Die Erfindung betrifft auch ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass das Material besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst, sowie mit diesem Trägersubstrat ausgeführte massenspektrometrische und gekoppelte Nachweisverfahren sowie deren Verwendung.

"Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry" (MALDI-MS) wurde 1988 von Karas und Hillenkamp eingeführt und hat sich seitdem als eine weit verbreitete Methode zur Bestimmung der Massen von Biopolymeren und anderen biologischen oder biochemischen Substanzen, wie beispielsweise Nukleinsäuren, Peptiden, Proteinen und DNA und deren Fragmenten, bewährt.

Das MALDI-Prinzip beruht darauf, dass der Analyt, wie beispielsweise ein Peptid oder Protein, in eine Matrix aus typischerweise organischen Molekülen niedrigen Molekulargewichts (z. B. Sinapinsäure) eingebettet wird oder zu einer solchen Matrix in Kontakt steht. Das Matrixmaterial wird dabei so ausgewählt, dass es bei der Anregungswellenlänge eines starken, anregenden Laserpulses stark absorbierend ist.

Bei Einstrahlung eines solchen Laserpulses wird die Probenmatrix in das Vakuum der MS-Apparatur verdampft. Gleichzeitig werden die in der Matrix eingebetteten oder damit verbundenen Analytmoleküle ebenfalls in die Gasphase überführt und gegebenenfalls zusätzlich durch Protonenübertragung von der Probenmatrix ionisiert.

Auf diese Weise können auch grosse Moleküle, bis zu einem Molekulargewicht von etlichen hunderttausend Dalton, in die Gasphase überführt werden. In einer typischem massenspektrometrischen Anordnung werden die Analyt-Ionen dann zur Massenauftrennung in einem elektrischen Feld eines Flugzeit-Massenspektrometers ("time-of-flight (TOF) mass spectrometer") beschleunigt. Ein besonderer Vorteil des MALDI-Verfahrens besteht darin, dass im linearen TOF-MS wenig bis keine Fragmente detektiert werden, in einem Reflektron-TOF-MS diese aber nachgewiesen werden können. Damit können sowohl die Molekularmasse als auch gegebenenfalls Strukturelemente der gemessenen Verbindungen bestimmt werden. Dem steht als Nachteil entgegen, dass sich MALDI-MS vorwiegend nur zur Massenbestimmung grösserer Moleküle (mit Molekulargewicht > 500 Da) eignet, während sich im Bereich kleiner Molekulargewichte die Anwesenheit der Probenmatrix störend auswirken kann.

Der Träger oder Rahmen für die MALDI-Matrix besteht traditionell aus einem elektrisch leitenden Material, d. h. einer metallischen Platte oder einem metallischen Gitter [siehe z. B. US-Patent Nr. 5,580, 434].

Eine massenspektrometrische Apparatur, basierend auf dem MALDI-Prinzip, wird nachfolgend als eine"MALDI-Messanordnung"bezeichnet.

MALDI ermöglicht, ebenso wie andere massenspektrometrische Analysemethoden, eine Identifikation von Substanzen aufgrund ihres Molekulargewichtes. Eine absolute oder relative quantitative Bestimmung der Konzentration eines Analyten in einer Probe oder der quantitative Vergleich der Affinitäten zwischen einer Vielzahl von Analyten in einer Probe und entsprechenden, auf einem Träger immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen, basierend auf der Anzahl gebundener Analytmoleküle, ist jedoch mittels MALDI schwierig und nur in speziellen Fällen verlässlich, da Wechselwirkungen zwischen der MALDI-Matrix und den Analytmolekülen, unterschiedliche Ionisationsquerschnitte der Analytmoleküle, Massenabhängigkeit des Detektorsignals und Transmissionseigenschaften des Massenspektrometers einen zusätzlichen Einfluss auf die Signalhöhen im Massenspektrum haben.

Für quantitative oder semi-quantitative Analysen des spezifischen molekularen Bindungsverhaltens sind daher solche Methoden besser geeignet, welche keine Aufbringung einer zusätzlichen molekularen Matrix erfordern.

In den vergangenen Jahren sind sogenannte"Mikroarrays", wie beispielsweise Nukleinsäure-oder Protein-Mikroarrays, bekannt geworden, welche beispielsweise, mit teilweise hoher Genauigkeit, den Nachweis einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten aus einer einzelnen Probe auf einem gemeinsamen Träger ermöglichen.

Derartige Nachweisplattformen sind vor allem unter der Bezeichnung"Biochips" bekannt geworden. Dazu werden in einer zweidimensionalen Anordnung auf einem im wesentlichen planaren Träger eine Vielzahl unterschiedlicher biologischer oder biochemischer oder synthetisch herstellbarer Erkennungselemente, für die spezifische Erkennung und Bindung des jeweiligen Zielanalyten, immobilisiert.

Danach werden in einem einen einzelnen oder mehrere Zugabeschrittte umfassenden Assay die Probe mit den nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Reagentien mit den auf der Trägeroberfläche immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht. Der qualitative und in vielen Fällen auch quantitative Nachweis gebundener Analytmoleküle, aus denen deren Konzentration in der untersuchten Probe bestimmt werden soll, kann mithilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Detektionsmethoden erfolgen.

Vielfach verbreitet sind fluoreszenzbasierende Nachweismethoden. Da die nachzuweisenden Analytmoleküle nur in den seltensten Fällen selbst fluoreszent sind, werden für einen fluoreszenzbasierenden Analytnachweis im allgemeinen sogenannte Fluoreszenzlabel verwendet, welche beispielsweise an den Analyten oder an einen seiner Bindungspartner gebunden werden.

Basierend auf einfachen Glas-oder Mikroskop-Plättchen, sind Arrays mit einer sehr hohen Dichte von diskreten Messbereichen ("Features") bekannt. Beispielsweise werden in der US 5,445, 934 Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter beschrieben und beansprucht. Die Anregung und das Auslesen solcher Arrays beruht auf klassischen optischen Anordnungen und Methoden. Es kann das ganze Array gleichzeitig mit einem aufgeweiteten Anregungslichtbündel beleuchtet werden, was jedoch zu einer relativ geringen Empfindlichkeit führt, da die auf die Fläche bezogenen Anregungslichtintensitäten unter diesen Bedingungen relativ gering sind. Zur Erreichung höherer Anregungslichtintensitäten und zur Einschränkung des Fokusbereichs des Anregungslichts und der Erfassung des Emissionslichts vor und nach der Ebene der immobilisierten Erkennungselemente werden vielfach konfokale Mikroskop- Messanordnungen eingesetzt und die verschiedenen Features sequentiell mittels "Scannen"ausgelesen..

Eine noch stärkere Beschränkung von Signalerzeugung und Detektion auf die Ebene, an der die Wechselwirkung zwischen den Analyten und den Erkennungselementen stattfindet, wird durch einen Analytnachweis im evaneszenten Feld eines optischen Wellenleiters, insbesondere eines Dünnschichtwellenleiters, ermöglicht : Koppelt man eine Lichtwelle in einen planaren Dünnschichtwellenleiter ein, der von optisch dünneren Medien umgeben ist, so wird sie durch Totalreflexion an den Grenzflächen der wellenleitenden Schicht geführt. Ein planarer Dünnschichtwellenleiter besteht im einfachsten Fall aus einem Dreischichtsystem : Trägermaterial, wellenleitende Schicht, Superstrat (bzw. zu untersuchende Probe), wobei die wellenleitende Schicht den höchsten Brechungsindex besitzt. Zusätzliche Zwischenschichten können die Wirkung des planaren Wellenleiters noch verbessern.

In die optisch dünneren Medien tritt dabei ein Bruchteil der elektromagnetischen Energie ein. Diesen Anteil bezeichnet man als ein evaneszentes oder quergedämpftes Feld. Die Stärke des evaneszenten Feldes ist sehr stark abhängig von der Dicke der wellenleitenden Schicht selbst, sowie vom Verhältnis der Brechungsindices der wellenleitenden Schicht und der sie umgebenden Medien. Bei dünnen Wellenleitern, d. h. Schichtdicken von derselben oder niedrigerer Dicke als der zu führenden Wellenlänge, können diskrete Moden des geleiteten Lichts unterschieden werden.

Es sind verschiedene Verfahren für die Einkopplung von Anregungslicht in einen planaren Wellenleiter bekannt. Die am frühesten benutzten Verfahren beruhten auf Stirnflächenkopplung oder Prismenkopplung, wobei zur Verminderung von Reflexionen infolge von Luftspalten im allgemeinen eine Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter aufgebracht wird. Diese beiden Methoden sind vor allem in Verbindung mit Wellenleitern relativ grosser Schichtdicke, d. h. insbesondere selbsttragenden Wellenleitern, sowie bei einem Brechungsindex des Wellenleiters von deutlich unter 2 geeignet. Zur Einkopplung von Anregungslicht in sehr dünne, hochbrechende wellenleitende Schichten ist demgegenüber die Verwendung von Koppelgittern eine wesentlich elegantere Methode.

Es können verschiedene Methoden zum Analytnachweis im evaneszenten Feld geführter Lichwellen in optischen Schichtwellenleitern unterschieden werden.

Aufgrund des eingesetzten Messprinzips kann man beispielsweise zwischen Fluoreszenz-oder allgemeiner Lumineszenzmethoden auf der einen Seite und refraktiven Methoden andererseits unterscheiden. Hierbei können Verfahren zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz in einer dünnen Metallschicht auf einer dielektrischen Schicht mit niedrigerem Brechungsindex in die Gruppe der refraktiven Methoden mit einbezogen werden, sofern als Basis zur Bestimmung der Messgrösse der Resonanzwinkel des eingestrahlten Anregungslichts zur Erzeugung des Oberflächenplasmonenresonanz dient. Die Oberflächenplasmonenresonanz kann aber auch zur Verstärkung einer Lumineszenz oder zur Verbesserung des Signal-zu- Hintergrund-Verhältnissen in einer Lumineszenzmessung verwendet werden. Die Bedingungen zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz, sowie zur Kombination mit Lumineszenzmessungen, sowie mit wellenleitenden Strukturen sind vielfach in der Literatur beschrieben.

