ZHANG BO (CN)
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| CN102978295A | 2013-03-20 | |||
| CN101001960A | 2007-07-18 | |||
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| 权利要求 书 1. 一种病原微生物核酸无扩增检测和分型方法，其特征在于包括如下 步屎： ( 1 )根据待測样品的核酸序列合成 DNA和 /或 PNA探针 1， 2， 3, 所述 的探针 1， 2 , 3能够分别与待测样品杂交并且互不重叠； ( 2 )分别将探针 1， 2， 3与磁性纳米顆粒和两种荧光量子点耦联，所 述的荧光量子点的荧光可以相同， 也可以不相同。 ( 3 )合成生物素连接的桥连 DNA合 /或 PNA序列 1， 2以及互补的序列 ， V ，将序列 1' 和 2' 与步稞（2 )中的两种荧光量子点分别耦联； ( 4 )合成两种生物素修饰的荧光 色不同的两种荧光量子点， 这两种 荧光量子点可以与步稞（2 ) 中的荧光量子点相同， 也可以不同； ( 5 )选择步槺 ( 2 ) 中的探针修饰的磁性纳米颗粒和其中一种探针修 饰的荧光量子点， 将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁 性分离； 然后通过重复加入 Sa (链審亲和素） -洗; ^加入步稞（ 4 )中的其 中一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步稞进行层层组装，然后通过磁性 分离得到待测样品的富集物，任选地，对富集物的样品进行荧光强度测定； ( 6 )选择另外一种探针修饰的荧光量子点， 将其与步骤（5 )获得的 富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁性分离； 然后通过重复加入 Sa-洗^"加入步樣（4 ) 中的另外一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步 骤进行层层组装， 然后通过磁性分离得到待测样品的第二富集物，任选地， 对第二富集物的样品运用荧光光谱成像技术或者流式细胞仪技术进行检 测。 2.一种病原微生物核酸无扩增检测和分型的试剂盒，其特征在于包括: 三种 DNA和 /或 PNA探针镇联的磁性纳米潁粒和两种荧光量子点，所述的三 种探针能够分別与待测样品杂交并且互不重叠， 荧光量子点的荧光可以相 同， 也可以不相同； 生物素修饰的桥连 DNA和 /或 PNA, 桥连 DM和 /或 PNA 的互补序列耜联的两种荧光量子点； 生物素修饰的荧光瀕色不同的两种荧 光 f子点， 这两种荧光量子点可以与上述荧光 1：子点的荧光相同， 也可以 不同； SA以及緩冲溶液。 3. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征在于待测样品为 HBV核酸。 4. 根据权利要求 1所述的方法或权利要求 2所述的试剂盒， 所述的探 针为 PM, 所述的荧光量子点中的一个或多个或全部为 CdSe/ZnS量子点， 优选的，两种不同的荧光量子点的发射波长相差至少 30nm，优选至少 50mn, 进一步优选至少 80nm, 5. 根据权利要求 1所述的方法或权利要求 2所述的试剂盒， 所述的磁 性纳米 «粒是 S i02S)Fe304纳米顆粒。 6. 根据权利要求 1所述的方法或权利要求 2所述的试剂盒， 所述的三 种探针为 PNA,其中两个种属特异性探针序列为 PM种属特异性探针 1和 / 或 PNA种属特异性探针 2的序列： 7 . 根据权利要求 6所迷的方法或试剂盒， 期特征在于另一个用于分型的序列 选自以下三条探针之一: 8.根据权利要求 7所述的方法或试剂盒，所述的桥连 DNA的序列为 5' - biot in (生物素） - GGGCAGCTGGGGCGGGCGGG- ΝΗ2-3' 9， 根据权利要求 1， 3 - 8任意一项所述的方法， 所述的方法是非诊断 目的的。 |
