura óptica por los mecanismos descritos en la presente invención cuando la muestra analizada no contiene MO, ya que en este caso el número de NP-BRs que interaccionan y se reconocen en la superficie del sensor es mayor (ver esquema en la parte inferior derecha de la figura 3). Sin embargo, cuando la muestra analizada comprende la MO, si este analito está en una concentración suficiente para tapizar todos los conjugados NP-BR, la variación de la señal de lectura será prácticamente nula, es decir no se alterará antes y después de la etapa d). En definitiva la curva de respuesta del sistema evolucionará de la siguiente manera, la señal de lectura irá disminuyendo a medida que aumenta la concentración de MO en dicha muestra. Por tanto, en el caso que la cantidad de MO en la muestra sea igual o superior a la cantidad necesaria para tapizar completamente la superficie de la cantidad total de NP-BRs utilizadas en el método que aquí se describe y, en consecuencia, el filtrado obtenido en la etapa c) únicamente comprenda el conjugado NP-BR-MO, la señal de lectura óptica no se verá modificada (ver esquema en la parte izquierda de la figura 3). La cuantificación se realiza calibrando el sensor entre estos dos estados, para ello se obtiene una curva de calibración en la que se obtienen la señal de respuesta del sensor en función de determinadas concentraciones tabuladas. Conviene remarcar aquí que el ratio de NPs y MO presente en la muestra ahora se puede modificar fácilmente para sintonizar y adaptar el rango dinámico del sensor.

Por otro lado, en aquellas realizaciones en las que la superficie sensora se funcionaliza o tapiza mediante la inmovilización de al menos un tipo de BR1 que reconoce específicamente a la MO, es decir, una biomolécula (BR1) capaz de reaccionar específicamente con la MO, el cambio de la respuesta óptica del sensor se verá aumentada a medida que aumenta la concentración de MO en la muestra analizada (ver parte superior izquierda de la figura 4), mientras que dicha señal de lectura no se modificará cuando la muestra no contiene el analito o MO a detectar, ya que en este caso no se forma el conjugado NP-BR-MO (ver parte inferior derecha de la figura 4) y no es reconocido por la superficie tapizada por el citado BR1. Como en el caso anterior, la cuantificación de MO se realiza calibrando el sensor entre las dos situaciones que se ejemplifican en la figura 4. Para ello se obtiene una curva de calibración en la que se obtiene la señal de respuesta del sensor en función de determinadas concentraciones tabuladas.

Los bioreceptores específicos (BR1) comprendidos en la superficie sensora del sensor óptico de interferencia pueden ser iguales o diferentes a los bioreceptores (BR) comprendidos en las nanopartículas funcionalizadas (NP-BR).

Adicionalmente, en otras realizaciones particulares de la invención, el método descrito se puede utilizar para detectar anticuerpos específicos de alergia (IgE), notados como MO en la presente invención de un alérgeno específico en una muestra biológica. En estas realizaciones, el BR inmovilizado en la superficie de las NPs (NP-BR) es un bioreceptor específico (anti-lgE) que reconoce los anticuerpos específicos de alergia (es decir, el analito o MO, en este caso la IgE) en la muestra biológica a analizar. En este caso complejo, el conjugado NP-BR (NP-antilgE) captura las IgEs en la muestra del paciente formándose el conjugado NP-antilgE-lgE (notado como NP-BR-MO). En una realización de la presente invención, cuando el receptor específico (BR1) es una molécula alergénica (MA), y en un caso particular, Prup3 en el ensayo que se representa en la figura 6 del presente documento, se tapiza la superficie sensora con MA, de tal manera que si el conjugado NP-BR-MO (es decir, NP-antilgE-lgE) se reconoce en la superficie del sensor, la señal será cero cuando el paciente no tenga IgEs especificas a la MA inmovilizada en el sensor, mientras que en el caso de que el paciente tenga anticuerpos específicos de alergia, el conjugado NP-BR-MO (es decir, NP-antilgE-lgE) sí que se reconoce en la superficie del sensor, alterando la señal de lectura óptica tal y como se ha descrito en esta invención. En definitiva, en estas realizaciones, si el paciente del que se ha obtenido la muestra analizada tiene alergia, la señal de interferencia se verá modificada por la presencia del conjugado NP-BR-MO, donde la MO son los anticuerpos específicos de alergia (IgE) a la molécula alergénica (MA). De esta forma, el método de la presente invención supone una gran ventaja, ya que permite la detección in vitro de las posibles alergias que pueda tener un paciente. Esta determinación actualmente se realiza in vivo mediante el “prick tesf’, que consiste en al introducir moléculas o extractos alergénicas en el brazo del paciente y observar si el cuerpo reacciona.