Mit dem Begriff"Lumineszenz"wird in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff"Lumineszenz"mit eingeschlossen. Dabei sind Fluoreszenz und Phosphoreszenz besonders bevorzugte Formen der Lumineszenz.

Bei den refraktiven Messmethoden wird die Änderung des sogenannten effektiven Brechungsindex aufgrund molekularer Adsorption oder Desorption auf dem Wellenleiter zum Nachweis des Analyten benutzt. Diese Änderung des effektiven Brechungsindex wird, im Falle von Gitterkoppler-Sensoren, bestimmt aus der Änderung des Koppelwinkels für die Ein-oder Auskopplung von Licht in oder aus dem Gitterkoppler-Sensor, und im Falle von interferometrischen Sensoren aus der Änderung der Phasendifferenz zwischen dem in einem Sensorarm und einem Referenzarm des Interferometers geführten Messlichts.

Die genannten refraktiven Methoden haben den Vorteil, dass sie ohne Verwendung zusätzlicher Markierungsmoleküle, sogenannter molekularer Labels, eingesetzt werden können. Der Nachteil dieser labelfreien Methoden ist jedoch, dass die damit erzielbaren Nachweisgrenzen aufgrund der geringen Selektivität des Messprinzips, in Abhängigkeit von dem Molekulargewicht des Analyten auf pico-bis nanomolare Konzentrationsbereiche beschränkt sind, was für viele Anwendungen, beispielsweise für diagnostische Applikationen, nicht ausreichend ist.

Zur Erreichung tieferer Nachweisgrenzen erscheinen lumineszenzbasierende Methoden aufgrund grösserer Selektivität der Signalerzeugung besser geeignet. Dabei ist die Lumineszenzanregung auf die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in das optisch dünnere Medium, also auf die unmittelbare Umgebung des wellenleitenden Bereichs mit einer Eindringtiefe in der Grössenordnung von einigen hundert Nanometer ins Medium beschränkt. Dieses Prinzip wird evaneszente Lumineszenzanregung genannt. Für die Analytik ist diese Anregungsmethode von grosser Bedeutung, da hiermit störende Einflüsse aus der Tiefe des Mediums minimiert werden können.

Die genannten optischen Nachweismethoden sind in den vergangenen Jahren ausgedehnt worden von Sensorplattformen zur Bestimmung einzelner Analyten auf Plattformen mit Hunderten bis Tausenden verschiedener, in diskreten Messbereichen ("Spots") immobilisierten Erkennungselementen zur Bestimmung einer Vielzahl unterschiedlicher Analyten auf einer gemeinsamen Plattform ("Mikroarrays"). Es wurde in der Vergangenheit vielfach demonstriert, dass derartige optische Nachweisverfahren eine verlässliche quantitative Bestimmung der Analytkonzentrationen in einer zugeführten Probe, basierend auf der Anzahl an die Erkennungselemente gebundener Analytmoleküle und der daraus resultierenden Signaländerung, ermöglichen. Ausserdem kann mithilfe oberflächengebundener Nachweisverfahren, beispielsweise basierend auf Wechselwirkungen im evaneszenten Feld eines Wellenleiters oder eines Oberflächenplasmons, die Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Analyten und ihren immobilisierten Erkennungselementen, in Echtzeit verfolgt werden.

Die genannten optischen Nachweismethoden ermöglichen jedoch keine Identifikation der gebundenen Analytmoleküle, was beispielsweise für Screening-applikationen erforderlich ist.

Daher besteht ein Bedürfnis nach einer einfachen Kombination optischer Nachweisverfahren, insbesondere mit Mikroarrays, mit massenspektrometrischen Nachweisverfahren, insbesondere mit MALDI.

Bekannt ist die Kopplung der optischen Methode des Analytnachweises mittels Oberflächenplasmonenresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR) mit MALDI.

Dabei wurden zwei verschiedene Wege beschritten [S. R. Weinberger, T. S. Morris, M. Pawlak,"Recent trends in protein biochip technology", Pharmacogenomics 1 (2000), 395-416]. Der ersten Methode folgend wurden die in einer Affinitätsreaktion der nachzuweisenden Analytmoleküle mit immobilisierten Erkennungselementen oberflächengebundenen Moleküle nach deren Nachweis in einem SPR-Reader ("Biacore") eluiert und anschliessend auf einen regulären MALDI-Träger ("MALDI probe") aufgebracht [R. W. Nelson, J. W. Jarvik, B. E. Taillon und K. A. Tubbs, BIA/MS of epitope-tagged peptides directly from E. Colilysate : multiplex detection and proetin identification at low-femtomole to subfemtomole levels", Analytical Chemistry 71 (1999) 2858-2865 ; R. W. Nelson, D. Nedelkov, K. A. Tubbs, "Biosensor chip mass spectrometry : a chip-based proteomics approach", Electrophoresis 21 (2000) 1155-1163]. Dieser Ansatz zur Kopplung einer optischen, biospezifischen Nachweismethode mit einer massenspektrometrischen Messung erforderte also die Übertragung der (gebundenen) Analytmoleküle von einem ersten Träger (SPR-Chip, typischerweise Biacore-Chip) auf einen zweiten Träger. Ein zweiter, eleganterer Ansatz beruht auf der direkten Verwendung des SPR-Chips nach Vollendung der optischen (SPR-) Messung als Träger ("probe") im MALDI-Gerät.

Dazu wurde nach Abschluss der optischen Messung die MALDI-Matrix auf den SPR- Chip aufgetragen [R. W. Nelson, J. W. Jarvik, B. E. Taillon und K. A. Tubbs, "BIA/MS of epitope-tagged peptides directly from E. Colilysate : multiplex detection and proetin identification at low-femtomole to subfemtomole levels", Analytical Chemistry 71 (1999) 2858-2865]. Das Träger-Material (SPR-Chip-Oberfläche) war dabei Gold, d. h. ein optisch nicht transparentes Material (im Sinne der nachfolgenden Definition).

Unter"optischer Transparenz"des Materials beziehungsweise eines Trägersubstrats (für eine MALDI-Messanordnung) soll dabei verstanden werden, dass die Lauflänge eines in besagtem Material oder in besagtem Trägersubstrat oder im (hochbrechenden) wellenleitenden Film eines als optischer Wellenleiter ausgebildeten Trägersubstrats geführten Lichts in mindestens einem Teilbereich des sichtbaren Spektrums (zwischen 400 nm und 750 nm) grösser als 2 mm ist, sofern diese Lauflänge nicht durch Strukturen zur Änderung der Ausbreitungsrichtung besagten Lichts begrenzt wird. Beispielsweise kann die Lauflänge von optisch sichtbarem Licht, d. h. die Strecke auf dem Weg des Lichts im entsprechenden Material, bis zur Abnahme der Lichtintensität auf einen Wert 1/e der Urspungsintensität beim Eintritt des Lichts in dieses Material, in der Grössenordnung von etlichen Zentimetern (z. B. in Dünnschichtwellenleitern) bis zu Metern oder Kilometern (im Falle von Lichtleitern für die optische Signalübermittlung) liegen. Im Falle einer Gitter- Wellenleiter-Struktur, basierend auf einem Dünnschichtwellenleiter, kann die Ausbreitungslänge eines in der wellenleitenden Schicht geführten Lichts durch ein auskoppelndes diffraktives Gitter (ausgebildet in der wellenleitenden Schicht) auf wenige Mikrometer begrenzt werden. Diese Begrenzung der Lauflänge ist dann jedoch durch die Strukturierung, und nicht durch die Materialeigenschaften der Struktur, bedingt. Im Sinne der vorliegenden Erfindung soll eine solche Gitter- Wellenleiter-Struktur als"optisch transparent"bezeichnet werden. Demgegenüber ist die Ausbreitungslänge eines in einem dünnen Metallfilm (beispielsweise aus Gold oder Silber) aufgrund der hohen Absorption des betreffenden Metalls, also materialbedingt, auf Strecken in der Grössenordnung von höchstens 100 pm bis 200 m begrenzt. Entsprechend soll eine solche SPR-Struktur, basierend auf einem dünnen Metallfilm zur Erzeugung einer Oberflächenplasmonenresonanz, als"optisch nicht transparent"bezeichnet werden.

Ein bei der Wellenlänge des Lasers transparenter Probenträger wird in US-Patent 5,828, 063 beschrieben. Die Transparenz des Trägers wird gefordert, um den Laserstrahl zur Desorption der Analytmoleküle durch die Rückseite des Trägers, auf die Probenmatrix mit darauf aufgebrachten Analytmolekülen zu richten. In dem US- Patent 6, 111, 251 wird eine Anordnung beschrieben, in der das Anregungslicht zur Probendesorption durch eine optische Faser geleitet wird, welche auf der Rückseite eines transparenten Trägers angeordnet ist. Es wird jedoch in beiden Patenten keinerlei Bezug zu anderen analytischen Techniken, insbesondere also nicht zu optischen Nachweisverfahren, hergestellt.

In den US-Patenten Nr. 5,770, 860 und 6,287, 872 werden Probenträger mit den Grundabmessungen einer Mikrotiterplatte beschrieben, um Hochdurchsatzmessungen für Screening-Applikationen zu ermöglichen. Es werden jedoch keinerlei Angaben über das Trägermaterial und seine optischen Eigenschaften gemacht.

