LIU TAO (CN)
ZHAO MEIRU (CN)
ZHANG XIANDONG (CN)
LI JIAN (CN)
LIU TAO (CN)
ZHAO MEIRU (CN)
ZHANG XIANDONG (CN)
| WO2008045575A2 | 2008-04-17 |
| CN101654691A | 2010-02-24 |
中国国际贸易促进委员会专利商标事务所 (CN)
| 权 利 要 求 1. 一种测定样品中目的核酸的核苷酸序列的方法， 其包括： 1 )提供 n个样品， n为大于等于 1的整数， 所述样品优选地来 自哺乳动物， 更优选是人， 特别是人的血样； 可选地， 将待分析 的 n个样品分成 m个小组， m为整数且 n > m > l; 2 )扩增: 对于每一个样品， 使用一对或多对标签引物， 在存 在来自该样品的模板时， 在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR 扩增， 其中， 每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引物和 反向标签引物 （均可以是简并引物）构成， 其中正向标签引物和 反向标签引物所包含的引物标签可以相同或者不同； 不同样品所 用标签引物对中的引物标签彼此不同； 3 ) 混合： 当 η>1时， 将各样品的 PCR扩增产物混合在一起； 4 )打断： 将所得的扩增产物进行不完全打断， 并进行纯化回 收； 5 )测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的是 Pair-End技术（例如 IUumina GA、 IUumina Hiseq 2000 )进行测序， 获得打断后的 DNA的序列； 和 6 )拼接：基于每个样品独特的引物标签将获得的测序结果与 样品 对应， 利用比对程序 （例如 Blast, BWA程序）把各个测 序序列定位到 PCR产物的相应 DNA参考序列上， 通过序列重叠和 连锁关系， 从打断后的 DNA的序列拼接出完整的目的核酸。 2. 权利要求 1所述的方法，其中每一对引物标签与 PCR引物对 组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端分别具有（或者任选 通过连接序列连接）正向引物标签和反向引物标签。 3. 权利要求 1所述的方法， 其中所述 PCR引物是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRBl 2号外显子的 PCR 引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。 4. 权利要求 1所述的方法，其中所述引物标签针对 PCR引物进 行设计， 优选针对用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物进行设 计， 更优选是用于扩增 HLA-A/B的 2 , 3 , 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物，特别是如表 2所示的 PCR引物 进行设计，所述引物标签特别是包括表 1所示 95对引物标签中的至 少 10对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对 （或 者所述一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对（例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95 对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且 所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10 , 或 PI-11至 PI-20 , 或 PI-21至 PI-30 , 或 PI-31至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70,或 PI-71 至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它们任何两个 或者多个的组合。 5. 权利要求 1所述的方法，其中所述 DNA打断包括化学打断方 法和物理打断方法， 其中所述化学方法包括酶切方法， 所述物理 打断方法包括超声波打断方法或机械打断方法。 6. 权利要求 1所述的方法， 其中所述 DNA打断后， 纯化回收 从测序仪最大读取长度到测序仪可适用的最长 DNA长度范围之间 的所有 DNA条带，其中所述纯化回收方法包括但不限于电泳割胶回 收， 也可以是磁珠回收。 7. 