Typ-PATl-Protein-Assay

Die Erfindung betrifft einen Typ-PATl-Protein-Assay und insbesondere ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft eines Wirkortkomplexes modifiziert, der einen Typ eines PATl-Protems enthalt.

Die Erfindung betrifft ferner einen Wirkstoffkomplex, der gemäß dem erfmdungsgemaßen Verfahren identifiziert ist oder wurde, ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels, einen Testkit zum Durchfuhren des erfmdungsgemaßen Verfahrens, ein Screeningver- fahren sowie die Verwendungen des erfmdungsgemaßen Verfahrens, des erfmdungsgemaßen Testkits sowie des Arzneimittels.

Die Proteine vom Typ PAT gehören zu der Familie SLC36 (SLC : so- lute carrier) entsprechend dem Human Genom Organisation (HUGO) Nomenklaturkomitee und umfassen unter anderem auch protonengekoppelte und somit protonenabhangige Aminosauretransporter (PAT : proton coupled ammo acid transporter) . Es handelt sich dabei im Transmembranproteine. In Saugern wurden bisher zwei protonenabhangige Aminosauretransporter nachgewiesen, die mit PATl und PAT2 bezeichnet werden. Es gehören noch zwei weitere orphane Transporter zur Familie SLC36, die mit PAT3 und PAT4 bezeichnet werden.

PATl ist hauptsächlich m der Plasmamembran von Enterozyten und in lysosomalen Membranen von Neuronen zu finden, aber auch m Niere, Lunge und Leber nachweisbar.

PAT2 wurde hauptsächlich m Herz und Lunge nachgewiesen, aber auch in Neuronen, die den N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor Subtyp NRl exprimieren .

Generell hat PATl ein breiteres Substratspektrum als PAT2, dafür zeigt PAT2 die höhere Affinitat. Physiologisch sind PATl und PAT2 für die Aufnahme von kleinen neutralen Aminosäuren aus dem Darm, Primarharn bzw. Blut verantwortlich. Darüber hinaus ist möglicherweise der neuronal-exprimierte PAT2 zusammen mit GIyTl und GlyT2 für die Regulation der Glycin-Konzentration verantwortlich, die modulierend die glycmerge und glutamaterge neuronale Signal- übertragung beeinflusst. Darüber hinaus gibt es experimentelle

Hinweise, dass PATl und PAT2 auch kurzkettige Fettsauren in einem elektroneutralen Prozess transportieren.

Die Lokalisation von PATl in Lysosomen von Neuronen deutet dar- aufhin, dass PATl möglicherweise für den Export von kleinen neutralen Aminosäuren nach lysosomaler Proteolyse verantwortlich ist.

Die treibende Kraft für den Transport sind der Protonengradient und im Falle des elektrogenen Aminosauretransportes auch das Membranpotential über die Membran.

Hinsichtlich der Struktur der PAT-Familie geht man ]e nach Hydropathieanalyse davon aus, dass PATl und PAT2 aus 9 bzw. 11 Trans- membrandomanen aufgebaut sind. Die Tatsache, dass in Neuronen PATl lysosomal und PAT2 endosomal sowie im ER exprimiert ist, konnte darauf hindeuten, dass sie für die neuronale Aktivität von großer Bedeutung sind und für den ZNS-Bereich zukunftige Targets darstellen .

Wahrscheinlich ist ein Gendefekt bei PATl verantwortlich für die erblich bedingte Iminoglycmurie , bei der der Transport von Prolin, Hydroxyprolm und Glycin in Darm und Niere nicht funktioniert .

In Bezug auf die Pharmakologie von PATl ist bemerkenswert, dass PATl therapeutisch relevante Prolinderivate sowie D-Serin und D- Cycloserin transportiert, die bei Krebs und Gemutskrankheiten eingesetzt werden. PATl ist daher bei oraler Medikamentengabe ein Kandidat für die Absorption von pharmazeutisch wirksamen Substan- zen.

Gegebenenfalls ist das PATl-Protein in einen übergeordneten Wirkortkomplex integriert. Dies kann eine Anordnung mehrerer PATl- Einheiten oder -Proteinmolekule zu einem Oligomer sein. Es können aber auch andere, z.B. enzymatische Komponenten vorhanden sein, die in Kooperation mit dem PATl-Protein vorliegen. Diese können auch raumlich beabstandet vorliegen.

Es sind im Stand der Technik unterschiedliche Verfahren und Mess- einrichtungen bekannt, mit denen Eigenschaften bestimmter Wirk-

Stoffe quantitativ und qualitativ analysiert und beschrieben werden können.

Auch ist es wünschenswert, vorgegebene und bekannte Wirkstoffe am Wirkortkomplex zu applizieren, z.B. am PATl-Protein , an einer Zelle, einem Gewebe oder dergleichen, um die Funktionsweise dieses Wirkortes zu beeinflussen und/oder zu untersuchen.

übliche Experimente am Gesamtorganismus sind aufgrund der Komple- xitat der Organismen und ferner aufgrund ethischer und moralischer Umstände oft bedenklich, und die damit erzielten Ergebnisse haben eine nur beschrankte Aussagekraft.

Folglich wurden Verfahren und Einrichtungen entwickelt, mit deren Hilfe eine isolierte Betrachtung der Wirkungsweise zu testender Wirkstoffe auf isolierte Wirkzentren oder eine Untersuchung der Wirkzentren selbst möglich ist. Dabei werden bestimmte Gewebe, isolierte Zellen und/oder andere biologische Einheiten, zum Beispiel Proteine oder dergleichen, in isolierter Art und Weise ei- ner Betrachtung zugänglich gemacht. Es sind zum Beispiel Techniken bekannt, die unter Verwendung von Farbstoffen oder radioaktiven Stoffen arbeiten und sich ändernde Transport- und/oder Bm- dungsspezifitaten ausnutzen und darstellen. Falls diese Vorgehensweise überhaupt möglich ist, ist sie aber dahingehend nachteilig, dass ihr oft nur ein geringes Auflösungsvermögen und eine hohe Fehleranfalligkeit zukommen.

