Akute Gefäßerkrankungen, wie der myokordiale Infarkt, der Schlaganfall, die Lun- genembolie, die tiefe Venenthrombose oder die periphere Gefäßverstopfung und andere Thrombosen des Blutsystems, bilden eine wesentliche gesundheitliche Gefahrenquelle.

Derartige Erkrankungen werden durch vollständige oder teilweise Verstopfung des Blut- gefäßes durch einen Pfropfen, der Fibrin und Blutplättchen enthält, hervorgerufen.

Gegenwärtige Methoden der Behandlung und Prophylaxe solcher Thromboseerkran- kungen umfassen Therapeutika, die auf zwei verschiedenen Wegen wirken. Der erste Typ der Therapeutika verhindert die Thrombin-Aktivität oder Thrombose-Bildung und damit die Bildung des Pfropfens. Diese Medikamente verhindern auch die Entwicklung von Blutplättchen und deren Aggregation. Die zweite Kategorie von Medikamenten be- schleunigt die Thrombolyse und löst den Pfropfen auf, beseitigt damit diesen aus dem Blutgefäß und hebt die Blockade des Blutflusses auf.

Heparin und Cumarin, Präparate des ersten Typs, werden in großem Maße zur Be- handlung von venöser Thromboseembolien eingesetzt, in der die thrombotische Akti- vität für die Entwicklung und Ausdehnung des Thrombus verantwortlich ist. Obgleich wirkungsvoll, ruft Heparin jedoch viele unerwünschte Nebenwirkungen hervor, wie Blu- tungen oder Thrombocytopenie. Das gleiche gilt für Cumarin, das durch die Blockade oder Verhinderung der Bildung von Prothrombin wirkt und einige Zeit bis zu seiner vollen Wirkungsentfaltung benötigt. Zusammengenommen hat dies zu einer Suche nach spezifischer wirkenden und weniger toxischen Antigerinnungsmitteln geführt, wie z. B. peptidischen Hemmern.

Hirudin ist ein natürliches vorkommendes Polypeptid, das vom Blutegel Hirudo me- dicinalis produziert wird. Dieser Wirkstoff, der in der Speicheldrüse des Blutegels syn- thetisiert wird, ist der wirkungsvollste bekannte natürliche Gerinnungshemmer. Hirudin ist ein direkter Thrombininhibitor und unterbindet die Koagulation des Blutes durch eine starke Bindung an das Thrombin (Kd=2x10-14M) in einem stöchiometrischen 1 : 1 Komplex [Stone & Hofstenge, Kinetics of the inhibition of thrombin by hirudin, Biochemistry 25, S. 4622-4628 (1986)]. Dieses wiederum verhindert, daß das Thrombin die Umwandlung von Fibrinogen zu Fibrin (dem Pfropfen) katalysiert, wie es auch alle ahderen'ThromDin-vermiiteneir Spaltüngsprözesse verhindert'.

In Tierstudien wurde die Effizienz von Hirudin, in gereinigter Form aus Blutegeln gewonnen, bei der Prävention von venöser Thrombose, Gefäßverstopfung und Thrombin- induzierter verbreiteter intravaskulärer Koagulation demonstriert. Darüber hinaus zeigt Hirudin eine geringe Toxizität, geringe Antikörperbildung und eine schnelle Abbaubar- keit aus dem Blutkreislauf [F. Markwardt et al., Pharmacological studies on the anti- thrombic action of Hirudin in experimental animals, Thromb. Haemost. 47, S. 226-229 (1982)]. In Projekten, die darauf abzielen, größere Mengen von Hirudin herzustellen, wurden Versuche unternommen, das Polypeptid durch rekombinante DNA-Technologie herzustellen. Die Gegenwart eines O-sulfatisierten Tyrosin-Rests im natürlichen Hirudin und die Unfähigkeit der Mikroorganismen, eine gleichartige Modifikation durchzufüh- ren, machten die Aussicht auf eine rekombinante Produktion biologisch aktiven Hirudins hochspekulativ. Die Beobachtung, daß desulfatisiertes Hirudin fast so wirkungsvoll ist wie das sulfierte Gegenstück [U. S. Pat. No. 4 654 302], zeigte den Weg zur Klonierung und Darstellung in verschiedenen Expressionssystemen auf, unter anderem S. cerevisiae [Har- vey et al., Cloning and expression of cDNA coding för the anticoagulant hirudin from the bloodsucking leech, Hirudo medicinalis, PNAS 83, S. 1084-1088 ; Europ. Pat. Appl.

