DERIVADOS DE OVIEDOMICINA, SU PROCEDIMIENTO DE OBTENCIóN

Y SUS USOS

La invención se adscribe al campo farmacéutico y en concreto se refiere a compuestos con aplicación en oncología, con estructura química derivada de oviedomicina y que se obtienen por fermentación de microorganismos.

ESTADO DE LA TéCNICA

La oviedomicina (OVM) es un policétido aromático de tipo anguciclinona producido por Streptomyces antibioticus ATCC 11891. La estructura química de la

OVM (Fig. 1) y los genes bio sintéticos responsables de su biosíntesis son conocidos

(J. Nat. Prod. 2002, 65, 779-782; Chembiochem. 2004, 5, 1181-1187). Las anguciclinonas son productos naturales que pertenecen a la familia de las anguciclinas, que se caracterizan por tener un sistema quinona en el anillo C de un sistema tetracíclico benzantraceno (Nat. Prod. Rep. 1992, 9, 103-137; Nat. Prod. Rep.

1999, 16, 425-484). Se ha descrito actividad antitumoral para varias anguciclinas, tales como la urdamicina y el 6-hidroxi-tetrangulol (J. Antibiot. 1986, 39, 1657-1669;

J. Antibiot. 1998, 51, 79-81).

La biosíntesis de OVM comienza con la generación de un policétido lineal de 20 átomos de carbono, sintetizado por una policétido sintasa y una cetorreductasa

(OvmPKST, Fig. 2). Este policétido lineal sufre una serie de ciclaciones llevadas a cabo por la aromatasa OvmA y la ciclasa OvmC (Chembiochem. 2004, 5, 1181-1187). El agrupamiento de genes responsable de la biosíntesis de OVM contiene tres genes que codifican oxigenasas dependientes de FAD (ovmOI, ovmOII, ovmOIII). Estas oxigenasas son las responsables de la introducción de grupos ceto en las posiciones C- 4 y C- 12 (parte de los sistemas quinona de los anillos A y C, respectivamente) y del grupo hidroxilo en posición C-2.

Actualmente existe una gran necesidad de nuevos agentes antitumorales, con actividad mejorada, con menos efectos secundarios indeseables y con mayor selectividad, en comparación con los fármacos actualmente en uso. Tradicionalmente,

la industria farmacéutica ha desarrollado nuevos fármacos mediante dos vías fundamentales: (1) búsqueda de nuevos productos naturales, y (2) síntesis y/o modificación química de determinados compuestos. Estos métodos siguen siendo útiles, pero suelen requerir inversiones muy importantes de recursos (tiempo, dinero, energía), pues normalmente es necesario analizar miles de productos para encontrar un nuevo compuesto prometedor. El desarrollo de la tecnología del ADN recombinante ha abierto un interesante campo de investigación para la generación de nuevos compuestos bioactivos mediante la manipulación de genes implicados en la biosíntesis de agentes antitumorales, principalmente de bacterias del grupo de los actinomicetos {Trenas Biotechnol. 2001, 19, 449-456; J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2005, 9, 77-85; Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2005, 8, 748-756; J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33, 560-568; Curr. Opin. Microbiol. 2006, 9, 252-260). Estas técnicas también pueden ser usadas para mejorar la producción de compuestos naturales ya conocidos, pues las cepas naturales suelen producir bajas concentraciones del metabolito de interés.

DESCRIPCIóN DE LA INVENCIóN

La presente invención proporciona nuevas cepas bacterianas que producen compuestos de tipo anguciclina; algunos de estos compuestos son nuevos, mientras que otros compuestos son ya conocidos. Varios de estos compuestos presentan una mayor actividad antitumoral in vitro en comparación con la actividad presentada por la OVM. Estas cepas bacterianas son obtenidas mediante la introducción de ciertos ácidos nucleicos adicionales en cepas de Streptomyces spp. no productoras de anguciclinas, en particular de Streptomyces albus. Los ácidos nucleicos mencionados codifican actividades enzimáticas implicadas en la biosíntesis de OVM, y pueden ser obtenidos a partir de Streptomyces albus ATCC 11891 o de cualquier otro microorganismo productor de OVM.

La introducción de ácidos nucleicos en Streptomyces spp. se puede realizar mediante transformación de protoplastos, conjugación, u otros métodos conocidos (tales como lo descritos en Practical Streptomyces genetics, The John Innes

Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000), de tal forma que los ácidos nucleicos son

replicables en el organismo, bien en forma de elemento extracromosómico o bien integrados en el cromosoma del organismo.