Oft sind solche Methoden auch relativ unempfindlich.

Es sind ebenfalls elektrophysiologische Methoden bekannt, zum Beispiel die sogenannten Patch-Clamp-Technik oder Voltage-Clamp- Technik, bei welchen zum Beispiel Zellen isoliert einer elektro- physiologischen Untersuchung zuganglich sind. Bei diesem Vorgehen werden native Zellen unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt und es werden bestimmte elektrische Aktivitäten, die über die Zellmembran durch darin enthaltenen Proteine, Proteinkomplexe oder dergleichen vermittelt werden, gemessen.

Trotz der dabei erzielbaren hohen Genauigkeit sind diese bekann- ten elektrophysiologischen Methoden dahingehend nachteilig, dass

sie aufgrund ihres hohen messtechnischen Aufwandes und ihrer Störanfälligkeit für einen schnellen, automatisierbaren und/oder breiten Einsatz ungeeignet sind und aufgrund der in der Regel na- tiven Umgebung der zu untersuchenden Objekte gewisse Probleme bei der Diskriminierung unerwünschter Signalanteile aufweisen. Darüber hinaus sind diese Methoden sehr kostenintensiv.

So wurden Bmdungs- bzw. Aufnahmestudien von radioaktiv markierten Substraten an Caco2-Zellen oder PATl exprimierende Zellen o- der Oozyten sowie Pat chclampmessungen und Zweielektrodenvoltagec- lampmessungen durchgeführt, die aber die oben beschriebenen Unzulänglichkeiten aufweisen.

Die Untersuchung der Wirkung von Substanzen bei radioaktiven Bm- dungs- und Aufnahmeassays lasst m der Regel keine Unterscheidung zu, ob ein Wirkstoff nur bindet oder auch transportiert wird, dafür mussten alle Wirkstoffe radioaktiv markiert sein.

Radioaktive Messungen bedürfen speziell ausgebildeten Personals sowie notwendiger Sicherheitseinrichtungen. Beide Methoden können nur offline durchgeführt werden und erfordern Vermittler in Form von Farbereagenzien oder radioaktiv markierten Substraten. Bestimmt wird nicht die unmittelbare Enzymaktivitat , sondern die änderung einer Substratkonzentration nach dem Abschluss des Transportes. Sie erfassen die Transportaktivitat im Laufe von Minuten .

Die Untersuchung von Substanzen mit Hilfe der Patch- /Voltageclamptechnik enthalt die gleichen Informationen wie mit der hier beschriebenen Erfindung. Allerdings bieten die Patch- Messungen bzw. Zweielektrodenvoltageclampmessungen nur einen sehr geringen Durchsatz und man benotigt erfahrenes Personal für die Durchfuhrung. Zudem sind für die Patch-/Voltageclarapmethode eine Zellkultureinheit oder die Haltung entsprechender Tiere, z.B. von Fröschen (Xenopus laevis) , von denen entsprechende Zellen entnommen werden, notig.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, einen Typ-PATl-

Protein-Assay zu schaffen, bei welchem auf besonders einfache und gleichwohl zuverlässige Art und Weise eine rasche Wirkstofftes-

tung, insbesondere im Massenbetrieb, unter vertretbaren Kosten möglich ist.

Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zu Grunde, die Wechselwir- kung von Substanzen mit PATl zu untersuchen. Wird z.B. eine Substanz von PATl transportiert, kann dies ein Indiz für eine hohe orale Absorptionsrate und damit für eine hohe Bioverfugbarkeit dieser Substanz sein. Die Bioverfugbarkeit von pharmazeutisch wirksamen Substanzen ist ein entscheidendes Merkmal für deren klinische Anwendung und damit kommerziellen Einsatz.

Gelost werden diese und weitere Aufgaben, die sich aus dem eingangs diskutierten Stand der Technik ergeben, bei einem Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes erfindungsgemaß mit den Merkmalen des unabhängigen Anspruchs 1. Vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemaßen Verfahrens sind Gegenstand der jeweiligen abhangigen Unteranspruche .

Weiterhin sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Wirk- stoff oder Wirkstoffkomplex gemäß Anspruch 20, ein Verfahren zum

Herstellen eines Arzneimittels gemäß Anspruch 21, ein Testkit zur

Durchfuhrung des erfindungsgemaßen Verfahrens gemäß Anspruch 22, ein Screenmgverfahren gemäß Anspruch 23, sowie Verwendungen des

Verfahrens, des Testkits und des Arzneimittels gemäß den Anspru- chen 24, 25 bzw. 26.

Im Transportzyklus von PATl werden Protonen zusammen mit Amino- sauremolekulen über die Membran verschoben.

Der Erfindung liegt unter anderem die Idee zu Grunde, diese ami- nosaureabhangige Ladungsverschiebung direkt, z.B. durch Anbindung von Enzympraparationen auf einer geeigneten Oberflache, die z.B. in ein Durchflusssystem integriert ist und/oder bei der ein Sub- stratkonzentrationssprung durchgeführt werden kann, als elektri- sehen Stromfluss, als elektrische Potentialanderung und/oder deren zeitlichem Verlauf zu messen und den Einfluss verschiedener Substanzen oder Wirksubstanzen auf die Messgroße Stromfluss, als elektrische Potentialanderung und/oder deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen.

Im Sinne der Erfindung ist dabei auch eine mögliche Untersuchung einer möglichen Protonenabhangigkeit , also eine Abhangi gkeit von dei Protonenkonzentration, z.B. auch im Rahmen eines Protonenkon- zentrations- oder pH-Wert-Sprungs, mitumfasst.

Es ist ferner eine alternative oder zusätzliche Idee, die sub- stratabhangige, aminosaureabhangige und/oder aminosaureanalogab- hangige Ladungsverschiebung - also den Protonen- oder allgemeiner einen Ionentransport - in der Messgroße Stromfluss, als elektn- sehe Potentialanderung und/oder in deren zeitlichem Verlauf zu untersuchen .

