La présente demande a pour objet des fragments de la protéine p53 correspondants à des épitopes immunodominants de la protéine p53 humaine.

Elle est d'autre part relative à leurs utilisations dans la détection et le suivi d'états pathologiques et en particulier d'états cancéreux et pré-cancéreux. Les mutations du gène p53 sont les altérations géniques les plus souvent rencontrées dans les cancers humains. La fréquence des mutations du gène p53 est élevée pour le cancer du colon (1), du sein (2) et du poumon (3) de même que dans les leucémies (4), les ostéosarcomes (5), les cancers de l'ovaire (6), de l'estomac (7), et du cerveau (8). Des mutations héréditaires ont été récemment mises en évidence comme support du syndrome du cancer familial de Li-Fraumeni

(9,10). Rapportées aux 10 cancers les plus fréquents dans le monde, les altérations du gène p53 sont retrouvées chez 40 à 45% des cancéreux. Les altérations les plus fréquentes sont des mutations ponctuelles situées dans 4 des 5 régions phylogénétiquement conservées (HCD) de la protéine p53 (11,12).

En 1982, Benchimol et al. ont montré par une technique radio-immunologique que la protéine p53 est spécifiquement surexprimée dans les cellules transformées et indécelable dans les cellules normales (13). De nombreuses études ont confirmé depuis ces résultats et montré que l'accumulation de la protéine p53 est due à sa stabilisation. On sait maintenant que cette stabilisation est due dans presque tous les cas à une mutation ponctuelle qui modifie la conformation et la stabilité de la protéine. Ces observations encouragent l'étude systématique par immunohistologie

de l'expression de la protéine p53 sur une large gamme de tumeurs car il semble y avoir une bonne corrélation entre la mutation du gène p53 et l'accumulation de la protéine (14, 15). En 1982, Crawford et al. ont détecté des anticorps anti-p53 chez des patients présentant un cancer du sein (16). Caron de Fromentel et al. ont ensuite montré en 1987 que de tels anticorps étaient présents dans le sérum d'enfants présentant des cancers très divers (17). La fréquence moyenne est de 12% avec une fréquence particulière de 20% dans le lymphome de Bur itt (17). Plus récemment, Davidoff et al. (18) ont montré que la présence d'anticorps anti- p53 est associée avec des mutations spécifiques des exons 5 et 6 du gène. Ces protéines mutées sont connues pour s'associer à la protéine hsp70 et sont encore plus oncogéniques in vitro et in vivo.

L'importance de ces anticorps sériques a été récemment soulevée par la découverte que leur présence est généralement corrélée avec un mauvais pronostic pour le patient.

La partie de la protéine p53 humaine présentant le plus de mutations étant située environ au milieu de la séquence de la protéine p53, on aurait pu supposer que les anticorps de patients atteints de cancer et produisant une telle protéine mutée reconnaissent spécifiquement cette partie centrale de la protéine présentant des mutations. En effet, cette région de la protéine p53 humaine étant différente chez des patients atteints de cancers, il semblait logique de concevoir que la réponse immunitaire de l'organisme serait préférentiellement dirigée contre la région modifiée.

Le demandeur a montré de manière surprenante que les régions reconnues par les anticorps des

patients ne correspondent pas aux régions de la p53 modifiées dans les cancers mais à d'autres régions de la protéine p53 humaine qui sont situées dans les extrémités amino et carboxy-terminales de la p53. Ce résultat original ne pouvait être prédit par aucune étude antérieure.

On notera que dans les années 1980-1985, de nombreux anticorps monoclonaux murins ont été produits soit contre la p53 murine, soit contre la p53 humaine. Deux études ont porté sur la caractérisation de ces anticorps monoclonaux. Banks et al. (22) ont décrit la production d'anticorps monoclonaux murins dirigés contre la p53 humaine. L'un de ces anticorps (PAblδOl) est très utilisé dans divers laboratoires à l'heure actuelle. En utilisant des protéines p53 tronquées, ces auteurs ont montré que l'épitope reconnu par pAbl801 ou Pabl803 est compris entre les acides aminés 32 et 79.