158654, 168342 und 171024], E. coli [Bergmann et al., Chemical synthesis and expres- sion of a gene coding for hirudin, the thrombin-specific inhibitor from the leech Hirudo medicinalis, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 367, S. 731-740 ; Europ. Pat. Appl. 200655] und auf den Spitzen eines filamentösen Phagen als Verschmelzungprotein mit Protein III (pIII) [Wirsching et al., Display of functional thrombin inhibitor hirudin on the surface of phage M13, Gene 204, S. 177-184J. Trotz dieser Fortschritte ist Hirudin in der Pro- duktion nach wie vor recht teuer. Dennoch hat es die dritte klinische Phase durchlaufen und wurde kürzlich für die Behandlung von Heparin-induzierter Thrombocytopenia zu- gelassen (HMR).

Erst kürzlich wurden bei der Identifikation von Peptidfragmenten natürlichen Hirud- ins Erfolge erzielt, die ebenso die Koagulationszeit verlängern. Solche Peptidfragmente können jedoch aufgrund ihrer geringen Wirksamkeit bezüglich der Verhinderung der Pfropfenbildung nicht voll zufriedenstellen. So hat z. B. N-Acetyl-Hirudin45_65 eine um vier Größenordnungen geringere Wirksamkeit als natürliches Hirudin, obgleich es nach wie vor ein relativ großes Molekül ist. Das Problem eher geringer Affinitäten für Throm- bin wurde durch die Entwicklung von Hirulogen [U. S. Pat. No. 5433940] gelöst. Diese Moleküle ahmen die Wirkung von Hirudin dadurch nach, daß sie sowohl an die nach außen gerichtete Anion-bindende Seite geringer Affinität binden, wie auch an die kataly- tische Seite des a-Thrombins. Von daher sind Hiruloge durch eine an die Anion-bindende Thrombin-Außenseite assoziierte Hälfte, eine Verbindungsgruppe und einen gegen das katalytische Zentrum des Thrombins gerichteten Anteil charakterisiert. Das am mei- sten bevorzugte Hirulog ist Hirulog-8, ein Peptid aus 20 Aminosäuren, das aus dem das katalytische Zentrum hemmenden Peptid D-Phe-Pro-Arg-Pro-, einer Gly4-Verbindungs- Sequenz und der Sequenz-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH des Hirudins aufgebaut ist. Hirulog-8 befindet sich seit kurzem in den USA auf dem Markt.

Trotz der Fortschritte relativ hoher Wirksamkeit für Thrombin (Ki = 2, 3nM) sind Hiruloge immer noch relativ große Moleküle, die in relativ mühsamen Schemata, wie gemischten heterologen/festen Phasen, synthetisiert werden müssen. Wie Hirudin sind Hirologe nur parenteral hilfreich und müssen sorgfältig überwacht werden. Daher sind Hiruloge nicht als Leitstrukturen für kleine Moleküle geeignet, die schließlich auch oral verabreicht werden könnten.

Daher gab es einige Anstrengungen, um kleinere Peptide als potente Thrombinhem- mer zu identifizieren. Bereits 1956 zeigte Bettelheim, daß das Fibrinopeptid A die Re- aktion zwischen Thrombin und Fibrinogen vergleichbar hemmt. In einer gemeinsamen Forschung von Blombäck und der Nobel Pharma/Kabi in Stockholm wurden vom Fi- brinopeptid A abgeleitete Peptidsequenzen mit nicht mehr als neun Aminosäuren mit guter Wirksamkeit auf Thrombin gefunden. Wesentliche Bestandteile der Wirksamkeit waren ein N-endständiges Phe und ein C-endständiges Arg, getrennt durch sieben Ami- nosäuren. Weniger Aminosäuren verringerten die Wirksamkeit, aber erstaunlicherweise zeigte ein Tripeptid mit N-und C-endständigem Phe bzw. Arg exzellente Wirksamkeit.