Así, en el presente método intervienen dos mecanismos, por un lado, el cambio de la interferencia en longitud de onda, frecuencia o número de onda del perfil de interferencia al verse aumentado el camino óptico (índice de refracción en su parte real por longitud que debe de atravesar la luz), y por otro la posible reducción de la amplitud por la dispersión de la luz de los correspondientes complejos de NPs en la superficie del sensor debidos a los mecanismos mencionados de dispersión y/o variación de la parte compleja del índice de refracción.

El método de la presente invención permite el análisis cuantitativo, es decir, determinar la presencia o no de una molécula objetivo (MO), así como su cuantificación dependiendo del ensayo que se realice en una muestra.

Las nanopartículas utilizadas en el método de la presente invención pueden estar formadas por cualquier tipo de material inerte dieléctrico tal como, óxidos o silicio; cualquier material transparente a la luz, por ejemplo, sílice, titania, alumina o silicio; así como nanopartículas de otra naturaleza como oro, aluminio, plata, entre otras. En este último caso ocurre que a determinadas longitudes de onda las NPs pueden ser transparentes a luz y/o generar más o menos dispersión o variación en el coeficiente de extinción o parte compleja del índice de refracción. Así, las nanopartículas pueden seleccionarse del grupo que consiste en sílice, oro, aluminio, plata, silicio y óxidos metálicos, en particular óxido de titanio (titania) u óxido de aluminio (alumina).

Cabe señalar que el tamaño y concentración de NPs se calculan en base a la superficie den sensor, el tipo de biosensor por interferencia utilizado y el rango dinámico de la concentración que se quiere detectar. Por ello, en realizaciones preferidas del método de la presente invención, cuando el sensor óptico utilizado es un interferómetro Fabry-Perot, se prefiere la utilización de NPs esféricas de sílice (Si0 ₂ ) con un diámetro entre 50 y 100 nm, o de otro morfología con diámetros de la misma magnitud que los anteriores, preferentemente con una concentración de 10 ⁸ a 10 ¹² (1E8 a 1E12) nanopartículas por micrólitro. Si bien esta concentración puede variar principalmente en función del área sensible del sensor, del tiempo de incubación, temperatura y del volumen, ya que no solamente la cinética de la reacción determina el tiempo de asociación, sino que la difusión y la sedimentación de las NPs juegan un papel relevante. A mayor concentración de NPs, menor tiempo es necesario para que estas alcancen la superficie y puedan tapizar el área sensible del sensor. Tal como se muestra en la figura 5, cuando las NPs tienen un diámetro de 200 nm, la respuesta (Señal de D _IROP del sensor Fabry-Perot utilizado) no es monótona decreciente y solo a partir de un tapizado igual o superior al 50% la respuesta del sensor se podría utilizar. En este caso, se considera que las NPs no están sintonizadas y la respuesta del sistema biosensor no mejora. Sin embargo, cuando las NPs son esféricas con un diámetro de 50 nm o 100 nm, se observa como la señal de respuesta es monótona decreciente y la señal de sensor (Señal de D _IROP de este sensor utilizado) decrece casi linealmente con el área tapizada en el sensor. En este caso el sistema biosensor esta sintonizado y la sensibilidad se ha mejorado porque la pendiente de la curva de respuesta es superior a la reportada en trabajos previos, gracias al método de la presente invención.

