1.成体神経幹細胞と成体膵臓幹細胞について
 成体幹細胞の中で、神経幹細胞は国際的、� ��術的にも確立されている。1990年代に始めて 明らかにされて以降、脳内で神経新生を起こ す成体神経幹細胞の仕組みを解明し、創薬開 発や再生医療、脳神経疾患の治療に役立てる 研究が盛んに今日では行われている。
 本発明者らは、内分泌器官である「成体」� ��膵臓にも、成体神経幹細胞と同じ未分化マ� ��カー遺伝子(Sox2)を発現する膵臓幹細胞が存� ��することを明らかにさせた(図1)。Sox2遺伝子 は、ES細胞でも発現する非常に高い未分化性� ��保持する転写因子である。トランスジェニ� ��クマウスを用いた動物個体の脳と膵臓で、� ��の発現を確認した(Sox2プロモーターにレポ� �ター遺伝子であるEGFPを連結した遺伝子改変� ��ウス内で、Sox2遺伝子を発現している細胞が 蛍光を発する)。重要なこととして、両臓器� �神経細胞及び、β細胞がともにインシュリン を発現していることである(図1、上図、赤が� ��ンシュリン抗体陽性、緑がSox2遺伝子を発現 している成体幹細胞)。神経細胞とβ細胞は成 体ではNRSF/RESTという転写因子を発現しており (マゼンタ)、そのNRSF/REST発現陽性の細胞がイ� ��シュリン(緑)を発現していることが分かる(� ��1、下段)。
 「成体幹細胞」を樹立したことは、得られ� ��成体幹細胞が多能性を有していることを、� ��sox-2マーカー」によって確認することがで� �る。ここで、「sox-2マーカー」とは、Sox2プ� �モーターにレポーター遺伝子であるEGFPを連� ��したものであり、遺伝子改変マウス内でSox2 遺伝子を発現している細胞が蛍光を発するこ とで確認できる(非特許文献7)。Sox2遺伝子は� �典型的な多能性を有する未分化細胞であるES 細胞でも発現している遺伝子であり、未分化 状態を示す幹細胞特異的な遺伝子であるとさ れ、当該遺伝子の発現は、成体組織幹細胞が 樹立されたことを示す最もよい指標となる。 本発明の実施例でも、成体神経幹細胞の樹立 は、Sox2遺伝子を発現していることで確認し� �いる(図1)。Sox2遺伝子配列は、公知のデータ� ��ースから入手可能であり、例えばヒトSox2遺 伝子は、NM_003106(Gene Bankアクセッションナン� ��ー)、マウスSox2遺伝子はNM_011443(Gene Bankアク セッションナンバー)である。また、Sox2遺伝� ��発現は、抗Sox2抗体によっても簡単に確認す ることができ、抗Sox2抗体はすでに市販され� �いるものを用いることができる(例えば、Chem icon社製)。

2.神経幹細胞の樹立法及び培養法
 本発明では、非特許文献1の記載に基づいて 、神経幹細胞存在領域として知られているマ ウス脳の海馬組織から、多能性をもつ成体神 経幹細胞を樹立した。樹立した成体神経幹細 胞は未分化状態を示す成体幹細胞特異的なSox 2遺伝子を発現している(図1)。
 なお、本発明において「成体神経幹細胞」� ��いうとき、典型的にはドナーとなるヒトの� ��々な神経組織から得られた「成体神経幹細� ��」であり、好ましくは再生治療を行う患者� ��身の「成体神経幹細胞」であることが好ま� ��いが、ブタなど異種哺乳類由来の「成体神� ��幹細胞」であってもよい。また、マウス、� ��ットなどの実験動物由来、又はイヌ、ネコ� ��どの愛玩動物由来の「成体神経幹細胞」で� ��ってもよい。
 具体的な手法は以下の通りである。
 神経幹細胞存在領域をマイクロダイセクシ� ��ンしたのち、迅速にトリプシン酵素処理下� ��細胞を分散させ、次いで、37℃のCO ₂ インキュベーター内で神経細胞培養用培地中 に細胞を懸濁し、培地による洗浄を繰り返し 、遠心により、神経幹細胞を含有する神経由 来の細胞成分を採取する。神経細胞培養用培 地としては、典型的には[DME/F12,high glucose(1mM� �L-glutamine)、N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic� ��加]が用いられる。
 細胞増殖能を上昇させるためには、上記神� ��幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添 加することが好ましい。例えば、FCSを濃度1~1 0%、好ましくは5%で添加すると共に、FGF2を10~2 00ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期 特有の培養方法を続ける。
 さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約5~8日間 、好ましくは7日間培養することで十分増殖� �せた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加� ��た神経幹細胞用培地(好ましいFGF2の添加量� �、10~100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。)� ��培養すれば、成人神経幹細胞の未分化状態� ��維持し続けることができる。
 なお、膵臓幹細胞の場合は、EGF2を添加して もあまり効果が見られないが、神経幹細胞の 場合は、FGF2に代えてEGF2を用いても未分化状� ��の維持効果がある。