Dans un autre article, ADE-EVANS et JENKINS (30) ont cartographie les épitopes de 4 anticorps monoclonaux dirigés contre la p53 de souris. Pour cette étude, ils ont utilisé des fragments de protéine p53 murine. Les résultats sont les suivants: l'anticorps PAb242 reconnaît un épitope situé entre les acides aminés 9 et 25, l'anticorps PAb246 reconnaît un épitope situé entre les acides aminés 88 et 109, l'anticorps PAb248 reconnaît un épitope situé entre les acides aminés 157 et 192 et l'anticorps PAb421 reconnaît un épitope situé entre les acides aminés 370 et 378.

L'ensemble de ces études montre que les épitopes reconnus par ces anticorps monoclonaux sont répartis sur tout le long de la protéine.

La présente invention a pour objet des peptides ou des fragments protéiques, à l'exclusion de la

protéine p53, présentant une réaction spécifique vis- à-vis des anticorps anti-p53 présents dans les fluides biologiques de patients précancéreux ou atteints d'un cancer quel que soit son origine . Avantageusement , un tel peptide est compris dans la séquence des acides aminés de la région amino terminale (résidus 1 à 112) ou dans la région carboxy terminale (résidus 350 à 393) de la protéine p53. La séquence de la protéine p53 humaine sauvage est décrite par SOUSSI et al (26).

Il comprend avantageusement en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes :

Glu Pro Pro Leu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu ( SEQ ID NO:l)

Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile. Glu Gin Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro (SEQ ID NO:2) .

Préférentiellement , un tel peptide comprend en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes :

Glu Pro Pro Leu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu (SEQ ID NO:3)

Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn (SEQ ID NO:4) Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn

Val Leu Ser Pro Leu(SEQ ID NO:5)

Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin Trp Phe Thr (SEQ ID NO 6)

Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro (SEQ ID NO:7).

Si un tel peptide est compris dans la séquence des acides aminés 350 à 393 de la protéine p53, il comprend alors préférentiellement en partie ou en totalité l'une des séquences suivantes : Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala

Gly Lys Glu Pro Gly (SEQ ID NO : 8)

Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His (SEQ ID NO:9)

Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys (SEQ ID NO:10)

Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin (SEQ ID NO:11)

Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser Arg His (SEQ ID NO: 12) Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser Arg His

Lys Lys Leu Met Phe (SEQ ID NO:13 )

Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro (SEQ ID NO:14)

Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser Asp (SEQ ID NO:15).

La détermination des fragments de la protéine p53 présentant une réaction spécifique vis-à-vis des anticorps de patients atteints d'un cancer peut se faire par les moyens mis à la disposition de l'homme du métier et en particulier par test immunoenzymatique, radio-immunologique, par immuno- précipitation ou par immunoblot.

De tels tests sont bien connus de l'homme du métier et sont décrits dans des manuels généraux (28,29).

La présente invention est en outre relative à une séquence nucléotidique , ribonucléotidique (ARN) ou désoxyribonucléotidique (ADN), codant pour la synthèse d'un des peptides objet de la présente demande .

De tels peptides peuvent être utilisés pour la détection ou le suivi d'états pathologiques, et en particulier pour la détection ou le suivi d'états cancéreux et précancéreux. Un autre objet de la présente invention est un

procédé pour la détermination de la présence d'anticorps ou pour leur dosage dans un tissu ou un fluide caractérisé en ce que :

- on met en présence le tissu ou le fluide et l'un des peptides objet de l'invention précédemment décrits , et

- on détermine la présence soit de l'anticorps, soit du peptide soit du couple anticorps-peptide et on effectue le dosage correspondant . Le dosage des complexes anticorps-peptides peut être effectué soit par dosage de la liaison anticorps peptide, soit par dosage du peptide ou de l'anticorps capté et rentrant dans le complexe anticorps-peptide.

Ce dosage peut être effectué par les méthodes connues de l'homme du métier et en particulier par des méthodes physiques ou immunologiques telles que les méthodes immunoenzymologiques, radioimmunologiques ou chimioimmunologiques ou par des approches plus récentes qui sont basées sur les nouvelles techniques de biologie moléculaire telles que 1'immuno-PCR. Selon cette technique, le complexe antigène-anticorps est détecté par une réaction de PCR qui met en jeu un oligonucléotide lié à l'anticorps de révélation. Le complexe est ensuite visualisé par électrophorèse. Avantageusement, les anticorps dont on détermine la présence ou que l'on dose sont des anticorps représentatifs d'états pathologiques et en particulier d'états cancéreux ou pré-cancéreux.

