TITRE : Puce de détection PCR, appareil de test associé et système d’analyse de mise en œuvre

[0001] L’invention concerne une puce échantillon micro fluidique pour l’analyse d’échantillons biologiques de type PCR et/ou de fluorescence à l’aide d’un appareil de test compatible. Elle se rapporte plus particulièrement au domaine des tests diagnostiques rapides au chevet du patient (ou « Point-of- Care » ou « Near Patient Test » en anglais) ou des auto-tests, la rapidité du test et la simplicité d’utilisation du dispositif devant être suffisantes pour qu’un utilisateur non formé à son usage, en particulier le grand public, puisse l’utiliser et obtenir un résultat rapide à la simple lecture de la notice d’utilisation.

[0002] Pour réaliser une réaction de PCR (« Polymerase Chain Reaction » en anglais) rapide et en temps réel, il est nécessaire de modifier le plus rapidement possible la température d'un mélange contenant l’échantillon avec son réactif tout en mesurant de préférence sa fluorescence, (ci-après le « cyclage » rapide de l’échantillon). Un procédé et un dispositif de ce type sont décrits par exemple dans la demande de brevet WO2011/138748.

[0003] La réaction de PCR est généralement mise en œuvre dans un récipient jetable car à l’issue de la réaction, l’amplification à grande échelle de la cible ADN à détecter contamine la surface du récipient avec la cible à amplifier ce qui empêche sa réutilisation. Les récipients des réactions de PCR sont donc des récipients dits consommables.

[0004] Ces consommables de PCR doivent pouvoir être manipulés et insérés dans l’appareil de test des échantillons de manière simple, évidente et rapide pour en faciliter l’usage, notamment dans un contexte où l’efficacité opérationnelle est importante. Par ailleurs, les consommables de PCR doivent être parfaitement étanche pendant et après la réaction de PCR afin d’éviter la contamination de l’environnement d’utilisation et des prochains tests par les produits de la réaction. [0005] WO 2018/1 14625 décrit notamment une puce échantillon micro fluidique contenant une chambre pouvant être scellé avec un film de scellement, de préférence plate et/ou de faible épaisseur formée entre une face au moins partiellement transparente et une face conductrice de la chaleur, par exemple en aluminium, la face transparente permettant de suivre la réaction de PCR à l’aide d’un moyen optique par exemple une technique d’imagerie par sonde fluorescente, tout en permettant une variation très rapide de la température de l’échantillon grâce à sa face conductrice de chaleur. Cette puce peut être utilisée par exemple en combinaison avec un système de contrôle de température micro fluidique tel que décrit dans cette demande WO2018/114625, permettant de modifier très rapidement la température de l’échantillon entre ses deux valeurs extrêmes typiques de la technologie PCR, en un temps de l’ordre de la seconde tout en étant simple à introduire dans l’appareil et assurer une parfaite étanchéité du consommable pendant et après réaction.

[0006] Toutefois les puces échantillons connues nécessitent généralement l’utilisation d’une micropipette pour introduire l’échantillon à analyser dans la puce. L’utilisation d’une micropipette nécessite un opérateur formé au préalable pour son utilisation et ne peut être confiée à un utilisateur non formé sous peine de compromettre le résultat du test. Les ouvertures sont habituellement petites pour favoriser l’étanchéité entre un cône de micropipette et la puce dans le cas d’une injection de l’échantillon. Le geste de déposer une goutte rend l’utilisation de la puce plus simple mais nécessite qu’au moins une des deux ouvertures soit plus grande. Augmenter le diamètre de l’ouverture rend le scellage de celle-ci plus difficile par la réduction de la zone adhérente notamment entre le bord de l’adhésif de scellage et l’ouverture.