Für die massenspektrometrische Bestimmung von Nukleinsäuresequenzen werden in dem US-Patent Nr. 6,043, 031 u. a."Chips"als Probenträger beschrieben. Als"Chip"- Materialien werden Glasfaser-Filter, Glas-und Metalloberflächen (Stahl, Gold, Silber, Aluminium, Kupfer und Silicium) und Plastik (Polyethylen, Polypropylen, Polyamid, Polyvinyliden-Fluorid-Membranen oder Mikrotiterplatten) benannt. Wiederum wird jedoch kein Hinweis zu einer Kombination der massenspektrometrischen Nachweismethode mit optischen Nachweisverfahren gegeben.

Es wurde nun überraschend gefunden, dass es möglich ist, mit einem optisch transparenten Trägersubstrat sequentiell einen hochempfindlichen optischen Analytnachweis und nachfolgend, nach Aufbringung einer MALDI-Matrix, ein hochauflösendes Massenspektrum der oberflächengebundenen Analytmoleküle zu erhalten. Diese Kombination ermöglicht insbesondere sequentiell die optische und massenspektrometrische Analyse von Mikroarrays.

Es wurde ausserdem überraschend gefunden, dass ein optisch transparentes Trägersubstrat, dessen Oberfläche ein Metalloxid, vorzugsweise Ti02 oder TaxOs oder Nb205, umfasst, sehr gut geeignet ist für eine MALDI-Messanordnung.

Erster Gegenstand der Erfindung ist ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat sequentiell die Durchführung einer oder mehrerer optischer und einer oder mehrerer massenspektrometrischer Messungen ermöglicht. Das Trägersubstrat kann ein Material aus der Gruppe von Glas, Quarz, optisch transparenten Keramiken, Metalloxiden, optisch transparenten Kunststoffen, insbesondere transparenten thermoplastischen Kunststoffen, wie beispielsweise Polycarbonaten, Acrylaten, Polyacrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten und Polystyrolen, umfassen.

Dabei wird bevorzugt, dass besagte optisch transparente Kunststoffe form-, präg-, spritz-und/oder fräsbar sind.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein bei mindestens einer eingestrahlten Anregungswellenlänge optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche besagten Trägersubstrats ein Metalloxid oder ein Gemisch von Metalloxiden umfasst.

Es wird bevorzugt, dass das Material eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats für eine MALDI-Messanordnung ein Metalloxid aus der Gruppe umfasst, die von Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, und Zr02 gebildet wird, wobei Ti02, Ta205 und Nb205 besonders bevorzugt werden.

Um insbesondere makromolekulare Verbindungen in die Gasphase überführen zu können, um sie dann in einem Flugzeit-Massenspektrometer einer MALDI- Messanordnung nachweisen zu können, ist der Kontakt dieser nachzuweisenden Moleküle zu einer MALDI-Matrix erforderlich, deren (im allgemeinen) niedermolekularen Komponenten infolge eines eingestrahlten Laserpulses desorbiert werden, wobei damit in Kontakt stehende höhermolekular Komponenten mitgerissen und zugleich ionisiert werden. Daher wird bevorzugt, dass auf der Oberfläche eines erfindungsgemässen Trägersubstrats, direkt als erste Schicht oder auf weiteren auf der Trägersubstratoberfläche aufgebrachten Schichten, eine MALDI-Matrix, bestehend aus bei der Wellenlänge eines im Desorptionsschritt eingestrahlten Laserpulses stark absorbierenden Molekülen, aufgebracht ist. Vorzugsweise umfasst besagte MALDI- Matrix Verbindungen aus der Gruppe von Hydroxybenzoesäuren, wie beispielsweise Gallussäure, Gentisinsäure (2,5-Hydroxybenzoesäure) und 2- (4- Hydroxyphenylazo) benzoesäure, Bernsteinsäure, 3-Hydroxy-Picolinsäure, Kaffeesäure, Ferulasäure, 4-Nitroanilin, Anthranilsäure, Salicylamid, Isovanillin, Dithranol, 3-Aminochinolin, 1-Hydroxy-Isochinolin, Nikotinsäure, Sinapinsäure, trans-3-Indolacrylsäure, Zimtsäure und deren Derivaten, wie beispielsweise trans-3,5- Dimethoxy-4-hydroxy-Zimtsäure sowie a-Cyan-4-hydroxy-zimtsäure, Di-und Trihydroxy-acetophenone (z. B. 2,6-Dihydroxyacetophenon und 2,4, 6- Trihydroxyacetophenon) und Mischungen mit 5-Methoxy-salicylsäure, etc.

Vorteilhaft ist, wenn die MALDI-Matrix als eine selbstorganisierte Monoschicht ("self-assembled monolayer", SAM) ausgebildet ist.

Die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle können in die MALDI- Matrix eingebettet sein. Es ist auch möglich, dass die MALDI-Matrix nach Aufbringung der Analytmoleküle auf dem Trägersubstrat aufgebracht wird.

Zur Verbesserung der Haftung der Analytmoleküle auf dem Trägersubstrat kann es von Vorteil sein, wenn zur Immobilisierung der Analytmoleküle eine ebenfalls transparente Haftvermittlungsschicht auf besagtem Trägersubstrat aufgebracht ist, welche vorzugsweise eine Dicke von weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm hat. Dabei wird bevorzugt, dass eine solche Haftvermittlungsschicht Verbindungen aus der Gruppe von Silanen, funktionalisierten Silanen, Epoxiden, funktionalisierten, geladenen oder polaren Polymeren und "selbstorganisierten passiven oder funktionalisierten Mono-oder Mehrfachschichten", Alkylphosphaten und-phosphonaten und multifunktionellen Block-Copolymeren, wie beispielsweise Poly (L) lysin/Polyethylenglycolen, umfasst.

Vorteilhaft ist auch, wenn besagte Haftvermittlungsschicht Verbindungen umfasst aus der Gruppe von Organophosphorsäuren der allgemeinen Formel 1 (A) Y-B-OPO3 H2 (IA) oder von Organophosphonsäuren der allgemeinen Formel I (B) Y-B-P03 H2 (IB) und deren Salzen, in denen B einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl-, Aralkyl-, Hetaryl-oder Hetarylalkylrest und Y Wasserstoff oder eine funktionelle Gruppe aus der Reihe Hydroxy, Carboxy, Amino, gegebenfalls durch Niederalkyl substituiertes Mono-oder Dialkylamino, Thiol, oder eine negative Säuregruppe aus der Reihe Ester, Phosphat, Phosphonat, Sulfat, Sulfonat, Maleimid, Succinimydyl, Epoxy oder Acrylat bedeutet, wobei an B oder Y ein biologisches, biochemisches oder synthetisch herstellbares Erkennungselement durch Additions-oder Substitutionsreaktion angedockt sein kann, wobei auch Verbindungen angelagert sein können, die der Substratoberfläche eine Resistenz gegen Proteinadsorption. und/oder Zelladhäsion verleihen und in B in der Kette gegebenenfalls anstelle einer oder mehrerer-CH2- Gruppen eine oder mehrere Ethylenoxidgruppen enthalten sein können. Derartige Verbindungen und Verfahren zu deren Aufbringung auf Metalloxid-Oberflächen sind in der PCT/EP 01/10077 beschrieben, deren Inhalt ebenfalls vollumfänglich Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.

Eine wichtige Gruppe von wichtigen Ausführungsformen eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche des Trägersubstrats oder auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermittlungsschicht biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sind, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.

Es ist auch möglich, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle auf der auf dem Trägersubstrat befindlichen MALDI-Matrix aufgebracht sind. Ebenso können auf der auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente immobilisiert sein, zur Erkennung und Bindung eines oder mehrerer Analyten aus einer oder mehreren Proben, welche mit besagten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.

Vorteilhaft ist, wenn die MALDI-Matrix zugleich die Funktion einer Haftvermittlungsschicht hat oder wenn eine auf besagtem Trägersubstrat aufgebrachte Haftvermittlungsschicht die Funktion einer MALDI-Matrix hat.

Eine auf dem Trägersubstrat aufgebrachte Schicht kann auch als Mischung einer MALDI-Matrix und einer Haftvermittlungsschicht vorliegen. Dazu wird zunächst eine Mischung der eine MALDI-Matrix zu bildenden Moleküle und der eine Haftvermittlungsschicht zu bildenden Moleküle in flüssiger Lösung hergestellt. Diese Mischungslösung wird dann auf dem Trägersubstrat aufgetragen, auf welchem nach Verdampfen des Lösungsmittels die gemischte Schicht verbleibt.

Für eine Vielzahl von Anwendungen ist erwünscht, nicht nur einen einzelnen Analyten zu bestimmen oder eine einzelne Probe zu analysieren, sondern solche Analysen für eine Vielzahl von Proben und/oder Analyten gleichzeitig oder sequentiell auf einem gemeinsamen Probenträger durchzuführen. Daher ist eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix immobilisiert sind. Dabei können in einer 2- dimensionalen Anordnung bis zu 1 000 000 Messbereiche angeordnet sein. Ein einzelner Messbereich kann beispielsweise eine Fläche von 0.001-6 mm2 einnehmen. Es wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10 000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind.

Es ist auch möglich, eine Vielzahl unterschiedlicher Analyten innerhalb eines einzelnen, flächig (z. B. in der Grössenordnung von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern) mittels ortauflösender optischer und massenspektrometrischer Methoden nachzuweisen. Letzgenannte orstauflösende massenspektrometrische Nachweisverfahren sind auch als"Molecular Scanner"bekannt geworden. Dazu werden auf einer oder mehreren Flächen geeigneter Grösse (z. B. in der Grössenordnung von Quadratmillimetern bis Quadratzentimetern) auf einem erfindungsgemässen Trägersubstrat ein oder mehrere Proben mit den darin nachzuweisenden Analyten oder verschiedene chemische oder biologische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix aufgebracht. Die Ortsauflsöung des massenspektrometrischen Nachweises in einer MALDI-Messanordnung wird dabei im wesentlichen von der Grösse des Laserspots auf dem Trägersubstrat bestimmt und liegt daher typischerweise in der Grössenordnung von Quadratmikrometern.