Die Erfindung betrifft damit ein Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes , welcher eine enzymatische Eigenschaft und/oder das Transportverhalten eines Wirkortkomplexes, welcher einen Typ eines PATl-Proteins oder eines Teils davon enthalt, modifiziert. Das erfindungsgemaße Verfahren weist folgende Schritte auf:

(a) Bereitstellen einer Mehrzahl Primartrager, welche den Wirkortkomplex enthaltend das Typ-PATl Protein umfassen, insbesondere in einer Mehrzahl im Bereich einer Membran des jeweiligen Primartragers enthalten,

(b) Anlagern oder In-Kontakt-Bringen der Primartrager am oder im Oberflachenbereich eines Isolationsbereichs einer als Sekun- dartrager dienenden Biosensorelektrode in einem Messmedium, wobei der Sekundartrager bevorzugt gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primartragern mittels des Isolationsbe- reichs mechanisch und elektrisch isoliert ist oder wird,

(c) Bereitstellen mindestens eines potenziellen Wirkstoffkomplexes,

(d) In-Kontakt-Bringen und insbesondere In-Wechselwirkung-Bringen des potenziellen Wirkstoffkomplexes mit dem Wirkortkomplex der Primartrager oder Teilen davon, und

(e) Bestimmen des qualitativen und/oder quantitativen Einflusses des potenziellen Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon

auf enzymatische Eigenschaften des Wirkortkomplexes oder eines Teils davon durch Detektieren einer elektrischen Aktion ües oder am Wirkortkomplex oder eines Teils davon oder eine änderung dieser elektrischen Aktion über die Biosensorelekt- rode als Sekundartrager ,

dadurch gekennzeichnet, dass in den Verfahrensschritten (c), (d) und/oder (e) einer oder mehrere der folgenden Unterschritte durchgeführt werden:

(f) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein Ruhemedium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e) ,

(g) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein zweites nicht-aktivierendes Medium und gegebenenfalls Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrensschritt (e), wobei im zweiten oder nicht- aktivierenden Medium, insbesondere ein Nicht-Substrat von PATl vorgesehen ist,

(h) Einbringen des Sekundartragers mit den Primartragern in ein drittes oder aktivierendes Messmedium und Detektieren einer elektrischen Aktion gemäß dem oder im Sinne von Verfahrens- schritt (e), wobei das dritte oder aktivierende Medium dem zweiten oder nicht-aktivierenden Medium entspricht, jedoch zusatzlich ein Substrat und/oder Cosubstrat des Typ-PATl- Proteins enthalt und/oder eine gegenüber dem nicht- aktivierenden Medium variierte Konzentration eines Substrats und/oder Cosubstrats, insbesondere anstelle eines gegebenenfalls im zweiten oder nicht-aktivierenden Medium vorhandenen Nicht-Substrats.

Die erfindungsgemaßen Schritte (f), (g), (h) werden - gegebenen- falls mit Wiederholungen - bevorzugt in der vorgegebenen Reihenfolge durchgeführt.

Im Sinne der Erfindung können in der Abfolge der Schritte (d) ,

(e) und/oder (f), (g), (h) und deren Wiederholungen auch so ge- nannte Substratkonzentrationssprunge und Cosubstratkonzentrati-

onssprünge, insbesondere in der H ⁺ -Konzentration, durchgeführt werden, wobei insbesondere immer bei einer ersten oder Startkon- zcntratiüπ - die auch null sein kann - begonnen und bei einer zweiten oder Endkonzentration - die auch null sein kann - geendet wird .

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet der Ausdruck „enzy- matische Eigenschaft" des Typ-PATl-Proteins gleichzeitig auch immer das Transportverhalten, z.B. in Bezug auf den durch diese Proteine vermittelten Aminosäure-, Aminosäureanaloga-, Protonen- und/oder Ionentransport, und nimmt damit auch immer Bezug auf den eingangs diskutierten Einfluss des Proteins auf die Bioverfügbarkeit potentieller Wirkstoffe. Dies bedeutet, dass, wo immer von der Modifizierung der enzymatischen Eigenschaften des Proteins die Rede ist, auch Untersuchungen erfindungsgemäß mit umfasst sind, die zeigen sollen, ob ein bestimmter Stoff vom Typ-PATl- Protein transportiert wird.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff das Typ- PATl-Protein aktiviert /inhibiert , kann der potentielle Wirkstoff in allen Medien vorhanden sein.

Soll überprüft werden, ob ein potentieller Wirkstoff transportiert wird, sollte der potentielle Wirkstoff im aktivierenden Me- dium vorhanden sein, nicht jedoch im Ruhemedium bzw. im nicht- aktivierenden Medium.

Bevorzugt wird als Wirkortkomplex oder Teil davon ein Monomer o- der ein Oligomer eines PATl-Proteins verwendet.

Ferner ist es vorgesehen, dass ein Wirkortkomplex oder ein Teil davon verwendet wird, welcher auf einem Typ-PATl-Protein basiert, die aus einem Gewebe eines Säugetiers stammt, z.B. aus dem Darm, aus neuronalem Gewebe oder dem ZNS, der Niere, Lunge oder der Le- ber, oder hieraus abgeleitet ist.

Insbesondere stammt das Typ-PATl-Protein aus Säugetierzelllinien, und liegt kloniert vor.

In vorteilhafter Weise ist es vorgesehen, dass der Wirkortkomplex - enthaltend das Typ-PATl-Protein - aus dem Organismus Ratte, Scnwem, Maus, Kaninchen oder Mensch stammt oder aus diesen genetisch abgeleitet wird.

Erfmdungsgemaß werden wassrige Messlosungen und insbesondere wassrige Elektrolyt losungen als Messlosung oder Messmedium verwendet, die als Ruhemedium, nicht aktivierende sowie aktivierende Losungen oder Medien bezeichnet werden.