[0007] W02020123957 décrit une cartouche de diagnostic par PCR intégrant le prétraitement de l’échantillon et la chambre de PCR. Dans ce dispositif, l’échantillon est transféré dans un réceptacle sous forme solide (par exemple un écouvillon) ou à l’aide d’un outil de transfert qui ne nécessite pas de geste technique et peut être réalisé par un non spécialiste. Toutefois ces cartouches ont l’inconvénient d’être encombrantes, chères à produire, et elles ont une vitesse de réaction limitée : elles ne sont donc pas adaptées à un usage délocalisé, au chevet du patient ou en autotest.

[0008] La puce échantillon micro fluidique selon l’invention pour le test d’échantillons biologiques, notamment pour une analyse de type PCR, ayant la forme d’un bloc (10) de préférence parallélépipédique comportant au moins une chambre creuse (4) pour recevoir un échantillon, délimitée notamment par une première paroi (ou paroi inférieure) (3) constituée d’un matériau conducteur de chaleur de conductivité thermique supérieure à 0,1 w.m-1.K-1 , de préférence supérieure à 15 w.m-1.K-1 , de préférence métallique et une seconde paroi (ou paroi supérieure) (2), parallèle à la première, constituée au moins partiellement d’un matériau transparent et de préférence hydrophile, le bloc (10) possédant un orifice d’entrée (50) permettant l’introduction de l’échantillon dans la chambre (4) et un orifice de sortie (51 ) permettant l’évacuation de l’atmosphère présente dans la chambre lors de son introduction, l’orifice d’entrée (50) se prolongeant par une cavité (52) permettant de recevoir l’échantillon, est caractérisée en ce que l’orifice d’entrée a une surface supérieure à 4 mm2, en ce que la cavité (52) est combinée avec un premier pont capillaire permettant de faire pénétrer l’échantillon par capillarité dans la chambre (4) et éviter qu’il reste dans la cavité (52) et en ce que la puce comporte également un film de scellement (6), configuré pour être mis en contact avec le bloc (10) , ce film de scellement (6) ayant une surface suffisante pour couvrir les orifices d’entrée (50) et de sortie (51 ) simultanément, ledit film de scellement étant configuré pour adhérer audit bloc (10) et fermer les orifices d’entrée (50) et de sortie (51 ) du bloc de façon étanche après remplissage de la chambre (4) avec l’échantillon.

[0009] De préférence la puce comportera en outre une languette (9) au moins partiellement opaque et rigide ou semi-rigide, disposée de préférence dans le prolongement et de préférence dans le même plan que les deux parois (2,3), le bloc (10) étant de préférence solidaire de la languette.

[0010] De préférence la puce comportera un film de protection (60) disposé sur la deuxième paroi (2), comportant deux ouvertures (81 ) dont les côtés sont adjacents au périmètre des orifices (50,51 ) de la chambre (4) permettant de protéger les zones en contact avec le film de scellement (6) des contaminations particulaires ou liquides pouvant limiter la capacité d’adhésion du film de scellement (6).

[0011] De préférence, également, la distance entre les parois inférieure et supérieure de la chambre sera inférieure à 1 mm, de préférence inférieure à 500 pm.

[0012] De préférence, le premier pont capillaire sera caractérisé selon une première alternative par au moins une saillie dans le bloc positionnée sur le rebord de la cavité (52) faisant face à la première paroi (3), cette saillie comportant au moins une surface verticale contigüe à au moins l’un des flancs de l’orifice d’entrée (50) d’une part, et à la première paroi (3) d’autre part, ou selon une seconde alternative par un élément en matériau poreux hydrophile en contact sur l’une de ses faces avec au moins l’un des flancs de l’orifice d’entrée (50) d’une part et sur une autre de ses faces avec la première paroi (3) d’autre part.

[0013] De préférence, la puce sera caractérisée en ce que la cavité (52) a une forme choisie entre celle d’un entonnoir (52) tel qu’un tronc de cône, un tronc de pyramide ou un prisme trapézoïdal ayant un angle au sommet compris entre 20 et 90 degrés, de préférence entre 20 et 50 degrés, et celle d’un trou droit à section elliptique ou polygonale, traversant la deuxième paroi (2).