Afin de mettre en oeuvre le procédé, le peptide peut être fixé sur une phase solide.

Les complexes formés peuvent être révélés à l'aide d'un anticorps réagissant spécifiquement avec le peptide ou les anticorps à doser ou à détecter . Cet anticorps permettant la révélation des complexes est avantageusement conjugué à un marqueur afin de

mettre en évidence le complexe anticorps-peptide .

Un tel marqueur peut être un enzyme, une molécule chimioluminescente, bioluminescente, fluorescente ou radioactive. Un tel procédé peut être avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un coffret pour le dosage et à la détermination d'anticorps comprenant au moins: une préparation d'un ou plusieurs des peptides tels que précédemment décrits et - un moyen permettant la révélation de la réaction ou de l'absence de réaction entre l'un de ces peptides et les anticorps à doser .

Le complexe peptide anticorps formé lors de la réaction est avantageusement révélé à l'aide d'un anticorps conjugué à un marqueur tel que défini ci- dessus ou à l'aide de toutes molécules capables de détecter la présence d'un tel complexe.

Les peptides objets de la présente invention sont préférentiellement obtenus par synthèse à partir d'acides aminés par tous moyens connus de l'homme du métier .

Ils peuvent aussi être obtenus par génie génétique ou par découpage enzymatique ou chimique de la protéine p53. Les anticorps permettant la révélation du complexe formé entre le peptide et les anticorps sont avantageusement dirigés contre des déterminants antigéniques spécifiques de l'espèce dont est originaire le fluide ou le tissu . Ainsi, dans le cadre de dosage d'anticorps d'origine humaine, les anticorps permettant la révélation du complexe seront des anticorps anti-humain.

La présente invention est illustrée sans pour autant être limitée par les exemples qui suivent dans lesquels :

La figure 1 représente les profils d'interaction entre les fragments de la protéine p53 et des anticorps présents dans le sérum de différents patients ayant un cancer. Les anticorps utilisés pour les hybridations des figures l'A à IF sont respectivement un sérum de lapin CM1 immunisé avec la protéine p53, un sérum de souris immunisé avec la protéine p53, trois sérums de patients dont il avait été déterminé qu'ils possédaient des anticorps anti- p53 et un témoin constitué par un anticorps anti- phosphatase alcaline.

Les figures 2 à 7 représentent la réactivité de 77 peptides correspondant à la protéine p53, vis-à-vis de sérums de trois patients atteints de cancers du poumon numérotés 84, 37, 109, et de trois patients atteints de cancer du sein numérotés 57, 27 et 29.

Le complexe anticorps/peptides est révélée par colorimétrie et la densité optique est mesurée par un lecteur de microplaque. La figure 8 illustre la fréquence de reconnaissance (en ordonnée) de 77 peptides ( en abscisse) par différents sérums de patients atteints de cancers.

Les abréviations suivantes sont utilisées dans les exemples :

ER, récepteur oestrogène

HCD, Domaine Hautement Conservé (highly conserved domain) de la protéine p53 hsp70, protéine du choc thermique de 70 kilodaltons MAB, anticorps monoclonal PBS, tampon phosphate PBST, PBS avec 0,1 % Tween 20

PBSTM, PBS avec 0,1% Tween 20 et 3% poudre de lait écrémé PCR, réaction de polymérisation en chaîne (polymerase

chain reaction) .

PhoA, Phosphatase alcaline d'E.coli PR, récepteur progestérone SDS, sodium dodécyl sulfate EXEMPLE 1 -

Mise en évidence et signification des anticorps anti-p53 présents dans le sérum de patients atteints de cancer et localisation des régions de la protéine p53 reconnues par ces anticorps. 1) MATERIELS ET METHODES

1.1 SERUMS.

Les sérums de 80 malades présentant un carcinome invasif du sein et de 20 malades avec des métastases ont été réunis après diagnostic histopathologique et conservés à -20°C.

