Verschiedene biosynthetische Produkte, wie beispielsweise Feinchemikalien, wie unter anderem Aminosäuren, Vitamine aber auch Proteine werden über natürliche Stoff- wechselprozesse in Zellen hergestellt und werden in vielen Industriezweigen verwen- det, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik-, Feed-, Food-und pharmazeutischen Industrie. Diese Substanzen, die zusammen als Feinchemika- lien/Proteine bezeichnet werden, umfassen unter anderem organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlenhydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, sowie Proteine und Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am zweckmäßigsten im Großmaßstab mittels Anzucht von Bakterien, die entwickelt wurden, um große Mengen der jeweils gewünschten Substanz zu produzieren und sezernieren. Für die- sen Zweck besonders geeignete Organismen sind coryneforme Bakterien, gram- positive nicht-pathogene Bakterien.

Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der großen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet.

Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen, wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien, wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zum Produkt, beispielsweise durch lonenaustauschchroma- tographie aber auch Sprühtrocknung, oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.

Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von Feinchemikalien/Proteine produzierender Stämme von Cory- nebacterium eingesetzt, indem man einzelne Gene amplifiziert und die Auswirkung auf die Produktion von Feinchemikalien/Proteine untersucht.

Andere Wege, um ein Verfahren für die Herstellung Feinchemikalien, Aminosäuren oder Proteine zu entwickeln, oder die Produktivität eines bereits existierenden Verfah- rens für die Herstellung Feinchemikalien, Aminosäuren oder Proteine zu erhöhen bzw. zu verbessern, sind die Expression eines oder mehrerer Gene zu erhöhen bzw. zu verändern und oder die Translation einer mRNA durch geeignete Polynukleotidse- quenzen zu beeinflussen. Beeinflussung kann in diesem Zusammenhang die Erhö- hung, Verringerung, oder auch andere Parameter der Expression von Genen wie zeitli- che Expressionsmuster umfassen.

Dem Fachmann sind unterschiedliche Bestandteile von bakteriellen Regulationsse- quenzen bekannt. Man unterscheidet die Bindungstellen von Regulatoren, auch Opera- toren genannt, die Bindungstellen von RNA-Polymerase-Holoenzymen, auch-35 und - 10 Regionen genannt, und die Bindungsstelle von Ribosomaler 16S-RNA, auch Ribo- somale Bindungsstelle oder auch Shine-Dalgarno-Sequenz genannt.

Als Sequenz einer Ribosomalen Bindungsstelle, auch Shine-Dalgarno-Sequenz ge- nannt, im Sinne dieser Erfindung werden Polynukleotidsequenzen verstanden, die sich bis zu 20 Basen stromauf des Initiationskodon der Translation befinden.

In der Literatur (E. coli und S. typhimurium, Neidhardt F. C. 1995 ASM Press) wird be- schrieben, dass sowohl die Zusammensetzung der Polynukletidsequenz der Shine- Delgarno-Sequenz, die Sequenzabfolge der Basen, aber auch der Abstand einer in der Shine-Delgarno-Sequenz enthaltenen Polynukletidsequenz zum einen wesentlichen Einfluss auf die Initiationstionsrate der Translation hat.

Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität können die Bildung von mRNA auf un- terschiedliche Weise beeinflussen. Promotoren, deren Aktivität unabhängig von der physiologischen Wachstumsphase des Organismus sind, nennt man konstitutiv. Wie- derum andere Promotoren reagieren auf externe chemische, wie physikalische Stimuli wie Sauerstoff, Metabolite, Hitze, pH, etc.. Wiederum andere zeigen in unterschiedli- chen Wachstumsphasen eine starke Abhängigkeit ihrer Aktivität. Beispielsweise sind in der Literatur Promotoren beschrieben, die während der exponentiellen Wachstums- phase von Mikroorganismen eine besonders ausgeprägte Aktivität zeigen, oder aber auch genau in der stationären Phase des mikrobiellen Wachstums. Beide Charakteris- tika von Promotoren können für eine Produktion von Feinchemikalien und Proteine je nach Stoffwechselweg einen günstigen Einfluss auf die Produktivität haben.

Zum Beispiel kann man Promotoren die während des Wachstums die Expresssion ei- nes Gens ausschalten, diese aber nach einem optimalen Wachstum anschalten dazu nutzen, ein Gen zu regulieren, das die Produktion eines Metaboliten kontrolliert. Der

veränderte Stamm weist dann die gleichen Wachstumsparameter wie der Ausgangs- stamm auf, produziert aber mehr Produkt pro Zelle. Diese Art der Modifizierung kann sowohl den Titer (g Produkt/Liter) als auch die C-Ausbeute (g Produkt/g-C-Quelle) er- höhen.

In Corynebacterium Spezies konnten bereits solche Nukleotidsequenzen isoliert wer- den, die für eine Erhöhung bzw. eine Abschwächung der Genexpression genutzt wer- den können. Diese regulierten Promotoren können die Rate, mit der ein Gen transkri- biert wird, abhängig von den internen und/oder externen Bedingungen der Zelle erhö- hen oder erniedrigen. Zum Teil kann die Anwesenheit eines bestimmten Faktors, be- kannt als Inducer, die Rate der Transkrition vom Promotor stimulieren. Inducer können direkt oder aber indirekt die Transkription vom Promotor beeinflussen. Eine andere Klasse von Faktoren, bekannt als Suppressoren ist in der Lage, die Transkription vom Promotor zu reduzieren oder aber zu inhibieren. Wie auch die Inducer, können auch die Suppressoren direkt oder indirekt wirken. Es sind jedoch auch Promotoren bekannt, die über die Temperatur reguliert werden. So kann der Level der Transkription solcher Promotoren zum Beispiel durch eine Erhöhung der Wachstumstemperatur über die normale Wachstumstemperatur der Zelle erhöht oder aber abgeschwächt werden.

Eine geringe Anzahl von Promotoren aus C. glutamicum wurden bis zum heutigen Tag beschrieben. Der Promotor des Malatsynthase-Gens aus C. glutamicum wurde im DE 4440118 beschrieben. Dieser Promotor wurde einem für ein Protein kodierendes Struk- turgen vorgeschaltet. Nach Transformation eines solchen Konstrukts in ein corynefor- mes Bakterium wird die Expression des dem Promotor nachgeschalteten Strukturgen reguliert. Die Expression des Strukturgens wird induziert sobald dem Medium ein ensprechender Induktor zugesetzt wird.

Reinscheid et al., Microbiology 145 : 503 (1999) haben eine trankriptionelle Fusion zwi- schen dem pta-ack Promotor aus C. glutamicum und einem Reportergen (Chlo- ramphenicol Acetyltransferase) beschrieben. Zellen von C. glutamicum, die eine solche transkriptionelle Fusion enthalten, wiesen eine erhöhte Expression des Reportergenes bei Wachstum auf Acetat haltigem Medium auf. Im Vergleich dazu zeigten transfor- mierte Zellen, die auf Glucose wuchsen, keine erhöhte Expression dieses Reporter- gens.

In Pa'tek et al., Microbiology 142 : 1297 (1996) wurden einige DNA Sequenzen aus C. glutamicum beschrieben, die die Expression eines Reportergens in C. glutamicum Zel- len verstärken können, beschrieben. Diese Sequenzen wurden miteinander verglichen, um Consensus-Sequenzen für C. giutamicum Promotoren zu definieren.

Weitere DNA-Sequenzen aus C. glutamicum, die zur Regulation der Genexpression genutzt werden können, sind im Patent WO 02/40679 beschrieben worden. Diese iso- lierten Polynukleotide stellen Expressionseinheiten aus Corynebakterium glutamicum dar, die entweder zur Erhöhung oder aber zur Verringerung einer Genexpression ge- nutzt werden können. Weiterhin sind in diesem Patent rekombinante Plasmide be- schrieben, auf denen die Expressionseinheiten aus Corynebakterium glutamicum mit heterologen Genen assoziiert sind. Die hier beschrieben Methode, Fusion von einem Promotor aus Corynebakterium glutamicum mit einem heterogen Gen, kann unter an- derem zur Regulation der Gene der Aminosäurebiosynthese eingesetzt werden.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde weitere Promotoren und/oder Expressions- einheiten mit vorteilhaften Eigenschaften zur Verfügung zustellen.

Demgemäß wurde gefunden, dass man Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, enthal- tend A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleo- tiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nuklein- säureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 un- ter stringenten Bedingungen hybridisiert oder D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C) zur Transkription von Genen verwenden kann.

Unter"Transkription"wird erfindungsgemäß der Prozess verstanden, durch den aus- gehend von einer DNA-Matrize ein komplementäres RNA-Molekül hergestellt wird. An diesem Prozess sind Proteine wie die RNA-Polymerase sogenannte Sigma-Faktoren und transkriptionelle Regulatorproteine beteiligt. Die synthetisierte RNA dient dann als Matrize im Prozess der Translation, der dann zum biosynthetisch aktiven Protein führt.

Die Bildungsrate, mit der ein biosynthetsich aktives Protein hergestellt wird, ist ein Pro- dukt aus der Rate der Transkription und der Translation. Beide Raten können erfin- dungsgemäß beeinflusst werden und damit die Rate der Bildung von Produkten in ei- nem Mikroorganismus beeinflussen.

Unter einem"Promotora oder einer"Nukleinsäure mit Promotoraktivität"wird erfin- dungsgemäß eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Verknüpfung mit einer zu trankripierenden Nukleinsäure, die Transkription dieser Nukleinsäure reguliert.

Unter einer"funktionellen Verknüpfung"versteht man in diesem Zusammenhang bei- spielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und einer zu transkribierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel Nukleinsäureseuqenzen, die die Transkription von Nukleinsäuren gewährleisten, sowie zum Beipsiel einen Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüp- fung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Bei- spiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positio- nen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevor- zugt sind Anordnungen, in denen die zu trankribierende Nukleinsäuresequenz hin- ter (d. h. am 3'-Ende) der erfindungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nuklein- säuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Unter Promotoraktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA, also die Trankriptionsrate verstanden.

Unter spezifischer Promotoraktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch den Promotor gebildete Menge RNA pro Promotor verstanden.

Unter dem Begriff"Wildtyp"wird erfindungsgemäß der entsprechende Ausgangsmikro- organismus verstanden.

Je nach Zusammenhang kann unter dem Begriff"Mikroorganismus"der Ausgangsmik- roorganismus (Wildtyp) oder ein erfindungsgemäßer, genetisch veränderter Mikroorga- nismus oder beides verstanden werden.

Vorzugsweise und insbesondere in Fällen, in denen der Mikroorganismus oder der Wildtyp nicht eindeutig zugeordnet werden kann, wird unter"Wildtyp"für die Verände- rung oder Verursachung der Promotoraktivität oder Trankriptionsrate, für die Verände- rung oder Verursachung der Expressionsaktivität oder Expressionsrate und für die Er- höhung des Gehalts an biosynthetischen Produkten jeweils ein Referenzorganismus

verstanden.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist dieser Referenzorganismus Corynebakteri- um glutamicum ATCC 13032.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden Ausgangsmikroorganismen verwendet die bereits in der Lage sind, die gewünschte Feinchemikalie herzustellen. Besonders bevorzugt sind dabei unter den besonders bevorzugten Mikroorganismen der Bakterien der Gattung Corynebacterien und den besonders bevorzugten Feinchemikalien L- Lysin, L-Methionin und L-Threonin, diejenigen Ausgangsmikroorganismen die bereits in der Lage sind, L-Lysin, L-Methionin und/oder L-Threonin herzustellen. Dies sind be- sonderes bevorzugt Corynebakterien bei denen beispielsweise das Gen kodierend für eine Aspartokinase (ask-Gen) dereguliert ist oder die feed-back-Inhibierung aufgeho- ben oder reduziert ist. Beispielsweise weisen solche Bakterien im ask-Gen eine Muta- tion auf, die zu einer Reduzierung oder Aufhebung der feed-back-Inhibierung führen, wie beispielsweise die Mutation T3111.

Bei einer uverursachten Promotoraktivitäta oder Transkriptionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung einer RNA verursacht, die im Wildtyp so nicht vorhanden war.

Bei einer veränderten Promotoraktivität oder Transkriptionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit die gebildete Menge der RNA verändert.

Unter"verändert"wird in diesem Zusammenhang bevorzugt erhöht oder erniedrigt ver- standen.

Dies kann beispielsweise durch Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Promo- toraktivität des endogenen erfindungsgemäßen Promotors, beispielsweise durch Muta- tion des Promotors oder durch Stimmulierung oder Hemmung des Promotors erfolgen.

Weiterhin kann die erhöhte Promotoraktivität oder Transkriptionsrate beispielsweise durch Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs- gemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität erreicht werden, wobei die Gene in Bezug auf die Nuk- leinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Vorzusgweise wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäu-

ren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität dadurch erreicht, dass man eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebe- nenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un- ter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotorak- tivität gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en- dogenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nuklein- säure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotorakti- vität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität enthalten A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleo- tiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nuklein- säureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 un- ter stringenten Bedingungen hybridisiert oder D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C) Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 stellt die Promotorsequenz des Protein Translation Elongations Faktor TU (P EF-TU) aus Corynebakterium glutamicum dar.

SEQ. ID. NO. 1 entspricht der Promotorsequenz des Wildtyp.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäuren mit Promotoraktivität enthaltend eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Se- quenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße Promotoren lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Se- quenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Daten-

banken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO : 1 leicht auffinden.

Künstliche erfindungsgemäße Promotor-Sequenzen lassen sich ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 1 durch künstliche Variation und Mutation, beispielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffinden.

Unter dem Begriff"Substitution"ist in der Beschreibung der Austausch einer oder meh- rerer Nukleotide durch ein oder mehrere Nukleotide zu verstehen. Deletion"ist das Ersetzen eines Nukleotides durch eine direkte Bindung. Insertionen sind Einfügungen von Nukleotiden in die Nukleinsäuresequenz, wobei formal eine direkte Bindung durch ein oder mehrere Nukleotide ersetzt wird.

Unter Identität zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleotide über die jeweils gesamte Nukleinsäurelänge verstanden, insbesondere die Identität die durch Vergleich mit Hilfe der Vector NTI Suite 7.1 Software der Firma Informax (USA) unter Anwendung der Clustal Methode (Higgins DG, Sharp PM. Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl. Biosci. 1989 Apr ; 5 (2) : 151-1) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Multiple alignment parameter : Gap opening penalty 10 Gap extension penalty 10 Gap separation penalty range 8 Gap separation penalty off % identity for alignment delay 40 Residue specific gaps off Hydrophilic residue gap off Transition weighing 0 Pairwise alignment parameter : FAST algorithm on K-tuplesize 1 Gap penalty 3 Window size 5 Number of best diagonals 5 Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 1 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 1, ins-

besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 90 % aufweist.

Besonders bevorzugte Promotoren weisen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

1 eine Identität von 91 %, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%,'96%, 97%, 98%, beson- ders bevorzugt 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für Promotoren lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 1 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Nukleinsäuren mit Promotoraktivi- tät, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID.

No. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als12, 15,30, 50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleotide.

Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Mani- atis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biolo- gy, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6 beschrieben : Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden : Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0, 1 x SSC bei 65°C.

Unter einem funktionell äquivalenten Fragment"werden für Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität, Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische Promotoraktivität aufweisen wie die Ausgangssequenz.

Unter"im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Promotoraktivität verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Promotoraktivität der Ausgangsse- quenz aufweist.

Unter"Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform A), B) oder C) beschriebenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität verstanden. Vorzusgweise weisen diese Fragmente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevorzugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 als Promotor, d. h. zur Transkriptiion von Genen.

Die SEQ. ID. NO. 1 ist ohne Funktionszuordnung im Genbank-Eintrag AP005283 be- schrieben worden. Daher betrifft die Erfindung ferner die neuen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen mit Promotoraktivität.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität, enthaltend A) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 oder B) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 aufweist oder C) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 1 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder D) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter A), B) oder C), mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 1 ausgenom- men ist.

Alle vorstehend erwähnten Nukleinsäuren mit Promotoraktivität sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäurebausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oli- gonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamidit- methode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die An- lagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow- Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonie- rungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Expressionseinheit, enthaltend eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und zusätzlich funktionell

verknüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Transiation von Ribonukleinsäuren ge- währleistet, zur Expression von Genen.

Unter einer Expressioneinheit wird erfindungsgemäß eine Nukleinsäure mit Expressi- onsaktivität verstanden, also eine Nukleinsäure verstanden, die in funktioneller Ver- knüpfung mit einer zu exprimierenden Nukleinsäure oder Gens, die Expression, also die Transkription und die Translation dieser Nukleinsäure oder dieses Gens reguliert.

Unter einer funktionellen Verknüpfung"versteht man in diesem Zusammenhang bei- spielsweise die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Expressionsein- heit und einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer re- gulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulati- ven Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter (d. h. am 3'-Ende) der erfindungsgemäßen Expressionseinheitssequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwi- schen der Expressionseinheitssequenz und der transgen zu exprimierende Nuklein- säuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner-als 50 Basenpaare.

Unter Expressionsaktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge Protein, also die Expressionsrate verstanden.

Unter spezifischer Expressionsaktivität"wird erfindungsgemäß die in einer bestimmten Zeit durch die Expressionseinheit gebildete Menge Protein pro Expressionseinheit ver- standen.

Bei einer"verursachten Expressionsaktivität"oder Expressionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp die Bildung eines Proteins verursacht, das im Wildtyp so nicht vorhanden war.

Bei einer"veränderten Expressionsaktivität"oder Expressionsrate im Bezug auf ein Gen im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimm- ten Zeit die gebildete Menge des Proteins verändert.

Unter verändert"wird in diesem Zusammenhang bevorzugt erhöht oder emiedrigt ver- standen.

Dies kann beispielsweise durch Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Aktivität der endogenen Expressionseinheit, beispielsweise durch Mutation der Expressionsein- heit oder durch Stimmulierung oder Hemmung der Expressionseinheit erfolgen.

Weiterhin kann die erhöhte Expressionsaktivität oder Expressionsrate beispielsweise durch Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsge- mäße Expressionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit Erhöhter spezifischer Expressionsaktivität erreicht werden, wobei die Gene im Bezug auf die Expressions- einheiten heterolog sind.

Vorzugsweise wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten mit Erhöhter spezifischer Expressionsaktivitätdadurch erreicht, dass man eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit ver- änderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein- bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kon- trolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Ex- pression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endoge- nen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezi- fischer Expressionsaktivität, erfolgt oder ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expres- sionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik- roorganismus einbringt.

Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, enthalten eine erfindungsgemäße, vor- stehend bechriebene Nukleinsäure mit Promotoraktivität und zusätzlich funktionell ver- knüpft eine Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleistet.

Vorzugsweise enthält diese Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonuk- leinsäuren gewährleistet, die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 42 als ribosomale Bindungsstelle.

In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die erfindungsgemäße Expressionsein- heit : E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G).

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 stellt die Nukleinsäuresequenz der Expres- sionseinheit des Protein Translation Elongations Faktor TU (P EF-TU) aus Corynebak- terium glutamicum dar. SEQ. ID. NO. 2 entspricht der Sequenz der Expressionseinheit des Wildtyp.

Die Erfindung betrifft weiterhin Expressionseinheiten, enthaltend eine von dieser Se- quenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Se- quenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist.

Weitere natürliche erfindungsgemäße Beispiele für erfindungsgemäße Expressions- einheiten lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomi- sche Sequenz bekannt ist, durch Identitätsvergleiche der Nukleinsäuresequenzen aus Datenbanken mit der vorstehend beschriebenen Sequenzen SEQ ID NO : 2 leicht auf- finden.

Künstliche erfindungsgemäße Sequenzen der Expressionseinheiten lassen sich aus- gehend von der Sequenz SEQ ID NO : 2 durch künstliche Variation und Mutation, bei- spielsweise durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden leicht auffin- den.

Unter einer Nukleinsäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90 % mit der Se- quenz SEQ ID NO : 2 aufweist, wird dementsprechend eine Nukleinsäuresequenz ver- standen, die bei einem Vergleich seiner Sequenz mit der Sequenz SEQ ID NO : 2, ins-

besondere nach obigen Programmlogarithmus mit obigem Parametersatz eine Identität von mindestens 90 % aufweist.

Besonders bevorzugte Expressionseinheiten weisen mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 eine Identität von 91%, bevorzugter 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, besonders bevorzugt 99% auf.

Weitere natürliche Beispiele für Expressionseinheiten lassen sich weiterhin ausgehend von den vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, insbesondere ausgehend von der Sequenz SEQ ID NO : 2 aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz nicht bekannt ist, durch Hybridisierungstechniken in an sich bekannter Weise leicht auffinden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft daher Expressionseinheiten, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. No. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Diese Nukleinsäuresequenz umfasst mindestens 10, bevorzugter mehr als12, 15,30, 50 oder besonders bevorzugt mehr als 150 Nukleo- tide.

Unter"hybridisieren"versteht man die Fähigkeit eines Poly-oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen vorzugsweise zu 90-100%, kom- plementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northem-oder Southern-Blot- Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze.

Die Hybridisierung erfolgt erfinungsgemäß unter stringenten Bedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise bei Sambrook, J., Fritsch, E. F., Mani- atis, T., in : Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57 oder in Current Protocols in Molecular Biolo- gy, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6 beschrieben : Unter stringenten Hybridisierungs-Bedingungen werden insbesondere verstanden : Die über Nacht Inkubation bei 42°C in einer Lösung bestehend aus 50 % Formamid, 5 x SSC (750 mM NaCI, 75 mM Tri-Natrium Citrat), 50 mM Natrium Phosphat (ph7,6), 5x Denhardt Lösung, 10% Dextransulfat und 20 g/ml denaturierte, gescheerte Lachsspermien-DNA, gefolgt von einem Waschen der Filter mit 0, 1 x SSC bei 65°C.

Die erfindungsgemäß Nukleotidsequenzen ermöglichen femer die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von homologer Se- quenzen in anderen Zelltypen und Mikroorganismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringen- ten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z. B. etwa 40,50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs-oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z. B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon.

Unter einem funktionell äquivalenten Fragment"werden für Expressionseinheiten, Fragmente verstanden die im wesentlichen die gleiche oder eine höhere spezifische Expressionsaktivität aufweisen wie die Ausgangssequenz.

Unter im wesentlichen gleich"wird eine spezifische Expressionsaktivität verstanden die mindestens 50%, vorzugsweise 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, bevor- zugter 90%, besonders bevorzugt 95% der spezifischen Expressionsaktivität der Aus- gangssequenz aufweist.

Unter Fragmente"werden Teilsequenzen der durch Ausführungsform E), F) oder G) beschriebenen Expressionseinheiten verstanden. Vorzusgweise weisen diese Frag- mente mehr als 10, bevorzugter aber mehr als 12,15, 30,50 oder besonders bevor- zugts mehr als 150 zusammenhängende Nukleotide der Nukleinsäuresequenz SEQ.

ID. NO. 1 auf.

Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 als Expressionseinheit, d. h. zur Expression von Genen.

Die SEQ. ID. NO. 2 ist ohne Funktionszuordnung im Genbank-Eintrag AP005283 be- schrieben worden. Daher betrifft die Erfindung ferner die neuen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend eine erfin- dungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität zusätzlich funktionell verknüpft eine

Nukleinsäuresequenz, die die Translation von Ribonukleinsäuren gewährleistet.

Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, enthaltend E) die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 oder F) eine von dieser Sequenz durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden abgeleitete Sequenz, die eine Identität von mindestens 90 % auf Nukleinsäureebene mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 aufweist oder G) eine Nukleinsäuresequenz, die mit der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 2 unter stringenten Bedingungen hybridisiert oder H) funktionell äquivalente Fragmente der Sequenzen unter E), F) oder G), mit der Maßgabe, dass die Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ. ID. NO. 2 ausgenom- men ist.

Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten umfassen ein oder mehrere der folgen- den genetischen Elemente : eine Minus 10 ("-10") Sequenz ; eine Minus 35 ("-35") Se- quenz ; einen Transkriptionsstart, eine Enhancer Region ; und eine Operator Region.

Vorzugsweise sind diese genetischen Elemente spezifisch für die Spezies Corynebak- terien, speziell für Corynbacterium glutamicum.

Alle vorstehend erwähnten Expressionseinheiten sind weiterhin in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleinsäure- bausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die Anlagerung synthe- tischer Oligonukleotide und Auffüllen von Lücken mithilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989), Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben.

Für die Erfindungen in diesem Patent wurden Methoden und Techniken genutzt, die dem Fachmann, der in mikrobiologischen und rekombinanten DNA-Techniken geübt ist, bekannt sind. Methoden und Techniken für das Wachstum von Bakterienzellen, das Einschleusen von isolierten DNA-Molekülen in die Wirtszelle, und die Isolierung, Klo- nierung und Sequenzierung von isolierten Nukleinsäuremolekülen usw. sind Beispiele für solche Techniken und Methoden. Diese Methoden sind in vielen Standardlitera- turstellen beschrieben : Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) ; J. H.

Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1972) ; J. H. Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1992) ; M. Singer and P. Berg, Genes & Genomes, University Science Books, Mill Valley, Carlifornia (1991) ; J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) ; P. B. Kaufmann et al., Handbook of Molcular and Cellular Methods in Biology and Medicine, CRC Press, Boca Raton, Florida (1995) ; Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, B. R. Glick and J. E. Thompson, eds., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993) ; and P. F. Smith-Keary, Molecular Genetics of Escherichia coli, The Guilford Press, New York, NY (1989).

Alle Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung liegen bevorzugt in Form eines isolierten Nukleinsäuremoleküls vor. Ein"isoliertes"Nukleinsäuremolekül wird von an- deren Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäu- re zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Mate- rial oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequen- zen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Promotoren und/oder Expressionseinheiten lassen sich bei- spielsweise besonders vorteilhaft in verbesserten Verfahren zur fermentativen Herstel- lung von biosynthetischen Produkten wie nachstehend beschrieben verwenden.

Die erfindungsgemäßen Promotoren und/oder Expressionseinheiten weisen insbeson- dere den Vorteil auf, dass es sich um starke, konstitutive Promotoren und Expressi- onseinheiten handelt.

Die erfindungesgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität können zur Verände- rung, also zur Erhöhung oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Transkriptions- rate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten können zur Veränderung, also zur Er- höhung oder Reduzierung, oder zur Verursachung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp verwendet werden.

Femer können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und die erfindungesgemäßen Expressionseinheiten zur Regulation und Verstärkung der Bil- dung von verschiedenen biosynthetischen Produkten, wie beispielsweise Feinchemika- lien, Proteinen, inbesondere Aminosäuren, in Mikroorganismen, insbsondere in Cory- nebacterium species dienen.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von endo- genen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, die die Transkription von endogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp oder b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs- gemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit ver- änderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Gemäß Ausführungsform a) kann die Veränderung oder Verursachung der Transkripti- onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus die spezifische Promotoraktivität verändert, also erhöht oder erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation der erfindungsgemä- ßen Nukleinsäuresequenz mit Promotoraktivität, also durch gezielte Substitution, Dele- tion oder Insertion von Nukleotiden erfolgen. Eine erhöhte bzw. erniedrigte Promotor- aktivität kann dadurch erreicht werden, dass Nukleotide in der Bindungsstelle des RNA- Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen (dem Fachmann auch als-10-Region und- 35 Region bekannt) ausgetauscht werden. Weiterhin dadurch dass der Abstand der beschriebenen RNA-Polymerase-Holoenzym-Bindungsstellen zueinander durch Dele- tionen von Nukleotiden oder Insertionen von Nukleotiden verkleinert oder vergrößert werden. Weiterhin dadurch dass Bindungsstellen (dem Fachmann auch als- Operatoren bekannt) für Regulatiosproteine (dem Fachmann bekannt als Repressoren und Aktiviatoren) in räumliche Nähe an die Bindungsstellen des RNA-Polymerase- Holoenzyms gebracht werden, dass diese Regulatoren nach Bindung an eine Promo- tor-Sequenz die Bindung des und Transkriptionsaktivität des RNA-Polymerase- Holoenzyms abschwächen oder verstärken, oder auch unter einen neuen regulatori- schen Einfluss stellen.

Die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 42 stellt vorzugsweise die ribosomale Bin- dungsstelle der erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, die Sequenzen SEQ. ID.

NOs. 39,40 oder 41 die-10-Region der erfindungsgemäßen Expressionseinheiten

dar. Veränderungen der Nukleinsäureaequenz in diesen Regionen führen zu einer Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung der Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO.

42 als ribosomale Bindungsstelle in Expressionseinheiten, die die Expression von Ge- nen in Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium ermöglichen.

Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung der Nukleinsäuresequenzen SEQ. ID.

NOs. 39,40 oder 41 als-10-Region in Expressionseinheiten, die die Expression von Genen in Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium ermöglichen.

Insbesondere betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, die die Expression von Genen in Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium ermöglicht, ent- haltend die Nukleinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 42. Vorzugsweise wird dabei die Nuk- leinsäuresequenz SEQ. ID. NO. 42. als ribosomale Bindungsstelle verwendet.

Weiterhin betrifft die Erfindung eine Expressionseinheit, die die Expression von Genen in Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium ermöglicht, enthaltend mindestens eine der Nukleinsäuresequenzen SEQ. ID. NOs. 39,40 oder 41. Vorzug- weise wird dabei eine der Nukleinsäuresequenzen SEQ. ID. NOs. 39,40 oder 41 als- 10-Region verwendet.

In Bezug auf die"spezifische Promotoraktivität"wird unter Erhöhung oder Reduzierung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Aktivität gegenüber der erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotoraktivität des Wildtyp, also beispielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 1 verstanden.

Gemäß Ausführungsform b) kann die Veränderung oder Verursachung der Transkripti- onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit veränderter spezifi- scher Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man b1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, ge- benenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer en- dogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promo-

toraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, er- folgt oder b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon- trolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribie- rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Es ist somit möglich, die Transkriptionsrate eines endogenen Gens des Wildtyps zu verändern, also zu erhöhen oder zu erniedrigen indem man gemäß Ausführungsform b1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotorak- tivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder gemäß Ausführungsform b2) ein oder mehrere endogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der einge- brachten, endogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Pro- motoraktivität, erfolgt oder Gemäß Ausführungsform b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit verän- derter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende endogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Ferner ist es somit möglich, die Transkriptionsrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyp zu verursachen, indem man gemäß Ausführungsform b2) ein oder mehrere exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der einge- brachten, exogenen Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Pro-

motoraktivität, erfolgt oder Gemäß Ausführungsform b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit verän- derter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende exogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Insertion von Genen gemäß Ausführungsform b2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird. Vor- zugsweise erfolgt die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.

Die Insertion von Nukleinsäurekonstrukten gemäß Ausführungsform b3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal. Eine chromosomale"Integration ist die Insert- on eines exogenen DNA-Fragmentes in das Chromosom einer Wirtszelle. Dieser Beg- riff wird auch für die homologe Rekombination zwischen einem exogenen DNA- Fragment und der entsprechenden Region auf dem Chromosom der Wirtszelle genutzt.

In Ausführungsform b) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) eingesetzt. Die- se können in Ausführungsform b), wie in Ausführungsform a) beschrieben im Mikroor- ganismus vorliegen und hergestellt werden oder in isolierter Form in den Mikroorga- nismus eingebracht werden.

Unter endogen"werden genetische Informationen, wie beispielsweise Gene, verstan- den, die bereits im Wildtypgenom enthalten sind.

Unter"exogen"werden genetische Informationen, wie beispielsweise Gene, verstan- den, die im Wildtypgenom nicht enthalten sind.

Unter dem Begriff Gene"in Bezug auf Regulation der Transkription durch die erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität werden vorzugsweise Nukleinsäu- ren verstanden, die einen zu transkripierenden Bereich, also beispielsweise einen Be- reich der die Translation reguliert, einen kodierenden Bereich, sowie gegebenenfalls weitere Regulationselemente, wie beispielsweise einen Terminator, enthalten.

Unter dem Begriff"Gene"in Bezug auf die nachstehend beschriebene Regulation der Expression durch die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten werden vorzugsweise Nukleinsäuren verstanden, die einen kodierenden Bereich, sowie gegebenenfalls wei-

tere Regulationselemente, wie beispielsweise einen Terminator, enthalten.

Unter einem. kodierenden Bereich"wird eine Nukleinsäuresequenz verstanden, die ein Protein kodiert.

Unter heterolog"in Bezug auf Nukleinsären mit Promotoraktivität und Gene wird ver- standen, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht unter Regulation der erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität transkribiert werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vorkommende funktionelle Verknüpfung entsteht und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Nukleinsäure mit Promotoraktivität und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vorkommt.

Unter heterolog"in Bezug auf Expressionseinheiten und Gene wird verstanden, dass die verwendeten Gene im Wildtyp nicht unter Regulation der erfindungsgemäßen Ex- pressionseinheiten exprimiert werden, sondern das eine neue, im Wildtyp nicht vor- kommende funktionelle Verknüpfung entsteht und die funktionelle Kombination aus erfindungsgemäßer Expressionseinheit und spezifisches Gen im Wildtyp nicht vor- kommt.

Die Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung oder Verursachung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp indem man ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, die die Transkription von en- dogenen Genen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Vorzugsweise wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität oder durch erfindungs- gemäße Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh- rungsform ah) dadurch erreicht wird, dass man bh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer en-

dogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten erfindungsgemäßen Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon- trolle der erfindungsgemäßen, endogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribie- rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Reduzierung der Transkriptionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, die die Transkription der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder br) Nukleinsäuren mit reduzierter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh- rungsform a) in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Transkription endogene Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Nuklein- säure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp durch c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von er- findungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp oder d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungs- gemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionsein- heiten mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungs- form c), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.

Gemäß Ausführungsform c) kann die Veränderung oder Verursachung der Expressi- onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass im Mikroorganismus die spezifische Expressionsaktivität verändert, also erhöht oder erniedrigt wird. Dies kann beispielsweise durch gezielte Mutation der erfindungs- gemäßen Nukleinsäuresequenz mit Promotoraktivität, also durch gezielte Substitution, Deletion oder Insertion von Nukleotiden erfolgen. Beispielsweise führt die Verlänge- rung des Abstandes zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und dem translationellen Startcodon in der Regel zu einer Änderung, einer Verkleinerung oder aber auch einer Verstärkung der spezifischen Expressionsaktivität. Eine Veränderung der der spezifi- schen Expressionsaktivität kann auch dadurch erreicht werden, dass die Sequenz der Shine-Dalgamo-Region (Ribosomale Bindungsstelle) in seinem Abstand zum translati- onellen Startcodon durch Deletionen oder insertionen von Nukleotiden entweder ver- kürzt oder verlängert wird. Aber auch dadurch dass die Sequenz der Shine-Dalgarno- Region so verändert wird, dass die Homologie zu komplementären 3'Seite 16S rRNA entweder verstärkt oder aber auch verringert wird.

In Bezug auf die"spezifische Expressionsaktivität"wird unter Erhöhung oder Reduzie- rung im Vergleich zum Wildtyp eine Erhöhung oder Reduzierung der spezifischen Akti- vität gegenüber der erfindungsgemäßen Expressionseinheit des Wildtyp, also bei- spielsweise gegenüber der SEQ. ID. NO. 2 verstanden.

Gemäß Ausführungsform d) kann die Veränderung oder Verursachung der Expressi- onsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp dadurch erfolgen, dass man die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit verän- derter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) reguliert, wobei die Gene in Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.

Dies wird bevorzugt dadurch erreicht, dass man d1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls -mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten erfolgt oder d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder

d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsak- tivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nuklein- säuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Es ist somit möglich, die Expressionsrate eines endogenen Gens des Wildtyp zu ver- ändern, also zu erhöhen oder zu erniedrigen indem man gemäß Ausführungsform d1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinhei- ten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endoge- nen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten erfolgt oder gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganis- mus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gege- benenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder gemäß Ausführungsform d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifi- scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimie- rende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Ferner ist es somit möglich, die Expressionssrate eines exogenen Gens im Vergleich zum Wildtyp zu verursachen, indem man gemäß Ausführungsform d2) ein oder mehrere exogene Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrach- ten Gene unter der Kontrolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinhei- ten, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder gemäß Ausführungsform d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit veränderter spezifi- scher Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimie- rende, exogene Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Insertion von Genen gemäß Ausführungsform d2) kann dabei so erfolgen, dass das Gen in kodierende Bereiche oder nicht-kodierende Bereiche integriert wird.

Vorzugsweise erfolgt die Insertion in nicht-kodierende Bereiche.