[0014] Selon une première variante le premier pont capillaire pourra comporter au moins une saillie située sur la face supérieure de la chambre (4), de la taille de la hauteur de la chambre (4) et ayant une surface verticale située dans le prolongement d’une partie des flancs de l’orifice d’entrée (50).

[0015] Selon une autre variante, un deuxième pont capillaire localisé sur la partie supérieure de la deuxième paroi (2), positionné sur un flanc de la cavité (52) pourra comporter au moins une saillie de la profondeur de la cavité (52), prenant la forme d’une ailette (53) ou d’un croisillon, perpendiculaire à la surface supérieure de la chambre (4) dont la direction longitudinale pointe vers le centre de l’orifice d’entrée (50), l’ailette se prolongeant dans la cavité (52) en direction de son centre sur une distance comprise entre 0,1 mm jusqu’à la distance bord- centre de l’orifice d’entrée. Selon ces deux variantes, l’échantillon lorsqu’il atteint le fond de la cavité mouille grâce aux saillies de la première paroi ce qui lui permet d’entrer dans la chambre par capillarité.

[0016] Alternativement, le premier pont capillaire peut être un élément en fibre hydrophile tel qu’une feuille de papier en cellulose ou une feuille en matériau éponge maintenue entre la première paroi et la face supérieure de la chambre tel que l’élément chevauche au moins partiellement la bordure de la cavité faisant face à la première paroi. Dans ce cas, l’échantillon lorsqu’il atteint le fond de la cavité est absorbé par le papier ou l’éponge et transporté jusqu’à la première paroi ce qui lui permet ensuite d’entrer dans la chambre par capillarité.

[0017] De préférence la chambre (4) de la puce comportera sur sa seconde paroi (2) au moins un, de préférence au moins trois guides capillaires correspondant à une saillie ou un sillon colinéaire à la circulation du liquide lorsqu’il remplit la chambre et ayant de préférence une section droite semi- elliptique.

[0018] De préférence, la fonction de maintien du film de scellement (6) sur l’orifice d’entrée (50) sera assurée par des ailettes, de préférence par au moins quatre ailettes (53) formant un croisillon ou une grille localisée sur le côté extérieur de la deuxième paroi (2) de la chambre (4) pour éviter au film de scellement (6) de pénétrer en profondeur dans l’orifice d’entrée lors de l’étape de scellement.

[0019] De préférence, la surface de la cavité a un état de surface poli d’une qualité comprise de SPI B2 à SPI A1 (selon la norme de la « Society of Plastics Industry ») pour favoriser le déplacement du liquide dans la direction du pont capillaire.

[0020] Selon une variante de réalisation, la puce comportera une cavité en forme d’ entonnoir (52) caractérisée en ce que la surface de l’entonnoir (52) est dotée d’ondulations constituées d’au moins 6 périodes, formant des sillons partant du centre de l’entonnoir et se projetant jusqu’à sa périphérie, ces ondulations favorisant le déplacement du liquide dans la direction du premier pont capillaire se trouvant au centre de l’entonnoir, ce qui évite que l’échantillon, si il n’est pas bien disposé au centre de l’orifice d’entrée, reste bloqué sur une périphérie de l’orifice sans atteindre le pont capillaire.

[0021] De préférence le film de scellement (6) adhérant, situé du côté du bloc au moins partiellement transparent (2), solidaire de la languette (9), se prolonge en direction de l’ouverture (16) sans être solidaire du bloc (2), la partie non- solidaire au bloc étant protégée par un opercule de protection (26).

[0022] Selon une variante, la puce comportera une étiquette d’identification (80) de préférence au niveau de la languette (9).

[0023] De préférence, la puce selon l’invention comportera des moyens de détrompage constitués par une encoche (8) située sur la puce, de préférence située sur la languette (9).