En otras realizaciones preferidas del método de la presente invención, cuando el sensor óptico utilizado es un interferómetro Fabry-Perot, se prefiere la utilización de NPs de oro (Au) con un diámetro de 20 a 70 nm y preferentemente 45-55, tamaños que hagan que las NPs sean transparentes a la longitud de onda o rango espectral de interrogación óptica ( Modelling the optical response ofgold nanoparticlesw, Chem. Soc. Rev., 2008, 37, 1792-1805) y, preferentemente, una concentración de 10 ⁸ o 10 ¹¹ NPs/mL. Si bien esta concentración puede variar principalmente en función del área sensible del sensor, del tiempo de incubación, temperatura y del volumen, ya que no solamente la cinética de la reacción determina el tiempo de asociación, sino que la difusión y la sedimentación de las NPs juegan un papel relevante. A mayor concentración de NPs, menor tiempo es necesario para que estas alcancen la superficie y puedan tapizar el área sensible del sensor. Lo relevante de la invención es que la modificación del índice de refracción se produce por el material biológico inmovilizado o reconocido en la NP, ya que ésta hace de vehículo y es dicho material biológico el que cambia el índice de refracción del transductor, y por ende, su respuesta de interferencia. Esta respuesta de interferencia se lee por la variación de intensidad de una longitud de onda o un rango espectral y dependiendo del tamaño de la NP con su material biológico correspondiente se suma el efecto de la dispersión.

El método de la presente invención permite una gran versatilidad, ya que es posible seleccionar el tamaño y material de las nanopartículas (NPs) que permite su sintonización con la respuesta por interferencia del transductor. Mediante este proceso de sintonización se puede amplificar la respuesta por interferencia del transductor elegido, preferentemente Interferómetro Fabry-Perot, así como tener en cuenta la reducción de la amplitud de señal por la dispersión de las NPs que son reconocidas en el sensor. Adicionalmente, el método de la presente invención también permite aplicar criterios de diseño para determinar la constante de amplificación, establecer el rango cuantitativo de detección, mejorar significativamente la sensibilidad, reducir la incertidumbre de medidas y mejorar drásticamente el límite de detección. Adicionalmente, este método también permite modificar el sistema de lectura de la señal de detección, lo que permite reducir la incertidumbre de la medida.

Así, con el método de detección que se describe en esta solicitud de patente se consiguen las siguientes ventajas:

- Detección de moléculas tanto de baja como de alta masa molecular, ya que el método es independiente de la masa molecular de la molécula objetivo (MO) a detectar y se da una solución técnica no resuelta a un problema habitual. De forma más específica, en el método óptico que aquí se describe la detección depende de los conjugados (NP- BR o NP-BR-MO) reconocidos en la superficie del sensor. Por lo tanto, a diferencia de los métodos convencionales donde la masa en la superficie sensora se modifica muy poco, si la MO es de muy baja masa molecular; en el método de la invención la masa en la superficie sensora depende principalmente de la nanopartícula (NP) y el biorreceptor (BR), no tanto de la masa molecular de la molécula objetivo (MO). Esto supone una gran ventaja respecto a otros métodos que utilizan sensores por interferencia, donde la señal y la sensibilidad dependen mucho de masa molecular de la molécula objetivo.

- Permite trabajar con muestras reales, es decir, muestras (en particular, muestras biológicas) que no se han sometido a ningún tratamiento previo. El problema de efecto matriz, adsorción inespecífica, se reduce drásticamente o se elimina, dado que el método comprende la separación del analito del resto de la muestra y, de forma ventajosa, esta separación se hace fuera del sensor, de forma que solo se deposita una muestra limpia en la superficie sensora del biosensor. De esta forma se elimina la necesidad de utilizar complejos sistemas de bloqueo en la superficie del propio sensor, además de evitar complejos procesos de lavado directamente en el sensor para eliminar el efecto matriz o adsorción inespecífica. Conviene remarcar aquí que el proceso de bloqueo y marcado en los sistemas ópticos que funcionan sin mareaje óptico es quizás una de las principales razones por la cual no se han comercializado de manera masiva como sensor o sistema de diagnóstico en el sitio de cuidado o necesidad “point ofeare” por su terminología en el idioma inglés.

Mediante la selección de la cantidad, tamaño y material de las NPs es posible optimizar la curva de respuesta representada como la señal de medida en función de la conctración con el objeto de adaptar la respuesta al rango de concentraciones a detectar, es decir, el rango dinámico. De esta forma, es posible optimizar el rango de concentraciones en el que se desea trabajar en función de la aplicación biológica seleccionada y para cada tipo de transductor que funciona por interferencia elegido

Este método mejora drásticamente la sensibilidad y límite de detección de origen del transductor por interferencia que se utilice. Así, el método permite detectar concentraciones mínimas de molécula objetivo (analito) debido al incremento de sensibilidad en el proceso de transducción. Adicionalmente, mediante la selección de la cantidad, tamaño y material de las NPs también es posible mejorar significativamente el límite de detección, ya que la amplificación de la señal depende de las NPs utilizadas, mientras que la incertidumbre de lectura del sistema no depende de las NPs. En consecuencia, la relación Sensibilidad/lncertidumbre de lectura correspondiente al límite de detección se podrá mejorar para cualquier sistema de lectura por el aumento de sensibilidad comentado.

