CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención describe un sistema para el cultivo de organoides. Además, la presente invención describe también un método para esterilizar un sistema de cultivo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En el estado de la técnica se han descrito varios sistemas para el cultivo de organoides, también conocidos como sistemas de cultivo tridimensional, en contraposición con el cultivo tradicional bidimensional en monocapa.

Qian, X. y otros describieron en un artículo científico en 2016 (Cell, 165, 1238-1254) el desarrollo de un biorreactor giratorio miniaturizado para generar organoides específicos del cerebro a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) humanas. Estos organoides incorporaron características clave del desarrollo cortical humano, incluyendo la organización de la zona progenitora, la neurogénesis, la expresión génica y una capa de células glía radiales externas específicas del ser humano. El biorreactor se denominó SpinZ y encaja en una placa de cultivo de tejido estándar de 12 pocilios, reduciendo drásticamente el consumo de medio y el espacio en la incubadora. El biorreactor también disponía de una versión apilable accionada por un motor común, lo que permitía comparar un gran número de condiciones en paralelo (para optimizar el protocolo) y reducir el espacio necesario en la incubadora. Sin embargo, el sistema no es modular ni tampoco es un sistema totalmente esterilizable. Además, SpinZ tampoco incorpora sensores que permitan medir en tiempo real parámetros importantes como pueden ser el crecimiento celular, pH, concentración de CO2 y O2, temperatura.

Wilkinson y otros describieron en un artículo científico (Stem Cells Translational Medicine (2017), 6, 622-633) un método escalable para la generación de organoides pulmonares humanos auto-ensamblados. La generación de dichos organoides se consiguió mediante la combinación de microesferas de alginato funcionalizadas con colágeno y fibroblastos humanos en un biorreactor rotacional de vasos de alta relación de aspecto (HARV) de 4 mi. Además, los autores también enseñan que se puede montar una cámara GoPro en el HARV para caracterizar la cinética de la formación de organoides. Sin embargo, dicha invención no permite usar material de cultivo estándar, ni tampoco cultivo simultáneo múltiple. El sistema tampoco es modular, y aunque permite caracterizar el crecimiento de organoides con la cámara que incorpora, no permite almacenar automáticamente esos datos ni tampoco monitorizar y almacenar otros parámetros físico-químicos de interés como pueden ser el pH, concentración de CO2 y O2 y la temperatura.

La solicitud de patente WO2015/184273 A1 enseña un sistema de biorreactor para la preparación de un organoide cardíaco. El sistema del biorreactor incluye un primer recipiente con un interior hueco y una parte superior abierta, además de una cánula con un lumen, un anillo poroso acoplado a la cánula y un catéter de balón. Esta invención presenta un problema de aplicabilidad, puesto que el requisito de un catéter de balón limita la producción de organoides a un único tipo cardíaco. Además, no se trata de un biorreactor modular ni tampoco permite un cultivo simultáneo de distintos tejidos y/o distintas condiciones. Este biorreactor tampoco incorpora la posibilidad de usar material de cultivo estándar. Además, tampoco permite monitorizar a tiempo real el crecimiento del organoide ni monitorizar y almacenar los datos referidos a parámetros físico-químicos de interés del cultivo.

La solicitud de patente WO2012/104437 A1 enseña un biorreactor para cultivo celular sobre un sustrato tridimensional. Se compone de una cámara de cultivo de forma cónica. El biorreactor se utiliza en la ingeniería de tejidos para la producción de injertos de tejidos, en particular un injerto óseo o de cartílago. Este biorreactor no permite el cultivo múltiple simultáneo ni tampoco el uso de material de cultivo estándar. Además, el biorreactor de dicha invención no permite tampoco monitorizar a tiempo real el crecimiento del organoide ni monitorizar y almacenar los datos referidos a parámetros físico-químicos de interés.