Alle verwendeten Messlosungen enthalten ein dem Fachmann bekanntes pH-Wert stabilisierendes Mittel bevorzugt ausgewählt aus der Liste: MOPS, HEPES, MES, Tris, PIPES u.a., wie sie z.B. in „Buffers, Calbiochem" veröffentlicht sind, aber auch mit Leichtigkeit weiteren Veröffentlichungen und Lehrbuchern der Biochemie bzw. der organischen Chemie entnommen werden können. Erfmdungsgemaß sollen diese an sich bekannten Mittel im Bereich von pH 6 - 8, bevorzugt etwa im Bereich von pH 6 stabilisierend wirken. Die Wahl des geeigneten pH-Bereichs und Mittels kann dabei vom Sub- strat (Wirkstoffkomplex) abhangen und vom Fachmann durch Routineexperimente leicht ermittelt werden.

Erfindungsgemaß ist es möglich, die Verfahrensschritte (c) und/oder (d) , gegebenenfalls auch (f) bis (h) mittels

Zumischen oder Injizieren des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon,

Austauschen oder Zumischen des Messmediums oder eines Teils davon und/oder

chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren des Messmediums oder eines Teils davon oder des Wirkstoffs, eines Teils und/oder einer Vorstufe davon

durchzufuhren .

Das bedeutet, dass zum einen der Wirkstoffkomplex oder ein Teil davon direkt durch Injizieren oder Beimischen in das Messmedium hinein zum Ort des Wirkortkomplexes transportiert werden kann.

Besonders einfach gestaltet sich jedoch ein derartiger Vorgang, wenn einfach das jeweilige Messmedium ausgetauscht wirri, beispielsweise in kontinuierlicher Art und Weise. Des Weiteren ist es denkbar, dass der Wirkstoff erst durch ein chemisches oder physikalisches Umsetzen oder Reagieren im Messmedium freigesetzt wird. Dies kann zum Beispiel auch durch Zufuhren von Strahlung erfolgen .

Der qualitative Einfluss und/oder der quantitative Emfluss des potenziellen Wirkstoffes oder Wirkstoffkomplexes wird erfindungs- gemaß durch Detektieren einer elektrischen Aktion bestimmt, welche durch den Wirkortkomplex oder einen Teil davon und insbesondere durch das Typ-PATl-Protein vermittelt wird.

Insbesondere wird diese elektrische Aktion mit und ohne potentiellen Wirkstoff bestimmt, und durch Vergleichen beider Messreihen wird untersucht, ob der potentielle Wirkstoff Einfluss nimmt auf die enzymatischen Eigenschaften des Typ-PATl-Proteins .

Wie in der WO02/074983 beschrieben werden die Primartrager mit den Wirkortkomplexen an einem Sekundartrager , nämlich der Biosensorelektrode und insbesondere mit deren Isolationsbereich in Kontakt gebracht und dort insbesondere angelagert.

Bei der Ausgestaltung der Biosensorelektrode als Sekundartrager bestehen vielfaltige Möglichkeiten.

Es wird aber besonders bevorzugt, dass eine Biosensorelektrode als Sekundartrager verwendet wird, bei welcher ein elektrisch leitfahiger und festkorperartiger Elektrodenbereich mit mindestens einer Elektrode vorgesehen wird, welcher gegenüber dem Messmedium und gegenüber den Primärtragern elektrisch und mechanisch isoliert wird durch Vorsehen eines Isolationsbereichs in Form einer festkorperunterstutzten Membran, welche schichtartig aufge- baut wird aus einer Unterschicht einer organischen Thioverbindung als unterster und der Elektrode jeweils zugewandter Schicht und aus einer Oberschicht einer amphiphilen organischen Verbindung.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens ist es vorgesehen, dass eine Biosensorelektrode als

Sekundartrager verwendet wird, bei welcher eine Elektrode aus Gold im Elektrodenbereich vorgesehen wird F ¹ It einer Muπoscnicht eines langkettigen Alkanthiols als Unterschicht darauf und einer Monoschicht eines Lipids als Oberschicht darauf.

Im Hinblick auf die Primartrager, welche den Wirkortkomplex und insbesondere die Typ-PATl-Proteme im Bereich ihrer Membran enthalten sollen, ergeben sich unterschiedliche Möglichkeiten, wobei der jeweiligen Zielsetzung des Verfahrens Rechnung getragen wer- den kann.

Zum Beispiel bietet es sich gemäß einer besonders vorteilhaften Ausgestaltungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens an, dass als Primartrager jeweils eine eukaryontische Zelle, eine prokaryonti- sehe Zelle, insbesondere ein Oozyt, ein Bakterium, ein Virus, eine Organelle oder Bestandteile hiervon, insbesondere Membranfragmente, oder Verbände davon m nativer Form und/oder m abgewandelter Form, insbesondere in gereinigter und/oder modifizierter Form, verwendet wird.

Es ist auch möglich, dass als Primartrager jeweils ein Vesikel, ein Liposom oder eine mizellare Struktur verwendet wird. Die Membranfragmente können sich auch planar anlagern, d.h. als nicht sphärische Struktur.

Besonders vorteilhaft gestaltet sich das erfmdungsgemaße Verfahren dann, wenn die Sensoranordnung aus Biosensorelektrode als Sekundartrager und daran angelagerten Primartragern in einem Messraum, Messbereich oder Messgefaß vom Messmedium umströmt oder an- geströmt wird. Auf diese Art und Weise lasst sich durch Wechsel des Messmediums zum Beispiel ein Konzentrationssprung im Hinblick auf den Wirkstoffkomplex oder eines Teils davon leicht realisieren. Auch lassen sich durch ein derartiges Messen im Rahmen eines Fließsystems vorteilhaft auf leichte Art und Weise und zuverlas- sig mit hoher Zeαtauflosung die erfmdungsgemaßen Versuchsbedingungen einstellen. Auch mithilfe einer automatisierten Pipettlervorrichtung kann das erfmdungsgemaße Verfahren vorteilhaft durchgeführt werden.