权利要求 1所述的方法， 其中所述方法还可以包括权利要求 1所述的步骤 1 ) - 4 ) ， 以及如下步骤： 5 )建库： 将打断后的 PCR产物文库构建 PCR-Free测序文库， 可以对文库添加不同的文库接头 （ adapter ) 以区分不同的 PCR-Free测序文库， 纯化回收位于所用测序仪最大读长长度到所 用测序仪适用的最长 DNA长度范围之间的所有 DNA条带，优选地 是 450-750bp长度范围的 DNA片段； 6 ) 测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的 是 Pair-End技术（例如 Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000 )进行 测序， 获得打断后的 DNA的序列； 7 )拼接： 基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品独特 的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应，利用比对程序（例 如 Blast，BWA程序） ^各个测序序列定位到 PCR产物的相应 DNA 参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打断后的 DNA的序列 拼接出完整的目的核酸。 8. 权利要求 1 - 7中任一项所述的方法用于 HLA分型的用途， 其特征在于包括： 使用权利要求 1 - 7中任一项的方法对来自患者 的样品 （特别是血样）进行测序， 以及将测序结果与 HLA数据库 (如 IMGT HLA专业数据库） 中 HLA-DRB1 2号外显子的序列数 据比对， 序列比对结果 100 %匹配的即为对应样本的 HLA-DRB1 基因型别。 9. 一组引物标签， 其包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10 对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对 （或者所 述一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对 （例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95 对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且 所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10， 或 PI-11至 PI-20 , 或 PI-21至 PI-30 , 或 PI-31至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70,或 PI-71 至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它们任何两个 或者多个的组合。 10. 权利要求 9所述的一组引物标签用于 PCR测序方法的用途， 其中特别是， 每一对引物标签与用于扩增待测目的序列的 PCR引 物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端分别具有 （或者 任选通过连接序列连接）正向引物标签和反向引物标签。 11. 权利要求 10所述的用途， 其中 PCR引物是用于扩增 HLA的 特定基因的 PCR引物， 优选是用于扩增 HLA-A/B的 2, 3 , 4号外 显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引 物如表 2所示。 12. 权利要求 9的一组引物标签与用于扩增待测目的序列的 PCR引物对组合成的一组标签引物， 其中每一对引物标签与 PCR 引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物的 5，端各具有 （或者 任选通过连接序列连接） 一个引物标签。 13. 权利要求 12所述的标签引物, 其中所述 PCR引物是用于扩 增 HLA的特定基因的 PCR引物，优选是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。 14. 权利要求 12所述的标签引物用于 PCR测序方法的用途。 |
PCR测序方法 技术领域
本发明涉及核酸测序技术领域， 特别是 PCR测序技术领域。 另一方面， 本发明还涉及 PCR-index/barcode技术领域。 本发明 的方法特别适用于第二代测序技术， 尤其是第二代测序技术中的 Pair-end测序技术， 还可以用于 HLA基因分型。 背景技术
PCR测序 （PCR sequencing ) 方法是通过 PCR的方法得到 目的基因 DNA片段， 再通过对所得到的目的基因 DNA片段进行 DNA序列检测， 从而得到目的基因 DNA序列信息的一种技术， 其具有直观、 准确的特点， 长久以来广泛应用于基因突变检测以 及基因分型等领域。