Das beste Tripeptid mit hemmender Wirkung auf die Thrombin-Fibrinogen-Reaktion war Bz-Phe-Val-Arg-OMe, wobei Val wie im Fibrinopeptid ganzer Länge dem Arg vor- ausgeht [Blombäck et al., Synthetic peptides with anticoagulant and vaodilating activi- ty, Scand. J. Clin. Lab. Invest. 24, S. 59-66 (1969), U. S. Pat. No. 3826794 (1974)]. Im Gegensatz zum Fibrinopeptid A geht Pro dem Arg in einer Reihe anderer Thrombin- ausschnittsbereiche, wie der des Prothrombins, des Faktors XIII und der menschlichen Wachstumshormone voraus. Auf Basis der Pro-Arg-Sequenz wurden die meisten der heu- te wirksamsten Thrombin-hemmenden Peptide und Peptidomimetiken entwickelt. Unter diesen wirkungsvollsten Hemmern befindet sich H-D-Phe-Pro-Arg-H (Ki = 70 nM) [Ba- juz et al., Inhibition of thrombin and trypsin by tripeptide aldehydes, Int. J. Peptide Protein Res. 12, S. 217-221 (1978) ; Hung. Pat. 169870 (1974)]. Die Idee zu diesem Pep- tidaldehyd erwuchs aus der Entdeckung von Peptidaldehyden bakteriellen Ursprungs durch H. Umezawa. Diese so genannten Leupeptide (z. B. Ac-Leu-Leu-Arg-H) sind Hem- mer des Plasmins und anderer Trypsin-ähnlicher Proteasen, jedoch nicht des Thrombins.

Der Aldehyd-Kohlenstoff hat in seiner acetalen Form eine tetraedrale Struktur, die glei- che wie der Carbonyl-Kohlenstoff von Substraten in der Übergangsphase.

Aus diesen eben erwähnten Aldehyden synthetisierten Shaw et al. den irreversiblen Chlormethylketon-Hemmer H-D-Phe-Pro-Arg-CH2-Cl mit einem Ki von 25 nM [Kett- ner et al., H-D-Phe-Pro-Arg-CH2-Cl-a selective activity label for thrombin, Thromb.

Res. 14, S. 969-973 (1979)]. Entwicklungsarbeiten bei Eli Lilly führten zu N-Methyl-D- Phe-Pro-Arg-H, auch als Efegatran [tm] bekannt. Die D-Phe-Pro-Arg-Sequenz wurde kürzlich nochmals weiterentwickelt. Spekulationen, daß eine N-endständige Aminosäure mit aromatischen/lipophilen Gruppen eine größere Wirksamkeit gegenüber Thrombin ergeben könnte, führten zur Entdeckung einiger Hemmer mit neuen Aminosäuren an die- ser Position, darunter das, ß-ß-Diphenylalanin (Dpa), Phenylglycin, Cyclohexylglycin, Carboy-1, 2,3, 4-tetrahydroisoquinolin (Tiq) [Schuman et al., Highly selective thrombin inhibitors, J. Med. Chem. 36, S. 314-319 (1993)]. Die interessanteste Verbindung war D-1-Tiq-Pro-Arg-H, die verglichen mit Boc-D-Phe-Pro-Arg-H, den doppelten Wirksam- keitsgewinn ergab. Jedoch wird Trypsin in gleichem Maße wie das Thrombin gehemmt.

Aus den heute zugänglichen Daten ist klar, daß, obgleich es einige effektive antigerin- nungswirksame Verbindungen gibt, ein Bedarf an leistungsfähigen Antithrombinmitteln besteht, die schnell wirken, um die Pfropfenbildung zu verhindern und die nicht mit anderen Proteaseaktivitäten, z. B. der Plasminwirkung beim Auflösen des Pfropfens in- terferieren.