[0024] De manière surprenante, après scellement le dispositif selon l’invention permet de maintenir une parfaite étanchéité malgré les variations de température qui induisent des variations de pression sur les parois intérieures du consommable et sur le film, pression dû au dégazage du réactif qui peut être supérieure à 1 bar, et ceci malgré la taille importante de l’orifice d’entrée.

[0025] L’invention concerne également un système de test d’une puce échantillon micro fluidique pour le test de type PCR d’échantillons biologiques, la puce étant telle que décrite ci-dessus.

[0026] Le système de test selon l’invention, outre la puce décrite ci-dessus et comportant des moyens de détrompage (8), comportera un appareil de test ayant une paroi latérale (23) munie d’une ouverture (22) permettant le passage de la puce vers des moyens de thermalisation (21 ), des moyens de détrompage complémentaires destinés à coopérer avec des moyens de détrompage présents sur la puce, des moyens de maintien de la puce au contact des moyens de thermalisation après introduction de celle-ci à travers l’ouverture qui viennent maintenir la puce au contact des moyens de thermalisation, contact de préférence engendré par la coopération des moyens de détrompage situés sur la puce et des moyens de détrompage complémentaires situés dans l’appareil, afin notamment de démarrer la séquence d’analyse de l’échantillon, ce système comportant en outre des moyens de mesure de la fluorescence de I’ échantillon.

[0027] Selon un mode préférentiel, le système de test d’une puce selon l’invention, comportera des moyens d’imagerie par fluorescence.

[0028] De préférence, la languette sera au moins partiellement opaque afin d’éviter le passage de la lumière extérieure jusqu’à l’échantillon une fois la puce insérée dans l’appareil de test associé. De plus, la languette sera de préférence rigide ou semi rigide, disposée dans le prolongement et de préférence dans le même plan que les parois.

[0029] Selon une variante préférentielle, la puce échantillon selon l’invention comporte des moyens de détrompage destinés à coopérer avec des moyens de détrompage complémentaires situés dans l’appareil de test pour analyser l’échantillon contenu dans la chambre afin notamment de démarrer la séquence d’analyse de l’échantillon automatiquement lorsque la puce est insérée dans l’appareil d’analyse par PCR et de repérer si la puce a été insérée à l’envers.

[0030] Ces moyens de détrompage sont constitués par exemple par une encoche située sur la puce, de préférence située sur la languette.

[0031] Si en général, la languette est de préférence plane et disposée dans le même plan que les parois, une variante de l’invention consiste à prévoir une languette ayant par exemple la forme d’une protubérance, disposée de préférence dans le prolongement des parois, permettant une meilleure préhension de la puce pour l’introduire dans l’appareil de test.

[0032] L’invention concerne également un procédé de réalisation d’un test avec une puce telle que décrite ci-dessus, procédé dans lequel on positionne la puce dans un appareil de test tel que décrit ci-avant, grâce à la coopération des moyens de détrompage (8) et des moyens de détrompage complémentaires, et en tant que moyen de maintien on applique une force de préférence d’au moins 25N à l’aide par exemple d’un bloc de verre (20) actionné par un moteur pas à pas comprimant la puce échantillon contre l’élément de thermalisation (21 ) au niveau du film de scellement (6), de manière à sceller la chambre (4) en privilégiant une compression plus importante du film grâce aux rebords des ouvertures d’entrée (54) et de sortie (58), et assurer un bon contact thermique minimisant le gap d’air entre les moyens de thermalisation (21 ) et la plaque métallique (3), puis on soumet l’échantillon au cyclage thermique PCR, puis à une détection par fluorescence et enfin les moyens de maintien libèrent la puce.

[0033] Dans la présente demande de brevet, les termes suivants auront la signification suivante :

[0034] Le terme « matériau compatible avec la PCR » signifie un matériau qui ne contient pas d’inhibiteurs de PCR, ne dégrade pas les enzymes, les sondes fluorescentes, les dNTP, les oligo nucléides et n’absorbe pas les oligonucléotides et autres séquences d’ARN ou d’ADN et ne diffuse pas de molécules pouvant interagir avec le fonctionnement des enzymes ou changer les caractéristiques de la réaction de PCR.