3.膵臓幹細胞の樹立法及び培養法における、� ��経幹細胞との類似性
 成体神経幹細胞の培養法と基本的には同じ� ��件下で行う。すなわち、例えば、典型的な� ��経幹細胞用培地である[DME/F12,high glucose(1mM  L-glutamine)、N2 supplement添加,Antibiotic-Antimicotic� �加]を用いることができる。
 細胞増殖能を上昇させるためには、上記神� ��幹細胞培養用培地に、さらにFCS及びFGF2を添 加することが好ましい。例えば、FCSを濃度1~1 0%、好ましくは5%で添加すると共に、FGF2を10~2 00ng/mL、好ましくは100ng/mL添加する、樹立初期 特有の培養方法を続ける。
 さらに、上記FCS及びFGF2を添加して約5~8日間 、好ましくは7日間培養することで十分増殖� �せた後に、FCSの添加をやめ、FGF2のみを添加� ��た神経幹細胞用培地(好ましいFGF2の添加量� �、10~100ng/mL、より好ましくは20ng/mLである。)� ��培養すれば、成人膵臓幹細胞の未分化状態� ��維持し続けることができる。
 なお、膵臓幹細胞の場合は、FGF2に代えてEGF 2を添加してもあまり未分化状態の維持効果� �見られない。
 一般に、神経幹細胞など、各種幹細胞が樹� ��されたことは、上述のように、Sox2遺伝子が 発現していることを確認して、未分化状態を 示すことを確認する。膵臓幹細胞の場合、膵 臓細胞が分化した状態で発現が上昇するイン シュリンやグルカゴン遺伝子の発現が認めら れないことも同時に確認できる(図3aおよびb)� ��

4.膵臓幹細胞の分化誘導法における神経幹細� ��との類似性
 成体神経幹細胞を分化させる際の手法とし� ��、神経分化誘導法やグリアへの分化誘導法� ��既に確立されている(非特許文献1、4~6など)� ��
 一方、成体膵臓幹細胞を、α細胞、β細胞、 δ細胞、γ細胞それぞれに分化させるために� �、各種神経細胞への分化方法を適用するこ� �ができる。つまり、β細胞分化には神経分化 の方法、α細胞の分化にはアストロサイト細� ��への分化方法、δ細胞の分化には抑制性の� �ンターニューロンを作製する神経分化条件� �γ細胞分化にはオリゴデンドロサイト細胞を 誘導するグリア細胞分化の条件が適用できる 。