Die Messbereiche können daher jeweils eine Vielzahl (d. h. zwei oder mehr) verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmende Arten von Analytmolekülen oder von (bio) chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen.

Eine spezielle Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf eine chemische Strukturierung durch lokale Abscheidung von Mono-oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und/oder Organophosphonaten (gemäss vorangehender Beschreibung) erzeugt ist. Dabei wird bevorzugt, dass die Oberfläche besagten Trägersubstrats ein definiertes Muster mit Siliziumoxid bzw.

Übergangsmetalloxiden aufweist. Für diese Ausführungsform ist es ausserdem von Vorteil, wenn auf den Siliziumoxidbereichen weitere Mono-oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und/oder Organophosphonaten durch Abscheidung aus organischen Lösungsmitteln aufgebracht sind.

Eine andere Variante eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dessen Oberfläche reine oder gemischte Oxide, Nitride oder Carbide von Metallen oder Halbleitern umfasst und darauf lokale hydrophobe oder hydrophile Bereiche durch lokale Abscheidung von Mono-oder Mehrfachschichten aus Organophosphaten und/oder Organophosphonaten erzeugt sind und deren umgebende Substratoberfläche mit einer endständig hydrophoben beziehungsweise hydrophilen Monoschicht abgedeckt ist.

Für die Aufbringung der verschiedenen genannten Schichten oder Teilbeschichtungen gibt es eine Vielzahl möglicher Verfahren. Ohne Einschränkung der Allgemeinheit wird bevorzugt, dass besagte MALDI-Matrix oder besagte Haftvermittlungsschicht oder besagte Mono-oder Mehrfachschichten und/oder besagte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente mittels eines Verfahrens aufgebracht sind, welches ausgewählt ist aus aus der Gruppe, welche Tauchen, Aufsprühen, Aufstreichen, Aufpinseln,"Ink jet spotting", mechanischem Spotting mittels Stift, Feder oder Kapillare, "micro contact printing", fluidischer Kontaktierung der Substratoberfläche mit parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen", photolithographischen Immobilisierungsmethoden etc. umfasst.

Die biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente können ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B.

PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono-oder polyklonalen Antikörpern, Antikörperfragmenten, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für Antikörper (z. B. Biotin <BR> <BR> für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten"und deren Komplexbildungspartnern, durch chemische Synthese erzeugten Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, etc. gebildet wird.

Ebenso können die massenspektrometrisch zu bestimmenden Analytmoleküle ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotiden) und Nukleinsäureanalogen (z. B. PNA) sowie deren Derivaten mit künstlichen Basen, mono-oder polyklonalen Antikörpern, Peptiden, Enzymen, Aptameren, synthetischen Peptidstrukturen, Glycopeptiden, Glycoproteinen, Oligosacchariden, Lektinen, löslichen, membrangebundenen und aus einer Membran isolierten Proteinen, wie beispielsweise Rezeptoren, deren Liganden, Antigenen für <BR> <BR> Antikörper (z. B. Biotin für Streptavidin), "Histidin-Tag-Komponenten"und deren Komplexbildungspartnern gebildet wird.

Ausserdem können sowohl biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente als auch massenspektrometrisch zu bestimmende Analytmoleküle jeweils ausgewählt sein aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern,"Polyether-Antibiotica", Pterocarpinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Terpenen (Mono-, Di-, und Triterpenen), Sesquiterpenen, Sesquiterpen-Dimeren, Sesquiterpen- Lactonen, Sesquiterpen-Chinonen, Sesterterpenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z.

B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon) gebildet wird.

Die genannten Erkennungselemente können in isolierter Form oder in einer künstlichen oder natürlichen komplexen Umgebung, zum Beispiel als Bestandteil von Zellen, Zellfragmenten, Gewebe ("Tissue Slices") Membranen etc. immobilisiert sein.

Insbesondere für die Kombination von massenspektrometrischen und optischen Nachweismethoden ist es von Vorteil, wenn Bereiche zwischen den räumlich getrennten Messbereichen zur Minimierung unspezifischer Bindung von Analyten oder deren Nachweissubstanzen"passiviert werden", d. h. dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen (d) gegenüber dem Analyten"chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, die von Albuminen, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifischen, polyklonalen oder monoklonalen, artfremden oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten unspezifischen Antikörpern (insbesondere für Immunoassays), Detergentien-wie beispielsweise aus der Tween-Reihe, insbesondere Tween 20-, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierender, fragmentierter natürlicher oder synthetischer DNA, wie beispielsweise ein Extrakt von Herings-oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladenen, aber hydrophilen Polymeren, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, gebildet werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrats ist dadurch gekennzeichnet, dass dieses einen optischen Wellenleiter umfasst, welcher im wesentlichen planar ist. Besonders bevorzugt wird dabei eine solche Ausführungsform eines optisch transparenten Trägersubstrats, welche einen optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst. Dabei kann die optisch transparente Schicht (b) ein Material aus der Gruppe umfassen, die von Silikaten, z. B. Glas oder Quarz, transparenten thermoplastischen oder spritzbaren Kunststoff, beispielsweise Polycarbonaten, Polyimiden, Acrylaten, insbesondere Polymethylmethacrylaten, oder Polystyrolen gebildet wird. Vorzugsweise ist der Brechungsindex der optisch transparenten Schicht (a) grösser als 1.8. Ausserdem wird bevorzugt, dass die optisch transparente Schicht (a)) ein Material aus der Gruppe von Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, oder Zr02, besonders bevorzugt jedoch aus Ti02 oder Ta205 oder Nb205 umfasst. Darüber hinaus wird bevorzugt, dass die Dicke der Schicht (a) 40 nm-1000 nm, bevorzugt 100 nm-300 nm, beträgt.

Es sind verschiedene Methoden zur Einkopplung eines Anregungslichts in einen planaren optischen Wellenleiter bekannt. Für optische Wellenleiter mit einer relativ dicken wellenleitenden Schicht, beispielsweise in der Grössenordnung von etlichen Mikrometern bis zu Millimetern, ist Stirnflächenkopplung mithilfe von vor einer Stirnfläche des Wellenleiters plazierten Linsen, insbesondere Zylinderlinsen, eine vielfach verwendete Methode. Insbesondere kann eine der Lichteinkopplung dienende Zylinderlinse auch selbst Teil einer Stirnfläche eines optischen Wellenleiters sein.

Eine solche Struktur kann beispielsweise durch Spritzguss eines transparenten Plastik (wie beispielsweise Polystyrol) erzeugt werden.

Eine weitere bekannte Methode ist die Lichteinkopplung mithilfe von auf dem Wellenleiter aufgebrachten Prismen. Beispielsweise können ebenfalls durch Spritzguss ein optischer Wellenleiter und ein darauf plaziertes Koppelprisma in einem einzigen Herstellungsschritt als eine einzige Komponente erzeugt werden. Weiter verbreitet ist es, dass ein Prisma, typischwerweise aus Glas oder aus einem transparenten Kunststoff, auf einen planaren Wellenleiter aufgesetzt wird. Zur Verminderung von Reflexionen an den Grenzschichten und insbesondere der Störung von Luftspalten zwischen Wellenleiter und Prisma wird dabei häufig eine brechnungsindexanpassende Flüssigkeit zwischen Prisma und Wellenleiter verwendet. Dabei ist es vorteilhaft, wenn der Unterschied der Brechungsindices von Flüssigkeit und wellenleitender Schicht möglichst gering ist.

Im Falle von Dünnschichtwellenleitern, insbesondere wenn die Dicke der wellenleitenden Schicht von gleicher Grössenordnung oder kleiner als die Wellenlänge des einzukoppelnden Lichts ist, ist die Lichteinkopplung mithilfe von mit der wellenleitenden Schicht verbundenen diffraktiven Koppelgittern besonders vorteilhaft.

Bevorzugt wird dabei ein erfindungsgemässes optisch transparentes Trägersubstrat, welches einen im wesentlichen planaren optischen Wellenleiter umfasst und dadurch gekennzeichnet, dass besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere optische Koppelemente aus der Gruppe von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen oder optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern umfasst. Dabei wird besonders bevorzugt, wenn besagtes Trägersubstrat ein oder mehrere Gitterstrukturen (c) als Koppelgitter umfasst, welche als Oberflächenreliefgitter in der optisch transparenten Schicht (a) moduliert sind.

Vorteilhafterweise sind solche Gitterstrukturen (c) mono-oder multidiffraktiv und haben eine Tiefe von 2 nm-100 nm, bevorzugt von 10 nm-30 nm, sowie eine Periode von 200 nm-1000 nm, bevorzugt von 300 nm-700 nm.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein gekoppeltes Nachweisverfahren zur qualitativen und/oder quantitativen Bestimmung und massenspektrometrischen Identifikation eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemässes optisch transparentes Trägersubstrat, nach einer der genannten Ausführungsformen, mit einer oder mehreren Proben mit darin enthaltenen, nachzuweisenden Analyten in Kontakt gebracht wird und sequentiell ein optischer und ein massenspektrometrischer Nachweis durchgeführt werden.

Kennzeichen eines solchen erfindungsgemässen optischen Nachweisverfahrens ist, dass als Teil des optischen Verfahrensschritts zum gleichzeitigen oder sequentiellen, qualitativen und/oder quantitativen Nachweis einer oder mehrerer Analyten in einer oder mehreren Proben besagte Proben und gegebenenfalls weitere Reagentien mit den auf einem Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, zur spezifischen Erkennung und Bindung besagter Analyten, in Kontakt gebracht werden und aus der Bindung dieser Analyten oder weiterer zum Analytnachweis eingesetzter Nachweissubstanzen resultierende Änderungen von optischen oder elektronischen Signalen gemessen werden.