Ausgehend von diesem Stand der Technik lag der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verbindungen bereitzustellen, die im Sinne einer Thrombinhemmung biolo- gisch aktiv sind und die Nachteile des vorhergehend beschriebenen Standes der Technik vermeiden. Das der Erfindung zugrundeliegende Problem bestand darüberhinaus darin, Thrombin spezifisch mit geringen Wirkstoffkonzentrationen und geringer Zelltoxizität zu inhibieren.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die Verbindung mit der Formel gelöst, wobei Y'entweder 1. ein Wasserstoff oder 2. eine Methylgruppe oder 3. eine Acetylgruppe ist oder 4. durch ein Rückgrat aus einer Kette von 1 bis 32 Kohlenstoffatomen charakterisiert ist, wobei (NH-Xl-C=O) eine D-oder L-Aminosäure, vorzugsweise 1. Valin oder 2. Alanin oder 3. Leucin oder 4. Isoleucin oder 5. Norleucin oder 6. Asparagin oder 7. Glutamin oder 8. Serin oder 9. Threonin oder 10. Tyrosin oder 11. Arginin oder 12. Lysin oder 13. Ornithin oder 14. Phenylalanin oder 15. Dichlorphenylalanin oder 16. Tetrahydronorharman-3-carbonsäure oder 17. Tetrahydroisoquinolin (1, 2,3, 4)-3-carbonsäure oder 18.4-Phenylpiperidin-4-carbonsäure oder 19. Thienylalanin oder 20. Phenylglycin oder 21. p-Nitrophenylalanin oder 22. Tranexamic acid (=Trans-4- (Aminomethyl) cyclohexancarbonsäure) oder 23. Trans-4- (Guanidinomethyl) cyclohexancarbonsäure ist 24. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird, wobei (NH-X2-C=0) eine D-oder L-Aminosäure, vorzugsweise 1. Alanin oder 2. Valin oder 3. Leucin oder 4. Isoleucin oder 5. Norleucin oder 6. Serin oder 7. Threonin oder 8. Tyrosin oder 9. Prolin oder 10. Citrullin oder 11. Arginin oder 12. Lysin oder 13. Ornithin oder 14. Histidin oder 15. Glutaminsäure oder 16. Asparaginsäure oder 17. Tryptophan oder 18. Cyclohexylalanin oder 19. Cyclohexylglycin ist 20. oder durch eine chemische Bindung ersetzt wird, wobei (NH-X3-C=O) eine beliebige Aminosäure, beispielsweise 1. L-Cyclohexylalanin oder 2. D-Cyclohexylalanin oder 3. L-Cyclohexylglycin oder 4. D-Cyclohexylglycin ist, wobei (NH-X4-C=0) eine kleine Aminosäure, vorzugsweise 1. L-Prolin oder 2. D-Prolin oder 3. L-Azetidin-2-carbonsäure oder 4. D-Azetidin-2-carbonsäure ist, wobei (NH-X5-C=0) eine vorzugsweise aromatische Aminosäure, wie 1. L-Tyrosin oder 2. D-Tyrosin oder 3. L-Phenylalanin oder 4. D-Phenylalanin ist, wobei (NH-X6-C=O) eine Aminosäure mit basischer Seitenkette, vorzugsweise 1. L-Arginin oder 2. D-Arginin oder 3. L-Lysin oder 4. D-Lysin oder 5. L-Ornithin oder 6. D-Ornithin oder 7. L-Homoarginin oder 8. D-Homoarginin ist, wobei y2 entweder 1 eine OH-Gruppe (die C-endständige Aminosäure hat eine endständige Carbonsäure- Gruppe) oder 2. eine Aminogruppe (bei der C-endständigen Aminosäure ist die Carbonsäure-durch eine Amid-Gruppe ersetzt) oder 3. ein Wasserstoff (bei der C-endständigen Aminosäure ist die Carbonsäure-durch eine Aldehyd-Gruppe ersetzt) oder 4. 7-Amido-4-methylcumarin (über die Carbonsäuregruppe kombiniert) oder 5. Paranitroanilid (über die Carbonsäuregruppe kombiniert) oder 6. durch eine Verbindungskette aus eins bis 35 Atomen ersetzt ist, oder ein am C-Terminus und/oder am N-Terminus um nicht weniger als eine Amino- säure verkürztes Molekül und pharmazeutisch akzeptable Salze davon.