本发明属于医药生物领域， 尤其涉及一种病原微生物核酸无扩增直接 检测与分型方法及试剂盒。 背景技术
感染性疾病是严重危害人类健康的最重要疾病 之一。 据国家疾控中心
( CDC )统计： 2011年我国法定传染病发病 632万例， 死亡 1. 5万人。 其中 病毒性肝炎、 肺结核和梅毒的发病率位居前三位， 占乙类传染病发病总数 的 85. 41%。 且乙型肝炎、 丙型肝炎等血源性传染病的发病率呈逐年上升 趋 势。 上述数据表明， 乙型病毒性肝炎仍占据我国感染性疾病发病率 首位， 其发病人数亦占我国肝炎发病总人数的 70%以上。 大量临床资料和研究表 明，乙型病毒性肝炎患者的血清学转归和预后 与所感染乙型肝炎病毒（ HBV ) 的基因型及拷贝数密切相关。 因此， 建立快速、 准确的 HBV检测与分型方 法对于乙型病毒性肝炎的早期诊断、 疗效监测、 预后判断和个体化治疗具 有重要临床意义。
对于 HBV感染的检测， 目前的实验室方法主要分为直接检测和间接检 测两大类。 其中间接检测以生物化学方法和免疫学为主。 生物化学方法通 过检测多项转氨酶（ALT, AST, γ -GGT等）的升高来间接判断病毒感染， 其灵敏度较高， 但易受其它原因导致的肝损伤影响， 故特异性差。 免疫法 包括早期的 ELISA和逐渐发展形成的免疫散射比浊、 化学发光和时间分辨 荧光检测等技术。 其原理是通过同时检测多项 HBV特征性抗原 （HBsAg、 HBcAg、 HBeAg )和患者机体产生的相应抗体（HBsAb、 HBcAb )来进行综合 判定。 该方法简便易行， 在临床上广为应用。 但是免疫学方法无法检出处 于 "窗口期 "的 HBV感染， 易导致假阴性。 最重要的是， 所有间接检测方 法都无法对 HBV进行基因型分型， 因而无法指导个体化临床用药。
直接检测法則检测患者样本中的 HBV的数量和基因亚型， 具有早期、 实时、 动态监测 HBV拷贝数变化的特点， 在早期诊断、 疗效判断、 个体治 疗等方面具有无可比拟的优势。 因病毒在体外极难培养， 因此目前病毒直 接检测技术均通过检测 HBV核酸实现。 然而， 由于早期 HBV感染患者体内 的 HBV拷贝数较低（通常 10 4 - 107ml )， 不足以被核酸杂交等常规分子生物 学方法直接检出. 因此进行耙分子信号放大是实现 HBV DNA高分辨检测与 分型的前提。 目前的信号放大策略主要包括两类： DNA模板扩增技术 (前放 大）和检测信号放大技术（后放大）。其中 DNA模板扩增技术以 PCR为基础， 通过体外扩增核酸分子模板至 10'倍， 以实现信号放大。 PCR技术相继衍生 出一系列变温核酸扩增、检测技术， 如巣式 PCR， 荧光定量 PCR和多重 PCR 等。这些基于 PCR的扩增技术用于 HBV检测与分型尚存在以下不足： (1) 对 扩增^ f 要求极为严格， 极易产生假阳性或者假阴性。 （2) 多基因型同步 扩增时常导致高浓度模板对低浓度模板的竟争 抑制， 导致低浓度样本的假 阴性结果。 (3) PCR相关技术核心知识产权的壁垒导致了其相关 试剂和设备 价格昂责， 增加了医疗成本和患者负担。 近年来， 相继发展出一系列等温 扩增技术，如链置换扩增（SDA ), 环介导等温扩增（LAMP ), 滚环扩增（RCA ) 等技术，部分降低了医疗成本和解决了上述低 浓度模板扩增受抑制等不足。 然而这些技术仍然无法解决同步进行 HBV高分辨检测和基因分型的难题。