 成体膵臓幹細胞の各膵臓細胞への具体的な� ��化誘導法は、以下の通りである。
(a)インシュリン産生能を有するβ細胞への分� ��
 神経幹細胞から神経細胞への分化条件を適� ��することで、成体膵臓幹細胞を、インシュ� ��ン産生能を有するβ細胞に分化させること� �できる。基本的には、非特許文献4又は5に記 載の神経細胞への分化条件に従うことが好ま しい。典型的には、[RA+FSK+KCl]添加培地が用い られ、例えば、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine) 、N2 supplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地 中に、1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μM� ��forskolin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社 製)を添加する。また、本実施例2-3中では、� �経細胞分化誘導剤として典型的に用いられ� �「RA+FSK+KCl」を添加する以外に、レチノイン� ��(RA)単独、またはレチノイン酸+フォスフォ� �リン(RA+FSK)でも、さらにヒストンデアセチラ ーゼ(HDAC)阻害剤の一種であるバルプロ酸(VPA)� ��メチル化酵素阻害剤の5AzaCもインシュリン� �ロモーターを活性化することを確認した(図3 F)。
 また、脳内の神経新生領域で発現する分泌� ��ンパク質として知られるWnt3もしくはその遺 伝子又はWnt3のシグナリング促進物質を用い� �ことでも、成体神経幹細胞をインシュリン� �生性のβ細胞へ効率的に分化することができ ることを本発明において、初めて実証できた 。すなわち、成体神経幹細胞の培地にWnt3aも� ��くはその活性化剤を添加するか、当該細胞� ��にWnt3a遺伝子を導入することでインシュリ� �を産生できるように分化させることができ� �。Wnt3aについては、下記5.で詳細に述べる。
 成体膵臓幹細胞がβ細胞に分化したことを� �認するためには、β細胞分化経路マーカーと して広く用いられている「インシュリン」発 現を抗体で確認すればよい。インシュリンが 新しく生成する反応由来の「C-peptide」で発現 を新規のインシュリン産生を同時に確認する こともできる。例えば、インシュリン検出用 の「guinea pig anti-Insulin(1:300;Sigma社製)」又はC -peptide検出用の「goat anti-C-peptide(1:250,Linco Res earch社製)」が好適に用いられる。また、イン シュリン又はC-peptideのmRNAの存在をRT-PCR法な� �により確認することができる(図3B)。

(b)δ細胞への分化
 成体膵臓幹細胞に対して、β細胞の場合と� �様の神経幹細胞から神経細胞への分化条件� �適用することで、δ細胞にも分化させること ができるが、δ細胞の含量を高めたい場合は� ��神経幹細胞から抑制性のインターニューロ� ��を作製する神経分化条件を適用する。基本� ��には、非特許文献4,5に記載の神経分化条件� ��従うことが好ましい。典型的には、DME/F12,hi gh glucose(1mM L-glutamine),N2 supplement添加,Antibioti c-Antimicotic添加培地中に、1μMのretinoic acid(RA� �シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)� ��追加的に40 mMのKCl(WAKO社製)を添加する。
 成体膵臓幹細胞がδ細胞に分化したことを� �認するためには、δ細胞分化経路マーカーと して広く用いられている「ソマトスタチン」 発現を確認すればよい。例えば、ソマトスタ チン検出用の「rat anti-Somatostatin(1:300,Chemicon� �製)」抗体が好適に用いられる。また、ソマ� ��スタチンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認 することができる。

(c)α細胞への分化
 神経幹細胞からアストロサイト細胞への分� ��条件を適用することで、成体膵臓幹細胞を� ��α細胞に分化させることができる。基本的� �は、非特許文献4~6に記載のアストロサイト� �胞への分化条件に従うことが好ましい。典� �的には、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 s upplement添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、5% FCSまたはLIF(50 ng/mL;WAKO社製)とBMP2(50 ng/mL;WAKO� ��製)を添加する。
 成体膵臓幹細胞がα細胞に分化したことを� �認するためには、α細胞分化経路マーカーと して広く用いられている「グルカゴン」発現 を確認すればよい。例えば、グルカゴン検出 用の「mouse anti-Glucagon(1:300,Immuno社製)」抗体� �の検出が好適に用いられる。また、グルカ� �ンmRNAの存在をRT-PCR法などにより確認するこ� ��ができる。