Die Erfindung betrifft auch Derivate der oben genannten Verbindungen.

Besonders vorteilhafte Ergebnisse werden erzielt, wenn es sich bei dem erfindungs- gemäßen Peptid um N-Acetyl-Rl-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid handelt, wobei Rl für D-Gln-D-His, D-Glu, D-Val-D-His, L-Ala, L-Ile-L-Arg, L-Tyr-L-Cit, L-Ser-L-Ser, D- Val, L-Trp, L-Ser-L-Ala, L-Ser-L-Arg, D-Lys-L-Nle, D-Tyr, L-Arg oder L-Tyr-D-Pro steht, wenn es sich bei dem erfindungsgemäßen Peptid um N-Acetyl-L-Ala-D-Cha-L- Aze-D-Tyr-L-Arg-amid, um N-Acetyl-L-Ala-D-Cha-L-Pro-D-Tyr-L-Har-amid oder um N-Acetyl-R2-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid handelt, wobei Ra für L-Trp, L-Ala, D- Phe, L-Dcp, L-Nhm, L-Iq3, L-Ppd, L-Tea, L-Phg, L-Nle, L-Cha oder L-Pnp steht.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Hemmung aller Thrombin-vermit- telten oder Thrombin-assoziierten Funktionen und Prozesse verwendet werden. Pharma- zeutische Zusammenstellungen, die diese Verbindungen enthalten, wie auch Methoden zur Behandlung und Prophylaxe von Gefäßerkranküngen, entzündlichen Reaktionen, Karzinomen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Verbindungen verwenden, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Die Verbindungen können auch zur ex vivo Darstellung verwendet werden, zur Lagerung und Behandlung von Blut außerhalb des Körpers und zur Beschichtung von invasiven Geräten. Ferner können die Verbindungen einem Patienten (unter Patient wird hier ein Mensch oder Tier verstanden) in Kombi- nation mit einem fibrinolytischem Mittel verabreicht werden, um die Wirksamkeit einer gegebenen Dosis zu erhöhen oder die zur Erzielung eines gewünschten Effekts notwendi- ge Dosis zu verringern, wie das Auflösen und Blutpfropfens oder die Verhinderung der Wiederverstopfung des zuvor blockierten Blutgefäßes.

Aufgrund ihres hohen Potentials und der Tatsache, daß sie durch chemische Synthe- setechniken hergestellt werden können, können die Verbindungen preisgünstig in kom- merziell praktikablen Mengen produziert werden. Die Peptide werden in passende Salz- formen wie Acetate und Sulfate umgewandelt.

Darüber hinaus sind die erfindungsgemäßen Moleküle wesentlich kleiner als Hiru- din und die anderen bisher beschriebenen peptidischen Thrombinhemmer. Daher ist es unwahrscheinlicher, eine unerwünschte Reaktion des Immunsystems bei mit diesen Sub- stanzen behandelten Patienten hervorzurufen. Dementsprechend ist der Einsatz dieser Thrombin-Hemmer nicht auf die Behandlung akuter Erkrankungen beschränkt. Diese Verbindungen können auch in der Therapie chronischer thrombo-embolitischer Erkran- kungen wie der Arteriosklerose oder der Restenosis infolge einer Angioplastie, eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in einer Vielzahl anderer Anwendungen anstelle natürlichen und rekombinanten Thrombins eingesetzt werden.