相对于 DNA模板扩增技术而言， 检测信号放大（后放大）技术仅对已 检测到的低信号进行放大，可消除因不同浓度 模板扩增导致的扩增性抑制。 由于检测信号放大技术是与检测原理紧密联系 的， 因此每个检测技术平台 都有自己最适合的信号放大技术。 如： 基于石英晶体微天平（QCM )传感器 的质量放大， 基于表面等离子体（SPR )传感器的折射光角度放大， 基于电 化学传感器的醉学放大， 基于荧光检测的纳米传感器的荧光增强等。 在这 些检测平台中， 均需使用生物传感技术将低于检测限的微弱信 号转化为可 以识别的物理或者化学信号。 以前使用最多的是酶化学传感器， 其原理是 通过醉的催化或者与底物的结合进行信号放大 ， 近年来， 纳米材料合成、 表面修饰技术的飞速发展为信号放大技术的研 发提供了广阔空间。 发明人 前期在纳米材料信号放大方面进行了大量研究 ，成功将纳米金颗粒用于 QCM 传感器的信号放大， 实现了血液中低浓度金黄色葡萄球菌的检测； 同时也 实现了 HCR反应的无蘇荧光信号放大。 然而， 试验中我们发现， 传统荧光 染料极易被漂白， 用于临床样^测难度较大。
然而， HBV的 A-H亚型间的序列同源性非常高，利用核酸杂交 技术对其 进行分型需要制备特异性极高的探针。 因此目前存在的 HBV分型技术則采 用 PCR首先将各亚型归类， 然后用多组 DNA探针分别检测不同组别的基因 型以提高检测特异性。 相比 DMA分子而言， 肽核酸（PM )分子因其独特的 碳链骨架结构， 其与 DNA单链结合的亲和常数较普通 DNA- DNA的结合常数 高 10 3 倍， 因此短链 PNA探针 ( 14-20bp )对于单戚基突变具有极强的识别 能力， PNA探针的这种高特异识别能力为 HBV病毒的基因分型提供了新的突 破口。 发明内容
本发明所要解决的技术问題在于提供一种病原 微生物核酸无扩增检测 和分型方法。 为了实现本发明的目的， 拟采用如下技术方案：
本发明涉及一种病原微生物核酸无扩增检测和 分型方法， 其特征在于 包括如下步驟：
( 1 )根据待测样品的核酸序列合成 DNA和 /或 PNA探针 1， 2， 3 , 所述 的探针 1， 2， 3能够分别与待测样品杂交并且互不重叠； ( 2 )分别将探针 1， 2， 3与磁性纳米领粒和两种荧光量子点輛联，所 述的荧光！:子点的荧光可以相同， 也可以不相同。
( 3 )合成生物素连接的桥连 DNA合 /或 PM序列 1， 2以及互补的序列 , V ，将序列 1' 和 2， 与步琛（2 )中的两种荧光量子点分别耗联；
( 4 )合成两种生物素修饰的荧光顧色不同的两种 光量子点， 这两种 荧光量子点可以与步綵（2 ) 中的荧光量子点相同， 也可以不同；
( 5 )选择步稞 ( 2 ) 中的探针修饰的磁性纳米顆粒和其中一种探针 修 饰的荧光量子点， 将其与待测样品以及相应的桥连序列进行杂交 并进行磁 性分离； 然后通过重复加入 Sa (中文全称 ) -洗涤-加入步 ( 4 )中的其中 一种生物素修饰的荧光量子点-洗涤的步猓进 层层組装，然后通过磁性分 离得到待測样品的富集物， 任选地， 对富集物的样品进行荧光强度测定；
( 6 )选择另外一种探针修饰的荧光量子点， 将其与步稞（5 )获得的 富集物以及相应的桥连序列进行杂交并进行磁 性分离； 然后通过重复加入 Sa (中文全称 ) -洗^ "加入步槺 ( 4 )中的另外一种生物素修饰的荧光量子 点-洗涤的步稞进行层层组装，然后通过磁性 离得到待测样品的第二富集 物， 任选地， 对第二富集物的样品运用荧光光讲成像技术或 者流式细胞仪 技术进行检测。
本发明另一方面还涉及种病原微生物核酸无扩 增检测和分型的试剂 盒， 其特征在于包括： 三种 DNA和 /或 PNA探针耗联的磁性纳米颗粒和两种 荧光量子点， 所述的三种探针能够分别与待测样品杂交并且 互不重叠， 荧 光量子点的荧光可以相同， 也可以不相同； 生物素修饰的桥连 DM和 /或 PNA, 桥连 DNA和 /或 PNA的互补序列輛联的两种荧光童子点； 生物素修饰 的荧光瀕色不同的两种荧光童子点， 这两种荧光量子点可以与上述荧光量 子点的荧光相同， 也可以不同； SA以及緩冲溶液。