1.2 Anticorps monoclonaux

Des souris BALB/c d'haplotype H-2d sont immunisées par voies intrapéritonéale avec 100 μg de p53 humaine normale. Une injection de rappel est effectuée par voie intraveineuse avec 80μg de protéine de même origine. Quatre jours après le rappel, les splénocytes sont prélevés et fusionnés avec des cellules de myélome NS-1 en présence de polyéthylène glycol (PEG 1500 Boehringer) . Après sélection en milieu additionné de 1 % d'Hypoxanthine Aminopterine Thymine (HAT) (Gibco), la sécrétion d'anticorps par les hybridomes a été recherchée par un test ELISA en utilisant la p53 humaine comme antigène. Les hybridomes sécrétant des anticorps capables de reconnaître la p53 ont été clones par la technique de dilution limite.

Pour la localisation des épitopes sur la p53 humaine, nous avons utilisé une série de peptides chevauchants (longueur de 15 acides aminés (aa), chevauchement de 10 aa) couvrant l'intégralité de la

protéine p53. On dispose d'une série de 77 peptides biotinylés correspondant à la totalité de la p53. Les 76 premiers peptides à partir de l'extrémité N- terminale ont une longueur de 15 acides aminés chacun et le 77ème peptide ne comprend que 1 ^* 3 acides aminés. L'anticorps Hlll reconnaît un épitope compris entre les acides aminés 291 et 300, l'anticorps HR231 reconnaît un épitope compris entre les acides aminés 371 et 380 et HT 216 reconnaît un épitope compris entre les acides aminés 1 à 64.

1.3 EXPRESSION DE FRAGMENT DE P53 Le vecteur pLip4 a été utilisé pour la production des protéines hybrides. Ce plasmide est dérivé de pLipl (21) dans lequel deux sites de restriction Sac I et Sal I sont introduits entre les codons +6 et +7 du gène E.coli PhOA. Après clonage, la protéine de fusion PhoA est exportée dans le périplasme bactérien et peut en être extraite par choc osmotique à froid (21). La protéine p53 a été découpée en 6 fragments bien définis. Les fragments 2 (résidus 108 à 162), 3 (résidus 158 à 219), 4 (résidus 215 à 267) et 5 (résidus 263 à 310) contiennent respectivement les régions HCD II à V et correspondent aux sites privilégiés pour les mutations (régions HOT-SPOT) dans ' les cancers humains (11,12).

Les fragments 1 (résidus 1 à 112) et 6 (résidus 306 à 393) correspondent aux régions amino- et carboxy-terminales de la protéine et sont généralement à l'écart des mutations.

Les fragments précis d'ADNc de la p53 humaine (clone H8, Varda Rotter, Institut eissman, Israël) ont été amplifiés par PCR utilisant la Vent-DNA polymerase pour réduire les erreurs d'incorporation puis sous clones dans un vecteur pLIP4. Les clones

positifs sont contrôlés pour l'activité phosphatase alcaline et séquences directement.

Les six fragments fusionnés au gène PhoA peuvent être exprimés dans E.coli comme des protéines solubles. Le rendement d'expression' de protéine de fusion avec, le fragment 6 est plus bas (2 à 5 fois) que pour les autres fragments .

L'antigënicité de la protéine exprimée est établie par sa réactivité avec différents anticorps monoclonaux . (voir tableau 2). PAblδOl (22) et HT 216 sont spécifiques du fragment 1; l'épitope PAb240 est localisé sur le fragment 3 (23). Hlll est sur le fragment 5; HR 231 et PAbl22 (24) sont spécifiques de la région carboxy-terminale de la p53 (fragment 6). Tous ces anticorps monoclonaux réagissent en immunoblot et immunoprécipitation avec la protéine de fusion pLIP4 en accord avec la localisation de leur épitope (voir tableau 2).