Wie man aus der Offenlegung folgern kann, sind die erfindungsgemäßen Verbindun- gen, Zusammenstellungen und Verfahren nützlich zur Behandlung und Vorsorge ver- schiedener Krankheiten in Zusammenhang mit unerwünschten Wirkungen des Throm- bins, wie auch für diagnostische Zwecke.

Schließlich soll erwähnt werden, daß die Moleküle dieser Erfindung als Leitstrukturen zur Entwicklung von Molekülen mit noch vorteilhafteren Eigenschaften in Hinblick auf die oben genannten Anwendungen dienen können.

Pharmazeutisch akzeptable Salze von Peptiden dieser Erfindung beinhalten die durch Säurezugabe erzeugten Salze, die aus anorganischen Säuren und Carbonsäuren gebildet werden. Die Verbindungen, die durch die Formel (I) repräsentiert werden, werden durch bekannte Methoden der Peptidkopplung hergestellt.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen als Verbindungsgemisch vor, das durch seinen Gehalt an mindestens zwei der erfindungs- gemäßen Verbindungen charakterisiert ist. Bevorzugte pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindungen werden mit einer anorganischen Säure gebildet. Besonders bevorzugt ist dabei die Bildung eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes mit Chlorwasserstoffsäu- re, Chlorsäure, Bromwasserstoffsäure, Bromsäure und/oder einer anderen Halogensäure.

Eine weitere besonders bevorzugte Ausführungsform besteht in der Bildung eines phar- mazeutisch akzeptablen Salzes mit Schwefelsäure und/oder Phosphorsäure. Vorteilhaft kann auch ein pharmazeutisch akzeptables Salz mit einer organischen Säure gebildet wer- den. Besonders bevorzugt ist dabei die Bildung des pharmazeutisch akzeptablen Salzes mit Essigsäure, Propionsäure, Malonsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäu- re, Fumarsäure, Äpfelsäure, Benzoesäure, und/oder einer ähnlichen Carbonsäuren. Die durch Säurezugabe gebildeten Salze werden auf konventionelle Weise hergestellt, z. B. durch Neutralisieren der freien Basenform der Verbindung (I) mit der Säure.

Die verbindungsgemäßen Substanzen können in Verbindungen und Methoden zur Hemmung aller Thrombin-vermittelten oder Thrombin-assoziierten Funktionen verwen- det werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die diese Moleküle enthalten, sind, wie auch Methoden zur Behandlung und Prophylaxe von Gefäßerkrankungen, entzünd- lichen Reaktionen, Karzinomen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Ver- bindungen verwenden, ebenfalls Teil der Erfindung. Die Substanzen können auch in Zusammensetzung zur ex vivo-Darstellung verwendet werden, zur Lagerung und zur Be- handlung von Blut außerhalb des Körpers und zur Beschichtung von invasiven Geräten.

Ferner können die erfindungsgemäßen Verbindungen einem Patienten (unter Patient wird hier ein Mensch oder ein Tier verstanden) in Kombination mit einem nbrinölytischen Mittel verabreicht werden, um die Wirksamkeit einer gegebenen Dosis zu erhöhen oder um die Erzielung eines gewünschten Effektes, wie das Auflösen eines Blutpfropfens oder das Verhindern der Wiederverstopfung des zuvor blockierten Blutgefäßes notwendige Dosis zu verringern.

Aufgrund ihres hohen Potentials und der Tatsache, daß sie durch chemische Synthe- setechniken hergestellt werden können, sind die erfindungsgemäßen Substanzen preis- günstig in kommerziell praktikabler Menge produzierbar. Bevorzugt werden die Peptide in passende Salzformen, wie Acetate oder Sulfate umgewandelt.

Die Erfindung betrifft auch ein Arzneimittel, das durch seinen Gehalt an einer oder mehreren erfindungsgemäßen Verbindungen mit den üblichen Trägerstoffen, Hilfsmitteln oder Zusatzstoffen charakterisiert ist. Ferner ist auch eine Diagnostikzusammensetzung mit einem Gehalt an einer oder mehreren der Verbindungen Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung besteht in der Verwendung der Verbindung als Thrombininhibitor sowie zur Herstellung eines Arzneimittels zur Thrombininhibie- rung, Inhibierung der Fibrinbildung und/oder zur Inhibierung der Bildung eines Gerin- nungspfropfens.