在本发明的一个优选实施方式中， 其特征在于待测样品为 HBV核酸。 在本发明的一个优选实施方式中，所述的探针 为 PNA,所述的荧光量子 点中的一个或多个或全部为 CdSe/ZnS量子点。
在本发明的一个优选实施方式中， 所述的磁性纳米顆粒是 SiO FeA 纳米 «粒。
在本发明的一个优选实施方式中，所述的三种 探针为 PNA,其中两个种 属特异性探针序列为下表探针 1或者探针 2的序列， 所述的生物素修饰的 桥连 DNA序列如下表所示。
另 一个用 分型的 序列选自以下三条探针之一:
在本发明的一个优选实施方式中， 所述的方法是非诊断目的的。
本发明的方法对于低浓度核酸无需扩增， 可以直接检测； 多探针保证 了信号放大过程中容易出现的假阳性问題， 提高了检测准确性， 该技术可 以实现病原微生物拷贝数的实时检测与同步基 因分型，速度快， 成本低廉。 附图说明 图 1： 检测原理示意图；
图 2： 合成的 CdSe/ZnS量子点 SEM图片；
图 3： 合成的超顺磁四氣化三铁 SEM图片；
图 4： 量子点的 DLS图；
图 5： 磁性微球的 DLS图；
图 6： 含有生物素配体的聚合物合成示意图；
图 7： 1：子点合成、 修饰示意图；
图 8： 不同摩尔比例 DNA探针与量子点偶联电泳图；
图 9： 不同摩尔比例 DM探针与量子点偶联后荧光光讲图片；
图 10 ： 不同 QD自组装层数与荧光信号放大的关系；
图 11： ： 不同浓度 HBV病毒检测荧光光谱结果；
困 12： ： 不同浓度 HBV检测的标准曲线；
图 13: ； 不同错 序列杂交的检测结果比较（特异性)；
图 14： ：同步检测与分型的检测结果 (检测为 540nmQD，分型为 620mnQD )。
具体实施方式
(1) . HBV答定探针的制备
HBV探针主要采用 ol igo6. 0软件结合 primer Premier6. 0软件进行 DM 探针的设计， 对于 PNA探针的设计則通过上述软件查找到多对候补 序列区 域后（将候补区域扩大至 1倍以上）， 然后再用 ol igonucleotide软件验证 出多条候补序列 （1: 10比例）， 然后将候补序列提交至 PNA合成公司 ( Bio-Synthes is )进行序列验证，最后合成的 PNA探针序列长度在 14-20bp 之间。 PNA探针的验证和合成均由 Bio-Synthes is公司完成。 桥连 DNA探 针的设计原則为在保证短序列的前提下实现高 Tm值， 且不能有回环结构。 探针名称 探针序列
PNA种属特异性探针 1 5， -NH - ((¾) -AGGCACAGCTTGGAGGC- 3，
PNA种属特异性探针 2 5 ' -NH - (CH 2 ) -GTGATGTGCTGGGTGTGTCG— 3， 桥连 DM序列 5' - biot in - GGGCAGCTGGGGCGGGCGGG- NH -3'
(2) . 多色量子点纳米微球的合成与表征
CdSe/ZnS i:子点的合成： 无氧条件下， 将 156mgNaBH 4 溶于 2mL超纯水 中。 超声混匀后加入 157. 8mgSe粉并于冰浴中反应生成无色 NaHSe溶液。 反应方程为 · 4NaBH 4 + 2Se + 7H 2 0 = 2NaHSe + Ha 2 B 4 0 7 丄 +14H 2 T 精确称取 CdCl 2 · 25Η 2 0228. 5mg溶于 100ml双蒸水并将溶液倒入三颈烧 瓶。 通氮气 30min后向烧瓶中滴加 262μ1 3-疏基丙酸， 然后用 NaOH调节 pH值至 11. 0。 