Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 17α-Hydroxy-3-methoxy-8,14- seco-l,3,5(10),9(l l)estratetraen-14-on durch Fermentation von 3-Methoxy-8,14-seco- l,3,5(10),9(ll)-estratetraen-14,17-dion mit einer lebenden Kultur von Kloeckera magna.

Ein derartiges Verfahren ist bereits aus der Deutschen Patentanmeldung DE-A 1768 513 vorbekannt. Den Ausführungsbeispielen dieser Patentanmeldung kann man entnehmen, daß dieses vorbekannte Verfahren in der Weise durchgeführt wird, daß man das Substrat in Ethanol löst und die erhaltene Lösung umsetzt.

Es wurde nun gefunden, daß es überraschenderweise möglich ist, das Substrat innerhalb signifikant kürzerer Fermentationszeit unter Erzielung siginifikant höherer Ausbeuten umzuwandeln, wenn man dem Fermentationsansatz das Substrat in Form einer lösungsmittelfreien wässrigen Suspension mit einer mittleren Korngröße von 0,2 bis 5 μm zusetzt.

Das erfϊndungsgemäße Verfahren wird unter den Fermentationsbedingungen durchgeführt, welche man auch bei den bekannten mikrobiologischen Umwandlungen von Substraten mit Kloeckera magna Kulturen anwendet.

Unter den für diesen Mikroorganismus üblicherweise verwendeten Kulturbedingungen werden in einem geeigneten Nährmedium unter Belüften Submerskulturen angezüchtet. Dann setzt man der Kultur eine wässrige Suspension des 3-Methoxy-8,14-seco-l,3,5(10),9(ll)- estratetraen-14,17-dions zu und fementiert bis eine maximale Substratumwandlung erreicht ist.

Die wässrige Suspension des 3-Methoxy-8,14-seco-l,3,5(10),9(ll)-estratetraen-14,17-dions läßt sich in einfacher Weise herstellen, indem man beispielsweise dieser Substanz mit der zweifachen bei fünffachen Menge Wasser unter Zusatz eines nichtionischen Tensids in einer Kugelmühle mahlt bis sie eine mittlere Korngröße von 0,2 bis 5 m besitzt. Geeignete Tenside sind beispielsweise Ethylenoxidaddukte oder Fettsäureester von Polyglykolen. Als geeignete Tenside seien beispielsweise die handelsüblichen Netzmittel wie Tegin ® , Tween® oder Span® genannt.

Nach erfolgter Fermentation wird die Kultur in üblicherweise aufbereitet, beispielsweise indem man sie mit einem in Wasser schwer löslichen Alkohol, Keton oder Ester extrahiert, den Extrakt einengt und den erhaltenen Rückstand durch Chromatographie und/oder Kristallisation aufreinigt.

Die Weiterverarbeitung des erhaltenen 17α-Hydroxy-3-methoxy-8,14-seco-l,3,5(10),9(ll)- estratetraen-14-on zu pharmakologisch wirksamen Steroiden ist bekannt oder erfolgt nach an sich bekannten Verfahren (Deutsche Patentanmeldung DE-A 1768 513).

Das nachfolgende Ausführungsbeispiel dient zur näheren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel:

a) Ein 2 1 Erlenmeyer mit 1 1 sterilem Nährmedium enthaltend

0,1 % Hefeextrakt 0,1 % Fleischextrakt 0,2 % Tryptose 1,0 % Glucose -eingestellt auf pH 7,2-

wird mit 5 ml einer Suspension einer Kloeckera magna ATCC 20109 - Kultur beimpft und 72 Stunden bei 30 °C mit 180 Umdrehungen pro Minute geschüttelt.

b) Ein 5,5 m ³ -Fermenter mit 5 m ³ steriler Nährlösung enthaltend

5 % Glucose

2 % Cornsteep liqour

-eingestellt auf pH 5,4-

wird mit 1 1 der Kloeckera magna- Anzuchtkultur beimpft un 24 Stunden bei 29 °C unter Belüftung von 45 m ³ pro Stunde und Rühren mit 60 Umdrehungen pro Minute inkubiert.

c) 100 kg 3-Methoxy-8,14-seco-l,3,5(10),9(ll)-estratetraen-14,17-dion werden in einer Dynomühle (Firma Netzsch, Typ KD 45) mit Glaskugeln, 400 1 Wasser und 10 1 Tween 80 auf eine Teilchengröße von ca. 1 μm vermalen.

d) Ein 64 m ³ -Fermenter mit 50 m ³ steriler Nährlösung wie unter b) angegeben wird mit 5 m ³ der Kloeckera magna-Vorkultur beimpft und unter Belüftung von 500 m ³ pro Stunde und Rühren mit 40 Umdrehungen pro Minute bei 29 °C 6 Stunden inkubiert.

Dann setzt man der Kultur die gemäß c) hergestellte 3-Methoxy-8,14-seco- l,3,5(10),9(ll)-estratetraen-14,17-dion-Suspension zu und fermentiert weitere 24 Stunden lang unter Rühren mit 40 Umdrehungen pro Minute und einer Belüftung von 500 m ³ pro Stunde.

e) Nach erfolgter Fermentation wird die Kulturbrühe dreimal mit Methyl isobutylketon extrahiert, der Extrakt bei max. 50 °C unter Vakuum eingeengt. Anschließend erfolgt eine Reinigung durch Kristallisation aus Ethanol.

Man erhält 80 kg 17 -Hydroxy-3-methoxy-8,14-seco-l,3,5(10),9(ll)estratetraen-14- on vom Schmelzpunkt 102- 4 °C.