PCR-index/barcode技术，通过在 PCR引物的 5， 末端添加引 物标签（ primer index )序列， 可在 PCR过程中对每个样本引入 独特的引物标签，使样本在利用第二代 DNA测序技术（以 Illumina GA， Roche 454， ABI Solid等测序仪为代表的可大规模， 高通量， 单分子测序的测序仪）检测过程中， 除 PCR ^节必须逐个样本处 理外， 其它实验环节可把多个样本混在一起同时处理 ， 最终每个 样本的检测结果可以通过其独特的引物标签序 列我回； 该方法具 有成本低， 通量大和可同时检测大量样本的多个不同基因 位点的 特点。
第二代 DNA测序技术与第一代（ Sanger法） DNA测序技术相 比， 其可连续测序的长度较短。 以 Illumina G A ( Illumina公司的 Genome Analyzer测序仪，简称 Illumina GA )为例， 当前 Illumina GA的最大测序长度为 200bp， 当 PCR产物的长度大于 200bp， 利 用 Illumina GA测序，直接釆取 PCR测序的方法，不能把整个 PCR 产物测通，得不到被检测 PCR产物的全部 DNA序列信息的。短的 测序读长限制了第二代测序技术的应用， 除了通过逐步改进测序技 术来获得更长的实际测序读长外， 开发可克服第二代 DNA测序仪 现有测序读长在 PCR测序应用领域不足的新技术也成为当务之急 。 发明内容
当前利用第二代测序技术， 对大量样本中的特定基因相关序 列同时进行测序分析时，一般会采用 PCR测序的策略，直接利用 引物标签 + 二代测序技术的组合。 当所用测序仪的测长可以覆 盖整个 PCR产物的长度时，上述技术就足够满足要求了 。但当所 用测序仪的测长不够覆盖整个 PCR产物的长度时，要么更换具有 更长测长的第二代测序仪（如用 Roche 454 GS-FLX)替代 Illumina GA, 如果测长还不满足要求的话， 只能牺牲成本和通量， 改用第 一代测序仪。
现实情况是， Illumina GA具有超高测序通量， 但其测长才 200bp; Roche 454 GS-FLX的测长虽然可以达到 500bp， 但其测 序成本较高， 通量较小； 第一代测序仪的测长虽然可以达到 lOOObp以上， 但其通量和成本没法和第二代测序仪相比。
有没有能够兼顾成本和通量， 能提高测序仪可以测通的 PCR 产物长度的技术呢？ 本专利中的引物标签 + DNA不完全打断策略 + 二代测序技术的组合能在充分利用第二代测序 仪高通量、 低成 本特点的同时，使测序仪能够测通的 PCR产物长度达到测序仪本 身测长以上， 大大扩大了其适用范围。 其中， 本发明的所采用的 二代测序技术包括第二代测序技术中的 Pair-end测序技术， 以及 针对 PCR模板有 DNA参考序列 （DNA Reference Sequence ) 的 PCR测序技术。
本发明提供了用于 PCR测序的方法，通过所述方法减少了自 身测序读长较短造成的限制，扩大了第二代 DNA测序技术在 PCR 测序应用领域的应用。
引物标签的设计根据所应用的实验平台不同而 不同， 考虑 Illumina GA测序平台本身的特点， 本发明在设计引物标签时主 要考虑了以下几点： 1: 引物标签序列中避免 3 个以上 （包括 3 个）单碱基重复序列， 2: 所有引物标签的同一位点中碱基 A和 碱基 C的总含量占所有碱基含量的 30%-70%之间， 3: 引物标签 序列本身的 GC含量在 40-60%之间， 4: 引物标签之间序列差异 度大于 4个碱基， 5: 引物标签序列中避免出现与 Illumina GA测 序引物相似度高的序列， 6: 减少引物标签序列添加到 PCR引物 上后， 对 PCR引物造成的严重发卡（ hairpin )， 二聚体（ dimer ) 情况的出现。
本发明通过 PCR反应在 PCR产物两端各引入一个引物标签 (引物标签序列可以相同也可以不同），使 PCR产物任何一端的 引物标签都可以特异的标记 PCR产物的样本信息。 所得 PCR产 物经过经不完全打 。所谓不完全打断，指打断终产物中包含完整 的未被打断的 PCR产物和局部打断的 PCR产物。所述打断方法包 括但不限于化学打断方法 （例如酶切） 和物理打断方法， 所述物 理打断方法包括超声波打断方法或机械打断方 法等。打断的 DNA 经 2%琼脂糖电泳， 割胶纯化回收从测序仪最大读取长度到测序仪 可适用的最长 DNA长度范围之间的所有 DNA条带 （ Illumina GA 测序仪可适用的最长 DNA为 700bp， 此长度为原始 DNA长度， 没 有包括文库接头序列长度） 。 纯化回收方法包括但不限于电泳割 胶回收， 也可以是磁珠回收等。 回收的 DNA片段再按照第二代测 序仪测序文库构建的流程构建测序文库， 然后进行测序， 优选为 采用 PCR-FREE测序文库构建的流程构建测序文库，测 方法优 选釆用 Pair-End方法测序。 PCR-Free测序文库构建的流程按照 本领域技术人员已知方法构建。 在得到测序总数据中， 通过引物 标签序列可以找到所有所测样本的序列信息， 利用 BWA把各个 测序序列定位到 PCR 产物的相应 DNA 参考序列 （Reference Sequence )上，再通过测序序列之间的重叠和连锁关系 接出 PCR 产物的完整序列（图 1)。此处连锁是指由 Pair-End测序特点决定的 pair-end连锁关系。