Besonders ökonomisch und für eine statistische Auswertung zugänglich gestaltet sich das erfindungsgemaße Verfahren dann, wenn dufeinandertolgend eine Mehrzahl von Tests durchgeführt wird, insbesondere durch aufeinanderfolgendes Austauschen des Messmedi- ums, ggf. mit zwischengeschaltetem Waschen oder Spulen des Messraums .

Wichtig ist bei dem vorliegenden erfmdungsgemaßen Verfahren das Vergleichen der Aktion des Wirkortkomplexes bei vorliegendem Wirkstoffkomplex mit einer Situation, bei welcher der potenzielle Wirkstoffkomplex nicht zugegen ist. Dies kann beispielsweise geschehen durch den Wechsel zwischen nicht-aktivierendem zu aktivierendem Medium m Gegenwart oder Abwesenheit des potentiellen Wirkstoffkomplexes und Vergleich der erhaltenen Messwerte.

Potentielle zu testende Wirkstoffe können insbesondere unter anderem sein monoklonale Antikörper, Antikorperfragmente , polyklo- nale Antikörper und Peptide. Es können jedoch auch andere Substanzen, von denen vermutet wird, dass sie eine entsprechende Wirkung entfalten können, zugesetzt werden. Diese Substanzen werden vorzugsweise in gelöster Form verabreicht.

Substanzen, die als Testsubstanzen in dem erfmdungsgemaßen Testsystem untersucht werden können, können niedermolekulare Verbm- düngen sein. Erfindungsgemali können den niedermolekularen Stoffen kleine Peptide, Aminosäuren und Aminosaureanaloga, Steroide, Nukleoside, Nukleotide.

Insbesondere können als Testsubstanzen Aminosäuren oder Aminosau- reanaloga verwendet werden.

Es kann der Wirkstoffkomplex sowohl im Ruhemedium, im nicht- aktivierenden als auch im aktivierenden Medium zugesetzt oder dort freigesetzt werden.

Auch ist als Zwischenschritt eine Inkubation der Wirkortkomplexe oder der sie tragenden Pπmartrager mit dem Wirkstoffkomplex denkbar .

Des Weiteren ist es denkbar, dass zwischen den Schritten (f) und (g) ein Waschschritt durchgeführt wird durch Einbringen des Se- Kundartragers mit den Primartragern in ein viertes oder Waschme- dium, welches bevorzugt mit dem nicht aktivierenden Medium iden- tisch ist, und/oder in ein oder in das Ruhemedium.

Ferner ist es denkbar, dass direkt vor dem Schritt (h) bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens der Schritt (f) wiederholt durchgeführt wird.

Es ist bevorzugt, wenn der Schritt (f) vor Beginn der eigentlichen Messreihe, d.h. bevor zum erstenmal die Schritte (g) und (h) durchgeführt werden, für mindestens 5 Minuten, bevorzugt für mindestens 10 Minuten, besonders bevorzugt für mindestens 15 Minu- ten, noch mehr bevorzugt für mindestens 20 Minuten und insbesondere bevorzugt für mindestens 30 Minuten durchgeführt wird. Die Schritte (g) und (h) werden erfmdungsgemaß für mindestens 0,2 s, höchstens jedoch 5 s und bevorzugt für etwa 1 bis 2 s durchgeführt. Nach der erstmaligen Durchfuhrung der Schritte (g) und (h) wird Schritt (f) für mindestens 1 s bis höchstens 120 s durchgeführt, bevorzugt für mindestens 30 s bis 90 s.

Die Prozesse des Spulens, Waschens und/oder Ruhens in den jeweiligen Medien können auch für oder mit deutlich kürzeren Zeitspan- nen erfolgen.

Die Medien, also das Ruhemedium, das nicht aktivierende Medium und das aktivierende Medium, weisen Kaliumionen in Konzentrationen im Bereich von etwa 10 mmol/1 bis etwa 300 mmol/1 auf, bevor- zugt im Bereich von etwa 100 mmol/1.

Des Weiteren enthalt das aktivierende Medium ein Substrat des PATl-Protems, bevorzugt Glycin. Weitere mögliche Substrate sind andere Aminosäuren, Aminosaureanaloga oder andere Substanzen, die von PATl transportiert werden oder werden können.

Die Konzentration kann je nach Anwendung schwanken. Bei Kompete- tionsuntersuchungen kann Glycin im Bereich von etwa einem oder einigen hundert μmol/1 bis zu einigen zehn mmol/1 eingesetzt wer- den, z.B. im Bereich von etwa 5 mmol/1 bis etwa 50 mmol/1. Bei

Wirkstofftestungen auf Aktivierung und/oder Inhibierung des TYP- PATl-Proteins kann auch eine Konzentration im Bereich darüber sinnvoll sein, z.B. im Bereich von etwa 1 mmol/1 bis etwa 100 mmol/1.

Bei einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsge- maßen Verfahrens wird alternativ oder zusätzlich als nicht aktivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH und VaIm im Bereich von et- wa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.

Ferner wird alternativ oder zusatzlich bei einer anderen bevorzugten Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens als aktivierendes Medium ein Medium verwendet mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH und Glycin im Bereich von etwa 2 mmol/1 bis etwa 80 mmol/1.

Dabei sind auch immer Verfahrensweisen möglich, bei denen das eigentliche Substrat im Hintergrund, z.B. in konstanter Konzentra- tion, vorliegt und ein die Konzentration eines Cosubstrats und/oder die Protonenkonzentration - durch einen pH-Sprung - ändernder Konzentrationssprung durchgeführt wird.