A la vista de los documentos anteriormente citados, resulta evidente la necesidad de un sistema para el cultivo de organoides que sea modular, esterilizable, que permita el cultivo múltiple simultáneo y que permita monitorizar a tiempo real el crecimiento celular así como también monitorizar y almacenar parámetros físico-químicos relevantes tales como el pH, concentración de C0 ₂ y O2 y la temperatura. En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides que incluye las anteriores características mejorando de forma significativa los sistemas existentes en el estado de la técnica.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides que permite un cultivo múltiple simultáneo (high-throughput), la reutilización de material y equipamento de cultivo estándar, así como la monitorización en tiempo real del crecimiento del organoide y de parámetros físico-químicos relevantes. Además, el sistema es modular y se puede esterilizar un módulo independientemente de otro.

Un aspecto de la presente invención trata de un sistema esterilizable para el cultivo de organoides que comprende:

un módulo de cultivo que comprende:

uno o más pocilios;

un módulo de agitación que comprende medios de agitación para cada pocilio;

caracterizado porque:

el módulo de agitación comprende:

un sistema compresor de aire que comprende medios de control de caudal configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;

una boquilla para cada pocilio, configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio;

un sensor de presión y un controlador, estando configurado el controlador para actuar sobre los medios de control de caudal variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión.

Por tanto, en la presente invención se describe un sistema que presenta numerosas ventajas respecto a otros biorreactores para el cultivo de organoides descritos en el estado de la técnica. El biorreactor de la presente invención permite un cultivo simultáneo múltiple, lo que permite realizar experimentos con distintas condiciones en paralelo. Además, la presente invención comprende un sistema modular, por lo que distintos módulos del sistema se pueden acoplar y desacoplar. Por lo tanto, en primer lugar, se posibilita que el módulo de cultivo sea esterilizable en su totalidad, sin necesidad de esterilizar por separado las partes del módulo de cultivo, siendo esto muy conveniente para preservar la totalidad del cultivo estéril. Es decir, el módulo de cultivo, que comprende uno o más pocilios, se pueden extraer como un bloque, sin necesidad de desmontaje de sus componentes.

La presente invención también describe un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides que comprende: proporcionar un sistema como el que se define anteriormente en una configuración de reposo de manera que el módulo de agitación y el módulo de control están desacoplados del módulo de cultivo; extraer el módulo de cultivo; y someter el módulo de cultivo a esterilización.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

En la Fig. 1 se muestra un ejemplo de realización de la presente invención, en donde el sistema para el cultivo de organoides comprende

un módulo de cultivo (2) que comprende:

uno o más pocilios (4);

un módulo de agitación (8) que comprende medios de agitación para cada pocilio (4); caracterizado porque:

el módulo de agitación (8) comprende:

un sistema compresor de aire que comprende medios de control de caudal (81) configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;

una boquilla (82) para cada pocilio (4), configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio (4);

un sensor de presión (83) y un controlador (84), estando configurado el controlador (84) para actuar sobre los medios de control de caudal (81) variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal (81) en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83).

En la Fig. 2 se detalla una realización de una cubierta (5) que se coloca sobre los pocilios (4). En la Fig. 2 se ilustra que la cubierta (5) comprende perforaciones (51) sobre cada uno de los pocilios (4) para conducir al exterior aire de evacuación de cada pocilio (4). El aire de evacuación pasa a través de las perforaciones (51) a una cámara de aire (52). En la Fig. 2 también se muestran las boquillas (82).

En la Fig. 3 se muestra una realización donde el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están comprendidos en un contendor (1).

En la Fig. 4 se ilustra una realización del módulo de monitorización de crecimiento (50) y su acoplamiento a los pocilios (4) comprendidos en el módulo de cultivo (2). En la realización ilustrada en la Fig. 4, los módulos de monitorización de crecimiento (50) y de cultivo (2) están separados por una base transparente (15).

En la Fig. 5 se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un sistema cartesiano de dos ejes motorizados, X - Y.

En las Fig. 6A y 6B se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un sistema Delta con 3 brazos motorizados.