"接头 ( adapter ) " 或 "文库接头 ( library adapter ) " 标 签技术是指通过对多个测序文库添加不同文库 接头 （不同文库接 头的组成序列不同， 序列不同的部分称为接头标签 （adapter index ) ) ， 构建标签测序文库， 从而可实现多个不同标签测序文 库混合测序， 且最终各个标签测序文库的测序结果可相互区 分的 一种文库标签技术。
基于 DNA分子标签技术和 DNA不完全打断策略的 PCR测 序方法的使用可在不增加引物标签数目的情况 下， 大大提高可唯 一标记的样本数目。
结合文库接头标签技术的 PCR-FREE的文库构建方法，是指 将文库接头直接连接至测序文库中的 DNA片段两端，文库接头的 导入过程因为没有 PCR的参与， 因此称作 PCR-Free文库构建。 其中接入方法可以采用 DNA连接酶进行连接。 其整个文库构建 过程中无 PCR的参与， 避免了在高序列相似度的 PCR产物混合 ( pooling ) 文库的构建过程中， 由 PCR 引入错误而导致最后结 果的不准确性。
在本发明中，通过对正反 PCR引物添加引物标记，结合 DNA 不完全打断策略，使第二代测序技术应用于 PCR测序领域时， 实 际可测得的 PCR产物长度超过测序仪的最大测序长度。
在本发明的一个方面中， 提供了一组引物标签 （ primer index ) , 其包括表 1所示 95对引物标签中的至少 10对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对 （或者所述 一组引物标签由表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对（例如 10 - 95对， 20 - 95对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并 且
所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10, 或 PI-11至 ΡΙ-20, 或 PI-21至 ΡΙ-30, 或 PI-31 至 ΡΙ-40,或 PI-41至 ΡΙ-50,或 PI-51至 ΡΙ-60,或 PI-61至 ΡΙ-70, 或 PI-71至 ΡΙ-80, 或 PI-81至 ΡΙ-90, 或 PI-91至 ΡΙ-95, 或者它 们任何两个或者多个的组合。
根据本发明另一方面， 还提供了所述的引物标签用于 PCR测 序方法的用途， 其中特别是， 每一对引物标签与用于扩增待测目的 序列的 PCR引物对组合成一对标签引物，正反 PCR引物的 5，端分 别具有（或者任选通过连接序列连接）正向引 物标签和反向引物标 签。
在本发明的一个具体实施方式中，所述 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物， 优选是用于扩增 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。 本发明另一方面中， 提供了上文所述一组引物标签与用于扩 增待测目的序列的 PCR引物对组合成的一组标签引物，其中每一 对引物标签与 PCR引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR引物 的 5，端分别具有 （或者任选通过连接序列连接）正向引物标签 和 反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中， 上文所述标签引物中的 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物，优选是用于 扩增 HLA-A/B 2， 3, 4号外显子和 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR 引物，优选的所述 PCR引物如表 2所示。在本发明的另一个具体 实施方式中， 所述的标签引物用于 PCR测序方法。
本发明另一方面中， 提供了一种测定样品中目的核酸的核苷 酸序列的方法， 其包括：
1 )提供 n个样品， n 为大于等于 1的整数， 所述样品优选地来 自哺乳动物， 更优选是人， 特别是人的血样； 可选地， 将待分析 的 n个样品分成 m个小组， m为整数且 n > m > l ;