Las cepas bacterianas de esta invención pueden ser cultivadas en cualquier medio adecuado, en condiciones que permitan su crecimiento, tal como se describe en J. Nat. Prod. 2002, 65, 779-782; Chembiochem. 2004, 5, 1181-1187. Tras varios días de incubación, estos cultivos contienen una cantidad elevada de células (micelio), junto con una mezcla de compuestos, incluyendo derivados de OVM. A continuación, los cultivos son sometidos a procesos para la separación de una fase líquida (sobrenadante) y una fase sólida (micelio). Seguidamente las dos fases son sometidas, separadamente, a diversos procedimientos que pueden incluir extracción con diversos solventes orgánicos, y varios tipos de cromatografías (tales como HPLC, cromatografía líquida de alto rendimiento), con el fin de obtener los derivados de OVM en forma de compuestos puros. Los derivados de OVM tienen actividad antitumoral y antibiótica.

Asimismo, la presente invención proporciona compuestos caracterizados por las siguientes fórmulas (I), (II), (III), (IV) y (V):

donde

R ₁ , R ₂ , R3, R ₄ , R5 y Rδ son, cada uno e independientemente, hidrógeno o un grupo protector. El grupo protector puede consistir en un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo hetero cíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo ácido carboxílico, un grupo aldehido, un grupo cetona, un grupo uretano, un grupo sililo, un grupo sulfoxo o una combinación de ellos.

Xi y X ₂ son, cada uno e independientemente, hidrógeno, grupo hidroxilo o un grupo -ORi, donde Ri es un grupo protector según la definición anterior,

Z es hidrógeno o un grupo elegido de los siguientes grupos: un grupo ácido carboxílico, un grupo éster, un grupo carbonato, un grupo carbamato, un grupo uretano, un grupo hidroxilo, un grupo alquilo, un grupo cicloalquilo, un grupo cicloalquilo heterocíclico, un grupo hidroxialquilo, un grupo alquilo halogenado, un grupo alcoxialquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo arilo, un grupo arilo heterocíclico, un grupo alquilarilo, un grupo aldehido o un grupo cetona.

En particular, la presente invención proporciona, entre otros, los compuestos con las siguientes fórmulas (VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII):

La presente invención proporciona cepas para la obtención de compuestos nuevos, no obtenidos anteriormente [fórmulas (VII), (VIII), (IX) y (XIII)]. Además, la presente invención proporciona nuevas cepas para la obtención de compuestos ya descritos anteriormente [fórmulas (VI), (X), (XI) y (XII)].

Los compuestos de la invención son inhibidores de crecimiento de tumores y son por tanto útiles en el tratamiento del cáncer.

De esta forma, son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufactura de un medicamento.

Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para inhibir el crecimiento de un tumor. Tal como es usado aquí, "inhibir" significa disminuir, hacer más lento, o detener. Por tanto, un compuesto de esta invención puede disminuir, hacer más lento, o detener el crecimiento de una célula tumoral. Tal como es usado aquí, "crecimiento" significa aumento en tamaño, o proliferación, o ambos. Por tanto, un compuesto de esta invención puede inhibir el aumento de tamaño de una célula tumoral y/o puede impedir que la célula tumoral se divida y aumente el número de células tumorales. Una "célula tumoral" es una célula que constituye un neoplasma (crecimiento nuevo), el cual puede ser canceroso (maligno) o no canceroso (benigno). Una célula tumoral cancerosa puede invadir los tejidos normales a su alrededor y los vasos sanguíneos/linfáticos y formar metástasis en tejidos alejados del tumor original. Por el contrario, una célula tumoral no cancerosa puede crecer y comprimir los tejidos normales adyacentes pero no puede invadir tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos, y tampoco puede formar metástasis en tejidos alejados del tumor original.

Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X),

(XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo para tratar el cáncer.

Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufactura de un medicamento con actividad antitumoral.

Es también objeto de la presente invención el uso de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo en la manufactura de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Es también objeto de la presente invención un método de tratamiento de un sujeto, incluyendo un ser humano, diagnosticado con cáncer, que consiste en tratar a dicho sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV), (V), (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) o (XIII) o una sal o solvato farmacéuticamente aceptable.