(d)γ細胞への分化
 成体膵臓幹細胞に対して、α細胞の場合と� �様の神経幹細胞からアストロサイト細胞へ� �分化条件を適用することで、γ細胞にも分化 させることができるが、γ細胞の含量を高め� ��い場合は、神経幹細胞からオリゴデンドロ� ��イト細胞を誘導するグリア細胞分化の条件� ��適用する。基本的には、非特許文献4~6に記� ��のグリア細胞、オリゴデンドロサイト細胞� ��の分化条件に従うことが好ましい。典型的� ��は、DME/F12,high glucose(1mM L-glutamine)、N2 supple ment添加、Antibiotic-Antimicotic添加培地に、1%FCS� �たはIGF1 (500 ng/mLが好適。使用範囲として20- 1000 ng/mL)を添加する。
 成体膵臓幹細胞がγ細胞に分化したことを� �認するためには、γ細胞分化経路マーカーと して広く用いられている「Pancreatic polypeptide� ��発現を確認すればよい。例えば、Pancreatic p olypeptide検出用の「guinea pig anti-Pancreatic polyp eptide (1:100,Linco Research社製)」抗体が好適に� �いられる。また、Pancreatic polypeptideのmRNAの� �在をRT-PCR法などにより確認することができ� �。

5.Wnt3a及びWnt3シグナル伝達機構(Wnt3/βcateninシ� ��ナリング)の促進物質について
 Wnt3は脳内の神経新生領域で、アストロサイ ト細胞(GFAP陽性)が発現する分泌タンパク質で 、この効果により神経幹細胞は神経新生を開 始し、ニューロブラストという神経新生細胞 (NeuroD1陽性)を産生する物質であるが、このWnt 3が、膵臓の膵島α細胞(GFAP、Glucagon陽性)で発� ��していることが分かった(参考例3、図3B)。
 また、膵臓の内分泌系は、脳内神経系と非� ��に高い相関が有り、β細胞内で新生してい� �細胞は、NeuroD1陽性であるという共通点が有� ��(図3C-E。NeuroD1のプロモーター上には、Wnt/βc ateninシグナリングで活性化されるβcatenin/TCF/L EF転写因子が認識して結合する配列がヒト-ラ ット-マウスで保存されている。膵臓幹細胞� �β細胞へ分化誘導する際に、初期神経誘導条 件下(ニューロブラスト産生状態)に置くと24� �間経過後には、Wnt/βcateninシグナリングで重� ��となるβcateninタンパク質の安定化が起きて� ��ることを、ウエスタンブロッティングで確� ��した(図4B)。
 さらに、NeuroD1遺伝子、インシュリン遺伝子 の活性化にWntが必須であり、Wnt3が両遺伝子� �活性化を導くことをRT-PCRで確認した(図4C)。
 図4Cは、Wnt/βcateninシグナリングの活性化(試 薬)でインシュリン遺伝子の発現が上昇し(Wnt3 ,GSK3beta-inhibitor)、対照的にWnt/βcateninシグナリ ングの不活性化(DnWnt;ドミナントネガティブWn t,βcatenin shRNA)でインシュリン遺伝子の発現� �起きないことを示している。
 NeuroD1のプロモーター上のTCF/LEF転写因子結� �部位のクロマチンの活性化(Anti-Acetyl HistoneH3 )がWnt3で誘導されること、さらにNeuroD1がイン シュリン遺伝子の活性化(インシュリン遺伝� �のプロモーター上のNeuroD1認識結合部位(E-box) )部位へ、直接結合し、クロマチン(染色体)の 活性化(Anti-Acetyl HistoneH3)を誘導する)を導く� �とを示した(図4D)。
 これらのことから、成体膵臓幹細胞を未分� ��状態に保つコントロール因子と共に、その� ��化制御におけるコントロール因子も、成体� ��経幹細胞からの神経再生制御機構ときわめ� ��共通性が高いことが実証された。
 したがって、Wnt3a自身及びWnt/βcateninシグナ� ��ングを活性化する物質は、成体膵臓幹細胞� ��前駆β細胞、さらにはβ細胞へと分化させる β細胞分化誘導剤となると同時に、インシュ� ��ン遺伝子発現を活性化することができるこ� ��から、これらの物質を、インシュリン産生� ��強用医薬組成物、糖尿病用治療薬(下記7.な� ��で詳細に述べる。)として用いることができ る。具体的には、Wnt3a自身、GSK3βインヒビタ� ��、リチウム塩(リチウムはWntシグナルを特異 的に活性化することで知られている)、及びβ カテニンを用いることができる。なお、β細� ��への分化効果、インシュリン産生増強効果� ��いずれに関しても、神経細胞の分化誘導剤� ��して知られるRA(+FA,KCl)、AzaCとVPAもWnt3aやWnt� �グナル活性化剤と同様な作用がある(図3F)。