[0035] Le terme « matériau opaque » signifie un matériau dont la transmission optique dans le domaine notamment du visible, soit entre 300 nm et 800 nm, est inférieure à 20%, de préférence inférieure à 1%, pour une épaisseur de matériau d’un millimètre.

[0036] Le terme « matériau transparent » signifie un matériau dont la transmission optique dans le domaine notamment du visible, est supérieure à 80%.

[0037] Le terme « matériau à forte conductivité thermique » signifie un matériau dont la conductivité thermique est supérieure à 15 w.m-1 .K-1 .

[0038] Le terme « matériau rigide ou semi-rigide » signifie un matériau dont le module de Young est supérieur à 10 MPa. [0039] Les termes appareil, appareil de test, appareil de test d’échantillon, appareil d’analyse par PCR sont utilisés indifféremment pour désigner l’appareil d’analyse d’échantillon par PCR.

[0040] Le terme matériau hydrophile signifie un matériau dont l’angle de contact d’avancé d’une goutte d’eau pure sur un surface plane constitué par ce matériau est inférieure à 90°.

[0041] L’invention sera mieux comprise à l’aide des exemples de réalisation suivants, donnés à titre non limitatif, conjointement avec les figures qui représentent :

[0042] [Fig. 1 a] [Fig. 1 b] Les figures 1 a et 1 b, une vue de dessus et de dessous de la puce échantillon selon l’invention.

[0043] [Fig. 2] La figure 2, une vue de dessus de la puce échantillon des figures 1 a et 1 b sans les films de protection et de scellement.

[0044] [Fig. 3a] La figure 3a, une vue en coupe de la partie active de la puce selon l’axe A-A de la figure 2.

[0045] [Fig. 3b] La figure 3b, une vue de détail C de l’orifice d’entrée de la figure 3a.

[0046] [Fig. 4] La figure 4, une vue en coupe de la partie active de la puce selon l’axe B-B de la figure 2.

[0047] [Fig. 5] La figure 5, une vue éclatée de la puce selon l’invention avant collage des éléments de la partie active de la puce.

[0048] [Fig. 6a] [Fig. 6b] [Fig. 6c] Les figures 6a-c montrent les différentes étapes de collage de la fenêtre et de la partie métallique pour réaliser la partie active de la puce.

[0049] [Fig. 7a] [Fig. 7b] [Fig. 7c] Les figures 7a-c montrent une vue schématique de la puce en combinaison avec l’appareil de test. [0050] [Fig. 8] La figure 8, des courbes représentant le signal de fluorescence de différents échantillons (RFU en ordonnées) en fonction du nombre de cycles (en abscisses).

[0051] [Fig. 9a] [Fig 9b] [Fig 9c] [Fig 9d] [Fig 9e] Les figures 9a-e, le procédé d’utilisation de la puce selon l’invention.

[0052] [Fig. 10] La figure 10, la puce en vue arrière sans la plaque métallique (3)

[0053] Sur ces figures les mêmes éléments portent les mêmes références.