2 )扩增： 对于每一个样品， 使用一对标签引物， 在存在来自 该样品的模板时， 在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR扩增， 其中， 每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引 物和反向标 签引物 （均可以是简并引物）构成， 其中正向标签 il物和反向标 签引物所包含的引物标签可以相同或者不同； 不同样品所用标签 引物对中的引物标签彼此不同；
3 )打断： 将所得的 PCR产物文库进行不完全打断；
4 ) 测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的 是 Pair-End技术（例如 Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000 )进行 测序， 获得打断后的 DNA的序列；
5 )拼接： 基于每个样品独特的引物标签将获得的测序结 果与 样品 对应， 利用比对程序 （例如 Blast, BWA程序）把各个 测序序列定位到 PCR产物的相应 DNA参考序列上， 通过序列重 叠和连锁关系， 从打断后的 DNA的序列拼接出完整的目的核酸。
本发明另一方面， 提供了一种测定样品中目的核酸的核苷酸 序列的方法， 其包括：
1 )提供 n个样品， n为大于等于 1的整数， 所述样品优选地来 自人， 特别是人的血样； 可选地， 将待分析的 n个样品分成 m个小 组， m为整数且 n > m > 1 ;
2 )扩增： 对于每一个样品， 使用一对标签引物， 在存在来自 该样品的模板时， 在适于扩增目的核酸的条件下进行 PCR 增， 其中， 每一对标签引物由包含引物标签的正向标签引 物和反向标 签引物 （均可以是简并引物）构成， 其中正向标签引物和反向标 签引物所包含的引物标签可以相同或者不同； 不同样品所用标签 引物对中的引物标签彼此不同；
3 ) 混合： 将各样品的 PCR扩增产物混合在一起， 获得 PCR 产物文库；
4 )打断： 将所得的 PCR产物文库进行不完全打断；
5 )建库： 将打断后的 PCR产物文库构建 PCR-Free测序文库， 回收位于所用测序仪最大读长长度到所用测序 仪适用的最长 DNA长度范围之间的所有 DNA条带， 可以对文库添加不同的文库 接头 （adapter ) 以区分不同的 PCR-Free测序文库；
6 ) 测序： 将回收的 DNA混合物利用二代测序技术， 优选的 是 Pair-End技术（例如 Illumina GA、 Illumina Hiseq 2000 )进行 测序， 获得打断后的 DNA的序列；
7 )拼接： 基于各个文库不同的文库接头序列和每个样品 独特 的引物标签将获得的测序结果与样品一一对应 ，利用比对程序（例 如 Blast，BWA程序 fe各个测序序列定位到 PCR产物的相应 DNA 参考序列上，通过序列重叠和连锁关系，从打 断后的 DNA的序列 拼接出完整的目的核酸。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述 的测序方法中， 每一对引物标签与 PCR引物对组合成一对标签引物， 正反 PCR 引物的 5，端分别具有 （或者任选通过连接序列连接）正向引物标 签和反向引物标签。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述 的测序方法中， 所述 PCR引物是用于扩增 HLA的特定基因的 PCR引物， 优选 是用于扩增 HLA-A/B的 2， 3， 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号 外显子的 PCR引物， 优选的所述 PCR引物如表 2所示。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述 的测序方法中， 所述引物标签针对 PCR引物进行设计， 优选针对用于扩增 ¾A 的特定基因的 PCR引物进行设计，更优选针对用于扩增 HLA-A/B 的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物， 特别是如表 2所示的 PCR引物进行设计，所述引物标签特别是包 括表 1所示 95对引物标签中的至少 10对， 或至少 20对， 或至少 30对， 或至少 40对， 或至少 50对， 至少 60对， 或至少 70对， 或至少 80对， 或至少 90对， 或 95对（或者所述一組引物标签由 表 1所示 95对引物标签中的 10 - 95对（例如 10 - 95对， 20 - 95 对， 30 - 95对， 40 - 95对， 50 - 95对， 60 - 95对， 70 - 95对， 80 - 95对， 90 - 95对， 或 95对）组成） ， 并且