 Wntは、細胞外に分泌され、細胞間のシグナ� ��伝達を司るタンパク質として複数種類(哺乳 類では19種類)存在し、線虫、ショウジョウバ エからヒトに至るまで生物種を超えて保存さ れている。ノックアウトマウスの解析により Wntは発生初期における体軸形成や器官形成に 必須な、生物学的に重要なタンパク質である 。Wntにより活性化される細胞内シグナル伝達 機構には、(1)βカテニン経路、(2)平面内細胞� ��性(PCP)経路(細胞骨格制御)、及び(3)Ca ²⁺ 経路(細胞運動制御)の3種類が存在するが、本 発明において「Wntシグナル伝達機構」という ときは、βカテニン転写因子(非特許文献8)を� ��した「βカテニン経路」を指す。
 Wnt3aは、典型的なWntであり、幹細胞、特に� �血幹細胞の増殖および自己再生を含む多数� �発達イベントに関与することが知られてお� �、本発明において、成体膵臓幹細胞からβ細 胞への分化を誘導する物質であることが見出 された。
 Wnt3aをインシュリン産生β細胞への分化誘導 剤として用いる場合、成体の膵臓組織に対し て、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を含む� �現ベクターなどを直接導入することも考え� �れるが、Wnt3aタンパク質、又はWnt3a遺伝子を� ��法により作用させた成体膵臓幹細胞、β前� �細胞を膵臓組織に移植する手法が好ましい� �
 その際に用いるWnt3aタンパク質としては、� �体試料から精製されたもの、化学合成され� �ものや遺伝子組み換えによって製造された� �のを用いることができ、市販Wnt3aを用いるこ ともできる。Wnt3aは保存性が高いので、由来� ��生物種はいずれのものであってもよいが、� ��薬製剤として用いる場合は対象生物種と同� ��の生物種由来のものが好ましい。また、Wnt3 aタンパク質におけるWntシグナル伝達機構に� �与する領域は古くから研究され、ほぼ解明� �れており(非特許文献9)、当該領域が含まれ� �いれば、Wnt3aタンパク質及びその遺伝子の全 長でなく部分配列であってもよい。
 Wnt3a遺伝子を細胞、組織に導入する際には� �生来のプロモーターと共に、もしくは強力� �公知プロモーター(例えばCAGプロモーターやC MVプロモーター)などに繋いで、生理学的に受 容可能なキャリアと共にそのまま導入しても よいが、通常は遺伝子治療用に用いられる各 種の公知ウイルスベクター(例えば、アデノ� �伴ウイルス(AAV) ベクターやレンチウイルス� ��クター)を用いて導入することができる。
 なお、「Wnt3a遺伝子」というとき、Wnt3aタン パク質をコードするDNA又はmRNAを指し、Wnt3a遺 伝子配列は、公知のデータベースから入手可 能であり、例えばヒトWnt3a遺伝子は、NM_033131( Gene Bankアクセッションナンバー)、マウスWnt3 a遺伝子はNM_009522(Gene Bankアクセッションナン バー)である。
 また、公知のWnt3a活性化剤(Wnt3aの活性を増� �させるような化合物やWnt3a 転写を活性化す� ��ような化合物)、例えば、Wntのシグナル伝達 機構を促進することが知られているグリコー ゲンシンターゼキナーゼ3β(GSK3β)インヒビタ� ��であるAR-A014418(J. Biol. Chem., Vol. 278, No. 46 , p45937-45945, 2003)やCT 99021 - CHIR 99021(Axon Li gands社製やSTEMGENT社製)、リチウム塩(Lithium Chl oride, Wakoやシグマ社製;)βカテニン(Proc.Natl.Aca d.Sci. USA, Vol.97. 4262-4266, 2000 )を用いること ができる。また、図3Dに示されるインシュリ� ��遺伝子発現増強効果が確認された、レチノ� ��ン酸(RA)は単独でも、フォスフォコリン(FSK)� ��共に、さらにKCl塩と共に用いることができ� ��神経分化誘導剤のバルプロ酸ナトリウム(VPA )や5AzaCも用いられる。
 なお、本発明の実施例4で用いた、Wnt3aのド� ��ナントネガティブタンパク質(dnWnt)は、Wnt3a� ��作用領域を改変して機能不全タンパク質を� ��ードする遺伝子をレンチウイルスベクター( Lie DC et al. Nature 437, 1370-1375. (2005))に組み 込み発現させたものを用いている。