[0054] Sur les figures 1 a et 1 b, la puce échantillon selon l’invention est représentée sous la forme d’un bloc de préférence parallélépipédique qui selon un mode préférentiel de réalisation a la forme d’une plaquette rectangulaire 10. Cette plaquette de forme parallélépipédique 10 en matériau opaque a une longueur égale à environ cinq fois sa largeur sur la figure (de préférence entre 50x10 mm (et une épaisseur d’au moins 1 mm) et 200x100 mm (et une épaisseur d’au plus 10 mm)). Elle est pourvue dans sa partie active 13, (partie gauche de la figure) d’une ouverture 16 (voir figure 5) sensiblement carrée entourée d’un cadre opaque 1 dans laquelle est logée une fenêtre transparente 2 (voir figure5). Celle-ci est pourvue de deux orifices 50 et 51 respectivement un orifice d’entrée 50 permettant l’introduction l’échantillon liquide et un orifice de sortie 51 pour l’évacuation de l’atmosphère présente dans la chambre 4 situées sur une diagonale de la fenêtre 2 et communiquant avec la chambre 4 (voir figures 3 et 4) pourvue de préférence de guides capillaires 12 (figure 5). Dans le prolongement et dans le même plan que le cadre 1 se trouve la languette 9 munie sur l’un de ses cotés d’une encoche 8 servant de moyen de détrompage lors de l’introduction de la plaquette rectangulaire 10 dans l’appareil de test, non représenté sur la figure. Sur les figures 1 a et 1 b, sont respectivement représentées les vues de dessus et de dessous de la puce échantillon, et sur la figure 2 une vue agrandie de la partie active 13 de la puce sans les films de protection 60 et de scellement 6. Sur la figure 1 b, une plaque métallique 3 est logée dans l’ouverture 16 (figure 5), fermant ainsi la partie active 13 de la puce échantillon. Cette plaque métallique 3, dans le prolongement de la languette 9, sera légèrement en relief (au-dessus) par rapport à la languette 9 afin de réaliser un bon contact thermique et mécanique avec l’élément de thermalisation 21 (figure 7a-c).

[0055] La figure 3a représente une vue en coupe selon l’axe A-A (diagonale de la partie active 13) défini par les deux orifices 50 et 51 (ou orifice d’entrée et de sortie respectivement). La fenêtre transparente 2 s’appuie à l’aide de son extrémité périphérique 17 sur un rebord 18 solidaire du cadre 1 , ménageant une gorge 7 dans laquelle sera injectée un adhésif (silicones ou autres) tout autour de la fenêtre 2 permettant de fixer de manière étanche la plaque métallique 3 à la fenêtre 2 et au cadre 1 . La plaque métallique 3 délimite ainsi la chambre 4 dans laquelle on introduit l’échantillon par l’orifice d’injection 50. Un film de scellement 6 recouvre les orifices 50 et 51 pour sceller de façon étanche ces ouvertures après injection de l’échantillon à analyser dans la chambre 4. Sur la figure 3b est représenté une vue détaillée d’une partie de l’entonnoir montrant l’angle au sommet entre la paroi de l’entonnoir 52 et le bord de celui-ci 54. Sur la figure 3 a est représenté le deuxième pont capillaire formé par les saillies (53).

[0056] La figure 4 représente une vue en coupe selon l’axe B-B (figure 2) de la partie active de la puce échantillon.

[0057] La figure 5 représente une vue éclatée de la puce échantillon des figures 1 a et 1 b, avant l’assemblage de la fenêtre 2 et de la plaque métallique 3 à l’intérieur de l’ouverture 16 dans la plaquette rectangulaire 10 et des films de protection et scellement respectivement 60 et 6 ainsi qu’une étiquette d’identification 80. Dans la chambre 4 sont représentées plusieurs guides capillaires longitudinaux 12 facilitant la circulation de l’échantillon liquide ainsi que sa répartition dans la chambre 4. Le film de protection 60 comporte une ouverture 81 correspondant à l’orifice d’entrée 50. L’ouverture dans ce film de protection 60 correspondant à l’orifice de sortie 51 n’est pas représentée sur cette figure 5.

[0058] Les figures 6a, 6b 6c illustrent l’assemblage de la fenêtre 2 et de la plaque métallique 3. A l’aide d’un moyen d’injection 19 d’adhésif liquide ou semi- liquide, on vient remplir la gorge 7 (figure 6c) disposée tout autour de la fenêtre 2 avec l’adhésif semi-liquide 14 tel qu’un silicone ou autre matériau compatible avec la PCR (figure 6b) puis on vient appliquer la plaque métallique 3 sur la fenêtre 2 de manière à étanchéifier la chambre 4 ainsi créée. L’adhésif est ensuite polymérisé (durcit) à l’aide d’une source UV 15 adaptée. La puce échantillon étant ainsi préparée, on peut introduire l’échantillon à analyser dans la puce, puis sceller les orifices 50 et 51 à l’aide d’un film adhésif compatible avec la PCR et procéder à l’analyse de l’échantillon comme cela est représenté sur les figures 7a, 7b, et 7c.