Die Verwendung einer oder mehrerer der Verbindungen zur Herstellung einer diagno- stischen Zusammensetzung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung. In einer der beson- ders bevorzugten Ausführungsformen wird zur Herstellung der diagnostischen Zusam- mensetzung eine erfindungsgemäße Verbindung verwendet, bei der in der Formel (I) y2 7-Amido-3-methylcumarin oder Paranitroanilid ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen gegenüber bisher bekannten Thrombin- inhibitoren vielfältige Vorteile au£ Insbesondere sind die Peptide leicht synthetisierbar, bereits wenig modifiziert wirksam und weisen eine hohe Wirksamkeit bei gleichzeitig hoher Spezifität und geringer Toxizität auf. Darüber hinaus dienen die kleinen Pepti- de, anders als Hirudin und Hirolog als Leitstrukturen für vorzugsweise oral verfügbare Wirkstoffe.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne diese einzu- schränken.

Beispiei 1 N-Acetyl-D-Gln-D-His-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde durch eine Festphasen-Synthese mithilfe eines ABIMED-Syn- thesizers AMS 96 (ABIMED Analysen-Technik GmbH, Langenfeld, Deutschland) her- gestellt. Im Detail ließ man 1 meq Rink Amid-Harz sequentiell mit 2 x 5 meq geschützter Aminosäure reagieren. Die Aktivierung erfolgte mit 2 x 5 meq TBTU (0-benzotriazol-l- <BR> <BR> yl) -N, N, N', N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat. Nach bis zu 6 Zyklen der Synthese wurde der N-Terminus mit Essigsäureanhydrid acetyliert. Dann wurde der Schutz des Peptids durch eine Behandlung mit 90% TFA, 2, 5% Triisopropylsilan, 2, 5% H20 und 5% Dichlormethan aufgehoben. Im selben Schritt erfolgte die Entkopplung des Peptids von seinem Träger. Die Testverbindung wurde anschließend an einen Trocknungsschritt in 20, u1 Trifluoressigsäure angelöst, und dann mit 2x750, u1 kaltem Butylether bei- 20°Celsius inkubiert. Nach Zentrifugation wurde der Überstand abgenommen und der Rest Ether verdunstet. Die Identität der Produkte wurde stichprobenartig durch Mas- senspektroskopie bestätigt.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins bestimmt und beträgt bei einer Peptidkonzentration von 1 MM 59%. Die <BR> <BR> Werte der hemmenden Konstante Ki wurden aus Assays gewonnen, in denen Thrombin<BR> das fluorogene Substrat Tos-Gly-Pro-Arg- (7-amino-4-Methylcumarin) hydrolisiert. Die Assays wurde in 30 pl Assaypuffer (0,05 M Tris, 0,1 M NaCl, 0,1% PEG 8000, pH 7,6) mit 10 pu humaner Thrombinlösung (10-5 U/, lll im Assaypuffer) und 140 pu einer Lösung des fluorogenen Substrats in einem Assaypuffer bei einer Konzentration von 30/IM durchge- führt. Lösungen der Testverbindung (10, sl) wurden bei verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt. Die Raten der Hydrolyse des Substrats wurden durch Überwachung der Re- aktionen bei 460 nm der Freisetzung von 7-Amino-4-Methylcumarin unter Verwendung von AMC gemessen. Die Reaktion erreichte einen Gleichgewichtszustand innerhalb von drei Minuten, nachdem Thrombin mit dem Substrat und einem Hemmer vermischt wur- den. Die kinetischen Daten der konkurrierenden Hemmung (Km, Vmax und Ki) wurden mittels der Darstellung nach Hanes analysiert (A/V gegen A bei verschiedenen Werten von A, dabei ist A die Substratkonzentration und V die Reaktionsgeschwindigkeit).