Vielfach, beispielsweise zur Vermeidung vieler sequentieller Inkubationsschritte, ist es von Vorteil, wenn die eine oder mehreren Proben mit einer Mischung aus den verschiedenen Nachweisreagentien zur Bestimmung der in besagten Proben nachzuweisenden Analyten vorinkubiert werden und diese Mischungen dann jeweils in einem einzigen Zugabeschritt mit den immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden.

Eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung des effektiven Brechungsindex an der die immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente tragenden Oberfläche des Trägersubstrats, aufgrund molekularer Adsorption oder Desorption, beruht. Dabei ist eine spezielle Ausführungsform des gekoppelten Nachweisverfahrens dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der Phasendifferenz zwischen einem Lichtanteil eines eingestrahlten Nachweislichts, welcher mit den Bereichen der immobilisierten Erkennungselemente wechselwirkt, und einem Referenzanteil beruht. Eine solche spezielle Ausführungsform kann so durchgeführt werden, dass das eingestrahlte Nachweislicht polychromatisch ist und der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der spektralen Verteilung von Interferenzmaxima und-minima, unter einem vorgegebenen Beobachtungswinkel, beruht. Das Verfahren kann auch so durchgeführt werden, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung der räumlichen Verteilung von Interferenzmaxima und-minima beruht.

Für andere Varianten der bevorzugten speziellen Ausführungsform des gekoppelten Nachweisverfahrens ist das eingestrahlte Nachweislicht monochromatisch.

Andere bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens sind dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Bestimmung der Änderung einer oder mehrerer Lumineszenzen beruht.

Es ist möglich, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Auflichtanregungsanordnung eingestrahlt wird. Eine andere mögliche Konfiguration besteht darin, dass, für den optischen Nachweis des einen oder mehrerer Analyten, das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in einer Transmissionslichtanregungsanordnung eingestrahlt wird.

Eine besonders bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen oder biochemischen Erkennungselemente, zur spezifischen Erkennung und Bindung einer oder mehrerer Analyten, auf einem vorzugsweise planaren optischen Wellenleiter als Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten Erkennungselementen, immobilisiert sind, dass die eine oder mehrere Proben mit dem einen oder den mehreren darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit besagten immobilisierten Erkennungselementen in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter eingekoppelt wird mithilfe eines oder mehrerer optischer Koppelelemente aus der Gruppe, die von stirnflächengekoppelten Zylinderlinsen, optischen Fasern als Lichtleitern, Koppelprismen und optischen Koppelgittern gebildet wird.

Eine mögliche Variante zeichnte sich dadurch aus, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten im Nahfeld (evaneszenten Feld) eines optischen Schichtwellenleiters als Trägersubstrat, mit einer bei mindestens einer Anregungswellenlänge transparenten Schicht (a) auf einer bei mindestens dieser Anregungswellenlänge ebenfalls transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), und über einer in der Schicht (a) dess optischen Schichtwellenleiters ausgeprägten Gitterstruktur (c) oder (c') anhand der aus der Bindung des Analyten und/oder weiterer Nachweisreagentien, an deren immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, resultierenden Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) eines als Schichtwellenleiter ausgebildeten Trägers oder zur Auskopplung von in der Schicht (a) geführten Lichts erfolgt.

Kennzeichen einer Untervariante ist dabei, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung des Einkoppelwinkels eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen monochromatischen Nachweislichts in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und/oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht. Unter"im wesentlichen monochromatisch" wird dabei verstanden, dass die spektrale Bandbreite eines auf die Gitterstruktur (c) eingestrahlten Anregungslichts maximal 20 nm, bevorzugt maximal 5 nm, besonders bevorzugt maximal 1 nm beträgt.

Die Erfüllung der Resonanzbedingung zur Einkopplung eines Anregunsglichts bei einer konstanten Anregungswellenlänge im Falle der Übereinstimmung des Einstrahlwinkels mit dem Resonanzwinkel zur Einkopplung ist äquivalent mit der Übereinstimmung der eingestrahlten Wellenlänge, bei konstantem Einstrahlwinkel, mit der Resonanzwellenlänge. Eine andere Untervariante ist daher dadurch gekennzeichnet, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf der Änderung der Resonanzwellenlänge zur Einkopplung eines auf eine in der Schicht (a) ausgeprägten Gitterstruktur (c) eingestrahlten, im wesentlichen parallelen Nachweislichtbündels in die Schicht (a), aufgrund der Bindung des Analyten und/ oder weiterer Nachweisreagentien, an deren im Bereich dieser Gitterstruktur immobilisierte biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente, beruht. Unter"im wesentlichen parallel"wird dabei verstanden, dass der Konvergenz-oder Divergenzwinkel (Öffnungswinkel) eines auf die Gitterstruktur (c) eingestrahlten Anregungslichts maximal 5°, bevorzugt maximal 1°, besonders bevorzugt maximal 0. 2° beträgt.

Gegenstand der Erfindung ist auch ein gekoppeltes Nachweisverfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der optische Nachweis des einen oder mehrerer Analyten auf einer ortsaufgelösten Bestimmung von Änderungen der Resonanzbedingungen zur Einkopplung eines Anregungslichts in die Schicht (a) oder Auskopplung eines in der Schicht (a) eines Schichtwellenleiters als Trägersubstrat geführten Lichts beruht, mit einem zweidimensionalen Array aus mindestens vier oder mehr, räumlich getrennten Messbereichen auf diesem Schichtwellenleiter als Trägersubstrat, mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), - mit einer oder mehrereren Gitterstrukturen (c) zur Einkopplung von Anregungslicht zu den Messbereichen oder Auskopplung von in der Schicht (a) geführtem Licht im Bereich des Messbereiche - mit mindestens zwei oder mehr räumlich getrennten Messbereichen auf der einen oder den mehreren Gitterstrukturen (c), wobei in diesen Messbereichen gleichen oder unterschiedliche biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselementen zum qualitativen und/oder quantitativen Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einer mit den Messbereichen in Kontakt gebrachten Probe immobilisiert sind, wobei die Dichte der Messbereiche auf einer gemeinsamen Gitterstruktrur (c) mindestens 10 Messbereiche pro Quadratzentimeter beträgt und wobei besagtes Anregungslicht gleichzeitig auf besagtes Array von Messbereichen eingestrahlt wird und der Grad der Erfüllung der Resonanzbedingung für die Lichteinkopplung in die Schicht (a) zu besagten Messbereichen gleichzeitig gemessen wird und ein Übersprechen von in der Schicht (a) geführtem Anregungslicht von einem Messbereich zu einem oder mehreren benachbarten Messbereichen durch Wiederauskopplung dieses Anregungslichts mittels der Gitterstruktur (c) verhindert wird.

Ein weiterer bevorzugter Gegenstand der Erfindung ist ein gekoppeltes Nachweisverfahren, wobei als Trägersubstrat ein optischer Wellenleiter als Schichtwellenleiter ausgebildet ist mit einer ersten optisch transparenten Schicht (a) auf einer zweiten optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a), wobei weiterhin Anregungslicht mithilfe einer oder mehrerer Gitterstrukturen (c) oder (c'), welche in der optisch transparenten Schicht (a) ausgeprägt sind, in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelt und zu darauf befindlichen Messbereichen (d) als geführte Welle geleitet wird, und wobei weiterhin die im evaneszenten Feld besagter geführter Welle erzeugte Lumineszenz von lumineszenzfähigen Molekülen mit einem oder mehreren Detektoren erfasst und die relative Menge oder Konzentration eines oder mehrerer Analyten aus der Intensität dieser Lumineszenzsignale bestimmt wird.

Eine solche Ausführungsform des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens eignet sich insbesondere für einen hochempfindlichen optischen Nachweis von einem oder mehreren Analyten in einer oder mehreren Proben, indem besagte Proben mit den darin nachzuweisenden Analyten und gegebenenfalls weitere Nachweisreagentien sequentiell oder nach Mischung mit besagten Proben in einem einzigen Schritt mit auf einem planaren optischen Wellenleiter als Trägersubstrat (direkt oder vermittelt über eine oder mehrere Schichten) immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente, zur spezifischen Erkennung und Bindung besagter Analyten, in Kontakt gebracht werden und dass das Anregungslicht von einer oder mehreren Lichtquellen in den optischen Wellenleiter (d. h. die wellenleitende Schicht (a)) eingekoppelt wird mithilfe eines oder mehrerer optischer Koppelelemente (vorzugsweise mithilfe einer in der Schicht (a) ausgebildeten Gitterstruktur (c)).

Bei der Bestimmung der im evaneszenten Feld der wellenleitenden Schicht (a) angeregten Lumineszenz können (1) die isotrop abgestrahlte Lumineszenz oder (2) in die optisch transparente Schicht (a) eingekoppelte und über eine Gitterstruktur (c) oder (c') ausgekoppelte Lumineszenz oder Lumineszenzen beider Anteile (1) und (2) gleichzeitig gemessen werden.

Zur gleichzeitigen Bestimmung einer Vielzahl von Analyten und/oder gleichzeitigen Untersuchung einer Vielzahl von Proben wird bevorzugt, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI- Matrix immobilisiert sind und dass das von den diskreten Messbereichen ausgehende Licht mit einem oder mehreren Detektoren in einem bildgebenden Verfahren gemessen und aufgezeichnet wird. Dabei können in unterschiedlichen diskreten Messbereichen verschiedene oder gleiche Analyten bzw. Erkennungselemente zum Nachweis verschiedener bzw. gleicher Analyten aufgebracht sein. In einem einzelnen Messbereich können auch mehrere verschiedene Analyten bzw. Erkennungselemente zum Nachweis verschiedener Analyten aufgebracht sein. Ein aufgebrachtes biologisches oder biochemisches oder synthetisch herstellbares Erkennungselement dient typischerweise dem spezifischen Nachweis eines einzelnen Analyten. Ein immobilisiertes Erkennungselement kann aber auch so ausgebildet sein, dass es dem Nachweis mehrerer, d. h. von zwei oder mehr, unterschiedlichen Analyten infolge von deren Bindung an verschiedene diskrete Erkennungsregionen des Erkennungselements dient. Im Falle von (einzelsträngigen) Nukleinsäuren als immobilisierten Erkennungselementen können beispielsweise diskrete Abschnitte mit unterschiedlichen Basensequenzen der Bindung von verschiedenen in einer Probe nachzuweisenden (einzelsträngigen) Nukleinsäuren mit zu den diskreten Abschnitten komplementären Sequenzen dienen.