Como conclusión, la presente invención resuelve problemas importantes de los biosensores ópticos que funcionan por interferencia:

I. Qué con esta invención la sensibilidad del sistema de detección ya no depende de la masa molecular de la molécula objetivo a detectar o reconocer.

II. Qué la sensibilidad se aumenta drásticamente mejorando, por tanto, el límite de detección de manera muy significativa y así detectar moléculas de muy baja masa molecular en concentraciones ínfimas

III. Qué se puede medir con eficacia muestras reales (por ejemplo muestras biológicas de de matriz compleja) reduciendo o eliminado la señal inespecífica (también llamada señal de fondo o background en lengua de habla inglesa) y por tanto poder medir

IV. Qué además se puede adaptar la curva de respuesta al rango de concentraciones que se desea medir.

Por tanto, el método de la presente invención se puede utilizar para desarrollar sistemas de diagnóstico in-situ y no invasivos mediante la captura de biomarcadores presentes en diferentes muestras, preferiblemente biológicas. En el caso del diagnostico clínico, las muestras líquidas biológicas donde encontrar estos biomarcadores pueden ser, entre otras, sangre, suero, orina, lágrima entre otras como liquido céfalo raquídeo, agua, salva, etc. Del mismo modo, el método de diagnóstico se podrá utilizar para múltiples sectores en donde tenga lugar una detección de reconocimiento bioreceptor-analito in-vitro (p.e. reacción de afinidad anticuerpo-antígeno).

Así, la invención también proporciona un método de diagnóstico in-vitro con base inmunológica mediante la utilización de transductores fotónicos basados en interferencia óptica (transductores interferométricos), donde estos transductores comprenden en su superficie sensora: i) la molécula objetivo, o ii) al menos un bioreceptor específico (BR1) de ésta; así como un sistema de lectura capaz de monitorear las variaciones relativas de los eventos de inmovilización y/o reconocimiento que se ven drásticamente amplificados por la utilización de los conjugados NP-BR y NP-BR-MO descritos anteriormente. En realizaciones particulares de la presente invención, la muestra a analizar es una muestra biológica, bien sea humana o animal, y la molécula objetivo a detectar es un biomarcador que permite el diagnóstico in vitro de, por ejemplo, una enfermedad.

En una de las realizaciones preferidas, el método óptico de detección de la presente invención puede ser utilizado para diagnóstico in vitro de alergia alimentaria. Dicho método consistiría en la detección de inmunoglobulinas (IgE) especificas de alergia contenidas en muestras reales de pacientes. En este caso, las Moléculas Objetivo (MOs) a detectar son IgEs especificas a los alérgenos a los que el paciente es alérgico. Para ello varias moléculas alergénicas de alimentos se inmovilizan diferentes pocilios de un biokit en los que se encuentran, por ejemplo, varios interferómetros tipo Fabry-Perot (p.e. Towards reliable optical label-free point-of-care (PoC) biosensing devices, Sensors and Actuators B 236 (2016) 765-772). Las NPs están biofuncionalizadas con un bioreceptor (BR) consistente en una Inmonuglobulina IgG que reconoce específicamente todas las IgEs existentes en la muestra del paciente (sueros de pacientes con alergia alimentaria). Para poder distinguir a qué moléculas IgE el paciente es alérgico, tras la incubación y filtrado de la muestra del paciente se obteine una muestra que contendrá los conjugados de NPs con las diferentes IgEs, esta muestra se deposita e incuba en los diferentes pocilios que contienen las moléculas alergénicas frente a las que se quiere hacer el diagnostico, de forma que los conjugados de NPs con las IgE específicas se unen al alérgeno correspondiente, siendo entonces detectadas al leer la señal óptica por el cambio de interferencia que se genera.