[0059] Pour cela on dispose d’un appareil de test, partie gauche des figures 7a-c (intérieur). Celui-ci comporte des moyens de maintien, par exemple, un bloc mobile 20 transparent (de préférence en verre) à travers lequel on pourra faire la mesure de fluorescence et un élément de thermalisation 21 de l’échantillon ; (pour plus de détails sur un élément de thermalisation, on pourra se reporter à la demande WO2018/114625 au nom de la Demanderesse). De l’autre côté de la paroi 23 de l’appareil de test (à droite sur les figures 7a-c : « extérieur » ) on introduit à travers l’ouverture 22 dans cette paroi, la plaquette rectangulaire 10 grâce à la languette 9, de manière à amener la partie active 13 de la puce au- dessus et au contact de l’élément de thermalisation : le positionnement adéquat de la puce sur l’élément de thermalisation 21 est réalisé grâce à l’encoche de détrompage 8 venant coopérer avec des moyens de détrompage complémentaires situés dans l’appareil de test. Cette coopération enclenche alors un mouvement (vers le bas sur la figure 7a) du bloc de verre 20 qui vient presser la partie active 13 de la puce échantillon (figure 7b) assurant le scellement de la chambre 4 par l’application d’une surpression sur le rebord de l’orifice d’entrée 54, le rebord de l’orifice de sortie 58 et les plots de planéité 55 (figure 2). L’action de presse sur la partie active 13 assure également un bon contact thermique de la puce (dont la partie métallique est au contact de l’élément de thermalisation) ce qui permet de démarrer le cyclage thermique de l’échantillon. Lors de ce cyclage, le signal optique 25 issu de la fluorescence de l’échantillon est collecté sur le capteur 24, permettant le suivi en temps réel de la fluorescence dans la puce. Après une durée prédéterminée (environ 40 cycles) le cyclage thermique est stoppé et l’on fait remonter le bloc de verre 20 (figure 7c) dans sa position de repos, la puce étant tirée vers l’extérieur grâce à la languette 9.

[0060] La puce est manipulée depuis l’extérieur de l’appareil et son insertion ne nécessite pas d’ouverture de l’appareil. Aucun panneau, tiroir ou porte d’accès n’est nécessaire sur l’appareil de test, d’où sa simplicité et sa rapidité d’utilisation.

[0061] La puce est insérée par une fente fixe, puis retirée de la même manière une fois l’opération de détection achevée.

[0062] Le bon positionnement de la puce est déterminé par l’encoche 8 sur le bord de la puce. Une fois en position, celle-ci enclenche un contacteur (non représenté sur la figure 7a) qui permet le verrouillage du système.

[0063] Les moyens de maintien et de thermalisation forment dans cette variante une mâchoire mobile qui permet de maintenir la puce en position, elle est composée :

- d’un bloc en verre 20 monté sur une plateforme motorisée permettant son déplacement vertical pour la partie supérieure,

- d’un élément de thermalisation 21 (métallique par exemple), permettant le changement rapide de température lors des cycles thermiques de PCR pour la partie inférieure.

[0064] La pression appliquée sur la puce est de préférence comprise entre 100 g et 10 kg repartie plus particulièrement sur les rebords des orifices d’entrée et de sortie, respectivement 54 et 58 ainsi que les plots de planéité 55 permettant un scellement préférentiel sur les orifices de la chambre 4.

[0065] Une fois la PCR terminée, la mâchoire s’ouvre automatiquement (sous la commande d’un automate programmé à cet effet, de manière connue en soi) libérant la puce, qui peut être retirée par l’utilisateur (figure 7c).