6.成体膵臓幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治� ��方法について
 成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島� ��抽出し、上記成体膵臓幹細胞を樹立する。� ��販のコラーゲンシート(例;コラーゲンビト� �ゲル(旭テクノグラス株式会社))などの生体� �合性シート上で前記4.(a)に示したβ細胞分化� ��促す薬剤(すなわち、神経系細胞分化を促進 する薬剤)による処理を施して培養し、複数� �成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、� �者本人の膵臓に移植して戻す方法が考えら� �る。例えば重度の合併症を起こす前の糖尿� �患者などが対象としてあげられる。患者本� �の細胞を使うため、ドナーや移植に伴う拒� �反応の心配が無い。β細胞分化を促す薬剤処 理としては、上述の神経分化を促進する薬剤 (1μMのretinoic acid(RA、シグマ社製)、5μMのforsko lin(FSK、シグマ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製)や� ��後述のWntシグナリングを活性化する薬剤遺� ��子(Wnt3A,beta-catenin,GSK3betaインヒビター、リチ ウム塩など)、またこれまでに開発されてい� �神経分化を誘導する薬剤(抗てんかん薬とし� ��知られるVPA;バルプロ酸ナトリウム、TSA;ト� �コスタチンA)などがあげられる。
 また、シートを用いる手法の他、成体膵臓� ��細胞を、遠心分離した細胞単独で、又は上� ��神経分化を促進もしくは誘導する薬剤を含� ��する培養液と共に、注射器などにより膵臓� ��織(患部)に直接注入する手法を採ることも� �きる。

7.インシュリン増強用医薬組成物、又は糖尿� ��治療薬としての製剤化、及び投与方法
 特に、インシュリンを産生するβ細胞への� �化作用のある、RA(+FSK,KCl)、VPA、5AzaCなどの神 経分化誘導剤、Wnt3aもしくはその活性化剤(GSK 3βインヒビター、リチウム塩)、は、分化後� �インシュリン産生も増強できるので、糖尿� �用治療薬として有効であり、I型糖尿病用、I I型糖尿病用のいずれにも効果が期待できる� �
 本発明の医薬組成物は、移植用の成体神経� ��細胞と共にこれらの神経分化誘導剤を膵臓� ��患部に直接注入するか、又はin vitroで成体� ��経幹細胞又はそれを分化させた前駆β細胞� �どに注入して移植する方法を用いることも� �きる。一般的には、コラーゲンシートなど� �植用の生体適合性シート上で成体神経幹細� �を分化誘導剤と共に培養し、β前駆細胞にま で分化させた後にシートごと患部に移植する のが最も効率的であるので、その際の培地中 に添加するか、その成体神経幹細胞に導入す るのが一般的である。本発明で生体適合性シ ートというとき、典型的にはコラーゲンシー トであるが、コラーゲンマトリックスやコラ ーゲンスポンジを用いることもでき、その際 の材質としては生体適合性材料製、例えば周 知の生体適合性合成樹脂製であってもよい。
 したがって、本発明でインシュリン増強用� ��薬組成物、糖尿病再生治療用組成物という� ��き、単に成体神経幹細胞を有効成分とする� ��薬組成物のみならず、移植用シート上の成� ��膵臓幹細胞も含めた移植用キットを含む場� ��、さらに上述のβ細胞分化誘導剤を含む場� �も包含し、さらに、成体神経幹細胞をあら� �じめ移植用シート上で、上述のβ細胞分化誘 導剤存在下で培養し、β前駆細胞にまで分化� ��せた状態の移植用シート上の細胞を含める� ��ともある。
 そして、いずれの場合も、好ましくは通常� ��注射製剤などと同様、無菌の水溶液に溶解� ��又は懸濁し、薬学的に許容される安定化剤� ��等張化剤、緩衝剤などが配合される。また� ��遺伝子製剤の場合は、常法に従い、核内に� ��伝子を運搬するためのキャリアが併用され� ��ことが好ましい。生理学的に受容可能なキ� ��リアとしては、リポフェクタミン(Invitrogen� �)などの遺伝子導入用カチオン性脂質などが� ��る。
 遺伝子を細胞、組織に導入する際には、生� ��のプロモーターと共に、もしくは強力な公� ��プロモーター(例えばCAGプロモーターやCMVプ ロモーター)などに繋いで、生理学的に受容� �能なキャリアと共にそのまま導入してもよ� �が、通常は遺伝子治療用に用いられる各種� �公知ウイルスベクター(例えばレトロウイル� ��ベクター、アデノウイルスベクター、アデ� ��随伴ウイルスベクターなど)を用いて導入す る。
 また、公知のインシュリン製剤又はアディ� ��ネクチン製剤などの公知インシュリン産生� ��強剤を併用することもできる。
 本発明の医薬有効投与量および投与回数は� ��目的とする治療効果、投与方法、治療期間� ��年齢、体重等により異なるが、通常成人1日 当たり1μg/kg~10mg/kgである。