En la Fig. 7 se representa un esquema de un sistema motorizado (52) para permitir posicionar el sistema de visión (511) mediante un brazo articulado con al menos dos articulaciones.

En la Fig. 8 se ilustra una posible realización para la ubicación de códigos visuales (532, 533) que forman parte de guías visuales (53) sobre una placa de cultivo (104). En la Fig. 8 se muestra un código bidimensional de identificación libre, como QR (532), y marcadores bidimensionales (533), que permiten definir las esquinas de la placa de cultivo (104) y las características de la misma.

En la Fig. 9 se ilustra una realización de la invención donde el módulo de monitorización de crecimiento (50) comprende medios de iluminación difusa (54) situados en los bordes del portafiltro (55). DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se describe un sistema para el cultivo de organoides así como un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides. En referencia a la Fig. 1 , en una realización particular, la presente invención trata de un sistema esterilizable para el cultivo de organoides que comprende:

un módulo de cultivo (2) que comprende:

uno o más pocilios (4);

un módulo de agitación (8) que comprende medios de agitación para cada pocilio (4); caracterizado porque:

el módulo de agitación (8) comprende:

un sistema compresor de aire (80) que comprende medios de control de caudal (81) configurados para suministrar un caudal de aire presurizado a una presión determinada;

una boquilla (82) para cada pocilio (4), configurada para canalizar el caudal de aire presurizado a cada pocilio (4);

un sensor de presión (83) y un controlador (84), estando configurado el controlador (84) para actuar sobre los medios de control de caudal (81) variando una potencia de alimentación de los medios de control caudal (81) en función de una lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83).

La base del módulo de cultivo (2) es la agitación del cultivo mediante burbujas de aire, que también ayudan a facilitar el intercambio gaseoso con el medio de cultivo.

En una realización de la invención, el controlador (84) está configurado para que la lectura de presión proporcionada por el sensor de presión (83) se corresponda con la curva de transferencia de presión/tiempo seleccionada para cada experimento.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 2, el módulo de agitación (8) comprende: una cubierta (5) que comprende medios de evacuación (51 , 52) de aire de cada pocilio (4). La salida de aire de los pocilios (4) se realiza por medio de unas perforaciones (51) realizadas en la cubierta (5) sobre cada uno de los pocilios (4), y se conduce al exterior a través de una cámara de aire (52) construida en la cubierta (5), para evitar la contaminación del cultivo.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el módulo de agitación (8) comprende un filtro de aire (85) entre cada boquilla (82) y el sistema compresor de aire (80). Conforme a una realización de la invención, el filtro de aire (85) es un filtro HEPA.

Conforme a una realización de la invención, el sistema compresor de aire (80) recoge el aire de la incubadora donde está ubicado el sistema de la invención y lo impulsa hacia las boquillas (82), pasando previamente a través del filtro (85), que evita la contaminación del medio de cultivo.

Como se ilustra en la Fig. 3, durante el crecimiento del organoide, las boquillas (82) de aire permanecen introducidas en el medio de cultivo. El sistema compresor de aire (80) genera un flujo de aire constante, que produce un burbujeo en cada uno de los pocilios (4). El sistema dispone de un sensor de presión (83) que se utiliza para regular la velocidad de los medios de control de caudal (81), que pueden ser un compresor, garantizando un flujo de aire constante a los pocilios (4) a través de las boquillas (82) de aire.

En una realización de la invención, el controlador (84) está configurado para detectar una anomalía de funcionamiento correspondiente a una boquilla (82) taponada, un filtro de aire (81) sucio y ambas. El sistema de control dispone de un algoritmo de control de bombeo de aire que, a partir de los datos de velocidad del compresor y la presión leída en la cámara previa al filtro (85), permite detectar boquillas (82) taponadas o filtro (85) sucio.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , los pocilios (4) se disponen sobre un medio de soporte (10).