所述一组引物标签优选地至少包括表 1所示 95对引物标签中 的 PI-1至 PI-10, 或 PI-11至 PI-20, 或 PI-21至 PI-30, 或 PI-31 至 PI-40,或 PI-41至 PI-50,或 PI-51至 PI-60,或 PI-61至 PI-70, 或 PI-71至 PI-80, 或 PI-81至 PI-90, 或 PI-91至 PI-95, 或者它 们任何两个或者多个的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，在上文所述 的测序方法中， 所述 DNA打断包括化学打断方法和物理打断方法， 其中所述化 学方法包括酶切方法， 所述物理打断方法包括超声波打断方法或 机械打断方法。 所述 DNA打断后， 分离 450-750bp长度的片段。
本发明另一方面中， 提供了一种 HLA分型方法， 包括： 使 用上文所述的测序方法对来自患者的样品 （特别是血样）进行测 序，以及将测序结果与 HLA数据库（如 IMGT HLA专业数据库） 中的标准序列数据比对， 序列比对结果 100 %匹配的即为对应样 本的 HLA基因型别。 附图说明
图 1: 为引物标签标记， DNA打断和 DNA测序后， 序列拼 接图示。 第 N号样本的 PCR产物两端引入了正反引物标签序列 Index-N-F/R (1), PCR产物经物理方法打断后的产物中包括： 一 端带有引物标签序列的产物， 两端都不带引物标签序列的产物， 完全未被打断的产物， 割胶纯化回收位于测序仪最大读长长度到 测序仪适用的最长 DNA长度范围之间的所有 DNA条带用于测序 ( 2 ) ， 利用 Index-N-F/R在测序结果中找回属于第 N号样本的 PCR产物的测序结果， 利用 PCR产物已知的参考序列信息定位 各个测序序列相对参考的位置， 并根据测序序列之间的重叠和连 锁关系组装成完整的 PCR产物的测序结果 （3， 4 ) 。
图 2: 为 1号样本 HLA-A/B/DRB1相应外显子 PCR产物电泳 结果， 从电泳图上看， PCR产物为一系列片段大小 300bp-500bp 的单一条带，其中泳道 M是分子量标记物（ DL 2000,Takara公司）， 泳道 1-7为 1号样本的 HLA-A/B/DRB1各外显子 （ A2、 A3、 A4、 B2、 B3、 B4、 DRBl-2 ) PCR扩增产物， 阴性对照 （N )无扩增条 带。 其它样品的结果与此类似。
图 3: 为 HLA-Mix打断后 DNA电泳情况 (割胶前后）， 割胶 区域为 450-750bp区域。 其中泳道 M是分子量标记物（NEB-50bp DNA Ladder ) , 泳道 1是割胶前 HLA-Mix的电泳情况， 泳道 2 是割胶后 HLA-Mix的胶图。
图 4: 1号样本的一致性（consensus )序列构建程序截图， 示 例说明了根据引物标签和 DN A片段之间的重叠关系拼接出 PCR产 物的完整序列。 具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详 细描述， 但是 本领域技术人员将会理解， 下列实施例仅用于说明本发明， 而不 应视为限定本发明的范围。
在本发明的实施例中， 通过采取引物标签 + DNA不完全打断 策略 + Illumia GA测序仪 Pair-End 100测序技术的组合对 95个 样本的 HLA-A/B 2, 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 基因分型 （PCR产物长度大小处于 290bp-500bp之间） ， 证明该 策略可以在充分发挥第二代测序仪高通量、低 成本^点的同时， 可 以实现对超过测序仪本身测长以上的基因片段 的分型。
原理： 将待分析的样本， 通过 PCR反应在 HLA-A/B 2, 3, 4 号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR产物两端引入引物标 签， 使其特异的标记 PCR 产物的样本信息。 将各组内样品的 HLA-A/B/DRB1三个位点的 PCR扩增产物混合在一起，获得 PCR 产物文库； 所得 PCR 产物文库经过超声不完全打断后， 构建 PCR-Free测序文库， 测序文库经 2%低熔点琼脂糖电泳， 割胶纯 化回收位于 450bp-750bp 长度范围之间的所有 DNA 条带 (PCR-Free测序文库的构建过程中在 DNA 片段的两端都添加上 了文库接头， 使 DNA 片段在电泳图上体现的长度比实际长度大 了 250bp左右， 因此，此处回收 450bp-700bp的片段， 实际上相当 于回收原长度为 200bp-500bp 的 DNA 片段)。 回收的 DNA 经 Illumina GA PE-100测序。 通过引物标签序列可以找到所有所测 样本的序列信息， 再通过已知 DNA片段的参考序列信息和 DNA 片段序列之间的重叠和连锁关系组装出整个 P C R产物的序列，再 通过与 HLA-A/B/DRB1 相应外显子的标准数据库的比对结果可 组装出原 PCR产物的全序列，实现 HLA-A/B/DRB1的基因分型。 实施例 1
样本提取