1.4 METHODE D'ANALYSE DES FRAGMENTS P53 PAR IMMUNOBLOT.

L'Immunoblot a été réalisé tel que décrit par

Towbin et al. (20). Les protéines sont séparées par électrophorèse en gel de polyacrylamide (10% acrylamide) en tampon Tris-Glycine contenant 0,1 % de SDS, pH 8,3. Les protéines sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (2 heures, 40 volts); la membrane est immergée en tampon PBSTM pour saturer les sites de fixation non spécifiques puis lavée 5 fois au

PBST. Pour le Western blot du sérum du patient et de l'extrait d'E.coli, plusieurs pré-incubations sont nécessaires pour diminuer les liaisons non spécifiques à la membrane de nitrocellulose et éliminer les anticorps anti-phosphatase présents dans certains sérums. Les sérums sont d'abord incubés avec l'extrait

bactérien exprimant la phosphatase alcaline E.coli pendant une heure à +4°C puis sur une membrane de nitrocellulose contenant un extrait bactérien (sans protéine de fusion)12 heures à +4°C. La membrane de nitrocellulose avec les protéines hybrides est incubée avec les sérums préparés et dilués du 1/100 au 1/500 pendant 1 heure en tampon PBSTM à température de la pièce . Après 5 lavages en PBSTM, les membranes sont incubées 1 heure avec un anticorps de lapin anti-souris conjugué peroxydase (dilué au 1/4000 en tampon PBSTM) , lavées 5 fois en tampon PBS et révélées par le Luminol (Amersham ^Λ ) .

Après lecture et interprétation , les filtres sont contrôlés par réaction immunologique (Immunoblot) pour la quantité de protéine de fusion effectivement déposée en incubant la membrane avec un anticorps anti-phosphatase alcaline.

L'immunoprécipitation et 1'électrophorèse en gel de polyacrylamide-SDS ( SDS-PAGE) ont été réalisés selon la technique décrite par Soussi et al. (19). 2) RESULTATS

2.1 Anticorps anti-p53 et résultats cliniques.

Les sérums de 100 patients avec un cancer du sein sont testés pour la présence d'anticorps par immunoprécipitation et Western blot (Tableau 1) . Les anticorps circulant sont détectés chez 14% des patients tous stades cliniques confondus.

La fréquence est légèrement plus élevée que celle rapportée par Crawford et al. (10%) (16), en raison sûrement de l'utilisation de protéine purifiée recombinante p53 à la place de lysat cellulaire.

Il n'y a pas de corrélation entre la présence d'anticorps et le stade clinique de la maladie. Aucune différence de fréquence en fonction de la taille de la

tumeur ou de la dissémination ganglionnaire n'a été montrée. Il n'y a pas de corrélation avec d'autres paramètres cliniques tels que l'âge , le statut hormonal. Par contre une corrélation a été établie avec le stade histologique de la tumeur (SBR stade 3), un marqueur pronostic indépendant dans les cancers primitifs du sein . Ceci est confirmé par l'association entre la présence d'anticorps et l'absence de récepteurs hormonaux (ER-PR) . 2.2 Analyse des régions de la protéine p53 impliquées dans la réponse immune.

Pour déterminer si la réponse immunitaire est dirigée contre la p53 mutante ou sauvage, tous les sérums positifs et plusieurs sérums négatifs sont contrôlés par immunoprécipitation contre différents mutants p53 (Hisl75, Val 143 et Prol56). La reconnaissance des types sauvages et mutants par les sérums est identique.

Dans une seconde série d'expériences , le sérum CM1 (25) a été contrôlé . CM1 est un anticorps polyclonal de lapin obtenu par immunisation avec la p53 humaine hautement purifiée et fréquemment utilisée en immunocytochimie (24). Les techniques de Western blot ont montré que le sérum CM1 contient des anticorps qui reconnaissent principalement les fragments 1 et 6 et à un moindre degré le fragment 5. Des résultats similaires sont obtenus par immunoprécipitation . Une expérience de contrôle avec un anticorps anti-phosphatase alcaline permet d'établir que des quantités identiques des différentes protéines de fusion sont bien présentes sur le gel (figure 1). Pour élargir des observations nous avons contrôlé le sérum d'une souris immunisée avec de la p53 immunopurifiee. Le profil de reconnaissance est quasiment identique à celui du sérum CM1. Des

- résultats identiques ont été obtenus avec trois autres souris.

L'ensemble de ces résultats permet d'établir que les parties amino et carboxy terminales de la protéine p53 sont très immunogènes chez l'animal immunisé et correspondent à des réponses préfé¬ rentielles alors que le fragment 5 a une réponse plus faible . Des temps d'exposition radiographique allon¬ gés n'ont pas permis de mettre en évidence une recon- naissance des fragments 2 à 4 tant par immunopré¬ cipitation que par immunohybridation (immunoblot).