Tal como es usado aquí, un "sujeto" puede incluir animales domesticados (por ejemplo, gatos, perros, etc.), ganado (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, conejos, cobayas, etc.) y pájaros. De manera preferente, el sujeto es un mamífero tal como un primate y, con mayor preferencia, un ser humano.

En general, una "cantidad efectiva" de un compuesto es aquella cantidad necesaria para conseguir el resultado deseado. Por ejemplo, la cantidad efectiva de un compuesto de la presente invención trata el cáncer mediante la inhibición del crecimiento de las células que constituyen el tumor, con lo que previene la invasión de tejidos normales y vasos sanguíneos/linfáticos por parte de las células tumorales y, por tanto, previene metástasis. Ejemplos de cánceres que pueden ser tratados incluyen, pero no están limitados a, pulmón, colon, ovario, próstata, testículo, melanoma, riñon, mama, sistema nervioso central y leucemia. La expresión "composición farmacéutica aceptable" consiste en un material adecuado biológicamente, es decir, que el material puede ser administrado al sujeto sin causarle efectos biológicos sustancialmente dañinos.

Las dosis o cantidades de los compuestos de la invención deben ser suficientemente grandes para producir el efecto deseado. Sin embargo, la dosis no debe ser tan grande que cause efectos secundarios adversos, por ejemplo reacciones cruzadas indeseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosis variará con la edad, condición, sexo y el grado de la enfermedad del sujeto, y puede ser determinada por cualquier experto en la materia. La dosis puede ser ajustada por cada médico, en base a la condición clínica del sujeto implicado. La dosis, régimen de dosificación y ruta de la administración pueden variarse. Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser utilizado terapéuticamente formando parte de una composición farmacéutica aceptable.

Cualquier experto en la materia puede crear composiciones farmacéuticas aceptables, las cuales pueden consistir en soluciones estériles en agua, soluciones salinas, o soluciones tamponadas a pH fisiológico. Cualquiera de los compuestos de la invención puede ser preparado en forma de composición farmacéutica. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir diversos agentes transportadores, espesantes, diluentes, tamponantes, conservantes, tensoactivos, y otros, además del compuesto de la invención. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir también ingredientes activos tales como agentes antimicrobianos, antiinflamatorios, anestésicos, etc. Los compuestos de la invención pueden ser administrados al sujeto de varias maneras distintas, dependiendo de si se desea que el tratamiento sea local o sistémico, y dependiendo del área a ser tratada. Así, por ejemplo, un compuesto de la presente invención puede ser administrado en forma de solución oftálmica, de aplicación en la superficie del ojo. Además un compuesto puede ser administrado a un sujeto por vía vaginal, rectal, intranasal, oral, por inhalación, o por vía parenteral, ya sea por ruta intradermal, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intrarrectal, intraarterial, intralinfática, intravenosa, intratecal e intratraqueal. La administración parenteral, si se emplea, se realiza generalmente mediante inyección. Los inyectables pueden ser preparados de diversas formas, tales como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para ser disueltas o puestas en suspensión antes de la inyección, o como emulsiones. Otras formas de administración parenteral emplean sistemas de liberación lenta o sostenida, de tal forma que se consigue mantener una dosis constante (ver, por ejemplo, patente US 3,710,795). Las preparaciones para la administración parenteral incluyen soluciones estériles acuosas o no acuosas, suspensiones, y emulsiones, que además pueden contener tampones y aditivos diluentes y otros. Ejemplos de solventes no acuosos son: propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables tales como etiloleato. Ejemplos de solventes acuosos son: agua, soluciones alcohólico-acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo soluciones salinas y tamponadas. Ejemplos de vehículos parenterales son: solución de cloruro sódico, dextrosa de Ringer, cloruro de sodio y dextrosa, etc. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos,

antioxidantes, quelantes, gases inertes, etc. Las formulaciones para administración tópica pueden incluir cremas, lociones, geles, gotas, supositorios, sprays, líquidos y polvos. También pueden ser necesarios o deseables ciertos transportadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, oleosas, o en polvo, espesantes, etc. Las composiciones para administración oral pueden incluir polvos o granulos, suspensiones o soluciones en agua o medio no acuoso, cápsulas, o tabletas. Puede ser deseable la inclusión de agentes espesantes, saborizantes, diluentes, emulsionantes, dispersantes, etc.