Die insertion von Nukleinsäurekonstrukten gemäß Ausführungsform d3) kann dabei chromosomal oder extrachromosomal erfolgen. Vorzugsweise erfolgt die Insertion der Nukleinsäurekonstrukte chromosomal.

Die Nukleinsäurekonstrukte werden im folgenden auch als Expressionskasetten be- zeichnet.

In Ausführungsform d) werden bevorzugt auch erfindungsgemäße Expressionseinhei- ten mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) ein- gesetzt. Diese können in Ausführungsform d), wie in Ausführungsform d) beschrieben im Mikroorganismus vorliegen und hergestellt werden oder in isolierter Form in den Mikroorganismus eingebracht werden.

Die Erfindung betrifft ferner in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren zur Erhöhung oder Verursachung der Expressionsrate eines Gens in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp indem man ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi- onsaktivität gemäß Ausführungsform c) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.

Vorzugsweise wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten oder durch Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform c) dadurch erreicht, dass man dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten, gegebe- nenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kon- trolle der erfindungsgemäßen, endogenen Expressionseinheiten, gegebenen-

falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsak- tivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nuklein- säuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Reduzierung der Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp, indem man cr) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von endogenen, erfin- dungsgemäßen Expressionseinheiten, die die Expression der endogenen Gene regu- lieren, im Vergleich zum Wildtyp reduziert oder dr) Expressionseinheiten mit reduzierter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Aus- führungsform cr) in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression endogener Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten mit redu- zierter Expressionsaktivität erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfindungsge- mäßen Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemi- kalien, wobei die Gene gegebenenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfin- dungsgemäßen Verfahren zur Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen sind die Gene ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäu- ren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nuk- leinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nuk- leinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäu- ren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gege-

benenfalls weitere Regulationselemente enthalten können.

In einer besondere bevorzugten Ausführungsform sind die Proteine aus dem Biosyn- theseweg von Aminosäuren ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat- Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate-Synthetase, Di- hydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 3- Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkrip- tioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1, Transkriptioneller Regu- lator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6- Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-O- Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Serin- Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin- Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyru- vat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase II, Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin- Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Se- rinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat- Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1-Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase.

Bevorzugte Proteine und Nukleinsäuren kodierend diese Proteine der vorstehend be- schriebenen Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind Proteinsequen- zen bzw. Nukleinsäuresequenzen mikrobiellen Ursprungs, vorzusgweise aus Bakterien der Gattung Corynebacterium oder Brevibacterium, bevorzugt aus coryneformen Bak- terien, besonders bevorzugt aus Corynebakterium glutamicum.

Beispiele für besonders bevorzugte Proteinsequenzen und die entsprechenden Nuk- leinsäuresequenzen kodierend diese Proteine aus dem Biosyntheseweg von Amino- säuren, deren Bezugsdokument, sowie deren Bezeichnung im Bezugsdokument sind in Tabelle 1 aufgelistet : Tabelle 1 Protein Nukleinsäure Bezugs-SEQ. ID. NO. kodierend dokument im Bezugsdoku- Protein ment Aspartatkinase ask oder IysC EP1108790 DNA : 281 Protein : 3781 Aspartat-Semialdehyd-asd EP1108790 DNA : 331 Dehydrogenase Protein : 3831 Dihydrodipicolinate-dapA WO 0100843 DNA : 55 Synthetase Protein : 56 Dihydrodipicolinate-dapB WO 0100843 DNA : 35 Reduktase Protein : 36 Meso-Diaminopimelat-ddh EP1108790 DNA : 3494 D-Dehydrogenase Protein : 6944 Diaminopicolinat-IysA EP1108790 DNA : 3451 Decarboxylase Prot. : 6951 Lysin-Exporter IysE EP1108790 DNA : 3455 Prot. : 6955 Arginyl-t-RNA Syn- argS EP 1108790 DNA : 3450 thetase Prot. : 6950 Glucose-6-Phosphat- zwf WO 0100844 DNA : 243 Dehydrognease Prot. : 244 Glycerinaldehyd-3- gap WO 010844 DNA : 187 Phosphat-Prot. : 188 Dehydrogenase 3-Phosphoglycerat-pgk WO 0100844 DNA : 69 kinase Prot. : 70 Pyruvat-Carboxylase pycA EP1108790 DNA : 765 Prot. : 4265 Triosephosphat-tpi WO 0100844 DNA : 61 Isomerase Prot. : 62 Biotin-Ligase birA EP1108790 DNA : 786 Prot. : 4286 PEP-Carboxylase pck EP1108790 DNA : 3470 Prot. : 6970 Homoserin Kinase thrB WO 0100843 DNA: 173 Prot. : 174 Threonin Synthase thrC WO 0100843 DNA: 175 Prot. : 176 Threonin Export Carrier thrE WO 0251231 DNA: 41 Prot. : 42 Threonin Efflux Protein RXA2390 WO 0100843 DNA : 7 Prot. : 8 Threonin Dehydratase ilvA EP 1108790 DNA : 2328 Prot. : 5828 Homoserin-O-metA EP 1108790 DNA : 727 Acetyltransferase Prot : 4227 Cystathionin-gamma-metB EP 1108790 DNA : 3491 synthase Prot : 6991 Cystathionin-beta- metc EP 1108790 DNA : 2535 Lyase Prot : 6035 Coenzym B12- metH EP 1108790 DNA : 1663 abhängige Methionin-Prot : 5163 Synthase,- O-Acetylhomoserin-metY EP 1108790 DNA : 726 Sulfhydrylase Prot : 4226 Methylentetrahydro-metF EP 1108790 DNA : 2379 folat-Reduktase Prot : 5879 D-3-Phosphoglycerat-serA EP 1108790 DNA : 1415 Dehydrogenase Prot : 4915 Phosphoserin-serB WO 0100843 DNA : 153 Phosphatase 1 Prot. : 154 Phosphoserin-serB EP 1108790 DNA : 467 Phosphatase 2 Prot : 3967 Phosphoserin- serB EP 1108790 DNA : 334 Phosphatase 3 Prot. : 3834 Phosphoserin-serC WO 0100843 DNA : 151 Aminotransferase Prot. : 152 Serin Acetyl- cysE WO 0100843 DNA : 243 Transferase Prot. : 244 Cystein-Synthase I cysK EP 1108790 DNA : 2817 Prot. : 6317 Cystein Synthase II CysM EP 1108790 DNA : 2338 Prot. : 5838 Homoserin-hom EP 1108790 DNA : 3452 Dehydrogenase Prot. : 6952 Coenzym B12- metE WO 0100843 DNA : 755 unabhängige Me-Prot. : 756 thionin-Synthase Serin- glyA WO 0100843 DNA : 143 Hydroxymethyltransfe-Prot. : 144 rase Protein in Sulfat-RXA247 EP 1108790 DNA : 3089 Reduktion Prot. : 6589 Protein in Sulfat-RXA248 EP 1108790 DNA : 3090 Reduktion Prot. : 6590 Sulfatadenyltransferase CysN EP 1108790 DNA : 3092 Untereinheit 1 Prot. : 6592 Sulfatadenyltransferase CysD EP 1108790 DNA : 3093 Untereinheit 2 Prot. : 6593 Phosphoadenosin CysH WO 02729029 DNA : 7 Phosphosulfat Reduk-Prot. : 8 tase Ferredoxin-Sulfit-RXA073 WO 0100842 DNA : 329 Reduktase Prot. : 330 Ferredoxin NADP Re-RXA076 WO 0100843 DNA : 79 duktase Prot. : 80 Transkriptioneller Re- luxR WO 0100842 DNA : 297 gulator LuxR Protein : 298 Transkriptioneller IysR1 EP 1108790 DNA : 676 Regulator LysR1 Protein : 4176 Transkriptioneller Re-IysR2 EP 1108790 DNA : 3228 gulator LysR2 Protein : 6728 Transkriptioneller Re-IysR3 EP 1108790 DNA : 2200 gulator LysR3 Protein : 5700 Malat-Quinon-mqo WO 0100844 DNA : 569 Oxodoreduktase Protein : 570 Transketolase RXA2739 EP 1108790 DNA : 1740 Prot : 5240 Transaldolase RXA2738 WO 0100844 DNA : 245 Prot : 246 OPCA opcA WO 0100804 DNA : 79 Prot : 80 1-Phosphofructokinase pfk1 W00100844 DNA : 55 1 Protein : 56 1-Phosphofructokinase pfk2 W00100844 DNA : 57 2 Protein : 58 6-Phosphofructokinase 6-pfk1 EP 1108790 DNA : 1383 1 Protein : 4883 6-Phosphofructokinase 6-pfk2 DE 10112992 DNA. 1 2 Protein : 2 Fructose-1, 6-fbr1 EP1108790 DNA : 1136 bisphosphatase 1 Protein : 4636 Pyruvat OxidasepoxBWO 0100844DNA : 85 Protein : 86 RXA00655-Regulator RXA655 US2003162267 DNA : 1 . 2 Prot. : 2 RXN02910-Regulator RXN2910 US2003162267 DNA : 5 . 2 Prot. : 6 6-RXA2735 WO 0100844 DNA : 1 phosphogluconolacto-Prot. : 2 nase

Ein weiteres Beispiel für eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entspre- chenden Nukleinsäuresequenz kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist die Sequenz der Fructose-1,6-bisphosphatase 2, oder auch fbr2 ge- nannt, (SEQ. ID. NO. 38) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz kodierend eine Fructose-1,6-bisphosphatase 2 (SEQ. ID. NO. 37).

Ein weiteres Beispiel für eine besonders bevorzugte Proteinsequenz und die entspre- chenden Nukleinsäuresequenz kodierend dieses Protein aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren, ist die Sequenz des Proteins in Sulfat-Reduktion, oder auch RXA077 genannt, (SEQ. ID. NO. 4) und die entsprechenden Nukleinsäuresequenz kodierend ein Protein in Sulfat-Reduktion (SEQ. ID. NO. 3) Weitere besonders bevorzugte Proteinsequenzen aus dem Biosyntheseweg von Ami- nosäuren, weisen jeweils die in Tabelle 1 für dieses Protein angegebene Aminosäure- sequenz auf, wobei das jeweilige Protein jeweils an mindestens einer der in Tabelle 2/Spalte2 für diese Aminosäuresequenz angegebenen Aminosäurepositionen eine andere proteinogene Aminosäure aufweist als die jeweilige in Tabelle2/Spalte3 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform, weisen die Proteine an mindestens einer der in Tabelle 2/Spalte 2 für die Aminosäure- sequenz angegebenenen Aminosäureposition die in Tabelle2/Spalte4 in der gleichen Zeile angegebene Aminosäure auf. Es handelt sich bei den in Tabelle 2 angegebenen Proteine um mutierte Proteine des Biosyntheseweges von Aminosäuren, die beson- ders vorteilhafte Eigenschaften aufweisen und sich deshalb insbesondere zur Expres- sion der entsprechenden Nukleinsäuren durch den erfinungsgemäßen Promotor und zur Herstellung von Aminosäuren eignen. Beispielsweise führt die Mutation T3111 zu

einem Ausschalten der feedback-Inhibierung von ask.

Die entsprechenden Nukleinsäuren, die ein vorstehend beschriebenes mutiertes Prote- in aus Tabelle 2 kodieren, lassen sich durch übliche verfahren herstellen.

Als Ausgangspunkt zur Herstellung der Nukleinsäuresequenzen kodierend ein mutier- tes Protein eignet sich beispielsweise das Genom eines Corynebacterium glutamicum- Stammes, der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 13032 erhältlich ist oder die in Tabelle 1 in Bezug genommenen Nukleinsäuresequen- zen. Für die Rückübersetzung der Aminosäuresequenz der mutierten Proteine in die Nukleinsäuresequenzen kodierend diese Proteine ist es vorteilhaft, die codon usage desjenigen Organismus zu verwenden, in den die Nukleinsäuresequenz eingebracht werden soll oder in der die Nukleinsäuresequenz vorliegt. Beispielsweise ist es vortei- haft für Corynebakterium glutamicum die codon usage von Corynebakterium glutami- cum zu verwenden. Die codon usage des jeweiligen Organismus lässt sich in an sich bekannter Weise aus Datenbanken oder Patentanmeldungen ermitteln, die zumindest ein Protein und ein Gen, das dieses Protein kodiert, aus dem gewünschten Organis- mus beschreiben.

Die Angaben in Tabelle 2 sind folgendermassen zu verstehen : In Spalte 1"Identifikation"wird eine eindeutige Bezeichnung für jede Sequenz in Bezug auf Tabelle 1 aufgeführt.

In Spalte 2"AS-POS"bezieht sich die jeweilige Zahl auf die Aminosäureposition der entsprechenden Polypeptidsequenz aus Tabelle 1. Eine"26"in der Spalte"AS-POS" bedeutet demzufolge die Aminosäureposition 26 der entsprechend angegebenen Poly- peptidsequenz. Die Zählung der Position beginnt N-Terminal bei +1.

In Spalte 3"AS-Wildtyp"bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure-darge- stellt im Ein-Buchstaben-Code-an der in Spalte 2 angegebenen Position beim ent- sprechenden Wildtyp-Stamm der Sequenz aus Tabelle 1.

In Spalte 4"AS-Mutante"bezeichnet der jeweilige Buchstabe die Aminosäure-darge- stellt im Ein-Buchstaben-Code-an der in Spalte 2 angegebenen Position beim ent- sprechenden Mutanten-Stamm.

In Spalte 5"Funktion"wird die physiologische Funktion der entsprechenden Polype- tidsequenz aufgeführt.

Für ein mutiertes Protein mit einer bestimmten Funktion (Spalte 5) und einer bestimm- ten Ausgangsaminosäuresequenz (Tabelle 1) werden in den Spalten 2,3 und 4 mindestens eine Mutation, bei einigen Sequenzen auch mehrere Mutationen beschrieben. Diese mehreren Mutationen beziehen sich immer auf die jeweils obenstehende, nächstliegendste Ausgangsaminosäuresequenz (Tabelle 1). Unter dem Begriff mindestens eine der Aminsäurepositionen"einer bestimmten Aminosäuresequenz wird vorzugsweise mindestens eine der für diese Aminosäuresequenz in Spalte 2,3 und 4 beschriebenen Mutationen verstanden.

Ein-Buchstaben-Code der proteinogenen Aminosäuren : A Alanin C Cystein D Aspartat E Glutamat FPhenylalanin G Glycin H His I Isoleucin K Lysin LLeucin M Methionin N Asparagin P Prolin Q Glutamin R Arginin S Serin TThreonin V Valin W Tryptophan Y Tyrosin Tabelle 2 Spaite 1 Spaite 2 Spaite 3 Spaite 4 Spalte 5 Identifikation AS Positi-AS Wildtyp AS Mu-Funktion on tante ask 317 S A Aspartatkinase 311 T 1 279 A T asd 66 D G Aspartat-Semialdehyd- Dehydrogenase 234 R H 272 D E 285 K E 20 L F dapA 2 S A Dihydrodipicolinat Synthetase 84 K N 85 L V dapB 91 D A Dihydrodipicolinat-Reduktase 83 D N ddh 174 D E Meso-Diaminopimelat-D- Dehydrogenase 235 F L 237 S A IysA 265 A D Diaminopicolinat- Decarboxylase 320 D N 332 I V argS 355 G D Arginyl-t-RNA-Synthetase 156 A S 513 V A 540 H R zwf 8 S T Glucose-6-Phosphat- Dehydrogenase 150 T A 321 G S gap 264 G S Glycerinaldehyd-3-Phosphat- Dehydrogenase pycA 7 S L Pyruvat-Carboxylase 153 E D 182 A S 206 A S 227 H R 455 A G 458 P S 639 S T 1008 R H 1059 S P 1120 D E pck 162 H PEP-Carboxylase 241 G D 829 T R thrB 103 S A Homoserin Kinase 190 T A 133 A v 138 P S thrC 69 G R Threonin Synthase 478 T I RXA330 85 I M Threonin-Efflux Protein 161 F I 195 G D hom 104 V I Homoserin-Deydrogenase 116 T 1 148 G A 59 V A 270 T S 345 R P 268 K N 61 D H 72 E Q IysR1 80 R H transkriptioneller Regulator LysR1 IysR3 142 R W transkriptioneller Regulator LysR3 179 A T RXA2739 75 N D Transketolase 329 A T 332 A T 556 V I RXA2738 242 K M Transaldolase opcA 107 Y H OpcA 219 K N 233 P S 261 Y H 312 s F 65 G R Aspartat-1-Decarboxylase 33 G S 6-Phosphogluconolactonase

In den vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung o- der Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mik- roorganismen sowie den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Mikroorganismen, den nachstehend beschriebenen genetisch veränderten Mikroorganoismen und den nachstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten erfolgt das Einbringen der erfindungsge- mäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität, der erfindungsgemäßen Expressionsein- heiten, der vorstehend beschriebenen Gene und der vorstehend beschriebnen Nuk- leinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus, insbeondere in corynefome Bakterien, vorzugsweise durch die SacB-Methode.

Die SacB-Methode ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Schäfer A, Tauch A, Jäger W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler A. ; Small mobilizable multi-purpose clo- ning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 : selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum, Gene. 1994 Jul 22 ; 145 (1) : 69-73 und Blomfield IC, Vaughn V, Rest RF, Eisenstein BI. ; Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSC101 replicon ; Mol Microbiol. 1991 Jun ; 5 (6) : 1447-57 beschrieben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfindungsge- mäßen Verfahren erfolgt die Veränderung oder Verursachung der Transkriptionsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen von erfin- dungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität bzw. erfindungsgemäßen Expres- sionseinheiten in den Mikroorganismus.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorstehend beschriebenen erfin- dungsgemäßen Verfahren erfolgt die Veränderung oder Verursachung der Transkripti- onsrate und/oder Expressionsrate von Genen in Mikroorganismen durch Einbringen der vorstehend beschriebenen Nukleinsäurekonstrukte oder Expressionskasetten in den Mikroorganismus.

Die Erfindung betrifft daher ferner eine Expressionskassette, umfassend mindestens eine erfindungsgemäße Expressionseinheit mindestens eine weitere, zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, also ein zu exprimie- rendes Gen und

gegebenenfalls weitere genetische Kontrollelemente, wie beispielsweise einen Termi- nator, wobei mindestens eine Expressionseinheit und eine weitere, zu exprimierende, Nuk- leinsäuresequenz funktionell miteinander verknüpft sind und die weitere, zu exprimie- rende, Nukleinsäuresequenz in Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.