烧瓶中持续通入氮气 30— 40min以除去其中 0 2 ， 同时向烧杯 中緩慢加入制备的 NaHSe溶液 lml， 用磁力搅拌器剧烈搅拌后密封反应容 器， 于 95。 C水浴中回流 lh即得 CdSe量子点溶液。将上述所合成 CdSe溶 液降至室温， 向其中通入氮气 30min并伴随剧烈磁力搅拌， 緩慢滴加 88mgZn (Ac) 2 · 2H 2 0和 96mgNa 2 S · 9H 2 0配成的溶液 10mL， 于 95。 C水浴 2h， 得 CdSe/ZnS量子点溶液。按照上述方法，通过控制 流时间分别制得多种 不同波长量子点（现初步拟定为 525nm、 550nm、 565nm、 605nm、 620nm )„ 量子点的表征： 运用荧光光度计和双光束紫外可见分光光度计 分别检 测不同发光波长的 CdSe/ZnS量子点的荧光发射光谱和可见吸收光谙 利用 激光光散射仪对纳米粒子分敉液的纳米粒径、 粒径分布及表面 Zeta 电荷值 进行测定。 将制备的纳米分散液滴在镀有破膜的铜网上， 室温干燥后用透 射电铣观察 QDs纳米粒子的径粒分布。运用电子衍射图判断 CdSe/ZnS量子 点的衍射环的情况。根据上迷结果分别优化量 子点合成的反应条件 ( PH值、 摩尔比、 回流时间等）。
量子点的表面修饰与表征： 量子点的表面生物素修饰主要根据 HediMattouss i等报道的方法进行， 其原理主要是首先合成一种表面修饰 有生物素的聚合物， 该聚合物包裹的量子点应该具有高度液相分散 性的体 积小、 可控偶联位点的优点。 具体的方法为首先合成（1 ) Diazide功能化 的四甘醇，合成好的产品（ 1 )经过柱进行纯化，然后加入 250ml0. 7M磷酸， 110隨 ol三苯基膊 ( PPh 3 )反应 16h， 经清洗、 过滤、 萃取并干燥后得到单 胺修饰的四甘醇，然后加入 55. 8mmol疏辛酸、10. 3mmol 4 -二甲氛基 CH 2 C1 2 后降温至零度， 然后緩慢加入 53. 8mol DCC反应 16h后过滤、 过柱纯化得 到 TA-TEG- N3复合物， 然后加入 150ffll THF, 81mmol PPh 3 反应 20小时，分 离纯化后得到 · Ι基末端标记的 TA-TEG, 然后加入羟基化的生物素， 在 DMF 中反应 16小时， 分离纯化后得到 TA- TEG-biot in。 再加入 18. 5闘1 NaBH 4 并在 75%的 乙醇中反应 4h， 经氯仿萃取并过柱纯化后得到 DHLA-TEG-biot in. 然后加入 T0P/T0P0表面覆盖的 CdSe/ZnS溶液，加热至 60-80° C反应 6 12小时。 经正己烷、 乙醇、 氯仿混合物（比例 11: 10: 1 ) 沉淀后再次分散在水中. 最后得到生物素修饰的 CdSe/ZnS量子点溶液
( CdSe/ZnS - biot in )。
表面修饰后的量子点采用 TEM、 SEM电镜观察形成的微球的直径
( 10-20nm ), 运用 DLS观察其在双蒸水和 PBS buffer中的水合直径。 运用 XRD判断其晶体结构。运用可见分光度计检测修 饰前后量子点的吸收光详和 荧光发射光讲的变化。 荧光光度计检测不同发光波长的量子点的荧光 发射 光谱， 以及它们共同装入微球后的荧光光谱， 比较其光谱变化（如半峰宽、 红移、蓝移以及荧光强度的变化）。通过量子 点装入前后的半峰宽恒定来证 明 QDs之间没有聚集。 通过微球荧光光谱研究可以进一步确认多色 QDs之 间有无发生能 1：共振转移（FRET ), 如果有发生， 可以通过增大合成量子点 的直径来解决。 因为 FRET要求受体与供体间距离 <10nm, 故增加量子点的 直径可有效防止不同量子点间 FRET的发生。