Beispiel 2 N-Acetyl-D-Glu-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 ßM 58%.

Beispiel 3 N-Acetyl-D-Val-D-His-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 51%.

Beispiel 4 N-Acetyl-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1, uM 44%.

Beispiel 5 N-Acetyl-L-Ile-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1/IM 61% Beispiel 6 N-Acetyl-L-Tyr-L-Cit-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 uM 55%.

Beispiel 7 N-Acetyl-L-Ser-L-Ser-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1, uM 40%.

Beispiel 8 N-Acetyl-D-Val-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 45%.

Beispiel 9 N-Acetyl-L-Trp-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zenträtion von 1 MM 63%.

Beispiel 10 N-Acetyl-L-Ser-L-Ala-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 47%.

Beispiel 11 N-Acetyl-L-Ser-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 51%.

Beispiel 12 N-Acetyl-D-Lys-L-Nle-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1, MM 48%.

Beispiel 13 N-Acetyl-D-Tyr-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1, uM 47%.

Beispiel 14 N-Acetyl-L-Arg-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 ßM 47%.

Beispiel 15 N-Acetyl-L-Tyr-D-Pro-L-Cha-D-Pro-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 44%.

Beispiel 16 N-Acetyl-L-Ala-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Arg-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1/iM 63% Beispiei 17<BR> N-Acetyl-L-Ala-D-Cha-L-Pro-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 1 MM 56%.

Beispiel 18 N-Acetyl-L-Trp-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 76%.

Beispiel 19 N-Acetyl-L-Ala-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 77%.

Beispiel 20 N-Acetyl-D-Phe-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 77%.

Beispiel 21 N-Acetyl-L-Dcp-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250nM 75%.

Beispiel 22 N-Acetyl-L-Nhm-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 80%.

Beispiel 23 N-Acetyl-L-Iq3-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 72%.

Beispiel 24 N-Acetyl-L-Ppd-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 76%.

Beispiel 25 N-Acetyl-L-Tea-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 74%.

Beispiel 26 N-Acetyl-L-Phg-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 95%.

Beispiel 27 N-Acetyl-L-Nle-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 89%.

Beispiel 28 N-Acetyl-L-Cha-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 90%.

Beispiel 29 N-Acetyl-L-Pnp-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Die Hemmung des Thrombins wurde durch in-vitro-Hemmung der Amidase-Aktivität des Thrombins wie in Ausführungsbeispiel 1 bestimmt und beträgt bei einer Peptidkon- zentration von 250 nM 72%.

Beispiel 30 Tranexamic acid-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Für die Hemmung des Thrombins wurde ein Ki von 7nM bestimmt.

Beispiel 31 Trans-4- (Guanidinomethyl) cyclohexancarbonsäure-D-Cha-L-Aze-D-Tyr-L-Har-amid Dieses Peptid wurde wie in Beispiel 1 beschrieben synthetisiert und für den Einsatz im Assay vorbereitet.

Für die Hemmung des Thrombins wurde ein Ki von 3nM bestimmt.

Beschreibung der Abkürzungen Ala = Alanin Val = Valin Leu = Leucin Ile = Isoleucin Pro = Prolin Phe = Phenylalanin Phg = Phenylglycin Cha = Cyclohexylalanin Trp = Tryptophan Met = Methionin Gly = Glycin Ser = Serin Thr = Threonin Cys = Cystein Tyr = Tyrosin Asn = Asparagin Gln = Glutamin Asp = Asparaginsäure Glu = Glutaminsäure Lys = Lysin Arg = Arginin His = Histidin Nle = Norleucin Orn = Ornithin Cit = Citrullin Aze = Azetidin Har = Homoarginin Dcp = Dichlorphenylalanin Nhm = carboxylsäure Iq3 Tetrahydroisoquinolin- (1, 2,3, 4) -3-carboxylsäure Ppd = 4-Phenylpiperidin-4-carbonsäure Tea = Thienylalanin.

Pnp = Paranitrophenylalanin