Vorzugsweise ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz mindestens eine Nuklein- säuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.

Besonders bevorzugt ist die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von protei- nogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodie- rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodie- rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodie- rend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen.

Bevorzugte Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind vorstehend und deren Beispiele in Tabelle 1 und 2 beschrieben.

In den erfindungsgemäßen Expressionskassetten ist die physikalische Lage der Ex- pressionseinheit relativ zum zu exprimierenden Gen so gewählt, daß die Expressio- neinheit die Transkription und vorzugsweise auch die Translation des zu exprimieren- den Gens reguliert und damit die Bildung eines oder mehrerer Proteine ermöglicht. Die "Bildung ermöglichen"beinhaltet dabei die konstitutive Steigerung der Bildung, Abschwächung bzw. Blockierung der Bildung unter spezifischen Bedingungen und oder die Steigerung der Bildung unter spezifischen Bedingungen. Die"Bedingungen" umfassen dabei : (1) Zugabe einer Komponente zum Kulturmedium, (2) Entfernen einer Komponente vom Kulturmedium, (3) Austausch einer Komponente im Kulturmedium durch eine zweite Komponente, (4) Erhöhung der Temperatur des Kulturmediums, (5) Erniedrigung der Temperatur des Kulturmediums, und (6) Regulierung der atmosphäri- schen Bedingungen, wie z. B. die Sauerstoff-oder Stickstoffkonzentration, in der das Kulturmedium gehalten wird.

Die Erfindung betrifft femer einen Expressionsvektor enthaltend eine vorstehend be- schriebene, erfindungsgemäße Expressionskassette.

Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus"Cioning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Transposons, IS- Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Als Plasmide eignen sich solche besonders bevorzugt, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren, wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64 : 549-554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102 : 93-98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107 : 69-74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmid- vektoren, wie z. B. pCLiK5MCS, oder solche, die auf pCG4 (US-A 4,489, 160) oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66,119-124 (1990)) oder pAG1 (US-A 5,158, 891) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.

Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126- 132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann.

Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Sirnon et al., Bio/Technology 1,784- 791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69-73 (1994)), Ber- nard et al., Journal ofMolecular Biology, 234 : 534-541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al.

1991, Journal of Bacteriology 173 : 4510-4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41 : 337-342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Ap- plied Microbiology and Biotechnology 29,356-362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio- technology 7,1067-1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123,343-347 (1994)) beschrieben.

Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Transkriptions-

rate von mindestens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch a) Veränderung der spezifischen Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindes- tens einer endogenen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, die die Transkription mindestens eines endogenen Gens reguliert oder b) Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivi- tät gemäß Anspruch 1 mit veränderter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausfüh- rungsform a), wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß An- spruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit verän- derter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man b1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, gebe- nenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un- ter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß An- spruch 1, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder b2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en- dogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder b3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Pro- motoraktivität gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Promo- toraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nuklein- säuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfindung betrifft ferner eine genetisch verändertern Mikroorganismus mit erhöhter oder verursachter Transkriptionsrate von mindestens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei ah) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von endogenen Nukleinsäu- ren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, die die Transkription von endogenen Ge-

nen regulieren, im Vergleich zum Wildtyp erhöht ist oder bh) die Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promo- toraktivität gemäß Anspruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform ah) reguliert wird, wobei die Gene in Bezug auf die Nukleinsäuren mit Promotoraktivität heterolog sind.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Transkription von Genen im Mikroorganismus durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß An- spruch 1 oder durch Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1 mit verän- derter spezifischer Promotoraktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man bh1) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, ge- gebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer endogenen Gene un- ter der Kontrolle der eingebrachten Nukleinsäure mit Promotoraktivität, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder bh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Transkription eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der en- dogenen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promotoraktivität, erfolgt oder bh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Promo- toraktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu transkribierende Nuklein- säuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertem Mikroorganismus mit redu- zierter Transkriptionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei ar) die spezifische Promotoraktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endo- genen Nukleinsäure mit Promotoraktivität gemäß Anspruch 1, die die Transkription von mindestens einem, endogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder br) eine oder mehrere Nukleinsäuren mit reduzierter Promotoraktivität gemäßAusfüh- rungsform a) in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die Transkription mindestens eines endogenen Gens unter der Kontrolle der eingebrachten

Nukleinsäure mit reduzierter Promotoraktivität erfolgt.

Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus, wobei die genetische Veränderung zu einer Veränderung oder Verursachung der Expressionsra- te mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp führt und bedingt ist durch c) Veränderung der spezifischen Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindes- tens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Ex- pression mindestens eines endogenen Gens reguliert, im Vergleich zum Wildtyp oder d) Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionsein- heiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a), wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit veränderter spezifi- scher Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man d1) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen- falls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorga- nismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, ge- gebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder d2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endo- genen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränder- ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder d3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressionseinheit ge- mäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit veränderter spezifischer Expressionsakti- vität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfindung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus mit erhöh- ter oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wild- typ, wobei man

ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression der endogenen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten ge- mäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression von Genen im Mikroorganismus durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 oder durch Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform a) dadurch erreicht, dass man dh1) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen- falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer endogenen Gene unter der Kon- trolle der eingebrachten Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenen- falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh2) ein oder mehrere Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endo- genen Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivi- tät, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mikroorganismus einbringt.

Die Erfidnung betrifft ferner einen genetisch verändertern Mikroorganismus mit redu- zierter Expressionsrate von mindetstens einem Gen im Vergleich zum Wildtyp, wobei, cr) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer en- dogenen Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3, die die Expression von min- destens einem edogenen Gen reguliert, im Vergleich zum Wildtyp reduziert ist oder dr) eine oder mehrere Expressionseinheiten gemäß Anspruch 2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität in das Genom des Mikrorganismus eingebracht wurden, so dass die Expression mindestens eines Gens unter der Kontrolle der eingebrachten Expres-

sionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 mit reduzierter Expressionsaktivität erfolgt.

Ferner betrifft die Erfindung einen genetisch veränderter Mikroorganismus, enthaltend eine Expressionseinheit gemäß Anspruch 2 oder 3 und funktionell verknüpft ein zu eprimierendes Gen, wobei das Gen im Bezug auf die Expressionseinheit heterolog ist.

Besonders bevorzugt enthält dieser genetisch veränderte Mikroorganismus eine erfin- dungsgemäße Expressionskasette.

Besonders bevorzugt betrifft die vorliegende Erfindung gentisch veränderte Mikroor- gansismen, insbesondere coryneforme Bakterien, die einen Vektor, insbesondere Pendelvektor oder Plasmidvektor, der wenigstens ein rekombinantes Nukleinsäurekon- strukt erfindungsgemäßer Definition trägt, enthalten.

In einer bevorzugten Ausführungsform der genetisch veränderten Mikroorganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene mindestens eine Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von Feinchemikalien.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der genetisch veränderten Mikroor- ganismen sind die vorstehend beschriebenen Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus den Biosyntheseweg von proteinogenen und nicht-proteinogenen Aminosäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Bio- syntheseweg von Nukleotiden und Nukleosiden, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von organischen Säuren, Nukleinsäuren kodierend ein Pro- tein aus dem Biosyntheseweg von Lipiden und Fettsäuren, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Diolen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Konhlenhydraten, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von aromatischen Verbindung, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Vitaminen, Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Cofaktoren und Nukleinsäuren kodierend ein Protein aus dem Biosyntheseweg von Enzymen, wobei die Gene gegebenenfalls weitere Re- gulationselemente enthalten können.

Bevorzugte Proteine aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Diaminopimelat- Dehydrogenase, Diaminopimelat-Decarboxylase, Dihydrodipicolinate-Synthetase, Di- hydrodipicolinate-Reduktase, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase, 3- Phosphoglycerat-Kinase, Pyruvat-Carboxylase, Triosephosphat-Isomerase, Transkrip-

tioneller Regulator LuxR, Transkriptioneller Regulator LysR1, Transkriptioneller Regulator LysR2, Malat-Quinon-Oxidoreduktase, Glucose-6-Phosphat-Deydrogenase, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Transketolase, Transaldolase, Homoserin-0- Acetyltransferase, Cystahionin-gamma-Synthase, Cystahionin-beta-Lyase, Serin- Hydroxymethyltransferase, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Phosphoserin-Aminotransferase, Phosphoserin- Phosphatase, Serin-Acetyl-Transferase, Homoserin-Dehydrogenase, Homoserin- Kinase, Threonin-Synthase, Threonin-Exporter-Carrier, Threonin-Dehydratase, Pyru- vat-Oxidase, Lysin-Exporter, Biotin-Ligase, Cystein-Synthasel, Cystein-Synthase li Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase, Coenzym B12-unabhängige Methionin- Synthase-Aktivität, Sulfatadenyltransferase Untereinheit 1 und 2, Phosphoadenosin Phosphosulfat Reduktase, Ferredoxin-sulfit-reductase, Ferredoxin NADP Reduktase, 3-Phosphoglycerat Dehydrogenase, RXA00655 Regulator, RXN2910-Regulator, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Threonin Efflux-Protein, Se- rinhydroxymethyltransferase, Fruktose-1,6-bisphosphatase, Protein der Sulfat- Reduktion RXA077, Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Protein der Sulfat- Reduktion RXA247, Protein OpcA, 1-Phosphofruktokinase und 6-Phosphofruktokinase Besonders bevorzugte Beispiele der Proteine und Gene aus dem Biosyntheseweg von Aminosäuren sind vorstehend in Tabelle 1 und Tabelle 2 beschrieben.

Bevorzugte Mikroorganismen oder genetisch veränderte Mikroorganismen sind Bakte- rien, Algen, Pilze oder Hefen.

Besonders bevorzugte Mikroorgansimen sind insbeondere coryneforme Bakterien.

Bevorzugte coryneforme Bakterien sind Bakterien der Gattung Corynebacterium, ins- besondere der Arten Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium acetoglutami- cum, Corynebacterium acetoacidophilum, Corynebacterium thermoaminogenes, Cory- nebacterium melassecola und Corynebacterium efficiens oder der Gattung Brevibacte- rium, insbesondere der Arten Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum und Brevibacterium divaricatum.

Besonders bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und Brevibacterium sind ausgewählt aus der Gruppe Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Coryne- bacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870, Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium me- lassecola ATCC 17965, Corynebacterium efficiens DSM 44547, Corynebacterium effi- ciens DSM 44548. Corynebacterium efficiens DSM 44549, Brevibacterium flavum ATCC 14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869, Brevibacterium divarica-

tum ATCC 14020, Corynebacterium glutamicum KFCC10065 und Corynebacterium glutamicum ATCC21608.

Mit der Abkürzung KFCC ist die Korean Federation of Culture Collection gemeint, mit der Abkürzung ATCC die American type strain culture collection, mit der Abkürzung DSM die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

Weitere besonders bevorzugte Bakterien der Gattungen Corynebacterium und Brevi- bacterium sind in Tabelle 3 aufgelistet : merlu pumme ., '..'. t,'.. :... : h . FRZIM MB Zut Brevibacterium ammoniagenes 21054 e9 g. Genus. s" es.-.., ATC -F, ERM NRRL,. _ EC.. NCIMB° _CBS. IJ TC SMZ ; Brevibacterium ammoniagenes 21054 Brevibacterium ammoniagenes 19350 Brevibacterium ammoniagenes 19351 Brevibacterium ammoniagenes 19352 Brevibacterium ammoniagenes 19353 Brevibacterium ammoniagenes 19354 Brevibacterium ammoniagenes 19355 Brevibacterium ammoniagenes 19356 Brevibacterium ammoniagenes 21055 Brevibacterium ammoniagenes 21077 Brevibacterium ammoniagenes 21553 Brevibacterium ammoniagenes 21580 Brevibacterium ammoniagenes 39101 Brevibacterium butanicum 21196 Brevibacterium divaricatum 21792 P928 Brevibacterium flavum 21474 Brevibacterium flavum 21129 Brevibacterium flavum 21518 Brevibacterium flavum B11474 Brevibacterium flavum B11472 Brevibacterium flavum 21127 Brevibacterium flavum 21128 Brevibacterium flavum 21427 Brevibacterium flavum 21475 Brevibacterium flavum 21517 Brevibacterium flavum 21528 Brevibacterium flavum 21529 Brevibacterium flavum B11477 Brevibacterium flavum B11478 Brevibacterium flavum 21127 Brevibacterium flavum B11474 Brevibacterium healii 15527 Brevibacterium ketoglutamicum 21004 Brevibacterium ketoglutamicum 21089 Brevibacterium ketosoreductum 21914 Brevibacterium lactofermentum 70 Brevibacterium lactofermentum 74 Brevibacterium lactofermentum 77 Brevibacterium lactofermentum 21798 Brevibacterium lactofermentum 21799 Brevibacterium lactofermentum 21800 Brevibacterium lactofermentum 21801 Brevibacterium lactofermentum B11470 Brevibacterium lactofermentum B11471 Brevibacterium lactofermentum 21086 Brevibacterium lactofermentum 21420 Brevibacterium lactofermentum 21086 Brevibacterium lactofermentum 31269 Brevibacterium linens 9174 Brevibacterium linens 19391 Brevibacterium linens 8377 Brevibacterium paraffinolyticum 11160 Brevibacterium spec. 717. 73 Brevibacterium spec. 717.73 Brevibacterium spec. 14604 Brevibacterium spec. 21860 Brevibacterium spec. 21864 Brevibacterium spec. 21865 Brevibacterium spec. 21866 Brevibacterium spec. 19240 Corynebacterium acetoacidophilum 21476 Corynebacterium acetoacidophilum 13870 Corynebacterium acetoglutamicum B11473 Corynebacterium acetoglutamicum B11475 Corynebacterium acetoglutamicum 15806 Corynebacterium acetoglutamicum 21491 Corynebacterium acetoglutamicum 31270 Corynebacterium acetophilum B3671 Corynebacterium ammoniagenes 6872 2399 Corynebacterium ammoniagenes 15511 Corynebacterium fujiokense 21496 Corynebacterium glutamicum 14067 Corynebacterium glutamicum 39137 Corynebacterium glutamicum 21254 Corynebacterium glutamicum 21255 Corynebacterium glutamicum 31830 Corynebacterium glutamicum 13032 Corynebacterium glutamicum 14305 Corynebacterium glutamicum 15455 Corynebacterium glutamicum 13058 Corynebacterium glutamicum 13059 Corynebacterium glutamicum 13060 Corynebacterium glutamicum 21492 Corynebacterium glutamicum 21513 Corynebacterium glutamicum 21526 Corynebacterium glutamicum 21543 Corynebacterium glutamicum 13287 Corynebacterium glutamicum 21851 Corynebacterium glutamicum 21253 Corynebacterium glutamicum 21514 Corynebacterium glutamicum 21516 Corynebacterium glutamicum 21299 Corynebacterium glutamicum 21300 Corynebacterium glutamicum 39684 Corynebacterium glutamicum 21488 Corynebacterium glutamicum 21649 Corynebacterium glutamicum 21650 Corynebacterium glutamicum 19223 Corynebacterium glutamicum 13869 Corynebacterium glutamicum 21157 Corynebacterium glutamicum 21158 Corynebacterium glutamicum 21159 Corynebacterium glutamicum 21355 Corynebacterium glutamicum 31808 Corynebacterium glutamicum 21674 Corynebacterium glutamicum 21562 Corynebacterium glutamicum 21563 Corynebacterium glutamicum 21564 Corynebacterium glutamicum 21565 Corynebacterium glutamicum 21566 Corynebacterium glutamicum 21567 Corynebacterium glutamicum 21568 Corynebacterium glutamicum 21569 Corynebacterium glutamicum 21570 Corynebacterium glutamicum 21571 Corynebacterium glutamicum 21572 Corynebacterium giutamicum 21573 Corynebacterium glutamicum 21579 Corynebacterium glutamicum 19049 Corynebacterium glutamicum 19050 Corynebacterium glutamicum 19051 Corynebacterium glutamicum 19052 Corynebacterium glutamicum 19053 Corynebacterium glutamicum 19054 Corynebacterium glutamicum 19055 Corynebacterium glutamicum 19056 Corynebacterium glutamicum 19057 Corynebacterium glutamicum 19058 Corynebacterium glutamicum 19059 Corynebacterium glutamicum 19060 Corynebacterium glutamicum 19185 Corynebacterium glutamicum 13286 Corynebacterium glutamicum 21515 Corynebacterium glutamicum 21527 Corynebacterium glutamicum 21544 Corynebacterium glutamicum 21492 Corynebacterium glutamicum B8183 Corynebacterium glutamicum B8182 Corynebacterium glutamicum B12416 Corynebacterium glutamicum B12417 Corynebacterium glutamicum B12418 Corynebacterium glutamicum B11476 Corynebacterium glutamicum 21608 Corynebacterium lilium P973 Corynebacterium nitrilophilus 21419 11594 Corynebacterium spec. P4445 Corynebacterium spec. P4446 Corynebacterium spec. 31088 Corynebacterium spec. 31089 Corynebacterium spec. 31090 Corynebacterium spec. 31090 Corynebacterium spec. 31090 Corynebacterium spec. 15954 20145 Corynebacterium spec. 21857 Corynebacterium spec. 21862 Corynebacterium spec. 21863

Die Abkürzungen haben folgende Bedeutung : ATCC : American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA FERM : Fermentation Research Institute, Chiba, Japan NRRL : ARS Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, IL, USA CECT : Coleccion Espanola de Cultivos Tipo, Valencia, Spain NCIMB : National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd., Aberdeen, UK CBS : Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, NL NCTC : National Collection of Type Cultures, London, UK DSMZ : Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Germany Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit Promotoraktivität und den erfin- dungsgemäßen Expressionseinheiten ist es mit Hilfe der vorstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren möglich in den vorstehend beschriebenen, erfindungs- gemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen die Stoffwechselwege zu spezifi- schen biosynthetischen Produkten zu regulieren.

Dazu werden beispielsweise Stoffwechselwege die zu einem spezifischen biosyntheti- schen Produkt führen durch Verursachung oder Erhöhung der Transkriptionrate bzw.

Expressionsrate von Genen dieses Biosyntheseweges verstärkt in dem die erhöhte Proteinmenge zu einer erhöhten Gesamtaktivität dieser Proteine des gewünschten Biosyntheseweges und damit zu einem verstärkten Stoffwechselfluß zu dem gewün- schen biosynthetischen Produkt führt.