Gemäß eines weiteren Aspekts schafft die vorliegende Erfindung einen Wirkstoff oder einen Wirkstoffkomplex, welcher eine enzyma- tische Eigenschaft eines Typs einen Typ eines PATl-Protems enthaltenden Wirkortkomplexes oder eines Teils davon modifiziert und welcher gemäß dem erfmdungsgemaßen Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes identifiziert ist, wird oder wurde.

Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Arzneimittels mit den Schritten:

- Identifizieren eines Wirkstoffs und/oder eines Wirkstoffkomple- xes, welcher eine - ggf. bestimmte - enzymatische Eigenschaft eines Wirkstoffkomplexes , welcher einen Typ eines PATl-Protems enthalt, oder eines Teils davon oder eine Mehrzahl von Eigenschaften geeignet modifiziert, und zwar mit Hilfe des erfm- dungsgemaßen Verfahrens,

- Herstellen und/oder Isolieren des Wirkstoffs, des Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder eines Derivats davon,

- ggf. Aufreinigen des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes , Teils und/oder Derivats,

- ggf. Mischen und/oder Portionieren des Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats mit einer pharmazeutisch vertraglichen Tragersubstanz.

Des Weiteren schafft die vorliegende Erfindung einen Testkit zur Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfahrens zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes . Dieser Testkit weist auf:

- mindestens einen Primartrager mit dem Typ-PATl-Protein,

- einen Messbereich,

- gegebenenfalls ein erstes oder Ruhemedium, ein zweites oder nicht-aktivierendes Medium sowie ein drittes oder aktivierendes

Medium.

Erfindungsgemaß wird auch ein Screenmgverfahren zum Identifizieren geschaffen, und zwar zum Identifizieren:

- eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, eines Teils und/oder Derivats davon,

- des Vorhandenseins eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkom- plexes, Teils und/oder Derivats davon,

- des Vorhandenseins eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,

- der Konzentration eines unbekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon,

- der Konzentration eines bekannten Wirkstoffs, Wirkstoffkomplexes, Teils und/oder Derivats davon.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird das erfmdungsgemaße Verfahren zum Identifizieren eines Wirkstoffkomplexes verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren einer enzy- matischen Eigenschaft eines Wirkort komplexes, welcher ein Typ- PATl-Protein enthalt, und von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für PATl darstellen.

Des Weiteren wird das erfmdungsgemaße Testkit erfmdungsgemaß verwendet zum Auffinden von Inhibitoren, Aktivatoren, partiellen oder temporaren Inhibitoren oder Modulatoren eines einen Typ eines PATl-Prote ms enthaltenden Wirkort komplexes und/oder von Wirkstoffkomplexen, die ein Substrat für PATl darstellen.

Des Weiteren wird das Arzneimittel erfmdungsgemaß verwendet zur Inhibition, partiellen oder temporaren Inhibition, Aktivierung oder sonstige Modulation eines Typ-PATl-Protems enthaltenden Wirkstoffkomplexes oder eines Teils davon, oder das Arzneimittel wird von PATl transportiert.

Auf der Grundlage der nachfolgenden Bemerkungen werden die voranstehenden und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung mit anderen Worten weiter erläutert:

Es ist ein z. B. wassriges Messmedium vorgesehen, in welchem die Primartrager und die Sekundartrager angeordnet werden. Der Elektrodenbereich wird gegenüber dem Messmedium, den Primartragern und gegenüber den biologischen Einheiten bevorzugt weitestgehend e- lektrisch isoliert.

Der Elektrodenbereich besitzt z.B. mindestens eine Elektrode. Diese kann zum einen jeweils selbst als mechanisch stabiler Mate- rialbereich ausgebildet sein, insbesondere als Platte, als Draht und/oder dergleichen.

Eine besonders einfache Anordnung der Sensorelektrodeneinrichtung ergibt sich, wenn die Elektrode im Wesentlichen als auf der Oberflache des Tragers abgeschiedene Materialschicht ausgebildet ist. Es kann sich dabei um eine aufgedampfte oder gesputterte Mateπ-

alschicht handeln. Die Materialschicht zur Ausbildung der Elektrode hat vorzugsweise eine Schichtstarke von etwa 10 bis 200 nrn.

Das Typ-PATl-Protem kann jeweils in im Wesentlichen nativer Form und/oder in abgewandelter, insbesondere gereinigter, mikrobiologisch und/oder molekularbiologαsch geänderter Form vorgesehen sein. Zum einen können dadurch bestimmte native Eigenschaften getestet und pharmakologisch untersucht werden. Andererseits bieten sich auch molekularbiologische oder gentechnisch initiierte Ver- anderungen an, die bestimmten Aspekte, zum Beispiel des Transports oder der pharmakologischen Wirkungsweise eines Wirkstoffes zu analysieren.

Besonders vorteilhaft ist es, dass Pnmartrager eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs von Pπmartragern vorgesehen werden. Dies ist im Hinblick auf eine möglichst eindeutige Aussage und Analyse eines Wirkstofftests von Bedeutung und bezieht sich auf die geometrischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften der Pnmartrager.

Das Nämliche gilt auch für die in dem Pnmartrager vorgesehenen Wirkortkomplexe und das Typ-PATl-Protein. Hier sind Wirkortkomplexe und Typ-PATl-Protem eines jeweils im Wesentlichen einheitlichen Typs vorgesehen, insbesondere im Hinblick auf ihre geomet- rischen, physikalischen, chemischen, biologischen und molekularbiologischen Eigenschaften. Zusätzlich sollen die biologischen Einheiten in vorteilhafter Weise im Hinblick auf ihre Orientierung und/oder im Hinblick auf ihre Aktivierbarkeit in Bezug auf den jeweiligen Pnmartrager in etwa einheitlich sein.

Wie bereits ausgeführt, liegt der Erfindung unter anderem die Aufgabe zu Grunde, die Wirkung von Substanzen auf die Funktion von Typ-PATl-Proteinen einer Untersuchung zugänglich zu machen. Substanzen, welche die Wirkung dieses Transportproteins modulie- ren, sind als potentielle Wirkstoffe von gewerblichem Interesse. Auch waren Substrate des Proteins, die von diesem transportiert werden, wichtige neue Moleküle.