El medio de soporte (10) permite la manipulación de forma solidaria de todos los pocilios (4) usados para el cultivo de organoides. Preferiblemente, el sistema descrito en la presente invención puede ser usado en combinación con una placa de cultivo (104) estándar. En una placa de cultivo (104) estándar, el medio de soporte (10) y los pocilios (4) forman una misma unidad. Así, en una realización preferida, se pueden utilizar placas de cultivo estándar en el sistema de cultivo de organoides descrito en la presente invención, de modo que el biorreactor tiene una gran aplicabilidad y su uso no precisará de dispositivos especiales para el cultivo de organoides, a diferencia de otros sistemas descritos en el estado de la técnica. Además, el uso de placas de cultivo estándar permite un cultivo múltiple simultáneo, permitiendo, por lo tanto, el cultivo celular en distintas condiciones físico-químicas en una misma placa, en un mismo experimento.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende: un módulo de sensorización ambiental (43) que comprende uno o más sensores (41); donde dichos uno o más sensores (41) están configurados para medir parámetros relacionados con el cultivo seleccionados entre crecimiento celular, concentración de CO2, concentración de O2, pH, temperatura, humedad y compuestos orgánicos volátiles.

Conforme a una realización de la invención, los uno o más sensores (41) están configurados para medir los parámetros relacionados con el cultivo en tiempo real.

Adicionalmente, el sistema de la invención permite incorporar nuevos sensores para registrar nueva información que pudiera ser relevante, en tiempo real.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende: un módulo de monitorización de crecimiento (50) que comprende: un sistema de visión basado en imágenes individuales de cada pocilio (4).

La monitorización en tiempo real del crecimiento de los organoides se realiza por medio de un sistema de visión artificial, que obtiene imágenes individuales de cada pocilio (4) y las procesa para calcular su tamaño.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema de visión comprende medios de captura de imágenes (51) seleccionados entre medios que comprenden lente con enfoque fijo, lente con enfoque ajustable, tecnología light field y tecnología multicámara. Mediante la lente con enfoque fijo, los medios de captura de imágenes (51) se ajustan al plano de reposo de los organoides, para realizar una estimación del crecimiento basada en una proyección 2D del cultivo.

Mediante la lente con enfoque ajustable, los medios de captura de imágenes (51) permiten capturar varias imágenes de cada pocilio, correspondientes a diferentes planos del cultivo, mejorando la estimación del crecimiento, ya que permite una reconstrucción 3D del organoide.

Mediante la tecnología light field,, los medios de captura de imágenes (51) permiten ver el crecimiento en diferentes planos sin lente ajustable, puesto que la tecnología Light Field, permite modificar el plano focal de la captura sin necesidad de lentes con enfoque ajustable.

Mediante la tecnología multicámara. los medios de captura de imágenes (51) comprenden varias cámaras que enfocan el cultivo desde ángulos diferentes, permitiendo la reconstrucción 3D del mismo.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el módulo de monitorización de crecimiento (50) comprende un sistema motorizado (52) para posicionamiento del sistema de visión en cada uno de los pocilios (4). El sistema motorizado (52) está configurado para permitir posicionar el sistema de visión (511) tridimensionalmente, es decir, en un punto del espacio determinado por tres coordenadas.

Conforme a diferentes realizaciones de la invención, el sistema motorizado (52) comprende un sistema seleccionado entre:

sistema cartesiano de dos ejes motorizados, X - Y, como el ilustrado en la Fig. 5, donde:

el sistema de visión (511) está instalado en un eje deslizante (X), que puede ser actuado mediante un mecanismo de engranajes y motor;

el eje deslizante (X) está instalado a su vez en un carro de desplazamiento perpendicular (Y), accionado por un mecanismo, que puede ser de engranajes y motor, independiente del eje X;

sistema Delta con 3 brazos motorizados donde:

el sistema de visión (511) está instalado en un soporte que está conectado mediante tres segmentos telescópicos (521) a tres carros (522) configurados para deslizar verticalmente sobre sendos ejes verticales (523), estando dispuestos los ejes verticales (523) en los vértices de un triángulo equilátero, vistos sobre un plano horizontal;

un movimiento horizontal y vertical del sistema de visión se produce mediante un movimiento coordinado de los 3 carros (522) a lo largo de los ejes verticales (523);

brazo articulado con al menos dos articulaciones (52A, 52B) donde el sistema de visión (511) se sitúa en un extremo libre del brazo que dispone de al menos dos articulaciones (52A, 52B) giratorias, cuyo movimiento coordinado permite posicionar el sistema de visión. En una realización, el brazo articulado tiene una primera articulación (52A) configurada para un posicionamiento en un plano horizontal y una segunda articulación (52B) configurada para un posicionamiento en un plano vertical.