Weiterhin können Stoffwechselwege die von einem spezifischen biosynthetischen Pro- dukt wegführen durch Reduzierung der Transkriptionrate bzw. Expressionsrate von Genen dieses wegführenden Biosyntheseweges abgeschwächt werden in dem die reduzierte Proteinmenge zu einer reduzierten Gesamtaktivität dieser Proteine des un- erwünschten Biosyntheseweges und damit zusätzlich zu einem verstärkten Stoffwech- selfluß zu dem gewünschen biosynthetischen Produkt führt.

Die erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen sind beispielsweise in der Lage aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol biosynthetische Produkte herzustellen.

Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produk- ten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Mikroorganis-

men.

Je nach gewünschtem biosynthetischen Produkt muss die Transkriptionsrate bzw. Ex- pressionsrate verschiedener Gene erhöht bzw. reduziert werden. In der Regel ist es vorteilhaft die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate mehrere Gene zu verändern, d. h. die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu Er- höhen und/oder die Transkrioptionsrate bzw. Expressionsrate einer Kombination von Gene zu reduzieren.

In den erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen ist mindestens eine veränderte, dass heißt erhöhte oder reduzierte Transkriptionsrate bzw. Expressi- onsrate eines Gens auf eine erfindungsgemäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität bzw. erfindungsgemäße Expressionseinheit zurückzuführen.

Weitere, zusätzliche veränderte, d. h. zusätzlich erhöhte oder zusätzlich reduzierte Transkriptionsraten bzw. Expressionsraten von weiteren Genen im genetisch veränder- ten Mikroorganismus können, müssen aber nicht auf die erfindungsgemäßen Nuklein- säuren mit Promotoraktivität bzw. die erfindungsgemäßen Expressionseinheiten zurück gehen.

Die Erfindung betrifft deshalb weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von biosyntheti- schen Produkten durch Kultivierung von erfindungsgemäßen, genetisch veränderten Mikroorganismen.

Bevorzugte biosynthetische Produkte sind Feinchemikalien.

Der Begriff"Feinchemikalie"ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Verbidnungen, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw., jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts-, Kosmetik, Food und Feed-Industrie. Diese Verbindun- gen umfassen organische Säuren, wie beispielsweise Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Purin-und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Ku- ninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten), Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure), Diole (bspw. Propan- diol und Butandiol), Kohlenhydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose), aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo), Vitamine und Cofakto- ren (wie beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten ; und

Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995)"Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research-Asien, abgehalten am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Cor- poration, lSBN : 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebe- nen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemika- lien sind nachstehend weiter erläutert.

1. Aminosäure-Metabolismus und Verwendungen Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zellfunktionen essentiell. Der Begriff"Aminosäure"ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinan- der verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH : Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der D-oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vor- findet. Biosynthese-und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryotischen als auch eukaryotischen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L. Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die"essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin), so bezeichnet, da sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosyn- these mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Bio- syntheseswege in die übrigen 11"nichtessentiellen"Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu syn- thetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenom- men werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.

Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren inte- ressante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen An- wendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschafts-und pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mono- natriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan

werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L- Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids-technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg. ) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH : Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Protei- nen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein, (S)-5-Hydroxytryptophan und anderen, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.

Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakte- riellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation, s. Umbarger, H. E. (1978) Ann.

Rev. Biochem. 47 : 533-606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von a- Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure-Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthe- se von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren und beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt bei der Glykolyse), und ergibt nach Oxidations-, Transaminie- rungs-und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homocystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seitenketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat, in einer durch Serintranshydroxymethylase katalysierten Reaktion.

Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glycolyse-und Pento- sephosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat in einem 9-Schritt- Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Prephenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt- Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalaninhydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosynthese- produkte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-1-pyrophosphat, einem aktivierten Zucker.

Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf der Zelle übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden stattdessen abgebaut, so daß Zwischenproduk- te für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21"Amino Acid Degradation and the Urea

Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel-Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäure- produktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure- Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer be- stimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für ei- nen Überblick über den Rückkopplungs-Mechanismus bei Aminosäure- Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24,"Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Amino- säure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt.

I I. Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika-Metabolismus sowie Verwendungen Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine weitere Gruppe von Molekülen.

Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, syntheti- siert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenträger oder Zwischen- produkte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antio- xidantien und Katalysatoren oder andere Verarbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Über- blick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindun- gen siehe bspw. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH : Weinheim, 1996). Der Begriff"Vitamin"ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen.

Der Begriff"Cofaktor"umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein ; die erfindungsgemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise orga- nisch. Der Begriff"Nutrazeutikum"umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Mo- leküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z. B. mehrfach ungesättigte Fettsäuren).

Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullmann's Encyclopedia of Indus- trial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH : Weinheim, 1996, Michal, G.

(1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons ; Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and

Disease"Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research-Asien, abgehalten am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Campaign, IL X, 374 S).

Thiamin (Vitamin B,) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol- Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B2) wird aus Guanosin-5'-triphosphat (GTP) und Ribose-5'-phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavin- mononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als"Vitamin B6"bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxin- hydrochlorid), sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6- methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+)-N- (2, 4-Dihydroxy-3, 3-dimethyl-1- oxobutyl)-ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure. Die für die Biosyn- theseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5'-phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, son- dern auch die Produktion von (R)-Pantoinsäure, (R)-Pantolacton, (R)-Panthenol (Provi- tamin B5), Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.

Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganis- men ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene i- dentifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS-Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Ener- gie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des a-Ketoglutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Sub- stanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L- Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methylpterin hergeleitet ist. Die Biosynthe- se der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den metabolischen Stoffwechsel- zwischenprodukten Guanosin-5'-triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p- Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden.

Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin B12) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B, 2 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht vollständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der betei-

ligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als"Niacin"bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidade- nindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Formen.

Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreie chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien ebenfalls durch großange- legte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind, wie Riboflavin, Vitamin B6, Pantothenat und Biotin. Nur Vitamin B, 2 wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Verfahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.

111. Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid-und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen Gene für den Purin-und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Beg- riff"Purin"oder"Pyrimidin"umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteil der Nuklein- säuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff"Nukleotid"beinhaltet die grunde- genden Struktureinheiten der Nukleinsäuremoleküle, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D- Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff"Nukleosid"umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Mole- küle oder ihrer Mobilisation zur Bildung von Nukleinsäuremolekülen ist es möglich, die RNA-und DNA-Synthese zu hemmen ; wird diese Aktivität zielgerichtet bei kanzeroge- nen Zellen gehemmt, läßt sich die Teilungs-und Replikations-Fähigkeit von Tumorzel- len hemmen.

Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsäuremoleküle bilden, jedoch als Energie- speicher (d. h. AMP) oder als Coenzyme (d. h. FAD und NAD) dienen.

Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese me- dizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin-und/oder Pyrimidin- Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R. l. und Lyons, S. D. (1990)"Po- tent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic a- gents", Med. Res. Reviews 10 : 505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medi- kamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressionsmittel oder Antiproliferantien verwendet werden können (Smith, J. L."Enzymes in Nucleotide Synthesis"Curr. Opin.

Struct. Biol. 5 (1995) 752-757 ; Biochem. Soc. Transact. 23 (1995) 877-902). Die Purin-

und Pyrimidinbasen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatz- möglichkeiten : als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese verschiedener Feinchemi- kalien (z. B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin), als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, werden gewöhnlich als Geschmacksverstärker verwendet (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen (siehe bspw. Kuninaka, A., (1996)"Nucleotides and Related Com- pounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim, S. 561-612). En- zyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid-oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden entwickelt werden.

Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für bersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J. E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis"in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287 ; und Michal, G. (1999)"Nucleotides and Nucleosides" ; Kap. 8 in : Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York). Der Purin-Metabolismus, das Objekt intesiver Forschung, ist für das normale Funktionieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höhe- ren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5'-phosphat (IMP) aus Ribose-5-phosphat synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5'- monophosphat (GMP) oder Adenosin-5'-monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Ver- bindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthe- se erfolgt über die Bildung von Uridin-5'-monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat.

UMP wiederum wird in Cytidin-5'-triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat-Desoxyriboseform des Nukle- otides hergestellt. Nach der Phosphorylierung können diese Moleküle an der DNA- Synthese teilnehmen.

IV. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über a, a-1, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet.

Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik-und Biotechno- logie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al., (1998) US-Patent Nr. 5 759 610 ; Singer, M. A. und Lindquist, S. Trends Biotech. 16 (1998) 460-467 ; Paiva, C. L. A. und

Panek, A. D. Biotech Ann. Rev. 2 (1996) 293-314 ; und Shiosaka, M. J. Japan 172 (1997) 97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.

Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind ausgewählt aus der Gruppe or- ganische Säuren, Proteine, Nukleotide und Nukleoside, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromati- sche Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren, Enzyme und Proteine.

Bevorzugte organische Säuren sind Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure Bevorzugte Nukleoside und Nukleotide sind beispielsweise beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten.

Bevorzugte biosynthetische Produkte sind weiterhin Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren, wie beispielsweise Arachidonsäure, Diole wie beispielsweise Propandiol und Butandiol, Kohlenhydrate, wie beispielsweise Hyaluronsäure und Trehalose, aro- matische Verbindungen, wie beispielsweise aromatische Amine, Vanillin und Indigo, Vitamine und Cofaktoren, wie beispielsweise beschrieben in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH : Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten ; und Ong, A. S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lip- ids, Health and Disease"Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research- Asien, abgehalten am 1. -3. Sept. 1994 in Penang, Malysia, AOCS Press (1995)), En- zyme Polyketide (Cane et aL (1998) Science 282 : 63-68), und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN : 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen, beschriebenen Chemikalien.

Besonders bevorzugte biosynthetische Produkte sind Aminosäuren, besonders bevor- zugt essentielle Aminosäuren, insbeondere L-Glycin, L-Alanin, L-leucin, L-Methionin, L- Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Lysin, L-Glutamin, L-Glutaminsäure, L-Serin, L-Prolin, L- Valin, L-Isoleucin, L-Cystein, L-Tyrosin, L-Histidin, L-Arginin, L-Asparagin, L- Asparaginsäure und L-Threonin, L-Homoserin, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin. Im folgenden wird unter unter einer Aminosäure, wie beispielsweise Lysin, Methionin und Threonin, sowohl jeweils die L-und die D-Form der Aminosäure, vor- zugsweise die L-Form, also beispielsweise L-Lysin, L-Methionin und L-Threonin ver- standen.

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von Lysin durch Kul- tivierung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Expressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge- nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi- fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind, und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Diaminopimelat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodie- rend eine Diaminopimelat-Decarboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydrodipi- colinate-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Dihydridipicolinate-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nuklein- säuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyru- vat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat-Isomerase, Nuklein- säuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LuxR, Nukleinsäuren kodierend einen Transkriptionellen Regulator LysR1, Nukleinsäuren kodierend einen Transkripti- onellen Regulator LysR2, Nukleinsäuren kodierend eine Malat-Quinon- Oxodoreduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Deydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphogluconat-Dehydrognease, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nuklein- säuren kodierend einen Lysin Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase, Nukleinsäuren kodierend eine Arginyl-t-RNA-Synthetase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoenolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Fruktose-1,6- bisphosphatase, Nukleinsäuren kodierend ein Protein OPCA, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Phosphofructokinase und Nukleinsäuren kodierend eine 6-Phosphofructokinase.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi- onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein-

bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen- falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh- ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik- roorganismus einbringt.

Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindes- tens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopi- melat-Dehydrogenase-Aktivität, Diaminopimelat-Decarboxylase-Aktivität, Dihydrodipi- <BR> <BR> <BR> colinate-Synthetase-Aktivität, Dihydridipicolinate-Reduktase-Aktivität, Glycerinaldehyd- 3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat-Kinase-Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat-Isomerase-Aktivität, Aktivität des Transkriptio- nellen Regulators LuxR, Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR1, Aktivität des Transkriptionellen Regulators LysR2, Malat-Quinon-Oxodoreduktase-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-Deydrognease-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrognease- Aktivität, Transketolase-Aktivität, Transaldolase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Argi- nyl-t-RNA-Synthetase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Fruktose- 1,6-bisphosphatase-Aktivität, Protein OpcA-Aktivität, 1-Phosphofructokinase-Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität und Biotin-Ligase-Aktivität aufweisen.

Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Lysin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzierte Ak- tivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydra- tase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin- Sulfhydrylase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität, Pyruvat-Oxidase- Aktivität, Homoserine-Kinase-Aktivität, Homoserin-Dehydrogenase-Aktivität, Threonin- Exporter-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-

Decarboxylase-Aktivität und Threonin-Synthase-Aktivität aufweisen.

Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste- hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge- mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi- onseinheit verursacht sein.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Methionin durch Kultivie- rung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Ex- pressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge- nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi- fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind, und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Homoserin Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine 3- Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyruvat Carboxylase, Nuklein- säuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nukleinsäuren kodierend eine Ho- moserin O-Acetyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin-gamma- Synthase, Nukleinsäuren kodierend eine Cystahionin-beta-Lyase, Nukleinsäuren ko- dierend eine Serin-Hydroxymethyltransferase, Nukleinsäuren kodierend eine O- Acetylhomoserin-Sulfhydrylase, Nukleinsäuren kodierend eine Methylen- Tetrahydrofolat-Reduktase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoserin- Aminotransferase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoserin-Phosphatase, Nuklein- säuren kodierend eine Serine Acetyl-TransferaseNukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase Aktivität I, Nukleinsäuren kodierend eine Cystein-Synthase Aktivität II, Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym B12-abhängige Methionin-Synthase- Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Coenzym B12-unabhängige Methionin- Synthase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoadenosin-Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine Ferredoxin NADPH-Reduktase Aktivität, Nukleinsäuren kodierend eine

Ferredoxin-Aktivität, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA077, Nukleinsäuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA248, Nuklein- säuren kodierend ein Protein der Sulfat-Reduktion RXA247, Nukleinsäuren kodierend eine, RXA0655 Regulator undNukleinsäuren kodierend einen RXN2910 Regulator.

Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi- onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein- bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen- falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh- ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik- roorganismus einbringt.

Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch verän- derten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Homoserin Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase- Aktivität, Pyruvat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Homose- rin O-Acetyltransferase-Aktivität, Cystahionin-gamma-Synthase-Aktivität, Cystahionin- beta-Lyase-Aktivität Serin-Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin- Sulfhydrylase-Aktivität, Methylen-Tetrahydrofolat-Reduktase-Aktivität, Phosphoserin- Aminotransferase-Aktivität, Phosphoserin-Phosphatase-Aktivität, Serine Acetyl- Transferase-Aktivität, Cystein-Synthase-Aktivität, Cystein-Synthase II-Aktivität, Coen- zym B12-abhängige Methionin-Synthase-Aktivität, Coenzym B12-unabhängige Methio- nin-Synthase-Aktivität, Sulfat-Adenylyltransferase-Aktivität, Phosphoadenosin-

Phosphosulfat-Reductase-Aktivität, Ferredoxin-Sulfit-Reduktase-Aktivität, Ferredoxin NADPH-Reduktase Aktivität, Ferredoxin-Aktivität Aktivität Proteins der Sulfat- Reduktion RXA077, Aktivität eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA248, Aktivität eines Proteins der Sulfat-Reduktion RXA247, Aktivität eines RXA655-Regulators und Aktivität eines RXN2910-Regulators aufweisen Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Methionin ist dadurch gekennzeichnet, dass die gene- tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzier- te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Homoserine-Kinase- Aktivität, Threonin-Dehydratase-Aktivität, Threonin Synthase-Aktivität, Meso- Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase- Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Synthase-Aktivität, Dihydrodipi- colinat Reduktase-Aktivität, und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.

Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste- hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge- mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi- onseinheit verursacht sein.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Threonin durch Kultivie- rung von genetisch veränderten Mikroorganismen mit erhöhter oder verursachter Ex- pressionsrate mindestens eines Gens im Vergleich zum Wildtyp, wobei man ch) die spezifische Expressionsaktivität im Mikroorganismus von mindestens einer endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheit, die die Expression der endoge- nen Gene reguliert, im Vergleich zum Wildtyp erhöht oder dh) die Expression von Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expres- sionseinheiten oder durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezi- fischer Expressionsaktivität gemäß Ausführungsform ch) reguliert, wobei die Gene im Bezug auf die Expressionseinheiten heterolog sind, und wobei die Gene ausgewählt sind aus der Gruppe Nukleinsäuren kodierend eine Aspartatkinase, Nukleinsäuren kodierend eine Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Nuklein- säuren kodierend eine 3-Phosphoglycerat Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Pyru- vat Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend eine Triosephosphat Isomerase, Nuklein- säuren kodierend eine Homoserin-Kinase, Nukleinsäuren kodierend eine Threonin Synthase, Nukleinsäuren kodierend einen Threonin Exporter Carrier, Nukleinsäuren

kodierend eine Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend eine Transaldolase, Nukleinsäuren kodierend eine Transketolase, Nukleinsäuren kodierend einer Malat-Quinon-Oxidoreductase, Nukleinsäuren kodierend eine 6- Phosphogluconat-Dehydrogenase, Nukleinsäuren kodierend einen Lysin-Exporter, Nukleinsäuren kodierend eine Biotin-Ligase, Nukleinsäuren kodierend eine Phosphoe- nolpyruvat-Carboxylase, Nukleinsäuren kodierend ein Threonin Efflux-Protein, Nuklein- säuren kodierend eine Fruktose-1,6-bisphosphatase, Nukleinsäuren kodierend ein Op- cA Protein, Nukleinsäuren kodierend eine 1-Phosphofructokinase, Nukleinsäuren ko- dierend eine 6-Phosphofructokinase, und Nukleinsäuren kodierend eine Homoserin- Dehydrogenase Wie vorstehend bei den Verfahren beschrieben, wird die Regulation der Expression dieser Genen im Mikroorganismus durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten o- der durch erfindungsgemäße Expressionseinheiten mit erhöhter spezifischer Expressi- onsaktivität gemäß Ausführungsform ch) dadurch erreicht, dass man dh1) eine oder mehrere erfindungsgemäße Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, in das Genom des Mikroorganismus ein- bringt, so dass die Expression eines oder mehrerer dieser endogenen Gene unter der Kontrolle der. eingebrachten, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenen- falls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh2) ein oder mehrere dieser Gene in das Genom des Mikrorganismus einbringt, so dass die Expression eines oder mehrerer der eingebrachten Gene unter der Kontrolle der endogenen, erfindungsgemäßen Expressionseinheiten, gegebenenfalls mit erhöh- ter spezifischer Expressionsaktivität, erfolgt oder dh3) ein oder mehrere Nukleinsäurekonstrukte, enthaltend eine erfindungsgemäße Expressionseinheit, gegebenenfalls mit erhöhter spezifischer Expressionsaktivität, und funktionell verknüpft eine oder mehrere, zu exprimierende Nukleinsäuren, in den Mik- roorganismus einbringt.