Typischerweise werden die in einem erfindungsgemässen (bildgebenden) gekoppelten Nachweisverfahren aufgezeichneten Daten in einer zweidimensionalen Datenmatrix auf einem Datenträger gespeichert.

Es wird bevorzugt, dass für Ausführungsformen des erfindungsgemässen gekoppelten Nachweisverfahrens mit einem optischen Analytnachweis durch die Änderung von ein oder mehreren Lumineszenzen infolge von dessen Erkennung und Bindung zur Erzeugung besagter Lumineszenz ein Lumineszenzfarbstoff oder lumineszentes Nanopartikel als Lumineszenzlabel verwendet wird, das bei einer Wellenlänge zwischen 300 nm und 1100 nm angeregt werden kann und emittiert. Dabei kann das Lumineszenzlabel an den Analyten oder in einem kompetitiven Assay an einen Analogen des Analyten oder in einem mehrstufigen Assay an einen der Bindungspartner der immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen oder an die biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente gebunden sein.

Eine spezielle Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass ein zweites oder noch weitere Lumineszenzlabel mit gleicher oder unterschiedlicher Anregungswellenlänge wie das erste Lumineszenzlabel und gleicher oder unterschiedlicher Emissionswellenlänge verwendet werden.

Dabei wird bevorzugt, dass das zweite oder noch weitere Lumineszenzlabel bei der gleichen Wellenlänge wie der erste Lumineszenzfarbstoff angeregt werden können, aber bei anderen Wellenlängen emittieren.

Für andere Anwendungen ist es von Vorteil, wenn die Anregungsspektren und Emissionsspektren der eingesetzten Lumineszenzlabel nur wenig oder gar nicht überlappen.

Eine Variante des Verfahrens besteht darin, dass zum Nachweis des Analyten Ladungs-oder optischer Energietransfer von einem als Donor dienenden ersten Lumineszenzlabel zu einem als Akzeptor dienenden zweiten Lumineszenzlabel verwendet wird.

Es ist auch möglich, dass das Ausmass der Löschung ("Quenching") einer oder mehrerer Lumineszenzen bestimmt wird.

Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass neben der Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen Änderungen des effektiven Brechungsindex auf den Messbereichen bestimmt werden.

Eine Weiterentwicklung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen und/oder Bestimmungen von Lichtsignalen bei der Anregungswellenlänge polarisationsselektiv vorgenommen werden.

Es wird bevorzugt, dass die einen oder mehreren Lumineszenzen bei einer anderen Polarisation als der des Anregungslichts gemessen werden.

Ein erfindungsgemässes gekoppeltes Nachweisverfahren nach einer der genannten Ausführungsformen kann eingesetzt werden zur gleichzeitigen oder sequentiellen, quantitativen oder qualitativen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen ("Tag-Proteinen", wie beispielsweise "Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA-oder RNA- Strängen, DNA-oder RNA-Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.

Das Verfahren kann auch eingesetzt werden zur Bestimmung von Stoffen aus der Gruppe von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B.

Zucker-, Stärke-und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern,"Polyether-Antibiotica", Pterocarpinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Terpenen (Mono-, Di-, und Triterpenen), Sesquiterpenen, Sesquiterpen-Dimeren, Sesquiterpen- Lactonen, Sesquiterpen-Chinonen, Sesterterpenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z.

B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon).

Die zu untersuchenden Proben können wässrige Lösungen, insbsondere Pufferlösungen oder natürlich vorkommende Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Lymphe oder Urin oder Gewebeflüssigkeiten oder auch beispielsweise Eigelb sein. Bei einer zu untersuchenden Probe kann es sich auch um eine optisch trübe Flüssigkeit, Oberflächenwasser, einen Boden-oder Pflanzenextrakt oder eine Bio- oder Syntheseprozessbrühe handeln. Die Proben können auch aus biologischen Gewebeteilen oder Zellkulturen präpariert sein.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten, dadurch gekennzeichnet, dass in einer MALDI-Messanordnung ein erfindungsgemässes Trägersubstrat nach einer der genannten Ausführungsformen verwendet wird, wobei das Trägersubstrat eine Metalloxidoberfläche, vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, und Zr02, umfasst.

Bevorzugt wird das erfindungsgemässe massenspektrometrische Bestimmungsverfahren so ausgeführt, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI- Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desorptionsschritt, minimiert werden können. Hierfür ist es von besonderem Vorteil, wenn das Metalloxid der Trägersubstratoberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, und Zr02.

Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist auch ein gekoppeltes Nachweisverfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass für den Teil des massenspektrometrischen Nachweises eines oder mehrerer Analyten in einer MALDI-Messanordnung ein erfindungsgemässes Trägersubstrat nach einer der genannten Ausführungsformen verwendet wird. Dabei werden auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten MALDI-Matrix immobilisierte Analytmoleküle oder im Rahmen des Teils des optischen Nachweis an biologische oder biochemische oder synthetisch herstellbare Erkennungselemente gebundene Analytmoleküle nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert.

Kennzeichen einer bevorzugten Ausführungsform ist dabei, dass nach Abschluss des optischen Nachweisschrittes auf das Trägersubstrat mit direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermitllungsschicht immobilisierten Analytmolekülen oder mit an direkt auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer auf dem Trägersubstrat aufgebrachten Haftvermittlungsschicht immobilisierten biologischen oder biochemischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen gebundenen Analytmolekülen eine MALDI-Matrix aufgebracht wird und die immobilisierten oder gebundenen Analytmoleküle massenspektrometrisch in einer MALDI-Messanordnung analysiert werden.

Vorzugsweise wird das Verfahren so ausgeführt, dass die Signale von Ionen mit niedrigem Masse-zu-Ladungs-Quotienten, insbesondere von der MALDI-Matrix, mittels zeitverzögerten Anlegens der Beschleunigungsspannung im Flugzeitrohr der MALDI-Messanordnung, nach dem laserinduzierten Desorptionsschritt, minimiert werden können. Hierfür ist es wiederum von Vorteil, wenn das Metalloxid der Trägersubstratoberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Ti02, ZnO, Nb205, Ta205, Hf02, und ZrO2.

Es ist auch möglich, dass die Analytmoleküle oder die chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselemente, mit gegebenenfalls daran gebundenen Analytmolekülen, in diskreten Messbereichen (Spots) auf besagtem Trägersubstrat oder auf einer darauf aufgebrachten Haftvermittlungsschicht oder auf der MALDI-Matrix immobilisiert sind und dass die diskreten Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.

Es ist auch wiederum möglich, dass Messbereiche eine Vielzahl verschiedener massenspektrometrisch zu bestimmender Arten von Analytmolekülen oder von (bio) chemischen oder biologischen oder synthetisch herstellbaren Erkennungselementen umfassen, welche mit Ortsauflösung innerhalb besagter Messbereiche in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.

Es wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung bis zu 1 000 000 Messbereiche angeordnet sind und ein einzelner Messbereich eine Fläche von 0.001- 6 mm2 einnimmt, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI- Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.

Ausserdem wird bevorzugt, dass in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 100, bevorzugt mehr als 1000, besonders bevorzugt mehr als 10 000 Messbereiche pro Quadratzentimeter angeordnet sind, und dass besagte Messbereiche sequentiell in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrerer Analyten aus der Gruppe von Proteinen, wie beispielsweise Antikörpern oder Antikörperfragmenten, Antigenen, Rezeptoren und deren Liganden, Chelatoren, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierten Proteinen ("Tag-Proteinen", wie beispielsweise"Histidin-Tag-Proteinen") und deren Komplexbildungspartnern, natürlichen oder veränderten Nukleinsäuren, wie beispielsweise Oligonukleotiden, DNA-oder RNA-Strängen, DNA-oder RNA- Analoga, Enzymen, Enzymcofaktoren oder Inhibitoren, Lektinen. Kohlehydraten sowie primären oder sekundären Metabolyten biologischer Prozesse.

Das Verfahren kann auch eingesetzt werden zur massenspektrometrischen Bestimmung eines oder mehrere Analyten aus der Gruppe, die von Acetylenen, Alkaloiden (beispielsweise Alkaloide mit Pyridinen, Pyperidinen, Tropanen, Chinolinen, Isochinolinen, Tropilidenen, Imidazolen, Indolen, Purinen, Fenantridinen enthaltenden Ringstrukturen), Alkaloidglycosiden, Aminen, Benzofuranen, Benzophenonen, Naphthochinonen, Betainen, Kohlenhydraten (z. B. Zucker-, Stärke- und Cellulosederivaten), Carbolinen, Cardenoliden, Catecholen, Chalkonen, Cumarinen, zyklischen Peptiden und Polypeptiden, Depsipeptiden, Diketopiperazinen, Diphenylethern, Flavenen, Flavonen, Isoflavanonen, Flavonoid- Alkaloiden, Furanochinolin-Alkaloiden, Gallocatechinen, Glycosiden, Antrachinonen, Flavonoiden, Lactonen, Phenolen, Hydrochinonen, Indolen, Indolochinonen, Alginsäuren, Lipiden (zum Beispiel Ölen, Wachsen und anderen Fettsäurederivaten), Macroliden, Oligopeptiden, Oligostilbenen, Peroxiden, Phenylglycosiden, Phloroglucinen, Polyethern,"Polyether-Antibiotica", Pterocarpinen, Pyranocumarinen, Pyrrolen, Quassinen, Chinolinen, Saframycinen, Terpenen (Mono-, Di-, und Triterpenen), Sesquiterpenen, Sesquiterpen-Dimeren, Sesquiterpen- Lactonen, Sesquiterpen-Chinonen, Sesterterpenen, Staurosporinen, Steroiden (wie beispielsweise Steroid-Hormonen, Sterolen, Gallensäuren), Sulfolipiden, Tanninen (z.