Das erfmdungsgemaße Vorgehen bietet folgende Vorteile:

Die Messung der Enzymaktivitat gemäß dem erfindungsgemaß vorgeschlagenen Verfahren bedarf keiner Vermittler oder markierten Substrate. Eine Einzeimessung dauert lediglich wenige Sekunden. Die Messung ist sensitiv gegenüber allen Substraten. Sofern eine Substanz die Reaktion nicht irreversibel inhibiert, können mit einem mit Enzym beladenen Sensor mehrere Messungen durchgeführt werden. Substrate müssen nicht chemisch modifiziert vorliegen, da die Stromantwort oder Potentialantwort des Proteins durch einen schnellen Losungswechsel induziert wird.

Darüber hinaus ist im Gegensatz zu der Patch-Clamp-Technik die Signalqualitat besser, und zwar im Sinne eines besseren Signal- Rauschverhaltnisses .

BEISPIEL 1 Vorbereitung des Sensorchips

Die Goldoberflache eines zu Grunde liegenden Sensorchips wurde durch Einlegen in eine 1 mmol/1 Octadecylmercaptanlösung in Alkohol mercaptanisiert oder hydrophobisiert, also hydrophob gemacht, mit 2-Propanol oder Ethanol (absolut) oder Wasser gespült und getrocknet. Sie wurde dann mit Diphytanoylphosphatidylcholin (in Decan) bedeckt und mit einem Anlagerungspufferpuffer (100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 Mes, pH 6/KOH) ύberschichtet .

BEISPIEL 2 Herstellung proteinhaltiger Membranfraqmente- suspension

Die Membranfragmente wurden nach folgendem Protokoll präpariert: Pro 1 g Zellpellet 1 ml Sucrosepuffer aus 0,25 mol/1 Sucrose, 5 mmol/1 Tris, pH 7,5, ca. 2 mmol/1 DTT, PMSF (50 μl PMSF als gesattigte ethanolische Losung auf 100 ml Puffer), Complete (Fa. Roche, eine Tablette pro 50 ml Puffer) . Zellen aufbrechen bis homogene Masse entstanden ist, 10 min/680 g/4°C; 10 min/6100 g/4°C; überstand 1 h/100.000 g/4°C zentrifugieren; Pellet in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 aufnehmen, so dass sehr trübe Mischung entsteht; mit Zugabe von 70% Sucrose (in 5 mmol/1 Tris) auf 51,3 % Sucrose einstellen, Zentrifugenröhrchen mit 44,4 %, 30,7 % und 8,6 % Sucrose in 5 mmol/1 Tris pH 7,5 uberschichten ; 1 h 40 min/100.000g/4 ⁰ C im Ausschwenkrotor zentrifugieren; Banden mit Pasteurpipette abneh- men und pelletieren in Anlagerungspuffer (siehe oben); 30

min/150.000g/4 ⁰ C; Pellets in Anlagerungspuffer aufnehmen. Alternativ zum Sucrosegradienten wurde auch ein Percollgradient eingehetzt. Denkbar ist auch eine Zweiphasentrennung

BEISPIEL 3 Herstellung der PATl-Sensorchips

10 μl bis 50 μl der Membranfragmentesuspension mit einer Proteinkonzentration von ca. 0,1-1,0 mg/ml wurden auf einen vorbehandelten Sensorchip mit einer runden Goldelektrode (IonGate Bioscien- ces GmbH, Frankfurt am Main) mit z.B. etwa 3 mm Durchmesser aufgetragen und bei 2 Stunden oder über Nacht im Kühlschrank bei weniger als etwa 8°C inkubiert.

BEISPIEL 4 Aktivitatsmessung an PATl-exprimierenden Membran- fragmenten

Die Durchflusszelle mit integriertem protembeladenem Sensorchip wurde mit nicht aktivierender Losung mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 40 mmol/1 bis 80 mmol/1 VaIm ge- spult. Mittels elektromechanischem 3/2-Wegeventil wurde anschließend auf aktivierende Losung mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 2,5 mmol/1 bis 80 mmol/1 Glycin umgestellt.

Im Transportzyklus von PATl werden durch Cotransport von Protonen und Glycin netto positive elektrische Ladungen über die Membran und auf die Elektrode des Biosensors zu verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt: Fig. 1.

BEISPIEL 5 Aktivitatsmes sung mit Leucin statt Glycin

Die Messungen wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurden in nicht aktivierender und aktivierender Losung 50 mmol/1 Valin bzw. 50 mmol/1 Leucin (statt Glycin) verwendet. Da Leucin von PATl nicht transportiert wird, findet auch kein Cotransport von Proto- nen statt und es kann kein Ladestrom gemessen werden: Fig. 2.

BEISPIEL 6 Aktivitatsmessung an Kontrollmembranen

Die Kontrollmessungen wurden wie bei den PATl-exprimierenden

Membranen durchgeführt, aber an Membranen, die in Bezug auf die

PATl-Bedingungen keine für den Test relevante Menge und/oder Aktivität an PATl enthielten bzw. zeigten. Z R kar.v. em deraxiiges Kontrollexperiment an Membranen oder Membranfragmenten durchgeführt werden, die ein anderes Protein als PATl uberexprimieren, z.B. NCX. Durch spezifische Aktivität smessung in Bezug auf dieses anderen Protein kann zunächst die Anlagerung der Membranen oder Membranfragmente nachgewiesen werden. Dann können die für PATl spezifischen Tests zur Kontrolle durchgeführt werden.

Dabei ergaben sich keine Signale beim Wechsel von nicht aktivierendem Medium mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 80 mmol/1 VaIm auf aktivierendes Medium mit 100 mmol/1 KCl, 2 mmol/1 MgCl ₂ , 30 mmol/1 MES pH 6/KOH, 80 mmol/1 Glycin anstelle von Valin.