Adicionalmente, conforme a una realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema motorizado (52) comprende medios de calibración del posicionamiento del sistema de visión mediante guías visuales (53) adheridas a una placa de cultivo (104) seleccionadas entre geométricas y códigos visuales. En una realización de la invención, las guías visuales (53) están situadas en las esquinas de la placa de cultivo (104), para permitir la alineación automática de una cámara del sistema de visión, adaptándose a variaciones de ubicación. Los códigos visuales pueden ser unidimensionales o bidimensionales.

Conforme a una realización de la invención, las guías visuales (53) están codificadas y seleccionadas entre códigos bidimensionales y marcadores bidimensionales (fiducial markers).

Los códigos bidimensionales, como por ejemplo QR, permiten almacenar cualquier tipo de información alfanumérica, codificada en forma de puntos formando una matriz bidimensional.

Los marcadores bidimensionales (fiducial markers) también están formados por una matriz bidimensional de puntos, pero a diferencia de los códigos bidimensionales, la información almacenada está predefinida y suele corresponderse con un número de secuencia para cada código único de un diccionario predeterminado. Por ejemplo, para el caso de los códigos April Tag, la familia 36H11 permite disponer de 518 códigos diferentes.

Los marcadores bidimensionales suelen utilizarse como índices para posicionamiento automático o detección de elementos predefinidos.

En una realización de la invención, se utiliza una combinación de ambos tipos de códigos:

Códigos bidimensionales, como puede ser QR, para la identificación única del medio de cultivo asignado a un experimento concreto;

Marcadores bidimensionales, para la calibración y ajuste de la posición exacta del medio de cultivo sobre el sistema de visión, así como para la codificación de otros datos específicos de la placa de cultivo (104) (formato, número de pocilios, etc.).

En la figura 8 se presenta una posible realización para la ubicación de estos códigos sobre una placa de cultivo (104). En las esquinas de la placa de cultivo (104), se ubican los diferentes códigos, de forma que no obstaculicen la visión de las cubetas para no interferir en la identificación visual del crecimiento del cultivo. Por una parte, se utiliza un código bidimensional de identificación libre, como QR (532), para codificar el código del soporte de cultivo y poder asociarlo a un experimento concreto. Por otra parte, se ubican los marcadores bidimensionales (533), que permiten definir las esquinas de la placa de cultivo (104) y las características de la misma.

En cada realización particular se pueden utilizar diferentes tipos y combinaciones de códigos, ubicados en distintas posiciones de las placas de cultivo (104).

Adicionalmente, conforme a una realización de la invención ilustrada en la Fig. 9, el módulo de monitorización de crecimiento comprende medios de iluminación difusa (54). Los medios de iluminación difusa (54) pueden estar situados en los bordes del portaf iltro (55).

En otra realización de la invención ilustrada en la Fig. 1 , el sistema comprende:

un módulo de control (3) que comprende:

medios de control de aireación (31): que comprenden medios de regulación PID (proporcional-integral-diferencial) configurados para mantener una presión determinada en el módulo de agitación (8) por aire, estando la presión definida por una curva de transferencia de presión con respecto al tiempo, leyendo un dato procedente del sensor de presión (83) y actuando sobre una velocidad de los medios de control de caudal (81), que pueden ser un compresor;

donde los medios de regulación de presión comprenden medios de cálculo que permiten detectar problemas en el sistema de agitación (8) por aire, como puede ser la detección de conductos taponados o filtro sucio;

medios de control de calidad de aire (32):

que comprenden una integración de sensores electrónicos de detección de gases, como puede ser la concentración de CO2, concentración de O2, compuestos orgánicos volátiles, etc.;