A los efectos de la presente invención y su descripción, el término "derivado" de la oviedomicina debe interpretarse como un compuesto cubierto por cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV) o (V). Del mismo modo, el término "prodroga" de la oviedomicina debe interpretarse a los efectos de la presente invención y de la descripción de la misma, como cualquier compuesto que libere, al circular en sangre o entrar en la célula, la oviedomicina o un derivado, de acuerdo con cualesquiera de las fórmulas (I), (II), (III), (IV) o (V), de las mismas.

BREVE DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Fig. 1. Estructura química de la OVM.

Fig. 2. Biosíntesis de OVM y derivados. Abreviaturas: Ac-CoA (acetil-coenzima A), MaI-CoA (malonil-coenzima A), OX (oxigenación), CYC (ciclación), -CO ₂ (descarboxilación), -H ₂ O (deshidratación), OVM (oviedomicina).

Fig. 3A. Organización genética del grupo de genes responsables de la biosíntesis de OVM.

Fig. 3B. Plásmidos usados en este trabajo, mostrando su composición genética. Los triángulos negros representan el promotor P* _e rmE.

Fig. 4A, Fig. 4B, Fig. 4C, Fig. 4D. Análisis por HPLC de extractos de cultivos de cepas de Streptomyces albus conteniendo los plásmidos pFL1031 (Fig. 4A), pFL1033 (Fig. 4B), pFL1030 (Fig. 4C) y pFL1146 (Fig. 4D). Identifϊcador de los picos: VI = rabelomicina; VII = prejadomicina 2-carboxilato; VIII = 5-hidroxi-dehidro-

rabelomicina; IX = 4a,12b-dehidro-UWM6; X = prejadomicina; XI = UWM6; XII = 5-hidroxi-rabelomicina; XIII = 9-hidroxi-rabelomicina.

Fig. 5. Estructuras químicas de oviedomicina (OVM), rabelomicina [fórmula (VI)], prejadomicina-2-carboxilato [fórmula (VII)], 5-hydroxi-dehidro-rabelomicina [fórmula (VIII)], 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)], prejadomicina [fórmula (X)], UWM6 [fórmula (XI)], 5-hidroxi-rabelomicina [fórmula (XII)], y 9-hidroxi- rabelomicina [fórmula (XIII)].

EXPLICACIóN DE UNA FORMA DE REALIZACIóN PREFERENTE Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.

En los siguientes ejemplos se emplean técnicas de manipulación de DNA bien conocidas en el estado de la técnica, tales como las descritas por Sambrook y colaboradores (Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd ed., CoId Spring Harbor

Laboratory Press, New York, 1989), y por Kieser y colaboradores (Practical

Streptomyces genetics, The John Innes Foundation, Norwich, Gran Bretaña, 2000).

Ejemplo 1. Construcción del plásmido pFL1028. Para la construcción del plásmido pFL1028, se digirió el cósmido cosAB4 (J.

Nat. Prod. 2002, 65, 779-782; Chembiochem. 2004, 5, 1181-1187) con los enzimas de restricción Bful y Sgβ, y se obtuvo un fragmento de DNA de 10906 bp cuyos extremos fueron hechos romos. Este fragmento de DNA fue subclonado en pEM4A {Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177-1186), el cual había sido previamente digerido con EcoRI y sus extremos hechos romos, generándose el plásmido pFL1028. En este plásmido, los genes ovmOI, ovmC, ovmP, ovmK, ovmS, ovmT, ovmA, ovmOII, ovmOIII y ovmF se expresan bajo el control del promotor ermE*τp (Fig. 3).

Ejemplo 2. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces albus (pFL1030).

La cepa Streptomyces albus (pFL1030) se generó a partir de Streptomyces albus Jl 074 (J. Gen. Microbiol. 1980, 116, 323-334) mediante la introducción del plásmido pFL1030. Para la construcción del plásmido pFL1030, se digirió el plásmido pFL1028 con los enzimas de restricción Bful y Kpnl, y se obtuvo un fragmento de

DNA de 8966 bp. Este fragmento de DNA (después de hacer romos sus extremos) fue clonado en pEM4A, el cual había sido previamente digerido con EcoKl y sus extremos hechos romos, generándose el plásmido pFL1030. En este plásmido, los genes ovmOI, ovmC, ovmP, ovmK, ovmS, ovmT, ovmA y ovmOII se expresan bajo el control del promotor P* _erm£ (Fig. 3).