El método de detección que aquí se describe, por tanto, tiene que comprender adicionalmente una etapa previa de funcionalización de nanopartículas con al menos un bioreceptor específico, dando lugar a la formación de las nanopartículas funcionalizadas (NP-BR). Para llevar a cabo esta funcionalización se puede utilizar cualquier método de anclaje (enlace covalente, adsorción directa o cualquier otra ruta de biofuncionalización) conocido por el experto en la materia.

En aquellas realizaciones en las que las NPs son de sílice, el método de funcionalización preferido es la silanización, para acoplar una molécula de anclaje que oriente el anticuerpo por su parte no específica. Por otro lado, cuando el método utilice NPs de oro, es preferible utilizar el tiol como elemento de anclaje. Los mecanismos de biofuncionalizacion de superficies están ampliamente reportados en la literatura científica (p.e. Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Second Edition, 2008, ISBN 978-0- 12-370501-3).

Como ejemplo particular, la biofuncionalización de NPs de sílice con bioreceptores específicos de la molécula objetivo puede realizarse a partir de una solución monodispersada de nanoesferas con grupos amino en su superficie. Los grupos carboxilo presentes en los anticuerpos pueden activarse y estabilizarse mediante la adición de EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) clorhidrato de carbomidina) y NHS (N- hidroxisuccinimida), que causa una reacción espontánea con las aminas primarias presentes en la superficie de las nanoesferas, resultando en la formación de un conjugado NP-BR estable por la formación de un amida covalente.

Así mismo, el método óptico de detección de la presente invención también requiere de la biofuncionalización de la superficie del sensor óptico, tal y como se describe en la etapa d) de reconocimiento, en la que se pone en contacto los conjugados NP-BR-MO y/o NP- BR con la superficie sensora. La biofuncionalización de la superficie sensora de los transductores, también se han descrito ampliamente en la bibliografía diferentes rutas, con anclajes covalente o por adsorción, con o sin orientación y utilizado diferentes agentes bloqueantes. A lo largo de esta invención se han reportado varias referencias en las que se describen estas rutas de biofuncionalización que no son objeto de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figuras 1A-1C: En la figura 1A se ilustra una señal óptica de un transductor interferométrico (p.e tipo Fabry-Perot de interrogación óptica vertical) en el que se han inmovilizado bioreceptores específicos. Las figuras B1a-B3a son una representación esquemática del proceso tradicional de operación, mientras que las figuras B1b-B3b se refiere al proceso descrito en la presente invención en la que se utilizan los conjugados de NPs. La figura C1 muestra de manera esquemática cual es la detección de una molécula objetivo en un sensor por interferencia, donde el perfil de la respuesta espectral se ve modificado por el reconocimiento de una molécula objetivo, mientras que la figura C2 muestra como sería la detección en el caso de utilizar lo descrito en la presente invención, donde el cambio de la señal óptica espectral es amplificado significativamente, y además puede conllevar una modificación en la citada amplitud de la citada señal óptica, y por tanto ambos efectos mejoran muy significativamente la capacidad de detección del sistema.

Figura 2: Es una representación esquemática de los diferentes tipos de conjugados formados con las nanopartículas (NP) en el método de la presente invención, es decir, nanopartículas funcionalizadas (NP-BR) y conjugado (NP-BR-MO) formado por estas nanopartículas funcionalizadas y la molécula objetivo. En las realizaciones particulares que se representan en esta figura, ambos conjugados comprende un agente bloqueante (AB), sin embargo, el método de la presente invención también podría realizarse de forma selectiva cuando las NP-BR y NP-BR-MO no comprenden ningún agente bloqueante.

Figura 3: En esta figura se representa el mecanismo de detección cuando se inmoviliza la MO en la superficie del sensor. De forma más específica, en la parte izquierda de la figura 3A se representa el resultado de haber incubado las NP-BRs (etapa b) con la muestra y filtradas (etapa c) para obtener los conjugados NP-BRs en el caso de que la muestra biológica no contuviera la MO y NP-BR-MOs en el caso de que si los hubiera, aquí se ejemplifica el caso extremo en el que todas las NP-BR presentes en el medio de reacción captan todas la MO presentes en la muestra. La figura 3B representa la etapa de reconocimiento (etapa d y etapa e), en el caso de que la muestra no contuviera MOs, los conjugados de NP-BRs se reconocerían en la superficie del sensor y la señal sería máxima (ver parte inferior de la Figura 6C), es decir la señal de interferencia de sensor cambia significativamente. En el caso de que la muestra sí tuviera la MO, entonces los conjugados NP-BR-MO no se reconocerían en la superficie del sensor ya que éste también tiene inmovilizada la MO (ver la parte superior de la Figura 6C)