Estos sensores se conectan al módulo de control (3) por medio de interfaces normalizados (puertos analógicos, puerto I2C, puerto SPI);

medios de cuantificación de crecimiento de organoide (33) configurados para establecer:

un crecimiento de cada uno de los organoides a partir de las imágenes obtenidas por el sistema de visión, imágenes que pueden ser imágenes 2D; diferentes algoritmos de estimación de crecimiento, adaptables a diferentes tipos de cultivo mediante:

estimación de crecimiento mediante cuantificación de máximo contorno bidimensional de diferentes planos focales; estimación de crecimiento mediante cuantificación volumétrica sobre una reconstrucción 3D del organoide obtenida a partir de varias imágenes 2D capturadas en diferentes planos focales; medios de captura de datos en tiempo real (34) configurados para:

muestrear periódicamente una lectura del valor detectado por los sensores conectados para obtener datos capturados;

guardar los datos capturados en un dispositivo de almacenamiento a largo plazo, como una memoria flash;

El intervalo de muestreo es definible de forma independiente para cada uno de los sensores conectados; medios de envío de datos capturados a sistemas de información (35):

Los datos capturados se enviarán a los sistemas de información a través de protocolos estándar, compatibles con medios de conexión remota. En caso de utilizar conexión de red ethernet o inalámbrica WiFi, la transmisión de datos se puede realizar a través de protocolos TCP/IP estándar;

medios de conexión remota (36).

La conexión del módulo de control (3) se puede realizar a través de conexión cableada o inalámbrica. Se soportan, entre otras, las siguientes modalidades de conexión:

Red cableada ethernet

Red inalámbrica WiFi (802.11)

Conexión inalámbrica Bluetooth

Conexión cableada serie RS-232

Conexión cableada serie RS-485

Conexión cableada serie I2C

Conexión cableada serie SPI

El módulo de control (3) según la invención puede además comprender un sistema que da información a tiempo real de los parámetros físicos mencionados anteriormente: crecimiento celular, la concentración de CO2, la concentración de O2, el pH y la temperatura.

En una realización de la invención ilustrada en la Fig. 4, el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están separados por una base transparente (15).

En otra realización preferida, el número de pocilios (4) es un número par.

En otra realización preferida, el número de pocilios (4) es 6, 8, 12, 24, 48 o 96. Preferiblemente, el número de pocilios se corresponde con el número de pocilios de una placa de cultivo (104) estándar.

Conforme a una realización de la invención, el sistema está adaptado para estar en una configuración de funcionamiento y una configuración de reposo, en donde en la configuración de funcionamiento el módulo de agitación (8) está acoplado al módulo de cultivo (2) y el módulo de cultivo (2) está acoplado al módulo de monitorización de crecimiento (50); y en donde en la configuración de reposo el módulo de cultivo (2) está desacoplado del módulo de monitorización de crecimiento (50) y del módulo de agitación (8), permitiendo la separación del módulo de cultivo (2) completo.

Otra realización de la invención se refiere a un método para la esterilización de un sistema para el cultivo de organoides que comprende: proporcionar un sistema como el definido anteriormente en una configuración de reposo, de manera que el módulo de agitación (8) y el módulo de monitorización de crecimiento (50) están desacoplados del módulo de cultivo (2); extraer el módulo de cultivo (2); y someter el módulo de cultivo (2) a esterilización.

En una realización del método de la invención, la esterilización a la que se somete el módulo de cultivo (2) es autoclavado, tratamiento con peróxido de hidrógeno o tratamiento con radiación ionizante.

En otra realización de la invención ilustrada en la Fig. 3, un contenedor (1) comprende el módulo de cultivo (2) y el módulo de monitorización de crecimiento (50).