(3) . 童子点与双探针的生物偶联 为实现 CdSe/ZnS量子点与桥连 DM和 PNA的生物偶联， 需对油溶性 CdSe/ZnS童子点进行水溶性转换。 其方法为取 2ml油溶性童子点， 加入二 St基丙酸， 在甲苯中搅拌反应 12小时， 并经 20000rpm离心 30min后弃上 清， 沉淀用甲苯清洗 3次后离心、 然后采用 3. 5kD滤膜进行透析 12小时， 烘干后得到羧基化 CdSe/ZnS ( CdSe/ZnS-COOH )并溶于 IX PBS (ρΗ7· 4)中 保存待用。 其荧光性能用可见光分光光度计进行检测。 然后取 2mmol CdSe/ZnS-COOH加入 100讓 ol 5， 端氛基修饰的桥连 DM探针和等摩尔的 5， 端>^基修饰的 PNA种属特异性探针 ( P2 ), 在 EDC和 NHS的存在下进行 缩合反应。 反应结束后， 然后 20000rpm离心 30min后弃上清， 沉淀用甲苯 清洗 3次后得到桥连 DNA标记的 CdSe/ZnS量子点。再次采用可见光分光光 度计检测 DNA偶联前后的荧光性能的变化， 并且用琼脂糖凝胶电泳检测是 否偶联成功。
(4) . 量子点标记探针前后荧光光谘变化研究：
分别于量子点标记探针前后运用荧光光度计和 双光束紫外可见分光光 度计检测 CdSe/ZnS量子点的荧光发射光谱和可见吸收光诿 观察量子点标 记探针后发生的蓝移或者红移程度。进一步通 过改变 CdSe/ZnS量子点的荧 光波长获得不同顏色量子点， 并与不同长度的 DNA探针偶联， 分别检测其 荧光发射光谦和可见吸收光讲。 建立量子点标记探针前后荧光光语与量子 点波长、 探针长度的关系。
(5) . 超顺磁纳米微球的合成表征并与探针的生物偶 联
超顺磁 Fe 3 0 4 采用化学共沉淀方法合成。 主要方法为： 混合 0. 005 mol FeCl 3 和 0. 0025 mol FeS0 4 于 50ml双蒸水中， 保持 Fe 3 7Fe 2+ = 2。 然后快 速加入 1. 5M NaOH溶液， 撹拌 lOmin后分离并清洗沉淀 4次。 然后用无氧 无水乙醇清洗后 50° C干燥即得到 Fe 3 0 4 晶体。 然后通过水解 TE0S在 Fe 3 0 4 表面从而形成二氧化硅包裹的 Fe 3 0 4 。其主要步綵为：将 Fe 3 0 4 溶于 240ml酒 精中， 调节 pH=9， 加入 4ml TE0S并反应 10h, 然后加热至 50。 C再次反应 12h。 然后用无氣无水乙醇清洗后 50。 C干燥过夜。 然后将表面二氣化硅包 裹的 Fe 3 0 4 超声^ t于 120mlDMF和 80ml甲苯中， 随后加入 10ml APTES反 应 24小时， 离心收集沉淀并清洗 3次得到表面氛基修饰的 Si0 2 S) Fe 3 0 4 纳米 穎粒。 重新将氛基修饰的 Si0 2 S) Fe 3 0 4 溶于 200ml甲苯中， 加热至 110。 C 再加入 4 . 85g戊二酸 fi反应 2h， 离心收集沉淀并清洗 3次得到表面羧基修 饰的 Si0 2 S) Fe 3 0 4 纳米顆粒 ( Si0 2 S Fe 3 0 -C00H ) β
超顺磁纳米微球的探针标记采用氛基与羧基间 的缩合反应进行。 其方 法主要为将 lOOmmol Si0 2 ® Fe 3 0 4 -C00H溶于 MES (pH=5. 4)緩冲液中， 然后 加入 500mmol的 5， 端氛基标记的种属特异性探 P2 ),再加入 EDC和 NHS, 在体系中反应 lh, 即可形成 Si0 2 Bl Fe 3 0 4 - PNA复合物。通±#性富集、分离， 并采用 PBS清洗 4次， 将最后的沉淀溶于 1 X PBS緩冲液中保存备用。
(6) . 量子点标记探针的性能研究