On a testé le profil de reconnaissance des sérums de malades contenant des anticorps anti-p53

(figure 1 et tableau 3).Les immuno hybridations réalisées ont clairement montré que la réponse immunitaire chez les patients est dirigée principalement contre des épitopes localisés dans les fragments 1 et 6 de la p53. Le sérum de certains patients reconnaît seulement le fragment 1 , mais aucun ne reconnaît uniquement le fragment 6 ce qui laisse supposer que la réponse primaire est dirigée principalement contre le fragment 1. Des résultats semblables sont obtenus par immunoprécipitation. De même que chez l'animal, il existe quelques variations dans la réponse immunitaire et quelques patients ont des anticorps dirigés contre les fragments 4 et 5.

Aucun anticorps dirigé contre les fragments 2 et 3 n'a pu être détecté. Ce phénomène n'est pas spécifique au cancer du sein. Des résultats identiques ont été obtenus avec des sérums de patients ayant des carcinomes de l'ovaire ou du poumon (figure 1 et exemple 2) .

Ces résultats établissent clairement que la partie amino terminale de la p53 contient un ou plusieurs épitopes dominants impliqué dans la réponse

immunitaire cellule B chez des patients présentant des cancers divers . La région carboxy terminale contient aussi un ou plusieurs épitopes immunodominant mais leur importance est moindre par rapport à la région amino terminale. EXEMPLE 2:

Mise en évidence des épitopes reconnus par les anticorps anti-p53 présents dans le sérum de malades atteints de divers types de cancer : analyse avec des peptides de synthèse .

1) MATERIELS ET METHODES

Les plaques de microtitration utilisées sont des plaques en polychlorure de vinyle à fond plat, à 96 puits. Ref: M129B, Société Dynatech. La streptavidine en poudre, référence (S4762) ,

Société Sigma.

Peptides biotinilés synthétisés par la Société CAT (Angleterre)

Une série de peptides chevauchants (longueur de 15 acides aminés (aa) , chevauchement de 10 aa) couvrant l'intégralité de la protéine p53. On dispose actuellement d'une série de 77 peptides biotinylés correspondant à la totalité de la p53. Les 76 premiers peptides à partir de 1'extrémité N-terminale ont une longueur de 15 acides aminés chacun et le 77ème peptide ne comprend que 13 acides aminés ( SEQ ID NO: 15) .

2 peptides témoins ne correspondant pas à la protéine p53 sont utilisés comme témoin négatif. Tablette ABTS 50 mg; ref 1112422, Boehringer

Tampon ABTS ref 1112597, Boehringer Anti human couplé à la peroxydase IgG-GAH; PDSOF, Silenus Lait en poudre METHODES DU TEST ELISA

16

PREPARATION DES PLAQUES DE MICROTITRATION.

100 μl de streptavidine ( concentration 5μg/ml dans l'eau distillée ) sont déposés dans les puits de la plaque. Les plaques sont ensuite incubées à 37"C dans une étuve sèche pendant 48 heures. Après cette étape de déshydratation, elles peuvent être emballées individuellement et stockées pendant plusieurs mois à 4°C. LAVAGE :

Les plaques déshydratées sont lavées 5 fois avec du PBS ( phosphate buffer saline) contenant 0,05% Tween 20. Ce tampon PBS avec du Tween (PBS-T) sera utilisé tout le long de l'expérience comme solution de lavage. Les 5 lavages se font de manière usuelle en utilisant 200 μl de tampon PBS-T par puits.

Après le dernier lavage, la plaque est séchée sur un papier absorbant. Tous les lavages sont effectués de cette façon. SATURATION

100 μl de solution de saturation sont ajoutés dans chaque puits. solution de saturation: tampon PBS

0,2 % Tween 20 5% Lait

Les plaques sont ensuite incubées 1 heure à 37°C avec une légère agitation puis sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. ADDITION DES PEPTIDES BIOTYNILES 50 μl de solution de peptides (125 nanogrammes de peptide dilué dans du tampon PBS contenant 0,1 % de Sérum Albumine Bovine et 0,02% d'azide de sodium) sont ajoutés dans chaque puits.