Eine weiter bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin ist dadurch gekennzeichnet, dass die genetisch verän- derten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine erhöhte Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Aspartatkinase-Aktivität, Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase-Aktivität, Glycerinal- dehyd-3-Phosphat Dehydrogenase-Aktivität, 3-Phosphoglycerat Kinase-Aktivität, Pyru- vat Carboxylase-Aktivität, Triosephosphat Isomerase-Aktivität, Threonin Synthase- Aktivität, Aktivität eines Threonin Export-Carriers, Transaldolase-Aktivität, Transketola-

se-Aktivität, Glucose-6-Phosphat-dehydrogenase-Aktivität, Malat-Qinon- Oxidoreductase-Aktivität, Homoserin-Kinase-Aktivität, Biotin-Ligase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxylase-Aktivität, Threonin-Efflux-Protein-Aktivität, Protein OpcA-Aktivität, 1-Phosphofructokinase-Aktivität, 6-Phosphofructokinase-Aktivität, Fruk- tose 1,6 bisphosphatase-Aktivität, 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase und Homoserin- Dehydrogenase-Aktivität aufweisen.

Eine weiter besonders bevorzugte Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung von Threonin ist dadurch gekennzeichnet, dass die gene- tisch veränderten Mikroorganismen im Vergleich zum Wildtyp zusätzlich eine reduzier- te Aktivität, mindestens einer der Aktivitäten, ausgewählt aus der Gruppe Threonin Dehydratase-Aktivität, Homoserin O-Acetyltransferase-Aktivität, Serin- Hydroxymethyltransferase-Aktivität, O-Acetylhomoserin-Sulfhydrylase-Aktivität, Meso- Diaminopimelat D-Dehydrogenase-Aktivität, Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase- Aktivität, Pyruvat-Oxidase-Aktivität, Dihydrodipicolinat Synthetase-Aktivität, Dihydrodi- picolinat Reduktase-Aktivität, Asparaginase-Aktivität, Aspartat-Decarboxylase-Aktivität, Lysin-Exporter-Aktivität, Acetolactat-Synthase-Aktivität, Ketol-Aid-Reductoisomerase- Aktivität, Branched chain aminotransferase-Aktivität, Coenzym B12-abhängige Methionin Synthase-Aktivität, Coenzym B12-unabhängige Methion Synthase-Aktivi- tät, Dihydroxy-acid Dehydratase-Aktivität und Diaminopicolinat Decarboxylase-Aktivität aufweisen.

Diese zusätzlichen, erhöhten oder reduzierten Aktivitäten mindestens einer der vorste- hend beschriebenen Aktivitäten können, müssen aber nicht durch eine erfindungsge- mäße Nukleinsäure mit Promotoraktivität und/oder eine erfindungsgemäße Expressi- onseinheit verursacht sein.

Unter dem Begriff der"Aktivität"eines Proteins wird bei Enzymen die Enzymaktivität des entsprechenden Proteins, bei anderen Proteinen, beispielsweise Struktur oder Transport-Proteinen die physiologische Aktivität der Proteine verstanden.

Die Enzyme sind in der Regel in der Lage ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln bzw. diesen Umwandlunsgschritt zu katalysieren.

Dementsprechend wird unter der"Aktivität"eines Enzyms die in einer bestimmten Zeit durch das Enzym umgesetzte Menge Substrat bzw. gebildete Menge Produkt verstan- den.

Bei einer erhöhten Aktivität im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat

bzw. die gebildete Menge Produkt erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der"Aktivität"bei allen vorstehend und nachste- hend beschriebenen Aktivitäten mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter mindestens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der"Aktivität des Wildtyp".

Bei einer reduzierten Aktivität im Vergleich zum Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Enzym die umgesetzte Menge Substrat bzw. die gebildete Menge Produkt reduziert.

Unter einer reduzierten Aktivität wird vorzugsweise die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende Unterbin- dung oder Blockierung der Funktionalität diese Enzyms in einem Mikroorganismus ver- standen.

Eine Reduzierung der Aktivität umfasst eine mengenmäßige Verringerung eines En- zyms bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen des Enzyms (d. h. fehlen- de Nachweisbarkeit der entsprechenden Aktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit des Enzyms). Vorzugsweise wird die Aktivität im Mikroorganismus im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. Insbe- sondere meint"Reduzierung"auch das vollständigen Fehlen der entsprechenden Akti- vität.

Die Aktivität bestimmter Enzyme in genetisch veränderten Mikroorganismen sowie im Wildtyp und damit die Erhöhung oder Reduzierung der Enzymaktivität lassen sich nach bekannten Verfahren, wie beispielsweise Enzymassays ermitteln.

Beispielsweise wird unter eine Pyruvatcarboxylase ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Pyruvat in Oxaloacetat umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter einer Pyruvatcarboxylase-Aktivität die in einer bestimm- ten Zeit durch das Protein Pyruvatcarboxylase umgesetzte Menge Pyruvat bzw. gebil- dete Menge Oxaloacetat verstanden.

Bei einer erhöhten Pyruvatcarboxylase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Pyruvatcarboxylase die umgesetzte Menge Pyruvat bzw. die gebildete Menge Oxaloacetat erhöht.

Vorzugsweise beträgt diese Erhöhung der Pyruvatcarboxylase-Aktivität mindestens 5 %, weiter bevorzugt mindestens 20 %, weiter bevorzugt mindestens 50 %, weiter bevorzugt mindestens 100 %, bevorzugter mindestens 300 %, noch bevorzugter min- destens 500 %, insbesondere mindestens 600 % der Pyruvatcarboxylase-Aktivität des Wildtyp.

Weiterhin wir beispielsweise unter eine Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die Enzymaktivität einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-verstanden.

Unter einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase wird ein Protein verstanden, das die enzymatische Aktivität aufweist, Oxaloacetat in Phosphoenolpyruvat umzuwandeln.

Dementsprechend wird unter Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität die in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat umgesetzte Menge Oxaloace- tat bzw. gebildete Menge Phosphoenolpyruvat verstanden.

Bei einer reduzierten Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität gegenüber dem Wildtyp wird somit im Vergleich zum Wildtyp in einer bestimmten Zeit durch das Protein Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase die umgesetzte Menge Oxaloacetat bzw. die gebildete Menge Phosphoenolpyruvat reduziert.

Eine Reduzierung der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität umfasst eine men- genmäßige Verringerung einer Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (d. h. fehlende Nachweisbarkeit von Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität oder feh- lende immunologische Nachweisbarkeit der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase).

Vorzugsweise wird die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Aktivität im Vergleich zum Wildtyp um mindestens 5 %, weiter bevorzugt um mindestens 20 %, weiter bevorzugt um mindestens 50 %, weiter bevorzugt um 100 % reduziert. insbesondere meint"Re- duzierung"auch das vollständigen Fehlen der Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase- Aktivität.

Die zusätzliche Erhöhung von Aktivitäten kann durch verschiedene Wege erfolgen, beispielsweise durch Ausschalten von hemmenden Regulationsmechanismen auf Expressions-und Proteinebene oder durch Erhöhung der Genexpression von Nuk- leinsäuren kodierend die vorstehend beschriebenen Proteine gegenüber dem Wildtyp.

Die Erhöhung der Genexpression der Nukleinsäuren kodierend die vorstehend be- schriebenen Proteine gegenüber dem Wildtyp kann ebenfalls durch verschiedene We- ge erfolgen, beispielsweise durch Induzierung des Gens durch Aktivatoren oder wie

vorstehend beschrieben durch Erhöhung der Promotoraktivität oder Erhöhung der Ex- pressionsaktivität oder durch Einbringen von einer oder mehrerer Genkopien in den Mikroorganismus.

Unter Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure codierend ein Protein wird er- findungsgemäß auch die Manipulation der Expression der Mikroorganismus eigenen, endogenen Proteine verstanden.

Dies kann beispielsweise, wie vorstehend beschrieben durch Veränderung der Promo- tor-und/oder Expressionseinheits-Sequenzen der Gene erreicht werden. Eine solche Veränderung, die eine erhöhte Expressionsrate des Gens zur Folge hat, kann bei- spielsweise durch Deletion oder Insertion von DNA Sequenzen erfolgen.

Es ist, wie vorstehend beschrieben, möglich, die Expression der endogenen Proteine durch die Applikation exogener Stimuli zu verändern. Dies kann durch besondere phy- siologische Bedingungen, also durch die Applikation von Fremdsubstanzen erfolgen.

Zur Erzielung einer Erhöhung der Genexpression kann der Fachmann weitere unter- schiedliche Maßnahmen einzeln oder in Kombination ergreifen. So kann beispielsweise die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der mRNA wird ebenfalls die Expres- sion verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.

Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Biontechnolo- gy 5,137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138,35-41 (1994)), Tsuchiya und Mo- rinaga (Bio/Technology 6,428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102,93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0472869, im US Patent 4,601, 893, bei Schwarzer und Pühler (Biotechnology 9,84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60,126-132 (1994), bei LaBarre et al. (Journal of Bac- teriology 175,1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Ma- lumbres et al. (Gene 134,15-24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A- 10-229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,. 191-195

(1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60 : 512-538 (1996) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.

Weiterhin kann es für die Produktion von biosynthetischen Produkten, insbesondere L- Lysin, L-Methionin und L-Threonin, vorteilhaft sein, neben der Expression bzw. Ver- stärkung eines Gens unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama : "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", in : Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds. ), Academic Press, London, UK, 1982).

In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Erhöhung der Genexpression einer Nukleinsäure kodierend eines der vorstehend beschriebenen Proteine durch Einbrin- gen von mindestens einer Nukleinsäure kodierend ein entsprechendes Protein in den Mikroorganismus. Das Einbringen der Nukleinsäure kann chromsomal oder extrachro- mosomal erfolgen, also durch Erhöhung der Kopienzahl auf dem Chromosom und oder eine Kopie des Gens auf einem sich replizierenden Plasmid in dem Wirtsmikroorga- nismus.

Vorzugsweise erfolgt das Einbringen der Nukleinsäure, beispielsweise in Form einer Expressionskassete, enthaltend die Nukleinsäure, chromosomal, insbesondere durch die vorstehend beschriebene SacB-Methode.

Dazu kann prinzipiell jedes Gen, das eines der vorstehend beschriebenen Proteine kodiert verwendet werden.

Bei genomischen Nukleinsäure-Sequenzen aus eukaryontischen Quellen, die entrons enthalten, sind für den Fall das der Wirtsmikroorganismus nicht in der Lage ist oder nicht in die Lage versetzt werden kann, die entsprechenden Proteine zu exprimieren, bevorzugt bereits prozessierte Nukleinsäuresequenzen, wie die entsprechenden cDNAs zu verwenden.

Beispiele für die entsprechenden Gene sind in Tabelle 1 und 2 aufgelistet.

Vorzugsweise erfolgt die Reduzierung der vorstehend beschriebenen Aktivitäten in Mikroorganismen durch mindestens eines der nachfolgenden Verfahren : Einbringen mindestens einer sense-Ribonukleinsäuresequenz zur Induktion ei- ner Kosuppression oder einer deren Expression gewährleistenden Expressi- onskassette

'Einbringen mindestens eines DNA-oder Protein-bindenden Faktors gegen das entsprechede-Gen, -RNA oder-Protein oder einer dessen Expression gewähr- leistenden Expressionskassette 'Einbringen mindestens einer den RNA-Abbau bewirkenden viralen Nukleinsäu- resequenz oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette 'Einbringen mindestens eines Konstruktes zur Erzeugung eines Funktionsver- lustes, wie beispielsweise die Generierung von Stopp-Kodons oder eine Ver- schiebungen im Leseraster, an einem Gen beispielsweise durch Erzeugung ei- ner Insertion, Deletion, Inversion oder Mutation in einem Gen. Bevorzugt kön- nen Knockout-Mutanten mittels gezielter Insertion in das gewünschte Zielgen durch homologe Rekombination oder Einbringen von sequenzspezifischen Nukleasen gegen das Zielgen generiert werden.

'Einbringen eines Promotors mit reduzierter Promotoraktivität oder einer Ex- pressionseinheit mit reduzierter Expressionsaktivität.

Dem Fachmann ist bekannt, dass auch weitere Verfahren im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Reduzierung seiner Aktivität oder Funktion eingesetzt werden können.

Beispielsweise kann auch das Einbringen einer dominant-negativen Variante eines Proteins oder einer deren Expression gewährleistenden Expressionskassette vorteil- haft sein.

Dabei kann jedes einzelne dieser Verfahren eine Verminderung der Proteinmenge, mRNA-Menge und/oder Aktivität eines Proteins bewirken. Auch eine kombinierte An- wendung ist denkbar. Weitere Methoden sind dem Fachmann bekannt und können die Behinderung oder Unterbindung der Prozessierung des Proteins, des Transports des Proteins oder dessen mRNA, Hemmung der Ribosomenanlagerung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines RNA abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder-termination umfassen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von biosynthetischen Produkten wird vorzugsweise dem Kultivierungsschritt der genetisch veränderten Mikroorganismen ein Isolieren von biosynthetischen Produkten aus den Mikroorganismen oder/oder aus der Fermentationsbrühe angeschlossen. Diese Schritte können gleichzeitig und/oder vor- zugsweisie nach dem Kultivierungsschritt stattfinden.

Die erfindungsgemäßen genetisch veränderten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulauf-

verfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zur Produk- tion von biosynthetischen Produkten, insbesondere L-Lysin, L-Methionin und L- Threonin, kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsme- thoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozeßtechnik 1. Einführung in die Bioverfah- renstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) zu finden.

Das zu verwendende Kulturmedium hat in geeigneter Weise den Ansprüchen der je- weiligen Stämme zu genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mik- roorganismen sind im Handbuch"Manual of für General Bacteriologyn der American Society für Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten.

Diese erfindungsgemäß einsetzbaren Medien umfassen gewöhnlich eine oder mehrere Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Salze, Vitamine und/oder Spuren- elemente.

Bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Zucker, wie Mono-, Di-oder Polysaccharide. Sehr gute Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Ribose, Sorbose, Ribose, Lactose, Maltose, Saccharose, Raffinose, Stärke oder Cel- lulose. Man kann Zucker auch über komplexe Verbindungen, wie Melassen, oder an- dere Nebenprodukte der Zucker-Raffinierung zu den Medien geben. Es kann auch vor- teilhaft sein, Gemische verschiedener Kohlenstoffquellen zuzugeben. Andere mögliche Kohlenstoffquellen sind Öle und Fette wie z. B. Sojaöl. Sonnenblumenöl. Erdnußöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure oder Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin, Methanol oder Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure oder Milchsäure.

Stickstoffquellen sind gewöhnlich organische oder anorganische Stickstoffverbindun- gen oder Materialien, die diese Verbindungen enthalten. Beispielhafte Stickstoffquellen umfassen Ammoniak-Gas oder Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumch- lorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat oder Ammoniumnitrat, Nitrate, Harn- stoff, Aminosäuren oder komplexe Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojamehl, Sojaprotein, Hefeextrakt, Fleischextrakt und andere. Die Stickstoffquellen können ein- zeln oder als Mischung verwendet werden.

Anorganische Salzverbindungen, die in den Medien enthalten sein können, umfassen die Chlorid-, Phosphor-oder Sulfatsalze von Calcium, Magnesium, Natrium, Kobalt, Molybdän, Kalium, Mangan, Zink, Kupfer und Eisen

Als Schwefelquelle für die Herstellung von Feinchemikalien, insbesondere von Methio- nin, können anorganische Verbindungen wie beispielsweise Sulfate, Sulfite, Dithionite, Tetrathionate, Thiosulfate, Sulfide aber auch organische Schwefelverbindungen, wie Mercaptane und Thiole, verwendet werden.

Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikali- umhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium haltigen Salze verwendet werden.

Chelatbildner können zum Medium gegeben werden, um die Metallionen in Lösung zu halten. Besonders geeignete Chelatbildner umfassen Dihydroxyphenole, wie Catechol oder Protocatechuat, oder organische Säuren, wie Citronensäure.

Die erfindungsgemäß eingesetzten Fermentationsmedien enthalten üblicherweise auch andere Wachstumsfaktoren, wie Vitamine oder Wachstumsförderer, zu denen bei- spielsweise Biotin, Riboflavin, Thiamin, Folsäure, Nikotinsäure, Panthothenat und Pyri- doxin gehören. Wachstumsfaktoren und Salze stammen häufig von komplexen Me- dienkomponenten, wie Hefeextrakt, Melassen, Maisquellwasser und dergleichen. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genaue Zusammensetzung der Medienverbindungen hängt stark vom jeweiligen Experiment ab und wird für jeden spezifischen Fall individuell entschieden. Information über die Me- dienoptimierung ist erhältlich aus dem Lehrbuch"Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Hrsg. P. M. Rhodes, P. F. Stanbury, IRL Press (1997) S. 53-73, ISBN 0 19 963577 3). Wachstumsmedien lassen sich auch von kommerziellen Anbie- tern beziehen, wie Standard 1 (Merck) oder BHI (Brain heart infusion, DIFCO) und der- gleichen.

Sämtliche Medienkomponenten werden, entweder durch Hitze (20 min bei 1,5 bar und 121 °C) oder durch Sterilfiltration, sterilisiert. Die Komponenten können entweder zu- sammen oder nötigenfalls getrennt sterilisiert werden. Sämtliche Medienkomponenten können zu Beginn der Anzucht zugegen sein oder frei kontinuierlich oder char- genweise hinzugegeben werden.

Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise zwischen 15°C und 45°C, vorzugsweise bei 25°C bis 40°C und kann während des Experimentes konstant gehalten oder verän- dert werden. Der pH-Wert des Mediums sollte im Bereich von 5 bis 8,5, vorzugsweise um 7, 0 liegen. Der pH-Wert für die Anzucht läßt sich während der Anzucht durch Zu- gabe von basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefel- säure kontrollieren. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel,

wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabi- lität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, wie z. B.

Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff haltige Gasmischungen, wie z. B. Umgebungsluft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C.

Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum des gewünschten Produktes gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stun- den erreicht.

Die so erhaltenen Fermentationsbrühen haben üblicherweise eine Trockenmasse von 7,5 bis 25 Gew.-%.

Vorteilhaft ist außerdem auch, wenn die Fermentation zumindest am Ende, insbeson- dere jedoch über mindestens 30% der Fermentationsdauer zuckerlimitiert gefahren wird. Das heißt, dass während dieser Zeit die Konzentration an verwertbarem Zucker im Fermentationsmedium auf 0 bis 3 g/l gehalten, beziehungsweise abgesenkt wird.

Die Isolierung von biosynthetischen Produkten aus der Fermentationsbrühe und/oder den Mikroorganismen erfolgt in an sich bekannter Weise entsprechend den physika- lisch-chemischen Eigenschaften des biosynthetischen Wertprodukts und den biosyn- thetischen Nebenprodukten. Nebenprodukten.

Die Fermentationsbrühe kann anschließend beispielsweise weiterverarbeitet werden.

Je nach Anforderung kann die Biomasse ganz oder teilweise durch Separationsmetho- den, wie z. B. Zentrifugation, Filtration, Dekantieren oder einer Kombination dieser Me- thoden aus der Fermentationsbrühe entfernt oder vollständig in ihr belassen werden.

Anschließend kann die Fermentationsbrühe mit bekannten Methoden, wie z. B. mit Hilfe eines Rotationsverdampfers, Dünnschichtverdampfers, Fallfilmverdampfers, durch Umkehrosmose, oder durch Nanofiltration, eingedickt beziehungsweise aufkon- zentriert werden. Diese aufkonzentrierte Fermentationsbrühe kann anschließend durch Gefriertrocknung, Sprühtrocknung, Sprühgranulation oder durch anderweitige Verfah- ren aufgearbeitet werden.

Es ist aber auch möglich die biosynthetischen Produkte, insbesonder L-Lysin, L- Methionin und L-Threonin, weiter aufzureinigen. Hierzu wird die produkthaltige Brühe nach dem Abtrennen der Biomasse einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Produkt oder die Verunreinigungen ganz oder teilweise auf dem Chromatographieharz zurückgehalten werden. Diese Chroma- tographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder ande-

re Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Die biosynthetischen Produkte können in unterschiedlichen Formen anfallen, bei- spielsweise in Form ihrer Salze oder Ester.

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindung (en) kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in : Patek et al. (1994) Appl. Environ. Micro- biol. 60 : 133-140 ; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32 ; und Schmidt et al.

(1998) Bioprocess Engineer. 19 : 67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH : Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566,575- 581 und S. 581-587 ; Michal, G (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons ; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in : Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biol- ogy, Bd. 17.

Die Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht-limitierenden Beispiele näher be- schrieben : Beispiel 1 Herstellung des Vektors pCLiK5MCS Zunächst wurden Ampicillinresistenz und Replikationsursprung des Vektors pBR322 mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO : 5 und SEQ ID NO : 6 mit Hilfe der Polyme- rase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert.

SEQ ID NO : 5 <BR> <BR> <BR> 5'-CCCGGGATCCGCTAGCGGCGCGCCGGCCGGCCCGGTGTGAAATACCGCACA<BR > <BR> <BR> <BR> <BR> G-3' SEQ ID NO : 6 <BR> <BR> <BR> 5'-TCTAGACTCGAGCGGCCGCGGCCGGCCTTTAAATTGAAGACGAAAGGGCCTC<B R> <BR> <BR> <BR> <BR> G-3'

Neben den zu pBR322 komplementären Sequenzen, enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO : 5 in 5'-3'Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Smal, BamHl, Nhel und Ascl und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO : 6 in 5'-3' Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Xhol, Notl und Dral. Die PCR Reaktion wurde nach Standardmethode wie Innis et al. (PCR Protocols.

A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit PfuTurbo Poly- merase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Größe von ungefähr 2, 1 kb wurde mit dem GFXMPCR, DNA and Gel Band Puri- fication Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt.

Die stumpfen Enden des DNA-Fragmentes wurden mit dem Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers miteinander ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Clo- ning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin (501ug/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmie erhält den Namen pCLiK1.

Ausgehend vom Plasmid pWLT1 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR Reakti- on wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO : 7 und SEQ ID NO : 8 eine Kana- mycin-Resistenzcassette amplifiziert.

SEQ ID NO : 7 : 5'-GAGATCTAGACCCGGGGATCCGCTAGCGGGCTGCTAAAGGAAGCGGA-3' SEQ ID NO : 8 : 5'-GAGAGGCGCGCCGCTAGCGTGGGCGAAGAACTCCAGCA-3' Neben den zu pWLT1 komplementären Sequenzen, enthält der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO : 7 in 5'-3'Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Xbal, Smal, BamHI, Nhel und der Oligonukleotidprimer SEQ ID NO : 8 in 5'-3'Richtung die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Ascl und Nhel. Die PCR Reaktion wurde nach Standardmethode wie Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit PfuTurbo Polymerase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,3 kb wurde mit dem GFXPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Das DNA-Fragment wurde mit den

Restriktionsendonukieasen Xbal und Ascl (New England Biolabs, Beverly, USA) ge- schnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Puri- fication Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt.

Der Vektor pCLiK1 wurde ebenfalls mit den Restriktionsendonukleasen Xbal und Ascl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 2, 1kb) mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstel- lers isoliert. Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Ro- che Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, be- schrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transfor- miert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Ampicillin (50Ng/ml) und Kanamycin (201ug/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virolo- gy, 1 : 190) erreicht.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK2.

Der Vektor pCLiK2 wurde mit der Restriktionsendonuklease Dral (New England Bio- labs, Beverly, USA) geschnitten. Nach Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel wurde ein ca. 2,3 kb großes Vektorfragment mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert.

Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Di- agnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers religiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Ma- nual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Strata- gene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20pg/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK3.

Ausgehend vom Plasmid pWLQ2 (Liebl et al., 1992) als Template für eine PCR Reak- tion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO : 9 und SEQ ID NO : 10 der Repli- kationsursprung pHM1519 amplifiziert.

SEQ ID NO : 9 : 5'-GAGAGGGCGGCCGCGCAAAGTCCCGCTTCGTGAA-3' SEQ ID NO : 10 : 5'-GAGAGGGCGGCCGCTCAAGTCGGTCAAGCCACGC-3' Neben den zu pWLQ2 komplementären Sequenzen, enthalten die Oligonukleotidpri- mer SEQ ID NO : 9 und SEQ ID NO : 10 Schnittstellen für die Restriktionsendonuklease Notl. Die PCR Reaktion wurde nach Standardmethode wie Innis et al. (PCR Protocols.

A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990)) mit PfuTurbo Poly- merase (Stratagene, La Jolla, USA) durchgeführt. Das erhaltene DNA Fragment mit einer Größe von ungefähr 2,7 kb wurde mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Puri- fication Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt.

Das DNA-Fragment wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl (New England Bio- labs, Beverly, USA) geschnitten und im Anschluß daran erneut mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Der Vektor pCLiK3 wurde ebenfalls mit der Restriktionsendo- nuklease Notl geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach Elektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel wurde. der linearisierte Vektor (ca. 2,3kb) mit dem GFXPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers mit dem geschnittenen PCR Fragment ligiert und der Ligationsansatz nach Standardme- thoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Aus- plattieren auf Kanamycin (201ug/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5.

Für die Erweiterung von pCLiK5 um eine"multiple cloning site" (MCS) wurden die bei- de synthetischen, weitestgehend komplementären Oligonukleotide SEQ ID NO : 11 und SEQ ID NO : 12, die Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen Swal, Xhol, Aatl, Apal, Asp718, Mlul, Ndel, Spel, EcoRV, Sall, Clal, BamHl, Xbal und Smal enthalten, durch gemeinsames erhitzen auf 95°C und langsames abkühlen zu einem dop- pelsträngigen DNA-Fragment vereinigt.

SEQ ID NO : 11 : <BR> <BR> <BR> 5'-TCGAATTTAAATCTCGAGAGGCCTGACGTCGGGCCCGGTACCACGCGTCATAT< BR> <BR> <BR> <BR> <BR> GACTAGTTCGGACCTAGGGATATCGTCGACATCGATGCTCTTCTGCGTTAATTAAC< BR> <BR> <BR> <BR> <BR> AATTGGGATCCTCTAGACCCGGGATTTAAAT-3' SEQ ID NO : 12 : <BR> <BR> <BR> 5'-GATCATTTAAATCCCGGGTCTAGAGGATCCCAATTGTTAATTAACGCAGAAGAG< ;BR> <BR> <BR> <BR> <BR> CATCGATGTCGACGATATCCCTAGGTCCGAACTAGTCATATGACGCGTGGTACCG<B R> <BR> <BR> <BR> GGCCCGACGTCAGGCCTCTCGAGATTTAAAT-3' Der Vektor pCLiK5 wurde mit den Restriktionsendonuklease Xhol und BamH1 (New England Biolabs, Beverly, USA) geschnitten und mit alkalischer Phosphatase (I (Roche Diagnostics, Mannheim)) nach Angaben des Herstellers dephosphoryliert. Nach E- lektrophorese in einem 0,8% igen Agarosegel wurde der linearisierte Vektor (ca. 5,0 kb) mit dem GFXPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Frei- burg) nach Angaben des Herstellers isoliert. Dieses Vektor-Fragment wurde mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Her- stellers mit dem synthetischen Doppelsträngigen DNA-Fragment ligiert und der Ligati- onsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Labo- ratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (201ug/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Plasmid-DNA eines individuellen Klons wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und über Restriktionsverdaus überprüft. Das so erhaltene Plasmid erhält den Namen pCLiK5MCS.

Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the Na- tional Academy of Sciences USA 74 : 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktio- nen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet.

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS ist als SEQ ID NO : 13 aufgeführt.

Beispiel 2 Herstellung des Plasmids PmetA metA

Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33 : 168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140 : 1817-1828 präpa- riert. Mit den Oligonukleotidprimer SEQ ID NO 14 und SEQ ID NO 15, der chromoso- malen DNA als Template und Pfu Turbo Polymerase (Fa. Stratagene) wurde mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Standardmethoden, wie in Innis et al.

(1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press be- schrieben, ein das metA Gen inklusice des nichkodierenden 5'-Bereichs amplifiziert.

SEQ ID NO 14 5'-GCGCGGTACCTAGACTCACCCCAGTGCT-3' und SEQ ID NO 15 5'-CTCTACTAGTTTAGATGTAGAACTCGATGT-3' Das erhaltene DNA Fragment von ca. 1,3 kb Größe wurde mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Im Anschluß daran wurde es mit den Restriktionsenzymen Asp718 und Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) gespalten und das DNA Fragment mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit aufgereinigt.

Der Vektor pCIik5MCS SEQ ID NO : 13 wurde mit den Restriktionsenzymen Asp718 und Spel geschnitten und ein 5 kb großes Fragment nach elektrophoretischer Auftren- nung mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit isoliert.

Das Vektorfragment wurde zusammen mit dem PCR-Fragment mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20pg/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Fa.

Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 : 5463-5467 durchgeführt.

Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Wei- terstadt) aufgetrennt und ausgewertet.

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS PmetA metA ist als SEQ ID NO : 16 aufgeführt.

Beispiel 3 Herstellung des Plasmids pCLiK5MCS P EF-TU metA Chromosomale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33 : 168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140 : 1817-1828 präpa- riert. Mit den Oligonukleotidprimer SEQ ID NO 17 und SEQ ID NO 18, der chromoso- malen DNA als Template und Pfu Turbo Polymerase (Fa. Stratagene) wurde mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nach Standardmethoden wie Innis et al. (1990) PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic Press ein DNA Frag- ment von ca. 200 Basenpaaren aus dem nichtkodierenden 5'-Bereich (Promotorregion) der Superoxiddismutase (Psod) amplifiziert.

SEQ ID NO 17 5'-GAGACTCGAGGGCCGTTACCCTGCGAATG-3' und SEQ ID NO 18 5'-CCTGAAGGCGCGAGGGTGGGCATTGTATGTCCTCCTGGAC-3' Das erhaltene DNA Fragment wurde mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purifica- tion Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) nach Angaben des Herstellers gereinigt.

Ausgehend vom Plasmid PmetA metA SEQ ID 16 als Template für eine PCR Reaktion wurde mit den Oligonukleotidprimern SEQ ID NO : 19 und SEQ ID NO : 20 ein Teil von metA amplifiziert.

SEQ ID NO 19 5'-CCCACCCTCGCGCCTTCAG-3' und SEQ ID NO 20 5'-CTGGGTACATTGCGGCCC-3' Das erhaltene DNA Fragment von ungefähr 470 Basenpaaren wurde mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit nach Angaben des Herstellers gerei- nigt.

In einer weiteren PCR Reaktion wurden die beiden oben erhaltenen Fragmente ge- meinsam als Template eingesetzt. Durch die mit dem Oligonukleotidprimer SEQ ID NO : 18 eingebrachten, zu metA homologen Sequenzen, kommt es im Zuge der PCR- Reaktion zu einer Anlagerung beider Fragmente aneinander und einer Verlängerung

zu einem durchgehenden DNA-Strang durch die eingesetzte Polymerase. Die Stan- dardmethode wurde dahingehend modifiziert, dass die verwendeten Oligonukleotidpri- mer SEQ ID NO : 17 und SEQ ID NO : 20 erst mit Beginn des 2. Zykluses dem Reakti- onsansatz zugegeben wurden.

Das amplifizierte DNA Fragment von ungefähr 675 Basenpaaren wurde mit dem GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit nach Angaben des Herstellers gerei- nigt. Im Anschluß daran wurde es mit den Restriktionsenzymen Xhol und Ncol (Roche Diagnostics, Mannheim) gespalten und gelelektrophoretisch aufgetrennt. Anschließend wurde das ca. 620 Basenpaar große DNA Fragment mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aus der Agarose aufgereinigt.

Das Plasmid PmetA metA SEQ ID NO : 16 wurde mit den Restriktionsenzymen Ncol und Spe) (Röche Diagnostics, Mannheim) gespalten. Nach gelelektrophoretischer Auf- trennung wurde ein ca. 0,7 kb großes metA Fragment mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit aus der Agarose aufgereinigt.

Der Vektor pClik5MCS SEQ ID NO : 13 wurde mit den Restriktionsenzymen Xhol und Spel (Roche Diagnostics, Mannheim) geschnitten und ein 5 kb großes Fragment nach elektrophoretischer Auftrennung mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit isoliert.

Das Vektorfragment wurde zusammen mit dem PCR-Fragment und dem metA- Fragment mit Hilfe des Rapid DNA Ligation Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) nach Angaben des Herstellers ligiert und der Ligationsansatz nach Standardmethoden wie in Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, be- schrieben (1989)), in kompetente E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, USA) transfor- miert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20, ug/ml) haltigen LBAgar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht.

Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Fa.

Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktionen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74 : 5463-5467 durchgeführt.

Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Wei- terstadt) aufgetrennt und ausgewertet.

Das entstandene Plasmid pCLiK5MCS P_EFTUmetA ist als SEQ ID NO : 21 aufge- führt.

Beispiel 4 MetA-Aktivitäten

Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde jeweils mit den Plasmi- den pClik5 MCS, pClik MCS PmetA metA und pCLiK5MCS P EF-TU metA nach der beschriebenen Methode (Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53 : 299-303) transformiert. Die Transformationsmischung wurde auf CM-Platten plattiert, die zusätz- lich 20mit Kanamycin enthielten, um eine Selektion auf Plasmid-haltige Zellen zu er- reichen. Erhaltene Kan-resistente Klone wurden gepickt und vereinzelt.

C. glutamicum Stämme, die eines dieser Plasmidkonstrukte enthielten, wurden in MMA-Medium ((40 g/l Saccharose, 20 g/1 (NH4) 2SO4, 1 g/1 KH2P04, 1 g/1 K2HPO4, 0, 25g/l MgSO4 x 7H2O, 54 g Aces, 1 ml CaCI2 (10 g/I), 1 mi Protocatechoat (300 mg/10 ml), 1 mi Spurenelementelösung (10 g/l FeS04 x/HzO, 10 g/1 MnS04 x H2O, 2 g/1 ZnS04 x 7 H20, 0,2 g/l CuS04, 0,02 g/1 NiCI2 x 6 H20), 100 µg/l Vitamin B12, 0,3 mg/l Thiamin, 1mM Leucin, 1 mg/l Pyridoxal HCI, 1 ml Biotin (100 mg/l), pH7,0) bei 30°C über Nacht angezogen. Die Zellen wurden bei 4°C abzentrifugiert und das zweimal mit kaltem Tris-HCI-Puffer (0, 1 %, pH 8,0) gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wur- den die Zellen in kalten Tris-HCI-Puffer (0,1%, pH 8,0) aufgenommen und eine OD600 von 160 eingestellt. Für den Zellaufschluß wurden 1 ml dieser Zellsuspension in 2 ml Ribolyserröhrchen der Fa. Hybaid überführt und in einem Ribolyser der Fa. Hybaid bei einer Rotationseinstellung von 6,0 dreimal für jeweils 30 sec lysiert. Das Lysat wur- de durch 30minütige Zentrifugation bei 15.000 rp, m bei 4°C in einer Eppendorfzentrifu- ge geklärt und der Überstand in ein neues Eppendororfcup überführt. Der Proteingehalt wurde nach Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72 : 248-254 bestimmt.

Die enzymatische Aktivität von MetA wurde wie folgt durchgeführt. Die Reaktionsan- sätze von 1 mi enthielten 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 5mM MgCl2, 100 , uM Acetyl CoA, 5mM L-Homoserine, 500 µM DTNB (Ellmans Reagenz) und Zellex- trakt. Der Test wurde durch Zugabe von dem jeweiligen Proteinlysat gestartet und bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde dann eine Kinetig bei 412 nm über 10 min aufge- nommen.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1a gezeigt.

Tabelle 1a Stamm spezifische Aktivität [nMol/mg/min] ATCC 13032 pClik5MCS 12, 6 ATCC 13032 pClik5MCS PmetA metA 50,7 ATCC 13032 pClik5MCSP EF-TU metA 98, 4

Die Aktivität von MetA konnte durch die Verwendung der heterologen Expressionsein- heit erheblich gesteigert werden.