B. Catechol und Pyrogallol), Vitaminen, ätherischen Ölen und Xanthonen (z. B. 9- Oxoxanthenon) gebildet wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines optisch transparenten Trägersubstrats und/oder eines Verfahrens nach einer der genannten Ausführungsformen zu quantitativen oder qualitativen Analysen zur Bestimmung oder Anreicherung oder Identifikation chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung (insbesondere Hochdurchsatz-Screening,"High Trough-Put Screening HTS"), der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbindungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA-und RNA- Analytik, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Gen-oder Protein-Expressionsprofilen sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktentwicklung und-forschung, der Human-und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktentwicklung und-forschung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, in der Lebensmittel-und Umweltanalytik.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Ausführungsbeispielen erläutert.

Beispiele 1. Optisch transparentes Trägersubstrat, mit einer Metalloxidoberfläche, für eine MALDI-Messanordnung und damit ausgeführtes Nachweisverfahren Als optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung dient ein Plättchen aus AF45-Glas, mit den äusseren Abmessungen 57 mm Breite x 14 mm Länge x 0.7 mm Dicke mit einer darauf aufgebrachten, 150 nm dünnen Schicht aus Tantalpentoxid. a) Eine Lösung des Peptids Melittin (Molekulargewicht 2846.5 Da) wird mit Sinapinsäure (MALDI-Matrix) gemischt. Ein Tropfen der Mischung (ca. 1 pl) wird auf dem unstrukturierten Teil der Tantalpentoxidoberfläche des erfindungsgemässen Trägersubstrats aufgetragen. Zu Vergleichszwecken wird auf einer anderen Stelle der Tantalpentoxidoberfläche ein Tropfen der reinen Sinapinsäure aufgebracht. Nach Eintrocknen der Tropfen zu"Spots"von jeweils ca. 1 mm Durchmesser werden Massenspektren aus den Bereichen der beiden Spots aufgenommen.

Während sich für das Massenspektrum des Sinapinsäure-Spots erwartungsgemäss nennenswerte Signale nur bei sehr niedrigen Molekulargewichten bzw.

(Mass/Ladung, m/z-Werten), im Bereich von etwa 200 Da-300 Da, ergeben, zeigt sich überraschend im Massenspektrum des zweiten Spots, aus der Mischung von Melittin mit Sinapinsäure, ein deutliches Signal bei etwa 2870 Da (Figur 1). Für die in diesem wie in den nachfolgenden Beispielen aufgeführten (m/z) -Werte ist zu berücksichtigen, dass stets die Kalibration der MALDI-Messanordnung für Goldoberflächen als Oberfläche eines"regulären"MALDI-Substratträgers verwendet wurde. Aufgrund anderer Feldverteilungen über den erfindungsgemässen optischen Trägersubstraten ergeben sich demzufolge veränderte (m/z) -Werte, so dass für eine absolute Massenbestimmung eine neue Kalibration erforderlich wäre.

Als ein nächster Abschnitt dieses Experiments wird schrittweise eine wachsende Zeitverzögerung ("delay time") zwischen dem laserinduzierten Desorptionsschritt und dem Anlegen der Beschleunigungsspannung des MALDI-Flugzeitrohres durchgeführt. Überraschenderweise verschwinden bei einer Zeitverzögerung von 800 nsec die Signale der Probenmatrix, im Bereich kleinerer gemessener Molekulargewichte, vollständig (Figur 2). Zugleich wird unter diesen Bedingungen eine verbesserte Auflösung der Spektren, d. h. eine verringerte Peakbreite und eine erhöhte Signalintensität und damit ein verbessertes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis beobachtet. Die Intensität der eingestrahlten Laserpulse zur laserinduzierten Desorption konnte unter diesen Bedingungen auch verringert werden. b) Das Experiment a) wird zu Vergleichszwecken wiederholt auf einer Glasoberfläche (AF 45, Rückseite des unter a) beschriebenen, optisch transparenten Substrats) sowie auf einem Substrat mit einer Goldoberfläche, wie es klassisch als MALDI- Substratträger Verwendung findet. Er ergeben sich Massenspektren von vergleichbarer, aber nicht besserer Qualität wie unter a) beschrieben (Figur 3). Die Signale der Probenmatrix können im Falle dieser Oberflächen jedoch durch zeitverzögertes Anlegen der Beschleunigungsspannung nicht vollständig zum Verschwinden gebracht werden. c) Ein Tropfen Melittin-Lösung wird auf die Tantalpentoxidoberfläche aufgebracht. Nach Eintrocknen zu einem Spot wird dieser massenspektrometrisch in der MALDI-Messanordnung untersucht. -Proteinsignale können nicht festgestellt werden.

Nach Herausnahme des Trägers aus der MALDI-Messanordnung wird auf denselben Spot ein Tropfen Sinapinsäure aufgebracht. Nach Eintrocknen dieses Tropfens wird der Spot erneut massenspektrometrisch analysiert. -Es ergibt sich ein Massenspektrum mit einem deutlichen Protein-Signal, mit ähnlicher Qualität wie unter a) beschrieben. d) Es wird ein gleichartiges Trägersubstrat, wie zu Beginn von Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Auf der Tantalpentoxidoberfläche werden zehn diskrete Messbereiche (Spots) mittels Auftragens von je 1 ul einer Antikörperlösung (120 pg/ml anti-Interleukin 4 Antikörper in 1 : 10 verdünntem Phosphatsalzpuffer ("1/10 PBS") erzeugt. Zusätzlich werden 2 Referenzsspots, ohne biochemische Erkennungselemente für einen Analyten, durch Auftragen von je 1 ul BSA-Lösung in Puffer (zur Passivierung unspezifischer, freier Bindungsstellen auf der Oberfläche mit für den Analyten nichtbindendem Rinderserumalbumin (BSA), 1/10 PBS mit 3 % BSA) erzeugt. Das Trägersubstrat wird eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit den aufgebrachten Tröpfchen in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert, anschliessend mit 1/10 PBS-Puffer gespült und dann nochmals eine Stunde lang mit Passivierungspuffer inkubiert.

Im nachfolgenden Assay, als Beispiel für den Nachweis eines Analyten in einer Probe, werden 120 Ill Probenlösung mit Human-Interleukin 4 (h-IL 4, 1 pg/ml) in Assay-Puffer (PBS/10) mit der gesamten Trägersubstratoberfläche in Kontakt gebracht und eine Stunde lang inkubiert. Danach wird die Trägersubstratoberfläche dreimal mit je 1 mL Assay-Puffer und anschliessend extensiv mit Wasser gespült.

Nach Abschluss des Analytbindungsschrittes und der nachfolgenden Spülschritte wird auf den Substratträger MALDI-Matrix (Sinapinsäure (3,5-Dimethoxy-4- Hydroxyzimtsäure) in 50 % AcCN/0. 1 % TFA (Acetonitril/Tri-Fluor-Essigsäure) aufgetragen.

Sowohl die für den Analytnachweis als auch die als Referenz vorgesehenen Spots werden dann massenspektrometrisch mit einer MALDI-Messanordnung analysiert.

Es werden folgende Ergebnisse festgestellt : - In den Massenspektren aus dem Bereich der Referenzspots sind deutlich für BSA charakteristische Signale (bei m/z-Werten von etwa 22.5, 34,45, 67.5 kDa für einfach und mehrfach geladene BSA-Moleküle und deren Dimere) sowie ein unbekanntes, in BSA-Proben aber häufig detektiertes Signal bei einem m/z-Wert von 13. -14 kDa zu erkennen (Figur 4 und Ausschnittsvergrösserung für den<BR> (m/z) -Bereich von 10000 bis 20000 in Figur 5).

In den Massenspektren aus dem Bereich der für den Analytnachweis vorgesehenen Spots sind zusätzlich zu einem unbekannten Signal bei einem (m/z) -Wert von 13 kDa deutliche Signale bei einem (m/z) -Wert von 15 kDa (entsprechend dem Molekulargewicht von h-IL 4) zu erkennen, was die selektive Erkennung und Bindung des Analyten in den vorgesehenen Messbereichen (Spots) auf dem Trägersubstrat demonstriert (Figur 6). e) Zur Untersuchung der Einheitlichkeit der Signalhöhen und der gemessenen m/z-Werte für einen bestimmten Analyten wird eine 1 : 1-Mischung von Ubiquitin (Molekulargewicht 8565.8 Da) (0.5 mg/ml) in Wasser und der MALDI-Matrixlösung in 9 über die Oberfläche des Trägersubstrats verteilten Spots aufgebracht.

Anschliessend werden diese Spots wiederum massenspektrometrisch analysiert.

Hinsichtlich der Signalhöhen (bezogen auf den Quotienten aus der absoluten Signalhöhe und des Signalrauschens) und des m/z-Quotienten ergibt sich eine statistische Verteilung über die Oberfläche des erfindungsgemässen Trägersubstrats.

Dieses deutet auf eine relativ homogene Verteilung des Beschleunigungsfeldes über einem erfindungsgemässen Trägersubstrat in einer MALDI-Messanordnung hin.

Mit den Experimenten zu Beispiel 1. konnte gezeigt werden : - Optisch transparente Trägersubstrate aus Glas und insbesondere aus einem Metalloxid, bevorzugt aus Tantalpentoxid, sind ähnlich gut geeignet für MALDI- Messanordnungen wie bekanntermassen metallische Trägersubstrate, beispielsweise aus Gold.