8.成体膵臓幹細胞を用いた、神経系再生用移� ��治療方法について
 成体の膵臓の膵尾部分に多く含まれる膵島� ��部分結紮して抽出し、そこから本件の技術� ��用いて成体膵臓幹細胞を樹立する。コラー� ��ンシート上で本件に記述されたようなβ細� �分化を促す薬剤処理を施して培養し、複数� �成体膵臓幹細胞培養コラーゲンシートを、� �者本人の神経疾患部位に移植して戻す方法� �考えられる。また、コラーゲンシートを用� �ずに、この細胞培養物を神経損傷部位に直� �インジェクションする方法も考えられる。� �述と同様、患者本人の細胞を使うため、ド� �ーや移植に伴う拒絶反応の心配が無い。神� �分化を促す薬剤処理としては、上述の神経� �化を促進する薬剤(1μMのretinoic acid(RA,シグマ 社製)、5μMのforskolin(FSK、シグマ社製)及び40 m MのKCl(WAKO社製))や、後述のWntシグナリングを� ��性化する薬剤遺伝子(Wnt3A,beta-catenin,GSK3betaイ ンヒビターなど)、またこれまでに開発され� �いる神経分化を誘導する薬剤(抗てんかん薬� ��して知られるVPA;バルプロ酸ナトリウム、TSA ;トリコスタチンA)なども用いることができる 。

9.成体神経幹細胞を用いた、膵臓細胞移植治� ��方法について
 前記2.のように樹立された成体神経幹細胞� �、上記4.で述べたと同様、例えばβ細胞分化� ��促す薬剤(すなわち、神経分化を促進する薬 剤)による処理を施したコラーゲンシート上� �培養する。次いで、複数の成体神経幹細胞� �養コラーゲンシートを、成体の膵臓組織に� �植して戻す。例えば、重度の合併症を起こ� �前の糖尿病患者などを対象とすることもで� �、その場合は患者自身の成体神経幹細胞を� �いることで、拒絶反応の心配のない再生医� �が可能となる。β細胞分化を促す薬剤処理と しては、神経分化を促進する薬剤(1μMのretinoi c acid(RA、シグマ社製)、5μMのforskolin(FSK、シ� �マ社製)及び40 mMのKCl(WAKO社製))や、Wntシグナ リングを活性化する薬剤遺伝子(Wnt3A,beta-cateni n,GSK3betaインヒビターなど)、またこれまでに� ��発されている神経分化を誘導する薬剤(抗て んかん薬として知られるVPA;バルプロ酸ナト� �ウム、TSA;トリコスタチンA)なども用いるこ� �ができる。
 また、シートを用いる手法の他、成体神経� ��細胞の培養液に、上記神経分化を促進又は� ��導する薬剤を添加した後、当該培養液と共� ��注射器などにより患部に直接注入する手法� ��採ることもできる。