Figura 4: En esta figura se representa primero el mecanismo de reconocimiento y filtrado (Figura 4), después el mecanismo de detección cuando lo que se inmoviliza es un receptor específico (BR) de la molécula objetivo (MO) en el sensor (Figura 4B). Al contrario de cómo se describía en la Figura 3, la muestra que contiene los conjugados de NP-BR-MOs ahora se reconocerán en la superficie del sensor y por tanto en este caso el cambio de la señal por interferencia será muy significativo (ver parte superior de la figura 4C), mientras que cuando la muestra no tenga la MO los conjugados NP-BRs no se reconocerán en la superficie del sensor (ver parte inferior de la figura 4C) y por tanto la señal de interferencia prácticamente no se verá alterada.

Figura 5: Ejemplo de sintonización de NPs sobre un sistema biosensor. En este caso se ha utilizado un sensor por interferencia tipo Fabry-Perot utilizado como mecanismo de lectura el basado en Increased Relative Optical Power (IROP (%)) descrito en Towards reliable optical label-free point-of-care (PoC) biosensing devices, Sensors and Actuators B 236 (2016) 765-772. La simulación de la curva de respuesta representa la señal de lectura en función del porcentaje de NPs reconocidas en la superficie. Se puede observar que para NPs de 50 a 100 nm, la curva de respuesta es monótona decreciente y válida para ser utilizada como sensor, mientras que para el 200 nm la curva de respuesta no sería válida.

Figura 6A: En la figura 6A se puede apreciar el cambio de la señal en una muestra real de suero con alta concentración de IgE especificas a Pru p 3 en 14 pocilios (P1 a P14). Cada Pocilio contiene un sensor tipo Fabry-Perot. En la figura 6B se puede observar las Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM por sus siglas en inglés), donde se observa una imagen sin NPs en la superficie, y otra con NPs en la superficie. Ocurre que este es el caso donde se observa el aumento de la señal y por tanto se certifica el reconociendo del conjugado NP-lgG-lgE-Pru p3. Conviene remarcar que en esta figura se muestran las lecturas de las señales de un kit de diagnostico de 14 pocilios (P1 a P14) en matriz de suero (en este caso expresada en D _IROP %) obtenidas en el ejemplo 1 (ver más abajo). La señal más baja de estas lecturas es la relativa a la inmovilización del bioreceptor (BR1), mientras que las altas ya se refieren a la detección especifica de la molécula objetivo (MO), en este caso una IgE especifica del alérgeno Pru p 3. Tal como puede observarse en esta gráfica las NPs de sílice utilizadas se han funcionalizado con un bioreceptor (BR) consistente en inmunoglobulinas G (IgGs) que reconocen específicamente todas las inmunoglobulinas E (IgEs) presentes en la muestra biológica, es decir, las NPs se han funcionalizado con antilgE (IgGs que capturan las IgEs). La superficie del sensor es funcionalizado con un bioreceptor (BR1). En este caso son moléculas de un tipo de alérgeno concreto (Pru p 3), de tal forma que solo aquellas IgEs especificas a Pru p 3 (en este caso la molécula objtivo) se reconocerán en la superficie del sensor, y por tanto cuando esto ocurre cambia la señal óptica de lectura.

Figura 7A: Imágenes de SEM de los conjugados reconocidos en la superficie del sensor (imágenes 7A-3 y 7A-4) en contraste con las imágenes 7A-1 y 7A-2 donde se han reconocido un número limitado de NPs. En este caso el método ha consistido utilizar NPs de oro que se han biofuncionalizado con un bioreceptor (BR) consistente en una inmunoglobulina G que reconoce específicamente la Molécula objetivo (MO) que es la metaloproteinasa MMP9. En este caso la muestra no biológica no contenía la MMP9 y por tanto los conjugados NP-antiMMP9 se reconocen en el sensor aumentado su señal significativamente (figura 7B), además se comprueba que la señal tan elevada es debido a las NPs que se observan por microscopía (imágenes 7A-3 y 7A-4 de la figura 7A). Como prueba adicional se inmovilizó en otro sensor otra MO (la Cistatina CST4). Cuando se puso la muestra en contacto con este otro sensor se pudo observar que no hubo prácticamente reconocimiento de los conjugados NP-antiMMP9 con la CST4, como se puede observar por el limitado número de NPs observadas por microscopía (imágenes 7A-1 y 7A-2 de la figura 7A) y la menor señal medida (figura 7B).