La cepa Streptomyces albus (pFL1030) fue depositada con fecha 26/02/2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT 7381.

Ejemplo 3. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces albus (pFL1031).

La cepa Streptomyces albus (pFL1031) se generó a partir de Streptomyces albus Jl 074 (J. Gen. Microbiol. 1980, 116, 323-334) mediante la introducción del plásmido pFL1031. Para la construcción del plásmido pFL1031, se digirió el plásmido pFL1028 con los enzimas de restricción Sphl y Xhol para obtener un fragmento de 5487 bp. Este fragmento de DNA (después de hacer romos sus extremos) fue clonado en pEM4A, el cual había sido previamente digerido con EcoBl y sus extremos hechos romos, generándose el plásmido pFL1031. En este plásmido, los genes ovmC, ovmP, ovmK, ovmS, ovmT, y ovmA se expresan bajo el control del promotor ^~ P* _er mE (Fig. 3). La cepa Streptomyces albus (pFL1031) fue depositada con fecha 26/02/2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso CECT 7380.

Ejemplo 4. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces albus (pFL1033).

La cepa Streptomyces albus (pFL1033) se generó a partir de Streptomyces albus Jl 074 (J. Gen. Microbiol. 1980, 116, 323-334) mediante la introducción del plásmido pFL1033. Para la construcción del plásmido pFL1033, se digirió el plásmido pFL1028 con los enzimas de restricción Bful y Xhol para obtener un fragmento de

6804 bp. Este fragmento de DNA (después de hacer romos sus extremos) fue clonado en pEM4A, el cual había sido previamente digerido con EcoRl y sus extremos hechos romos, generándose el plásmido pFL1033. En este plásmido, los genes ovmOI, ovmC, ovmP, ovmK, ovmS, ovmT, y ovmA se expresan bajo el control del promotor ^~ P* _er mE (Fig. 3)

Ejemplo 5. Obtención de la cepa bacteriana Streptomyces albus (pFL1146).

La cepa Streptomyces albus (pFL1146) se generó a partir de Streptomyces albus Jl 074 (J Gen. Microbiol. 1980, 116, 323-334) mediante la introducción del plásmido pFLl 146. Para la construcción del plásmido pFLl 146, se digirió el plásmido pFL1028 con el enzima de restricción Salí para obtener un fragmento de 2541 bp que contenía el gen ovmOIII. Este fragmento de DNA fue clonado en el sitio Salí de pUC18, generando el plásmido pFLl 142. Este plásmido fue digerido con HmdlII, sus extremos hechos romos y posteriormente digerido con Xbal, para obtener un fragmento conteniendo el gen ovmOIII que fue clonado en los sitios Xbal y PstI (este último sitio hecho romo) del vector pIAGO (Mol. Microbiol. 1998, 28, 1177-1186), generándose el plásmido pFL1144. Finalmente, se obtuvo un fragmento EcoRl- Hindlϊl (con extremos romos) a partir de pFL1144, conteniendo ovmOIII bajo el control del promotor V _ermE , el cual fue clonado en el sitio HindIII (hecho romo) de pFL1033, generándose el plásmido pFL1146. Este plásmido contiene los genes ovmOI, ovmC, ovmP, ovmK, ovmS, ovmT, y ovmA bajo el control del promotor V* _ermE , y el gen ovmOIII bajo el control del promotor F _erm E (Fig. 3).

La cepa Streptomyces albus (pFL1146) fue depositada con fecha 26/02/2008 en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), Universidad de Valencia, Campus de Burjassot, 46100 Burjassot (Valencia, España) con el número de acceso

CECT 7379.

Ejemplo 6. Producción de los compuestos de fórmulas (VI-XIII).