- Im Falle von erfindungsgemässen Trägersubstraten mit einer Metalloxidoberfläche, vorzugsweise aus Tantalpentoxid, können die Signale der Probenmatrix vollständig durch ein zeitverzögertes Anlegen der Beschleunigungsspannung unterdrückt werden und damit die Spektrenqualität deutlich gesteigert werden. Zugleich wird unter diesen Bedingungen eine verbesserte Auflösung der Spektren, d. h. eine verringerte Peakbreite und ein verbessertes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, beobachtet. Die Intensität der eingestrahlten Laserpulse zur laserinduzierten Desorption kann unter diesen Bedingungen verringert werden.

Die Bedingungen der MALDI-Messanordnung können für einen erfindungsgemässes Trägersubstrat so eingestellt werden, dass selektiv die in einem Bioaffinitätsassay gebundenen Analyten beim Desorptionsschritt freigesetzt und massenspektrometrisch identifiziert werden können, während ihre als spezifische Bindungspartner immobilisierten Erkennungselemente auf dem Trägersubstrat verbleiben.

Beispiel 2 : Optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI- Messanordnung, welches sequentiell die Durchführung einer optischen und einer massenspektrometrischen Messung ermöglicht, und damit durchgeführtes gekoppeltes Nachweisverfahren Als optisch transparentes Trägersubstrat für eine MALDI-Messanordnung dient ein Plättchen aus AF45-Glas, mit den äusseren Abmessungen 57 mm Breite x 14 mm Länge x 0.7 mm Dicke mit einer darauf aufgebrachten, 150 nm dünnen Schicht aus Tantalpentoxid.

In dem Glasplättchen sind im Abstand von 9 mm zwei Oberflächenreliefgitter mit einer Gitterperiode von 318 nm (mit Orientierung der Gitterlinien parallel zu der Breite des Plätchens) und einer Gittertiefe von (12 +/-3) nm strukturiert, welche sich beim Prozess der Beschichtung mit dem Tantalpentoxidfilm etwa im Masstab 1 : 1 auf dessen Oberfläche übertragen haben. Die Länge dieser Gitterstrukturen (parallel zu der Länge des Plättchens) beträgt jeweils 0.5 mm.

In dem durchzuführenden gekoppelten Nachweisverfahren soll beispielhaft sequentiell in einem fluoreszenzbasierenden, optischen Nachweisverfahren und in einem nachfolgenden massenspektrometrischen Nachweisverfahren die Bindung von Human-Interleukin 4 (h-IL 4, R&D Systems, ...) als Analyt quantifiziert und identifiziert werden.

Die Vorbereitung des Trägersubstrats, einschliesslich der Immobilisierung der Erkennungselemente, erfolgt wie unter Beispiel ld) geschildert. Für den optischen Analytnachweis wird die Probenlösung mit nachzuweisenden h-IL 4 mit einem biotinylierten, sekundären anti-h-IL 4 Antikörper und Cy5-markiertem Streptavidin (zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals) vorinkubiert (60 Minuten). Dann wird die so erzeugte Lösungsmischung in einem einzigen Schritt auf das Trägersubstrat mit den immobilisierten primären anti-h-IL 4-Antikörpern aufgebracht. Anschliessend wird das Trägersubstrat in eine optische Messanordnung, zur Anregung und Detektion von Fluoreszenz in einem planaren optischen Wellenleiter, eingesetzt. Eine geeignete optische Messanordnung ist beispielsweise in der Anmeldung PCT/EP 01/10012 beschrieben, deren Inhalt als vollständiger Bestandteil der vorliegenden Anmeldung angesehen wird. Mögliche Ausführungsformen und die einzelnen Schritte des optischen Nachweisverfahrens sind beispielsweise in der Anmeldung PCT/EP 01/05995 beschrieben, deren Inhalt ebenfalls als vollständiger Bestandteil der vorliegenden Anmeldung angesehen wird.

Wie in der genannten internationalen Anmeldung beschrieben, wird das Anregungslicht eines Lasers (beispielsweise bei 635 nm) mithilfe des ersten in dem erfindungsgemässen Trägersubstrat als Reliefgitter strukturierten Koppelgitter in die hochbrechende, wellenleitende Tantalpentoxidschicht eingekoppelt und dort geleitet, bis es am zweiten Gitterstreifen wieder ausgekoppelt wird. Auf den Messbereichen (Spots) gebundene fluoreszenzfähige Moleküle werden längs der Strecke der Lichtleitung des geführten Lichts im evaneszenten Feld (an der Oberfläche des <BR> <BR> Tantalpentoxidfilms) zur Fluoreszenz angeregt. -Der mehr oder minder isotrop in den Raum (in das Fernfeld) abgestrahlte Anteil dieses Fluoreszenzlichts wird mit einem optischen System, wie es in der PCT/EP 01/10012 beschrieben ist, erfasst und als Bild mit einer CCD-Kamera detektiert. Selektiv im Bereich der analytspezifischen Spots werden Fluoreszenzsignale beobachtet, deren Intensität bei sachgerecht gestalteteten Assaybedingungen beispielsweise im wesentlichen proportional zur Analytkonzentration ist.

Nach einem oder mehreren Spülschritten zur Entfernung ungebundener Analytmoleküle oder anderer, im Vorinkubationsschritt hinzugegebener Bindungspartner wird, wie unter Beispiel ld) beschrieben, wiederum eine MALDI- Matrix aufgetragen und das dermassen modifizierte Trägersubstrat dann in einer MALDI-Messanordnung massenspektrometrisch analysiert..

Beschreibung der Figuren : Figur 1 zeigt das MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) des Peptids Melittin (lmg/mL in H2O dest. ) auf der Metalloxidoberfläche eines Trägersubstrats bestehend aus 150 nm Tantalpentoxid auf AF45-Glas. Als MALDI-Matrix, in die das Peptid durch Mischung der Lösungen eingebettet wurde, diente Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0. 1% Trifluoressigsäure). Die Zeitverzögerung ("Delay Time") zwischen dem laserinduzierten Desorptionsschritt und dem Anlegen der Beschleunigungsspannung des MALDI-Flugzeitrohres betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI-Messanordnung für eine"normale"Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Daher sind die mit dem erfindungsgemässen optisch transparenten Trägersubstrat gemessenen (m/z) -Werte leicht verändert.

Figur 2 zeigt eine Messung der gleichen Probe bei einer auf 800 nsec vergrösserten Delay Time. Die Signale der Probenmatrix, im Bereich kleiner (m/z)-Werte, verschwinden unter diesen Bedingungen vollständig, und es wird eine höhere Spektrenauflösung in Form einer verringerten Peakbreite beobachtet.

Figur 3 zeigt das MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) des Peptids Melittin (lmg/mL in H20 dest. ) auf der Goldoberfläche eines konventionellen Trägersubstrats.

Als MALDI-Matrix, in die das Peptid durch Mischung der Lösungen eingebettet wurde, diente Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0. 1% Trifluoressigsäure). Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI-Messanordnung für eine"normale"Goldplatte als Trägersubstrat <BR> <BR> verwendet. Erwartungsgemäss stimmt daher der gemessene (m/z) -Wert von 2848 gut mit dem Literaturwert überein. Das Massenspektrum ist von ähnlicher Qualität wie das in Figur 1, auf einer Metalloxidoberfläche erzeugte Spektrum.

Figur 4 zeigt ein MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) aus dem Bereich von Referenzspots, welche durch Auftragung von BSA-Lösung in Puffer (zur Passivierung unspezifischer, freier Bindungsstellen) mit für einen Analyten nichtbindendem Rinderserumalbumin, BSA, in 1 : 10 verdünnter Phosphatsalz- Pufferlösung (PBS/10) auf der Trägersubstratoberfläche (Tantalpentoxid auf AF45- Glas) erzeugt wurden. Als MALDI-Matrix wurde anschliessend Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0. 1 % Trifluoressigsäure) aufgetragen. Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI- Messanordnung für eine"normale"Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Verschiebung der gemessenen absoluten (m/z)- Werte aufgrund der Kalibration für ein anderes Trägermaterial entspricht das gemessene Spektrum den für BSA charakteristischen Signalen. <BR> <BR> <P>Figur 5 zeigt einen Ausschnitt des Spektrums von Figur 4 für den (m/z) -Bereich von 10000 bis 20000 (übereinstimmend mit Figur 6).

Figur 6 zeigt ein MALDI-Massenspektrum (positive Ionen) aus dem Bereich der Messbereiche (Spots) für den Nachweis von Human-Interleukin 4 (h-IL 4) nach Durchführung des Assays : Anti-h-IL 4-Antikörper wurden auf der Metalloxidoberfläche eines erfindungsgemässen Trägersubstrats, bestehend aus einer Tantalpentoxidschicht auf AF45-Glas, in diskreten Messbereichen (Spots) immobilisiert. Die Trägersubstratoberfläche wurde, nach Passivierung freier, unspezifischer Bindungsstellen auf der Metalloxidoberfläche, mit einer Lösung von h- IL 4 (1 llg/ml) als nachzuweisendem Analyten in Puffer (PBS/10) eine Stunde lang inkubiert, dann mit Puffer und nachfolgend mit Wasser gewaschen. Als MALDI- Matrix wurde anschliessend Sinapinsäure (gesättigte Lösung in 50% Acetonitril, 0. 1% Trifluoressigsäure) aufgetragen. Die Delay Time betrug 100 nsec. Es wurde die Massenkalibration (m/z) der MALDI-Messanordnung für eine"normale"Goldplatte als Trägersubstrat verwendet. Unter Berücksichtigung einer erwarteten Verschiebung der gemessenen absoluten (m/z) -Werte aufgrund der Kalibration für ein anderes Trägermaterial entspricht der gemessene Peak bei etwa (m/z) entsprechend 15 kDa einem an dieser Stelle gegebenenfalls zu erwartenden Signal von h-II 4. Das Signal bei etwa 13 kDa ist auf eine unbekannte, aber für BSA-Proben häufig zu beobachtende Komponente zurückzuführen.