[0066] La position verrouillée sous pression (figure 7b) permet d’assurer un contact maximum entre la plaque métallique de la puce et l’élément de thermalisation, d’une part et d’empêcher l’ébullition du liquide échantillon contenu dans la puce lorsque la température avoisine les 100°C d’autre part. Mais elle permet en outre d’éviter d’éventuelles fuites de produits de PCR dans l’appareil qui risqueraient de le contaminer.

[0067] Le bloc transparent de préférence en verre, permet de collecter le signal de fluorescence issu de l’échantillon lors de l’amplification PCR.

[0068] La figure 8 représente le signal de fluorescence RFU en fonction du nombre de cycles auxquels les échantillons sont soumis. Les courbes CIBLE 1 et CIBLE 2 correspondent à deux cibles de l’ADN du coronavirus SARS-COV-2 tandis que la courbe CONTRÔLE correspond au contrôle interne. L’amplification est clairement détectable dès le 35ème cycle, ce qui correspond à une détection rapide en moins de 20 minutes.

[0069] Les figures 9a-c représentent le procédé d’utilisation de la puce selon l’invention.

[0070] Sur la figure 9a, à l’aide d’une pipette 70 on dépose une goutte de liquide 71 , contenant l’échantillon et les réactifs permettant la PCR, dans l’orifice d’entrée 50.

[0071] Sur la figure 9b, le liquide pénètre dans la chambre à travers l’orifice d’entrée 50 par capillarité jusqu’à atteindre l’orifice de sortie 51 .

[0072] Sur la figure 9c, le film de protection 60 est retiré de la puce à l’aide de la languette 61 pour retirer tout liquide hors de l’orifice d’entrée.

[0073] Sur la figure 9d, l’opercule protecteur 26 du film de scellement 6 est retiré du film par la languette 28 laissant la surface adhésive du film de scellement à l’air.,

[0074] Sur la figure 9e, le film de scellement 6 est appliqué sur la deuxième paroi 2 ou paroi supérieure de la chambre 4 en obstruant les orifices d’entrée 50 et de sortie 51 , après l’injection de l’échantillon dans la chambre.

[0075] Le film de scellement est constitué de préférence d’un support en PET résistant à la chaleur d’une épaisseur comprise entre 20pm et 500pm, d’une masse adhésive en silicone compatible avec le procédé de PCR de préférence entre 20pm et 500pm. De par la viscosité relative des adhésifs en silicone lors du cyclage thermique, la présence de croisillons (53) pour le soutien du film est de préférence nécessaire et dans certain cas indispensable. Du fait de la viscosité relative des adhésifs en silicone lors du cyclage thermique, la présence de rebords (54, 58) autour des orifices, respectivement d’entrée et de sortie, assure un moyen de scellage des orifices par compression locale du film de scellement sur le pourtour de ces orifices.

[0076] Sur la figure 10 est représentée la face inférieure de la chambre (4) et le deuxième pont capillaire formé par les deux saillies latérales (90) permettant au liquide de de créer un pont favorisant son entrée dans la chambre.

[0077] L’opercule protecteur 26 du film de scellement 6 est retiré au moment du scellement de la puce, après injection de l’échantillon et le film de scellement 6 est rabattu sur la paroi supérieure de la puce afin de recouvrir hermétiquement les orifices 50 et 51 .

[0078] Une étiquette de suivi 80 présentant un code de type « datamatrix », par exemple, permet de référencer de manière automatisée chacune des puces, ce qui permet d’avoir un suivi échantillon et une connexion avec le Système de gestion de l’information du laboratoire (LIMS) des hôpitaux pour les applications médicales. L’étiquette peut présenter également les informations concernant l’usage de la puce, par exemple pour un usage recherche ou un usage de diagnostic in Vitro.

[0079] Une telle structure de la puce avec son film de scellement, sa languette et son système de détrompage permet notamment d’introduire la puce dans l’appareil de test par la fente 22 sans avoir besoin d’ouvrir l’appareil