Para la purificación de los derivados de OVM, las cepas S. albus (pFL1030), S. albus (pFL1031), S. albus (pFL1033) y S. albus (pFL1146) fueron cultivadas en medio R5A empleando un método de cultivo en dos pasos, tal como se ha descrito anteriormente (J. Bacteriol. 1998, 180, 4929-4937). En el paso de producción, se emplearon 8 matraces Erlenmeyer de 2 litros, cada uno de ellos conteniendo 400 mi de medio, los cuales fueron incubados durante 5 días. Los cultivos fueron centrifugados y filtrados, y el sobrenadante fue extraído en fase sólida tal como se ha descrito (Chem. Biol. 2002, 9, 519-531). En el caso de la cepa S. albus (pFL1031), el sobrenadante fue acidificado a pH 4,0 con ácido fórmico antes de la extracción. Las fracciones obtenidas fueron analizadas por HPLC-MS empleando un equipo cromato gráfico acoplado a un espectrómetro de masas ZQ4000 (Waters - Micromass), usando como solventes acetonitrilo y 0.1% ácido trifluoroacético (TFA) en agua, y una columna de fase reversa (Symmetry C 18, 2.1 x 150 mm, Waters). Las muestras fueron eluidas con 10% acetonitrilo durante los primeros 4 min., seguido de un gradiente lineal 10-88% acetonitrilo durante 26 min., a un flujo de 0.25 ml/min. La detección y la caracterización espectral de los picos fue realizada con un detector de fotodiodos y software Empower (Waters). Los análisis de MS fueron hechos mediante ionización de electrospray en modo positivo, con un voltaje de capilar de 3 kV y voltajes de cono de 20 y 100 V. Aquellas fracciones que contenían derivados de OVM fueron secadas en vacío. Estos extractos fueron disueltos y cromatografiados en una columna μBondapak Cl 8 de compresión radial (PrepPak Cartridge, 25 x 100 mm, Waters) o en una columna preparativa (SunFire Prep C18, 10 x 250 mm, Waters). Para cada compuesto, se optimizaron eluciones isocráticas con mezclas de acetonitrilo o metanol y 0.1% TFA en agua, a 10 ml/min. En todos los casos, después de cada paso de purificación, los compuestos recogidos fueron diluidos 4 veces con agua y fueron desalados y concentrados mediante extracción en fase sólida, para ser finalmente liofilizados. La Fig. 4 muestra los cromatogramas resultantes de las cuatro cepas utilizadas. De esta manera se obtuvieron los siguientes compuestos (Fig. 5). A partir de S. albus (pFL1030): 2,0 mg de 5-hydroxi-dehidro-rabelomicina [fórmula (VIII)]. A partir de S. albus (pFL1031): 5,7 mg de prejadomicina-2-carboxilato [fórmula (VII)],

4,2 mg de rabelomicina [fórmula (VI)], 17,8 mg de prejadomicina [fórmula (X)], 21,5 mg de UWM6 [fórmula (XI)], 3,7 mg de 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)]. A partir de S. albus (pFL1033): 7,3 mg de 5-hidroxi-rabelomicina [fórmula (XII)], 37,3 mg de rabelomicina [fórmula (VI)]. A partir de S. albus (pFL1146): 13,8 mg de 9- hidroxi-rabelomicina [fórmula (XIII)], 33,0 mg de rabelomicina [fórmula (VI)]. Tal como se describe en el Ejemplo 7, algunos de estos compuestos son ya conocidos [fórmulas (VI, X, XI, XII)], mientras que otros son producidos aquí por primera vez [fórmulas (VII, VIII, IX, XIII)].

Ejemplo 7. Caracterización de los compuestos de fórmulas (VI), (VII),

(VIII), (IX), (X), (XI), XII) y (XIII)

Las estructuras de los compuestos de fórmulas (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) y (XIII), aislados de la forma descrita en el Ejemplo 6, fueron estudiadas mediante espectrometría de masas (MS) y espectrometría de resonancia magnética nuclear (NMR). Los espectros ESI-MS (ionización por electrospray-MS) fueron adquiridos empleando un espectrómetro Finnigan LCQ. Los espectros de masas de ionización por impacto de electrones (EI) fueron medidos empleando un espectrómetro Finnigan PolarisQ. Los espectros de masas de ionización EI de alta resolución fueron realizados a 25 eV en una estación JEOL JMS-700T M (instrumento de sector magnético) a una resolución mayor de 10000. Todos los datos de NMR fueron obtenidos en ¿4-DMSO empleando un espectrómetro Varían Mercury 300, o bien un espectrómetro Varían Inova 400 MHz. Todas las asignaciones de NMR fueron confirmadas mediante espectros de correlación heteronuclear de quanto único (HSQC, heteronuclear single quantum correlation) y de correlación heteronuclear de enlace múltiple (HMBC, heteronuclear múltiple bond correlation), lo cual permitió la asignación inequívoca de todas las señales.