La medición a tiempo real de los parámetros anteriormente citados, como son el crecimiento celular, la concentración de CO2, la concentración de O2, el pH y la temperatura, resulta muy ventajosa para determinar el correcto crecimiento del organoide bajo unas condiciones adecuadas.

En referencia a la Fig. 4, en una realización particular, los pocilios (4) están separados del módulo de monitorización de crecimiento (50) por una base transparente (15). Esta base transparente (15) permite aislar el módulo de monitorización de crecimiento (50) en caso de un derrame de medio de cultivo y/o muestra contenida en los pocilios (4). La base transparente (15), en una realización preferida, es de cristal. Toda la información recabada desde el módulo de control (3) es accesible en cualquier momento en que el sistema está funcionando, pero puede ser también almacenada para análisis posteriores y/o control de calidad. La forma de almacenaje de la información puede ser de forma local, preferiblemente en una tarjeta de memoria, y/o de forma remota, en la nube (cloud) usando cualquier conexión de red estándar.

El sistema incluye también preferiblemente un protocolo de alarma que continuamente alerta de un fallo del sistema o de una alteración inesperada de los parámetros físicos medidos por el módulo de control (3).

EJEMPLOS Ejemplo 1

El módulo de cultivo (2) se acopla/desacopla del módulo de monitorización de crecimiento (50) tal y como se muestra en las Figs. 1 y 3.

Ejemplo 2 El módulo de cultivo (2) se esterilizó de la siguiente manera:

1. Autoclavado en autoclave STERIVAP 669 - 1 ED (BMT) a 134°C durante 7 minutos .

2. 4 fases de secado intensivo de 3 minutos cada una.

Ejemplo 3 Los organoides fueron desarrollados de dos líneas celulares tumorales previamente obtenidas de astrocitos primarios RbloxP/loxP HRasV12 (T653) y cRb-/- HRasV12 (T731) en ratón SCID. Estas células fueron cultivadas en DMEM (Dulbecco modified Eagle médium) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) a 37°C y 5% C0 ₂ .

Para establecer el cultivo de neuroesferas derivado del cultivo primario del tumor, las células T653 y T731 se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), se tripsinizaron y se recuperaron por centrifugación en PBS a 1000 rpm durante 5 minutos. Las células se resuspendieron en la mezcla de nutrientes DMEM/F-12, GlutaMAX suplementado con 1X B-27 (50X) y factores de crecimiento 0.02 pg/ml EGF (Factor de Crecimiento Epidérmico humano) y 0,02 pg/ml de bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos básico). Las células se sembraron en placas de 60 mm y se cultivaron a 37°C y 5% de CO2. Las células se mantuvieron en una incubadora humidificada durante 48h, y después de este tiempo se recuperaron por centrifugación a 1000rpm durante 5min, se resuspendieron en medio de inducción neuronal (DMEM/F-12 + GlutaMAX suplementado con 1 % de N2 (100X) , MEM-NEAA al 1% (Solución de aminoácidos no esenciales MEM 100X) y 1 pg/ml de heparina, sembradas en placas de 60mm y mantenidas en este medio de cultivo durante 48 horas a 37°C y 5% de CO2.

Después de esto, las células se cultivaron en Matrigel en placas de 60mm y en presencia de medio de cultivo de diferenciación. La composición de este medio fue 50% DMEM / F12 + GlutaMAX y 50% de medio neurobasal (1X), suplementado con 0.5% N2, 0.025% Insulina, 0.5% MEM-NEAA y 1 % de penicilina-estreptomicina, 0.035% de 2-Mercaptoetanol (dilución 1 : 1000) en DMEM/F-12 + GlutaMAX y 1% B27- sin vitamina A. Las neuroesferas se mantuvieron en Matrigel durante 72 h antes de ser transferidas al biorreactor.

Las neuroesferas se mantuvieron en el biorreactor en presencia de medio de diferenciación suplementado con B27 con vitamina A (Lancaster MA et al., 2014). El medio fue cambiado cada 72 h.