Chaque puits reçoit un peptide différent correspondant à une région précise de la p53.

Les plaques sont incubées 1 heure à 20 ^β C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment . ADDITION DES SERUMS DES PATIENTS Les sérums à tester sont dilués au 1/50 dans une solution de PBS contenant du lait à 5%.

50 μl de sérum ainsi dilué sont ajoutés dans chaque puits de la plaque.

Les plaques sont incubées 1 heure à 20°C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. INCUBATION AVEC L'ANTICORPS SECONDAIRE.

100 μl d'anticorps monoclonal anti- im unoglobuline humaine sont ajoutés dans chaque puits ( commercialisé par Silenus, anticorps dilué au 1/2500 dans du PBS 5%lait) .

Les plaques sont incubées 30 minutes à 37°C avec une légère agitation et sont ensuite lavées comme indiqué précédemment. REVELATION.

100 μl de substrat (ABTS 1 mM, commercialisé par Boerhinger) sont ajoutés dans chaque puits.

Les plaques sont incubées à 20°C avec une légère agitation. Le résultat est lu dans un appareil de lecture

ELISA (405 nm) 15 minutes, 30 minutes et 60 minutes après addition du substrat . 2) RESULTATS OBTENUS

Dans 1 'exemple 1 deux phénomènes ont été mis en évidence. i) La présence d'anticorps anti-p53 est retrouvée chez les patients ayant une forme agressive de cancer du sein (mauvais pronostic ) . ii) Les anticorps anti-p53 reconnaissent principalement une région de 112 acides aminés situés

dans la partie amino terminale de la p53 ainsi qu'une région carboxy terminale localisée entre les résidus 306-393. L'étude ne pouvait pas permettre de détailler plus précisément la région reconnue par les anticorps anti-p53.

L'étude décrite dans cet exemple présente une étude très détaillée de ces régions.

Une analyse de plus de 1 000 sérums de patients atteints de divers types de cancers a été faite. 47 sérums positifs ont été choisis pour une étude très détaillée afin de déterminer la nature exacte des épitopes que reconnaissent les anticorps sériques.

Ces 47 sérums contenant des anticorps anti-p53 ont été testés sur une série de 77 peptides couvrant l'intégralité de la protéine p53 humaine sauvage. La méthode utilisée est la détection ELISA .

Des exemples de résultats obtenus sont décrits dans les figures 2 à 7.

L'ensemble des résultats est résumé dans le tableau 5.

Dans ce tableau, les peptides donnant une réponse comprise entre 50 et 100 % de la valeur maximale de l'ELISA ont été indiqués en noir. Les peptides donnant une réponse comprise entre 20 et 50 % de la valeur maximale de l'ELISA ont été indiqués en gris.

Les initiales des cancers étudiés sont les suivantes :

LC: cancer du poumon UC: cancer de la vessie

PA: cancer du pancréas BC: cancer du sein BL: lymphome de Burkitt H : cancer du foie OV: cancer de l'ovaire

L : leucémie

TY: cancer de la thyroïde PR: cancer de la prostate.

La figure 8 illustre les fréquences obtenues pour chacun de ces peptides.

Cet histogramme montre la fréquence de reconnaissance de chaque peptide par les 47 sérums étudiés (voir tableau 5). Il montre, par exemple, que 40% des sérums reconnaissent au moins le peptide 3 et que 63% reconnaissent au moins le peptide 4. 98% des sérums reconnaissent au moins l'un des 5 peptides de la région aminoterminale (N-ter) tandis que seulement 47% reconnaissent l'un des peptides de la région carboxy terminale (C-ter) . Bien sur, 100% des sérums reconnaissent l'un des 13 peptides décrits dans ce tableau.

L'ensemble de ces résultats montre que 98% des sérums de malades reconnaissent au moins l'un des épitopes présents dans les 5 peptides de la région amino terminale. 47% des sérums reconnaissent au moins un des peptides de la région carboxy terminale.

Il apparait donc que l'utilisation de ces peptides, amino ou carboxy terminaux, sont d'une importance majeure dans la possibilité de mettre au point un test ELISA pour mesurer la présence de ces anticorps dans le fluide biologique de patients atteints de cancers ou d'états précancéreux.