Los compuestos de fórmulas (VI), (X), (XI) y (XII) fueron identificados como los ya conocidos rabelomicina, prejadomicina, UWM6 y 5-hidroxi-rabelomicina, respectivamente, mediante la comparación de sus datos de NMR con datos publicados anteriormente (Microbiology 2000, 146, 147-154; J. Magn. Reson. 2000, 146, 232- 239 ; J. Nat. Prod. 2002, 65, 221-244; WO 02/074800 2002). La rabelomicina [fórmula (VI)] y el compuesto UWM6 [fórmula (XI)] han sido aislados previamente

como productos de varias rutas biosintéticas (J. Antibiot. 1970, 23, 437-441; Microbiology 1996, 142, 123-132; J Antibiot. 2004, 57, 502-510; ChemBioChem 2005, 6, 1-8; J 5io/. C/zem. 2005, 280, 22508-22514; Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7842-7846; J Am. Chem. Soc. 2004, 126, 12262-12263; J Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1786-1794; J Am. Chem. Soc. 2004, 126, 4496-4497; Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 1291-1296). La única diferencia existente entre prejadomicina [fórmula (X)] y UWM6 [fórmula (XI)] es la hidratación de su enlace 2,3-enoil. El compuesto UWM6 es inestable y se convierte espontáneamente en rabelomicina [fórmula (VI)] mediante deshidratación y oxidación (J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 1786-1794). Los compuestos producidos y descritos aquí por primera vez son: prejadomicina-2-carboxilato [fórmula (VII)], 5-hidroxi-dehidro-rabelomicina [fórmula (VIII)], 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)], y 9-hidroxi-rabelomicina [fórmula (XIII)]. Estos compuestos poseen las siguientes propiedades físico-químicas:

Prejadomicina-2-carboxilato [fórmula (VII)]: sólido amarillo; 1.8 mg/L; R _re i = 18.1 min; máximos en UV (medidos con detector de fotodiodos en HPLC): 266

(69%), 280 (100), 407 (29%); (-)-APCI-MS: m/z 367 ([M-H], 100); (+)-APCI-MS: m/z (%) = 369 ([M+H] ⁺ , 100); HREI-MS (m/z 368.0834; calculado 368.0896 para

C ₂₀ Hi ₆ O ₇ ); los datos de ¹ H y ¹³ C NMR se muestran en la Tabla 1.

5-hidroxi-dehidro-rabelomicina [fórmula (VIII)]: sólido verde; 0.6 mg/L; R _re i = 31.1 min; máximos en UV (medidos con detector de fotodiodos en HPLC): 224

(44%), 345 (67%), 456 (15 %); (-)-APCI-MS: m/z (%) = 335 ([M-H], 100); (+)-APCI-

MS: m/z (%) = 337 ([M+H] ⁺ , 100); HREI-MS (m/z 336.0642; calculado 336.0634 para C19H12O6); los datos de ¹ H y ¹³ C NMR se muestran en la Tabla 2.

4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)]: sólido amarillo; 1.2 mg/L; R _re i = 21.2 min; máximos en UV (medidos con detector de fotodiodos en HPLC): 241

(45%), 259 (89%), 403 (16%); (-)-APCI-MS: m/z (%) = 323 ([M-H], 100); (+)-APCI-

MS: m/z (%) = 325 ([M+H] ⁺ , 100); HREI-MS (m/z 324.0909; calculado 324.0998 para Ci ₉ Hi ₆ O ₅ ); los datos de ¹ H y ¹³ C NMR se muestran en la Tabla 3.

9-hidroxi-rabelomicina [fórmula (XIII)]: sólido amarillo; 4.3 mg/L; R _re i =16.8 min; máximos en UV (medidos con detector de fotodiodos en HPLC): 271 (75

%), 286 (100%), 437 (20 %); (-)- APCI-MS: m/z (%) = 353 ([M-H], 100); (+)-APCI-

MS: m/z (%) = 355 ([M+H] ⁺ , 100); HREI-MS (m/z 354.0714; calculado 354.0739 para C ₁₉ H ₁₄ O ₇ ); los datos de ¹ H y ¹³ C NMR se muestran en la Tabla 4.