量子点探针生物活性研究： 生物活性是判断探针质量的重要指标。 本 课題中拟合成多个不同长度寒核苷酸探针（10b p、 20bp、 30bp、 40bp、 50bp、 60bp )分别标记不同颜色的量子点（在此拟用 DNA替代 PNA进行条件优化 以降低实验成本， 因为不同序列长度 DNA-DNA杂交或者 PNA-DM杂交对荧 光强度的影响成正相关），然后与减基完全匹 配的核酸序列在 DM杂交仪中 进行杂交， 通过杂交前后荧光强度变化情况判断杂交效率 并以此优化探针 设计 β
量子点探针保存时间研究： 同上设计 ΡΝΑ探针以及完全匹配的核酸序 列（DNA) ,将探针上标记多色量子点微球后，避光保存 - 20 ，分别于 ld、 5d、 10d、 20d、 30d、 60d、 9 Od后取出并分别用荧光分光光度计进行荧光 强度测试和探针杂交实验^探针的降解情况， 从而优化探针保存时间。
(7) . 核酸样本的制备
方法学评价所需短链 DNA寡核苷酸样本（ <80bp )为上海英俊公司或者 上海生工合成。 长链靱分子序列采用确诊 HBV患者且为血清学检查 HBsAg、 HBcAb、 HBeAb三者均为阳性者血清中提取 HBV DNA。 该 DNA采用碱裂解法 进行提取， 然后将提取产物作为模板， 运用设计的引物对（该引物对设计 时考虑到需能够使扩增产物同时包含所需的 P1和 P2探针的互补序列）进 行 PCR扩增 β PCR产物经胶回收后重新进行 PCR扩增以提高纯度，同时将扩 增产物提交上海英俊公司进行测序。 待测序产物为包含所需 P1和 Ρ2探针 的互补序列后， 即可作为待检测的 分子进行方法学评价试驗。
临床样本驗证則需要选取正常体检者血清 50例，明确诊断 HBV患者 100 例（其中尽量收集每个亚型的病例， 因为我国 HBV以 B/C/D基因型居多， 因此发明以此三型为代表）.全血样本经静脉 集后，经 4000rpm离心 20min 并收集上清液。 所收集血清采用械裂解法进行核酸提取并保存 于不含 RNA 醉的 EP管中， 低温 于 -80° C待用。
(8) . 量子点信号放大系统研究
为证明其放大系统的有效性， 我们设计了一段耙序列 [P1- (T) 6 -P2〗，该 靶序列两端分别可以与种属特异性探针 Pl、 Ρ2完全互补， 我们在此两段序 列用一段 (T) 6 1 inker将其偶联。首先加入前面准备好的标记有 增 DNA探 针（Pa)和 PI DNA探针的量子点，随即加入与扩增 DNA探针互补序列（Pac)， 该序列末端为 biot in标记， 另外加入 P2偶联的磁珠， 在杂交液中反应 30min。 再加入过 t链審亲和素（Sa )， 待其完全反应后， 利用磁性富集技 术去除溶液中未结合的所有化学分子、 DM序列。 重新加入 PBS ( pH7. 4 ) 緩冲液复溶沉淀（磁珠 -DNA-QD复合物）， 然后加入表面修饰有 biot in的 f子点（CdSe/ZnS-biotin ), 通过 Sa_biot in间的高效特异性结合， 形成 第一层量子点的自组装。 再次运用磁性富集以去除未能结合的量子点， 将 沉淀溶于 PBS ( pH7. 4 ), 加入过量 Sa并反应 lOmin, 磁性富集后将沉淀复 溶于 PBS，第二次加入 CdSe/ZnS-biot in,从而形成量子点的第二层自组装， 以此类推，可以形成量子点的层层自组装，从 而将单个信号放大至 10 8 —'倍。
从理论上讲， 其放大效率可以用以下公式进行推导： = 2 3m '【 3 ( w 一 I)] 1 = 4 《 3m + 3m ' [3(n - i)3 1 + 3m - [3(n一 l)] 2 + ·" + 3m · [3(n一 i)]*^ 1 } 上述公式中， A为溶液中 DM拷贝数， m为每个 QD表面结合的 ssDNA 数目， n为 QD表面俩联的 biot in数目， 为 LBL-SA量子点的层数。