Figura 8: En esta figura se observan NPs de PMMA sobre la superficie de un sensor mediante los cuales se hace una prueba experimental para certificar que en función del tamaño de las NPs también la dispersión de la luz es un fenómeno que se puede utilizar y/o sumar al cambio de la interferencia. En este caso mediante NPs de PMMA se puede observar como el perfil de interferencia se reduce en amplitud de la señal y se utiliza como mecanismo de detección.

EJEMPLOS

Con objeto de contribuir a una mejor comprensión de la invención, y de acuerdo con una realización práctica de la misma, se acompaña como parte integrante de esta descripción una serie de ejemplos de realizaciones preferidas de la presente invención.

Ejemplo 1 : Detección de IgE específica de alergia alimentaria utilizando nanopartículas de sílice

En este caso las NPs se funcionalizan inmovilizando un receptor específico de anticuerpos específicos de alergia IgE (NP-antilgE), conviene indicar que las anti-lgE son IgGs que reconocen y capturan todas las IgEs existentes en la muestra biológica correspondiente, y en la superficie del sensor se inmoviliza una de las moléculas alergénicas especificas para la que se desea saber si el anticuerpo específico de alergia que es afín a dicha molécula, y por ende detectar si el paciente tiene anticuerpos específicos de alergia (IgEs) a la molécula Pru p 3. Las medidas están realizadas en una muestra de suero real. En este caso se forma el conjugado NP-antilgE-lgE, pero con la peculiaridad de que la IgE puede ser específica o no a la molécula alergénica que se ha tapizado en el sensor (Pru p 3, en este ensayo) y que hemos notado como BR1. De esta forma, si la señal del sensor aumenta, significa que el conjugado se reconoce en la superficie y la muestra viene de un paciente que tiene una concentración específica de anticuerpos específicos de alergia a la molécula Pru p 3. Por el contrario, si la señal del sensor no cambia, la muestra no contiene anticuerpos específicos de alergia a Pru p 3.

Se inmovilizó una molécula alergénica (Pru p3) en la superficie sensora del Sensor Inter- ferometro Fabry-Perot a una concentración de 5 pgramos/mL.

Por otro lado, se inmovilizó anticuerpo (anti-lgE) que reconoce específicamente todas la IgEs en NPs de sílice (conjugado NP-antilgE) con un diámetro entre 50 nm y 100 nm.

Se extrajo una muestra del paciente, que se centrifugo para obtener el suero. Posterior mente, esta muestra se mezcló con el suero del paciente, donde se encontraban los anti cuerpos específicos de alergia (IgEs). Se añadió las NPs de sílice funcionalizadas, a una concentración de 2,5 x 10 ¹⁰ NPs/DL y se incubo durante 30 min, es decir, se dejó a 37°C en un incubador para que el conjugado NP-anti-lgE reconociera las posibles IgEs presen tes en la muestra del paciente.

Una vez completado el proceso de incubación, se procedió al proceso de centrifugado para que los conjugados de NPs sedimentaran en el eppendorf. Se eliminó el sobrena dante, obteniéndose así los conjugados de NPs que hayan reconocido las IgEs del pa ciente. Este proceso de centrifugado se repitió 3 veces.

Una vez filtrada la muestra que contenía los conjugados NP-antilgE-lgE (especifica), se introdujo en el sensor previamente funcionalizado con la molécula alérgica Pru p 3 y se incubó durante 30 min a 37°C. Finalizada la etapa de reconocimiento, si el conjugado NP- antilgE-lgE es específico a la molécula alergénica, el conjugado se queda reconocido específicamente en la superficie del sensor y la señal de lectura cambia.