En una publicación anterior, se ha sugerido que el compuesto 4a,12b-dehidro- UWM6 [fórmula (IX)] podría encontrarse en equilibrio con la prejadomicina (fórmula X) a través de una reacción de reordenación intramolecular de Michael (Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7842-7846). Quede claro que en dicha publicación la estructura de fórmula IX fue propuesta únicamente como hipotética. La presente solicitud describe por vez primera la producción y caracterización del compuesto 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)].

Ejemplo 8. Actividad antitumoral de los compuestos de fórmula (VI), (VII), (VIII), (IX), (X), (XI), (XII) y (XIII).

Los derivados de OVM se ensayaron frente a una serie de líneas celulares procedentes de tumores. Se determinó cuantitativamente el crecimiento celular y la viabilidad, utilizando un ensayo tipo colorimétrico, usando la reacción con sulforrodamina B (SRB), según la técnica descrita por Faircloth y colaboradores {Journal of Tissue and Culture Methods 1988, 11, 201-205). Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Se inoculan placas de "microtiter" de 96 pocilios, con células (5xlO ³ células por pocilio) en alícuotas de 195 μl de medio, incubándolas durante 18 h, en medio sin compuesto añadido, para permitir que las células se adhieran a la superficie. A continuación, se añaden los compuestos a ensayar, en muestras de 5 μl, en un rango de concentraciones de 10 a 10 ^"8 μg/ml, disueltas en DMSO/EtOH (0.2% en tampón PS).

Tras 48 h de exposición, se mide el efecto antitumoral utilizando la técnica de SRB: se fijan las células añadiendo 50 μl de ácido tricloroacético frío al 50% (p/v) y se incuba durante 60 min. a 4 ⁰ C. Las placas se lavan con agua desionizada y se secan. Se añaden

100 μl de solución de SRB (0.4% p/v en ácido acético al 1%) a cada pocilio, y se incuba durante 10 min. a temperatura ambiente. Se elimina la SRB no unida, lavando con ácido acético al 1%. Las placas se secan al aire y el colorante unido se disuelve con tampón Tris. Se leen las densidades ópticas en un lector espectrofotómetro de placas automático a una longitud de onda de 490 nm.

En la Tabla 5 se muestran los resultados de las GI50 (inhibición del crecimiento). La mayoría de los compuestos mostraron una actividad antitumoral semejante a la de la OVM. Sin embargo, los compuestos prejadomicina-2-carboxilato [fórmula (VII)], 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)] y prejadomicina [fórmula (X)] mostraron actividades claramente superiores a la de la OVM, con valores GI50 de rango submicro molar. Estos resultados sugieren que la ausencia de oxigenación en la posición C- 12 aumenta la actividad antitumoral de esta clase de compuestos. Por tanto, la eliminación de la oxigenasa OvmOI (responsable de dicha oxigenación) es útil para la producción de anguciclinas más activas.

Tabla 1. Datos de NMR de prejadomicina 2-carboxilato [fórmula (VII)] en J ₆ -DMSO

( ¹ H a 400 MHz, 1 ¹ 3X/ a 100 MHz).

^[a] Intercambiable con D ₂ O.

Tabla 2. Datos de espectros de NMR de 5-hidroxi-dehidro-rabelomicina [fórmula (VIII)] en J ₆ -DMSO ( ¹ H a 400 MHz, ¹³ C a 100 MHz).

Tabla 3. Datos de espectros de NMR de 4a,12b-dehidro-UWM6 [fórmula (IX)] en d ₆ - DMSO ( ¹ H a 400 MHz, ¹³ C a 100 MHz).

Tabla 4. Datos de espectros de NMR de 9-hidroxi-rabelomicina [fórmula (XIII)] en J ₆ -DMSO ( ¹ H a 400 MHz, ¹³ C a 100 MHz).

Tabla 5 Ensayo de la actividad antitumoral de derivados de OVM frente a líneas celulares tumorales. Se incluyen también los datos obtenidos con OVM, como referencia. Los valores numéricos hacen referencia a la GI50 (μM), o concentración a la que el compuesto ensayado inhibe el 50% del crecimiento celular en comparación con células no tratadas, fórmula VI: rabelomicina; fórmula VII: prejadomicina 2- carboxilato; fórmula VIII: 5-hidroxi-dehidro-rabelomicina; fórmula IX: 4a, 12b- dehidro-UWM6; fórmula X: prejadomicina; fórmula XI: UWM6; fórmula XII: 5- hidroxi-rabelomicina; fórmula XIII: 9-hidroxi-rabelomicina.