Beispiel 5 Konstruktion von Plasmid pCIS IysC Im ersten Schritt der Stammkonstruktion wurde ein allelischer Austausch des IysC Wildtypgens in C. glutamicum ATCC13032 durchgeführt. Dabei wurde im IysC Gen ein Nukleotidaustausch durchgeführt, so daß im resultierenden Protein die Aminosäure Thr an der Position 311 durch ein Ile ausgetauscht wurde. Ausgehend von der chromoso- malen DNA aus ATCC13032 als Template für eine PCR Reaktion wurde mit den Oli- gonukleotidprimern SEQ ID NO 22 und SEQ ID NO : 23 IysC mit Hilfe des Pfu-Turbo PCR Systems (Stratagene USA) nach Angaben des Herstellers amplifiziert. Chromo- somale DNA aus C. glutamicum ATCC 13032 wurde nach Tauch et al. (1995) Plasmid 33 : 168-179 oder Eikmanns et al. (1994) Microbiology 140 : 1817-1828 präpariert. Das amplifizierte Fragment wird an seinem 5'-Ende von einem Sall Restriktionsschnitt und an seinem 3'-Ende von einem Mlul Restriktionsschnitt flankiert. Vor der Klonierung wurde das amplifizierte Fragment durch diese beiden Restriktionsenzyme verdaut und mit GFXTMPCR, DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg) aufgereinigt.

SEQ ID NO : 22 5'-GAGAGAGAGACGCGTCCCAGTGGCTGAGACGCATC-3' SEQ ID NO : 23 5'-CTCTCTCTGTCGACGAATTCAATCTTACGGCCTG-3' Das erhaltenen Polynukleotid wurde über die Sall und Mlul Restriktionsschnitte in pCLIK5 MCS integrativ SacB im folgenden pCIS genannt (SEQ ID NO : 24) kloniert und in E. coli XL-1 blue transformiert. Eine Selektion auf Plasmid tragende Zellen wurde durch das Ausplattieren auf Kanamycin (20pg/ml) haltigen LB Agar (Lennox, 1955, Virology, 1 : 190) erreicht. Das Plasmid wurden isoliert und durch Sequenzierung die erwartete Nukleotidsequenz bestätigt. Die Präparation der Plasmid DNA wurde nach Methoden und mit Materialien der Fa. Quiagen durchgeführt. Sequenzierungsreaktio- nen wurden nach Sanger et al. (1977) Proceedings of the National Academy of Scien- ces USA 74 : 5463-5467 durchgeführt. Die Sequenzierreaktionen wurden mittels ABI Prism 377 (PE Applied Biosystems, Weiterstadt) aufgetrennt und ausgewertet. Das erhaltene Plasmid pOS) IysC ist als SEQ ID NO : 25 aufgeführt.

Beispiel 6 Mutagenese des IysC Gens aus C. glutamicum Die gerichtete Mutagenese des IysC Gens aus C. glutamicum wurde mit dem Quick- Change Kit (Fa. Stratagene/USA) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Mutagenese wurde im Plasmid pCIS IysC, SEQ ID NO : 25 durchgeführt. Für den Aus- tausch von thr 311 nach 311 ile mit Hilfe der Quickchange Methode (Stratagene) wur- den folgende Oligonukleotidprimer synthetisiert : SEQ ID NO : 26 5'-CGGCACCACCGACATCATCTTCACCTGCCCTCGTTCCG-3' SEQ ID NO : 27 5'-CGGAACGAGGGCAGGTGAAGATGATGTCGGTGGTGCCG-3' Der Einsatz dieser Oligonukleotidprimer in der Quickchange Reaktion führt in dem IysC Gen SEQ ID NO : 28 zu einem Austausch des Nukleotids in Position 932 (von C nach T). Der resultierende Aminosäureaustausch Thr311 Ile im IysC Gen wurde nach Trans- formation in E. coli XL1-blue und Plasmidpräparation durch ein Sequenzierungsreaktio- nen bestätigt. Das Plasmid erhielt die Bezeichnung pOS) IysC thr311 ile und ist als SEQ ID NO:29 aufgeführt.

Das Plasmid pCIS lysC thr311ile wurde in C. glutamicum ATCC13032 mittels Elektro- poration wie bei Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53 : 299-303 beschrie- ben, transformiert. Modifikationen des Protokolls sind in DE 10046870 beschrieben.

Die chromosomale Anordnung des IysC-Lokus einzelner Transformanten wurde mit Standardmethoden durch Southernblot und Hybridisierung wie in Sambrook et al.

(1989), Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, beschrieben, überprüft. Dadurch wurde sichergestellt, daß es sich bei den Transformanten um sol- che handelt, die das transformierte Plasmid durch homologe Rekombination am IysC- Lokus integriert haben. Nach Wachstum solcher Kolonien über Nacht in Medien, die kein Antibiotikum enthalten, werden die Zellen auf ein Saccharose-CM-Agarmedium (10 9/l Pepton, 5 g/l Beef-Extrakt, 5 g/1 Hefe-Extrakt, 2,5 g/1 NaCI, 2 g/l Harnstoff, 1% Glucose, 10% Saccharose, pH 6,8) ausplattiert und bei 30°C für 24 Stunden inkubiert.

Da das im Vektor pCIS IysC thr311 ile enthaltende sacB Gen Saccharose in ein toxi- sches Produkt umwandelt, können nur solche Kolonien anwachsen, die das sacB Gen durch einen zweiten homologen Rekombinationsschritt zwischen dem Wildtyp IysC Gen und dem mutierten Gen IysC thr31 ile deletiert haben. Während der homologen Rekombination kann entweder das Wildtyp Gen, oder das mutierte Gen zusammen mit dem sacB Gen deletiert werden. Wenn das sacB Gen zusammen mit dem Wildtyp Gen entfernt wird, resultiert eine mutierte Transformante.

Anwachsende Kolonien wurden gepickt, und auf eine Kanamycin-sensitiven Phänotyp hin untersucht. Klone mit deletiertem SacB Gen müssen gleichzeitg Kanamycin sensi- tives Wachstumsverhalten zeigen. Solche Kan-sensitiven Klone wurde im einem Schüttelkolben auf ihre Lysin-Produktivivät hin untersucht (siehe Beispiel 6). Zum Ver- gleich wurde der nicht behandelte C. glutamicum ATCC13032 angezogen. Klone mit einer gegenüber der Kontrolle erhöhten Lysin-Produktion wurden selektiert, chromo- somale DNA gewonnen und der entsprechende Bereich des IysC Gens durch eine PCR-Reaktion amplifiziert und sequenziert. Ein solcher Klon mit der Eigenschaft erhöh- ter Lysin-Synthese und nachgewiesener Mutation in IysC an der Stelle 932 wurde mit ATCC13032 IysCfbr bezeichnet.

Beispiel 7 Herstellung eines Integrationsplasmids zur Überexpression des IysC-Gens mit Hilfe des heterologen Expressionseinheit Peftu (SEQ ID 2) Zur Amplifizierung des Promotors des Gens, das für den Elongationsfaktor Tu kodiert, wurden die folgenden Oligonukleotide definiert.

SEQ ID : 30 CK 352 : 5'-CGCCAATTGTGGCCGTTACCCTGCGAATG-3' SEQ ID : 31 CK 353 : 5'-TTCTGTACGACCAGGGCCACTGTATGTCCTCCTGGACTTC-3' Die Primer wurden in eine PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC 13032 eingesetzt. Mit diesem Ansatz konnte ein DNA-Fragment amplifiziert werden, das der erwarteten Größe von ca. 200 bp entsprach.

Zur Amplifizierung des Gens, das für die Aspartokinase kodiert, wurden sie folgenden Oligonukleotide definiert.

SEQ ID : 32 CK 354 : 5'-GAAGTCCAGGAGGACATACAGTGGCCCTGGTCGTACAGAA-3' SEQ ID : 33 CK 355 : 5'-CATGCCCGGGACAGCAGCAAGTTCCAGCAT-3' Die Primer wurden in eine PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum ATCC13032 IysCfbr eingesetzt. Mit diesem Ansatz konnte ein DNA-Fragment amplifi- ziert werden, das der erwarteten Größe von ca 620 bp entsprach.

Die Primer CK 354 und CK 353 enthalten eine überlappende Sequenz und sind an ihren 5'-Enden homolog zueinander.

Die oben erhaltenen PCR-Produkte wurden als Template für eine weitere PCR ein- setzt, in der die Primer CK 352 und CK 355 genutzt wurden.

Mit diesem Ansatz konnte ein DNA-Fragment amplifiziert werden, das der erwarteten Größe von ca. 820 bp entsprach. Diese Fusion Peftu/lysC^°r wurde mit den Restrikti- onsenzymen Muni und Smal geschnitten.

Zur Amplifikation eines 5'-Bereiches des IysC-Gens wurden folgende Oligonukleotide definiert : SEQ ID : 34 CK 356 : 5'-CGCGACGTCCGTCCCAAAACGATCATGAT-3' SEQ ID : 35 CK 357 : 5'-CGCCAATTGCTTTGTGCACCTTTCGATCT-3' Die Primer wurden in eine PCR-Reaktion mit chromosomaler DNA von C. glutamicum eingesetzt. Mit diesem Ansatz konnte ein DNA-Fragment amplifiziert werden, das der erwarteten Größe von ca. 600 bp entsprach. Dieses DNA-Fragment wurde mit den Restriktionesenzymen Aatll und Munl verdaut. Diese Fragment und die verdaute Pef- tu/lysCfDr-Fusion wurden dann anschließend in den Vektor pOS kloniert, der zuvor mit den Restriktionsenzymen Aatll und Smal verdaut worden war. Das resultierende Plas- mid wurde mit pOS Peftu IysCtr (SEQ ID : 36) bezeichnet. Bis zu diesem Schritt wur- den alle Klonierungen in Escherichia coli XL-1 Blue (Firma Stratagene, Amsterdam, Nierderlande) durchgeführt.

Mit dem Transformationsplasmid pCIS Peftu IysCfbr wurde dann E. coli Mn522 (Firma Stratagene, Amsterdam, Nierderlande) zusammen mit dem Plasmid pTc15AcgIM nach Liebl, et al. (1989) FEMS Microbiology Letters 53 : 299-303 transformiert. Das Plasmid pTc15AcgIM ermöglicht die Methylierung von DNA nach dem Methylierungsmuster von Corynebacterium glutamicum (DE 10046870). Durch diesen Schritt wird eine anschlie- ßende Elektroporation von Corynebacterium glutamicum mit dem Integrationsplasmid pOS Peftu IysCf°r ermöglicht. Aus dieser Elektroporation und der nachfolgenden Selek- tion auf CM-Platten mit Kanamycin (25 µg/ml) wurden mehrere Transkonjuganten er- halten. Zur Selektion auf das zweite Rekombinationsereignis, das zur Excision des Vectors samt dem IysC-Promotor und dem lysC-Gen führen soll, wurden diese Transkonjuganten in CM-Medium über Nacht ohne Kanamycin angezogen und an-

schließend zur Selektion auf CM-Platten mit 10% Saccharose ausplattiert. Das auf dem Vektor pOS vorhandenen sacB-Gen kodiert für das Enzym Laevansucrase und führt bei Wachstum auf Saccharose zur Synthese von Laevan. Da Laevan für C. glu- tamicum toxisch ist, können nur C. glutamicum Zellen, die das Integrationsplasmid durch den zweiten Rekombinationsschritt verloren haben, auf Saccharose-haltigem Medium wachsen (Jäger et al., Journal of Bacteriology 174 (1992) 5462-5466). 150 Saccharose-resistente Klone wurden auf ihre Kanamycin-Sensitivität hin überprüft. Für 56 der getesteten Klone konnte neben der Resistenz gegenüber Saccharose auch eine Sensitivität gegenüber Kanamycin nachgewiesen werden. Ob auch der gewünschte Austausch des natürlichen Promotors durch den Peftu-Promotor erfolgt war, wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) überprüft. Für diese Analyse wurde chromo- somale DNA aus dem Ausgangsstamm und 20 Klonen isoliert. Hierzu wurden die je- weiligen Klone mit einem Zahnstocher von der Agarplatte abgenommen und in 100 NI H20 suspendiert und 10 min bei 95°C aufgekocht. Jeweils 10 ut der erhaltenen Lösung wurden als Template in die PCR eingesetzt. Als Primer wurden Oligonukleotide ver- wendet, die zum Peftu-Promotor und dem IysC-Gen homolog sind. Die PCR- Bedingungen wurden wie folgt gewählt : Vorabdenaturierung : 5 min bei 95°C ; Denaturie- rung 30 sec bei 95°C ; Hybridisierung 30 sec bei 55°C ; Amplifizierung 2 min bei 72°C ; 30 Zyklen, ; End-Exrension 5 min bei 72°C. Im Ansatz mit der DNA des Ausgangs- stammes konnte durch Wahl der Oligonukleotide kein PCR-Produkt entstehen. Nur bei Klonen, die durch die 2. Rekombination den Austausch des natürlichen Promotors (PlysC) gegen Peftu vollzogen haben, wurde ein Bande mit einer Größe von 552 bp erwartet. Insgesamt waren von den getesteten 20 Klonen 3 Klone positiv.

Beispiel 8 Aspartokinase (IysC) Assay C. glutamicum Stämme, die entweder eine chromosomale Copy des IysCfbr-Gens mit dem natürlichen Promotor oder eine chromosomale Copie des Peftu IYSCfbr Konstruk- tes enthielten, wurden in CM-Medium (10 9/l Pepton, 5 g/1 Beef-Extrakt, 5 gel Hefe- Extrakt, 2,5 g/l NaCI, 2 girl Harnstoff, 1% Glucose, pH 6,8) bei 30°C bis zu einer OD600 von 8 angezogen. Die Zellen wurden bei 4°C abzentrifugiert und das zweimal mit kal- tem Tris-HCI-Puffer (0, 1 %, pH 8,0) gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in kalten Tris-HCI-Puffer (0, 1%, pH 8,0) aufgenommen und eine ODgoo von 160 eingestellt. Für den Zellaufschluß wurden 1 ml dieser Zellsuspension in 2 ml Ribo- lyserröhrchen der Fa. Hybaid überführt und in einem Ribolyser der Fa. Hybaid bei einer Rotationseinstellung von 6,0 dreimal für jeweils 30 sec lysiert. Das Lysat wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 15.000 rpm bei 4°C in einer Eppendorfzentrifuge geklärt und der Überstand in ein neues Eppendororfcup überführt. Der Proteingehalt wurde nach Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. 72 : 248-254 bestimmt.

Die enzymatische Aktivität der Aspartokinase wurde wie folgt durchgeführt. Reaktions- ansätze von 1 ml mit 100 mM Tris-HCI (pH8,0), 10 mM MgCl2, 600 mM Hydroxylamin- HCI (pH 73,0 mit 10 N KOH), 4 mM ATP, 200 mM Aspartat (Natriumsalz) und H20 ad 1 ml wurden für 10 min bei 30°C inkubiert. Der Test wurde durch Zugabe von dem je- weiligen Proteinlysat gestartet und bei 30°C für 30 min inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurde 1 ml der Stoplösung (10% Eisenchlorid, 3,3 % Trichloressigsäure, 0,7 N NaCI) zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Nach einem Zentrifugationsschritt wur- de OD540 des Überstandes gemessen. 1 Unit entspricht dabei 1 nmol Aspartat Hydro- xamat, das pro mg Protein pro Minute gebildet wird.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 2a gezeigt.

Tabelle 2a Stamm spezifische Aktivität [nmol/mg/min] ATCC 13032 lyscfbr 19, 3 ATCC 13032 Peftu lysCfbr 49, 37 Die Aktivität der Aspartokinase konnte durch die Integration des Peftu IysCf°r Konstruk- tes in das Chromosom um das 2,5-fache gesteigert werden.

Beispiel 9 Produktion von Lysin Zur Untersuchung der Auswirkung des Peftu IysC'br Konstruktes auf die Lysin- Produktion wurde der Stämm ATCC13032, ATCC130321ysCfbr und ATCC13032 Peftu IysCfbr auf CM-Platten (10,0 g/L D-glucose, 2,5 g/L NaCI, 2,0 g/L Harnstoff, 10,0 g/L Bacto Pepton (Difco), 5,0 g/L Yeast Extract (Difco), 5,0 g/L Beef Extract (Difco), 22,0 g/L Agar (Difco), autoklaviert (20 min. 121°C)) für 2 Tag bei 30°C angezogen. An- schließend wurden die Zellen von der Platte abgekratzt und in Saline resuspendiert.

Für die Hauptkultur wurden 10 ml Medium I und 0,5 g autoklaviertes CaCO3 (Riedel de Haen) in einem 100 ml Erlenmeyerkolben mit der Zellsuspension bis zu einer OD600 von 1,5 beimpft und für 39h auf einem vom Typ Infors AJ118 (Fa. Infors, Bottmingen, Schweiz) bei 220 upm inkubiert. Anschließend wurde die Konzentration des in das Me- dium ausgeschiedene Lysin bestimmt.

Medium I : 40g/1 Saccharose 60g/l Melasse (auf 100% Zuckergehalt berechnet) 10g/l (NH4) 2S04 0. 4g/l MgS04*7H20 0. 6g/l KH2PO4 0. 3mg/l Thiamin*HCI 1mg/l Biotin (aus einer 1 mg/ml steril flitrierten Stammlösung die mit NH40H auf pH 8,0 eingestellt wurde) 2mg/) FeS04 2mg/I MnS04 mit NH40H auf pH 7,8 eingestellt, autoklaviert (121°C, 20 min). zusätlich wird Vitamin B12 (Hydroxycobalamin Sigma Chemicals) aus einer Stamm- lösung (200 µg/ml, steril filtriert) bis zu einer Endkonzentration von 100 pg/1 zugegeben Die Bestimmung der Aminosäurekonzentration erfolgte mittels Hochdruckflüssig- keitschromatographie nach Agilent auf einer Agilent 1100 Series LC System HPLC.

Eine Vorsäulenderivatisierung mit Ortho-Pthalaldehyd erlaubt die Quantifizierung der gebildeten Aminosäuren, die Auftrennung des Aminosäuregemisch findet auf einer Hypersil AA-Säule (Agilent) statt.

Das Ergebnis der Untersuchung ist in Tabelle 3a dargestellt Tabelle 3a Stamm L-Lysin (g/l) ATCC 13032 0 ATCC 13032 lysCfbr 10,15 ATCC 13032 Peftu lysCfbr 13,2