En las figuras 6A y 6B se muestran los resultados obtenidos en este ensayo. En particu lar, en la figura 6A se puede observar las barras de inmovilización del alérgeno Pru p 3 y el incremento de señal en 14 pocilios (señales de 1100 de D _|ROP (%) cuando se recono cen la superficie del sensor los conjugados NP-antilgE-lgE específicos a Pru p 3 de la muestra biológica. En este caso señales de 1200 de D _IROP (%) en contrate con la señal inicial correspondiente a la inmovilización del Pru p 3, señales de 200 de D _|ROP (%)) Esta señal es corroborada con la figura 6B, donde se muestran imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM por sus siglas en ingles) que demuestran el reconocimiento del conjugado NP-antilgE-lgE _{Pm p} 3.

Es importante remarcar aquí que este sensor funciona por la intensidad de la luz que ge nera el interferómetro Fabry-Perot utilizado ( Towards reliable optical label-free point-of- care (PoC) biosensing devices, Sensors and Actuators B 236 (2016) 765-772) y, en este caso, el método que aquí se describe amplifica la señal de reconocimiento, ya que de pende tanto del desplazamiento de la señal por interferencia, amplificado por el incremen to de materia en el sensor, así como por la pérdida de intensidad de la luz por la disper sión ópticas de las NPs reconocidas en dicha superficie.

Ejemplo 2: Detección de la metaloproteinasa MMP9 (marcador de inflamación)

Para realizar esta prueba experimental se inmovilizó el anticuerpo específico de MMP9 (antiMMP9) en la superfice de las NPs de oro (conjugado NP-anti-MMP9). En este caso se eligió NPs de oro de 50 nm ya que son transparentes al intervalo de longitudes de on da elegidas entorno a 850 nm ( Modelling the optical response of gold nanoparticlesw, Chem. Soc. Rev., 2008, 37, 1792-1805).

Por otra parte se tapizaron sensores tipo interferómetros Fabry-Perot con MMP9 y con CST4 en sus correspondientes superficies de sensoras con una concentración suficiente para tener un porcentaje elevado de tapización de dichas superficies sensoras. En con creto se inmovilizó tanto la proteína MMP9 (marcador de inflamación) como la proteína CST4 a una concentración de 10 Dg ml_ ¹ en la superficie del sensor tipo Fabry Perot. Por tanto se obteinen dos biosensores, uno en que se ha inmovilizado una proteína afín a la antiMMP9 (la molécula objetivo) y en otro una proteína no afín al anticuerpo MMP9.

En este caso para fabricar el interferómetro se utilizó un material de base polimérica (SU8) similar al descrito en Development towards Compact Nitrocellulose-Based Interfe- rometric Biochips for Dry Eye MMP9 Label-Free In-Situ Diagnosis Sensors 2017, 17, 1158; doi:10.3390/s17051158), salvo que este caso no se utilizó nitrocelulosa para el anclaje.

El análisis se realizó directamente utilizando conjugados NP-antiMMP9 que debían de reconocer como biorecpetor a la MMP9 y no debían de reconocer como receptor a la CST4. Para ello se incubó la muestra que contenía los conjugados de NP-antiMMP9 so bre las citadas superficies sensoras durante un periodo de 2 horas, a una temperatura de 37 °C. De forma que si la señal es alta, el los conjugados NP-antiMMP9 se han reconoci do en la superficie, mientras que si la señal es baja, es que los conjugados NP-antiMMP9 no se reconocen en la superficie sensora y la señal debe de ser baja.

En la figura 7 se muestran los resultados obtenidos en este ensayo. Se puede observar en las imágenes de microscopía electrónica (ver figura 7A) como el conjugado NP-anti- MMP9 se reconoce en la superficie (imágenes 7A-3 y 7A-4, y por tanto reconoce la molé- cula objetivo (MO). Además esto se corrobora con las señales detectadas en los senso res en la Figura 7B (señales 7A-3 y 7A-4) que son muy elevadas cuando se han recono cido los citados conjugados NP-antiMMP9. Sin embargo, los resultados encontrados cuando se inmoviliza una proteína no es afín (en este caso la mencionada CST4) indican que el número de conjugados NP-antiMMP9 es limitado, y por tanto, la señal es mucho menor. Ver figuras 7A, imágenes 7A-1 y 7A-2 y figura 7B señales 7A-1 y 7A-2 respecti vamente.