Fig. 1 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen

Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht .

Fig. 2 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen

Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht, und zwar bei einem Kontrollexperiment, bei welchem zwischenzeitlich Glycin durch Leucin ersetzt wird .

Fig. 3 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer anderen Ausfuhrungsform des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode normierten gemessenen maximalen elektrischen Strom I(t) als Funktion des eingestellten pH-Werts.

Fig. 1 zeigt in Form eines Graphen den gemäß einer Ausfuhrungs- form des erfindungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektro-

de gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Proteir hcrvo.gerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht.

Dabei bezeichnet die Abszisse die Zeit t, wobei t = 0 denjenigen Zeitpunkt t angibt, bei welchem das Medium effektiv, also für PATl wirksam von einem nicht aktivierendem zu einem aktivierendem gewechselt wird. D.h., ab t=0 ist das Substrat, hier Glycin, welches vor t=0 fehlte, effektiv, also für PATl wirksam im Messmedi- um vorhanden. Dadurch wird der elektrische Strom I(t), dargestellt durch die Ordinate als Strom transportierter Ionen als Funktion der Zeit t manifest, welcher auf der Ordinate aufgezeichnet ist. Die Ordinate bezeichnet also den gemessenen elektrischen Strom I(t), als Funktion der Zeit t, welcher über die Biosensorelektrode gemessen wird.

Dargestellt sind in Fig. 1 vier Messspuren A, B, C und D, die mit unterschiedlichen Messbedingungen m Bezug auf die Substratkonzentration an Glycin korrespondieren.

Spur A der Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher die PATl- Protememheiten durch Glycmzugabe von 80 mmol/1 zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert wird, und zwar in Anwesenheit von 100 mmol/1 K bei pH = 6. Unter Glycmtransport werden mittels des PATl- Proteins Protonen über die Primartrager, z.B. über Membranfragmente oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt. Im Transportzyklus von PATl wird dabei netto positive e- lektrische Ladung über die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt. Dies ist am gemessenen positiven elekt- rischen Strom I(t) erkennbar.

Spur B in Fig. 1 zeigt eine Messung, bei welcher - unter sonst gleichen Bedingungen wie bei der Spur A - die Konzentration des bei tθ = 0 zugegebenen Glycins statt 80 mmol/1 nur 20 mmol/1 be- trug. Deutlich erkennbar ist die Absenkung des Maximums des gemessenen elektrischen Stroms I(t).

In den Spuren C und D der Fig. 1 ist die zugegebene Glycinkon- zentration auf 10 mmol/1 bzw. auf 2,5 mmol/1 eingestellt.

Fig. 1 zeigt somit die Relevanz der Anwesenheit von Glycin für die Transportaktivitat der PATl-Einheiten

Fig. 2 zeigt ebenfalls in Form eines Graphen den gemäß einer an- deren Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Verfahrens mit einer Biosensorelektrode gemessenen elektrischen Strom I(t) als Funktion der Zeit t, der teilweise auf einem durch das PATl-Protem hervorgerufenen Transportstrom als messbare elektrische Aktion beruht, und zwar bei einem Kontrollexpenment, bei welchem zwi- schenzeitlich Glycin durch Leucin ersetzt wird.

Spur A der Fig. 2 entspricht hinsichtlich der Messbedingungen etwa der Spur A aus Fig. 1 und zeigt also eine Messung, bei welcher die PATl-Proteineinheiten durch Glycmzugabe von 40 mmol/1 zum Zeitpunkt t = 0 normal aktiviert werden, und zwar in Anwesenheit von 100 mmol/1 K bei pH = 6. Unter Glycmtransport werden mittels des PATl-Proteins wieder Protonen über die Primartrager , z.B. u- ber Membranfragmente oder Vesikel, auf die Biosensormembran und die Elektrode zu bewegt. Im Transport zyklus von PATl wird dabei wieder netto positive elektrische Ladung über die Membran verschoben, was zu einem positiven Stromsignal fuhrt. Dies ist am gemessenen positiven elektrischen Strom I(t) erkennbar.

Spur B der Fig. 2 zeigt eine Messung, bei welcher statt 40 mmol/1 Glycin in der nicht aktivierenden Messlosung nun 50 mmol/1 VaIm und 50 mmol/1 Leucm in der aktivierenden Messlosung vorliegen. Trotz des Vorhandenseins von Protonen bei pH = 6 bei tθ = 0 ist kein über das Rauschen hinausgehendes Signal messbar. Dadurch ist gezeigt, dass der gemessene elektrische Strom I(t) aus der Spur A den Transportstrom repräsentiert. Aus Messungen mit anderen Methoden ist bekannt, dass PATl Leucin nicht transportiert.

Fig. 3 zeigt die pH-Abhängigkeit des normierten maximalen Stroms als elektrische Aktion von PATl, und zwar normiert auf das Maxi- mum, das bei pH = 6 vorliegt, wobei die weiteren Bedingungen 100 mmol/1 K ⁺ und 80 mmol/1 Valin-Glycin waren.

Grundsätzliche Vorteile der vorliegenden Erfindung sind die hohe mechanische Stabilität der vorgesehenen Sensoranordnung und damit einhergehend die große Einsatzbereitschaft, die einfache Handhab-

barkeit und geringer Störanfälligkeit. In der Verwendung der Sensoranordnung ergeben sich im Rahmen von pharmakologischen Wirkstofftests eine lange Lebensdauer, eine hohe Zuverlässigkeit, eine geringe Störanfälligkeit sowie insbesondere ein gegenüber her- kommlichen Verfahren maßgeblich gesteigerter Testdurchsatz, wodurch entsprechende Testverfahren kostengünstig ausgearbeitet und durchgeführt werden können.

Darüber hinaus ist im Gegensatz zu anderen Techniken die Signal- qualitat besser, und zwar im Sinne eines besseren Signal- Rauschverhaltnisses .