运用上述方法，我们进行了 HBV病毒放大倍数与 QD自组装层数的研究。 其方法为： 将合成的 P1- (T) 6 -P2序列倍比稀幹至 10 1 。倍（其终浓度为 0. OlfM )，然后取 10ml耙分子溶液， 加上 lOulFeA- P2， 10ul540nm QD-P1 溶液于 PBS (pH7. 4)緩冲液中杂交 20min, 然后通过 0. 3T的外加磁场作用 3min , 将杂交后的靶分子-磁珠 -量子点复合物进行分离， 然后分别用 PBS (pH7. 4)缓冲液清洗 3次后， 再将复合物复溶于 lmlPBS (pH7. 4)中， 同 时加入 Ιθθμΐ ImM的链審亲和素， 反应 lOmin后运用 0. 3T外加磁场分离， 清洗 3次后复溶于 lmlPBS (pH7. 4)中， 然后加入 ΙΟΟμΙΙηιΜ的生物素标记的 540nmQD, 反应 lOmin后用外加磁场分离、 清洗从而形成第一层 QD的自組 装。 此时记录复合物的荧光强度记为 FL1。 依照同样的方法再次先后加入 ΙΟΟμΙΙιηΜ的链審亲和素， 和 ΙΟΟμΙ ImM的生物素标记的 540nmQD， 磁性富 集后分离得到第二层 QD的自组装， 记录复合物的荧光强度为 FL2。 依照此 方法， 分别记录第三层、 笫四层…… .的 QD自组装的荧光强度 FL3， FL4 , FL5'". .直至第 10层自组装 FL10。结果如图表明，第一层 QD自组装可将信 号放大 12倍， 第二层可将信号放大至 174倍， 第三层放大到 1634倍， 第 四层放大到 15876倍，依次类推，在 10层时， 达到原始荧光强度的 1. 13E8 倍， 因此， 我们时间检测结果与理论推导结果非常接近， 但略微低于理论 结果， 其原因可能是由于多层放大之后的空间位阻导 致了量子点多层组装 时未能全部组装。
(9) . 同步鉴定与基因型分型
在含有靶分子（T)的溶液中加入量子点标记的 P1探针和磁性微球标记 的 P2探针之后， 待杂交 30min进行磁性分离， 所得沉淀为同时含有 54 Onm QD-PK Fe 3 0 4 -P2和靶分子的复合体（PI- T-P2 )。 由于 P1P2同为针对不同 位点的种属特异性探针，故此复合体检测的是 所有 HBV病毒 DM。进而加入 620nm CdSe/ZnS标记的基因型分型探针 ( P3 ), 因为 P3可以与靶分子中的 型特异性位点互补杂交， 故可以通过呈现不同的颜色来判断不同基因型 的 存在。 这样， 再次通过磁性分离可以将待检 分子复合物（P1-P2-P3-T ) 从体系中分离出来，运用荧光光谦成像技术或 者流式细胞仪技术进行检测。 由于 P2和 P3探针分别标记为不同的顔色， 因此通过最后检测到的颜色进 行鉴定和分型的同步实施。 并且， 两种颜色的同时出现可以作为自身内参， 及如果只有 P3探针的顏色（无 P2探针 色）说明是假阳性结果。 同样， 只有 P2探针的顧色（无 P3探针顧色）说明是 P2探针信号放大时产生的假 阳性结果， 只有当 P2、 P3的颜色同时出现， 才能确定为真阳性结果， 从而 提高了检测的特异性。 在本实施例中， 我们针对不同基因型分别设计了相 应的探针并进行了量子点标记， 分别为： B基因型探针（P3b- QD560nm )， C 基因型探针（P3c-QD580nm )， D基因型探针（ P3d-QD620mn )， 同样的方法 可以建立针对不同基因型的分型探针。 结果表明， P3b-QD620nm能够与 540nm的鉴定探针完全分开，不存在光诸的重叠 因此可以非常准确的进行 鉴定。 因为此时的鋈定探针未进行扩增， 其信号较弱， 如果进行扩增， 则 可达到与 5 Onm QD想类似的荧光强度。
各个分型探针的 PM序列分别为:
当理解的是， 本发明的具体实施例仅仅是出于示例性说明的 目的， 其 不以任何方式限定本发明的保护范围， 本领域的技术人员可以根据上述说 明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权 利要求 的保护范围。