TABLEAU 1

Corrélation entre le taux d'anticorps anti-p53 dans le sérum et les paramètres cliniques et histologiques de patients atteints d'uh cancer du sein

Paramètres cliniques N ^β

Patients atteints par des 3/20 métastases ou ayant subi une rechute cancer primaire du sein 17/80

Taille de la tumeur

NS

NS

<O.05

<O.05

S = non significatif

TABLEAU 2 Caracterisation des fragments de p53 clones dans le plasmide pLIP4

TΛDLEΛU 3

Caracterisation des déterminants antigeniques de la p-53 par les anticorps seriques de patients atteints par un carcinome

l'rυt. - I.i. ijiiiL'iiL prυlu quo.

(1) TOUR les patients sont atteints par un cancer du sein sπuf indications contraires

(2) p-53 humaine intacte

(3) carcinome pulmonaire (4)cαrcinome des ovaires.

TABLEAU 4

24

TABLEAU 4 (suite.

26

TABLEAU 4 (suite)

TABLEAU 4 (suite)

TABLEAU 4 (suite)

TABLEAU 4 ( suite)

3D TABLEAU 4 (suite)

BIBLIOGRAPHIE

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StYrzbecher H. ., Ullrich S., Jenkins J. and May P. Evolutionary conservation of the biochemical properties of p53- spécifie interaction of xenopus- laevis p53 with simian virus 40 large T-antigen and mammalian heat shock proteins- 70. J. Virol., 63: 3894-3901, 1989.

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0

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LISTE DE SEQUENCES

(1) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: LABORATOIRES EUROBIO

(B) RUE: 7, Avenue de Scandinavie

(C) VILLE: LES ULIS CEDEX

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 91953

(G) TELEPHONE: 69 07 94 77 (H) TELECOPIE: 69 07 95 34 (I) TELEX: 681 425 F

(ii) TITRE DE L' INVENTION: FRAGMENTS DE LA PROTEINE P53 ET LEURS UTILISATIONS DANS LA DETECTION ET LE SUIVI D'ETATS PATHOLOGIQUES

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 15

(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (OEB)

(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:

(A) NUMERO DE DEPOT: FR 9213110

(B) DATE DE DEPOT: 02-NOV-1992

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE;

(A) LONGUEUR: 25 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

Glu Pro Pro Leu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp 1 5 10

Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu Ser Pro Leu 15 20 25

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 20 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple <

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin 1 5 10

Trp Phe Thr Glu Asp Pro Gly Pro 15 20

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Glu Pro Pro Leu Ser Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu 1 5 10

Trp Lys Leu 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

Gin Glu Thr Phe Ser Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro 1 5 10

Glu Asn Asn 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Asp Leu Trp Lys Leu Leu Pro Glu Asn Asn Val Leu 1 5 10

Ser Pro Leu 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

Asp Asp Leu Met Leu Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin

1 5 10

Trp Phe Thr 15

- ^'• (2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

Ser Pro Asp Asp Ile Glu Gin Trp Phe Thr Glu Asp

1 5 10

Pro Gly Pro 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

Glu Ala Leu Glu Leu Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys 1 5 10

Glu Pro Gly 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide (vi) ORIGINE:

P

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

Lys Asp Ala Gin Ala Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser

1 5 . 10

Arg Ala His 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10:

Gly Lys Glu Pro Gly Gly Ser Arg Ala His Ser Ser

1 5 10

His Leu Lys 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

Gly Ser Arg Ala His Ser Ser His Leu Lys Ser Lys

1 5 10

Lys Gly Gin 15

r

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire .

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

Ser Ser His Leu Lys Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr

1 5 10

Ser Arg His 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(vi) ORIGINE:

(A) ORGANISME: Homo sapiens

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

Ser Lys Lys Gly Gin Ser Thr Ser Arg His Lys Lys 1 5 10

Leu Met Phe 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 15 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

Ser Thr Ser Arg His Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr 1 5 10

Glu Gly Pro 15

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 13 acides aminés

(B) TYPE: acide aminé

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15:

Lys Lys Leu Met Phe Lys Thr Glu Gly Pro Asp Ser 1 5 10

Asp