使用 KingFisher 自动提取仪（美国 Thermo公司）从 95份 已知 HLA-SBT分型结果的血样 （中国造血干细胞捐献者资料库 (以下称 "中华骨髓库" ）） 中提取 DNA。 主要步骤如下： 取出 6 个 Kingfisher自动提取仪配套的深孔板及 1个浅孔板， 根据说明 书分别加入一定量配套的试剂并做好标记， 将所有已加好试剂的 孔板按要求置于相应的位置， 选定程序 " Bioeasy一 200ul Blood DNA一 KF.msz" 程序， 按下 "star" 执行该程序进行核酸提取。 程序结束后收集 plate Elution中的 lOOul左右的洗脱产物即为提 取的 DNA。 实施例 2
PCR扩增
通过合成在 5， 末端具有不同引物标签的 PCR引物制作不同 的 PCR标签引物， 这样不同的 PCR标签引物可以用于不同的样 本， 所述 PCR 引物是针对 HLA-A/B的 2， 3， 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物。其后通过 PCR反应在 PCR 产物两端引入引物标签，从而特异地标记了来 自不同样本的 PCR 产物。
以 95套 PCR标签引物来分别扩增 95份 DNA样本，每套 PCR 标签引物由一对双向引物标签（表 1 )和用于扩增 HLA-A/B的 2， 3, 4号外显子以及 HLA-DRB1 2号外显子的 PCR引物 （表 2 ) 组成， 其中每个正向 PCR引物的 5， 末端上连接一对引物标签的 正向引物标签， 而反向 PCR引物的 5' 末端上连接一对引物标签 的反向引物标签。引物标签在引物合成时直接 添加在 PCR引物的 5，末端。
把实施例 1的样本提取步骤中所得的 95份 DNA, 依次编号 1-95， PCR反应在 96孔板中进行，共 7板，编号分别为 HLA-P-A2、 HLA-P-A3, HLA-P-A4, HLA-P-B2、 HLA-P-B3, HLA-P-B4以 及 HLA-P-DRB1-2 ( A2/3/4, B2/B3/B4, DRB1-2 表示扩增的位 点） ， 板内设置一个不添加模板的阴性对照， 阴性对照所用引物 与模板 1的对应引物相同。 实验的同时， 记录下每对引物标签对 应的样本编号信息。
表 1， 引物标签的相关信息
sz PD 0DV0 DV10V13 8r-u
LZ £3 3V3VOVIVOXDI LZ-Ιά
91 ZD XV1019VI30I3 9Ζ-\ά sz ID IV0VXV3V30V3 XVI3XOX3VDV1 sr-u
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PP 8a V3IV10VXV0I3 DX0V013X3V0V Pf-ld
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S9 丄 ) 130丄 I3IDVIVOV3VX S9"Id 9 Λ P9-ld
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09 ΠΉ V013VD1V130X O VDIDIO:)丄 ) V 09-Id
6S na 0V0I03V0313V 6S"Id
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9S 83 3V9IV030VXVX fJV JD工 V工 VO丄 3 9S-Id
,a D03V3VXVD0VX SS-Id
PS 93 丄：) 3VI303I3V03V
l7C8lOOOlOiN3/X3d PI-79 TGTATCACGAGC ATGATCGTATAC G7 79
PI-80 TACTGCTATCTC CGCTGCATAGCG G8 80
PI-81 CGCGAGCTCGTC ACTCGATGAGCT G9 81
PI-82 TAGAGTCTGTAT TGTCTATCACAT G10 82
PI-83 TACTATCGCTCT TATGTGACATAC Gil 83
PI-84 TAGATGACGCTC TACTCGTAGCGC G12 84
PI-85 TCGCGTGACATC ATCTACTGACGT HI 85
PI-86 ACACGCTCTACT ACAGTAGCGCAC H2 86
PI-87 TACATAGTCTCG CTAGTATCATGA H3 87
PI-88 TGAGTAGCACGC TCGATCATGCAG H4 88
PI-89 TAGATGCTATAC TACATGCACTCA H5 89
PI-90 ATCGATGTCACG CAGCTCGACTAC H6 90
PI-91 ATCATATGTAGC CTCTACAGTCAC H7 91
PI-92 TAGCATCGATAT AGATAGCACATC H8 92
PI-93 TGATCGACGCTC CTAGATATCGTC H9 93
PI-94 TGCAGCTCATAG TACAGACTGCAC H10 94
PI-95 CGACGTAGAGTC CAGTAGCACTAC Hll 95 表 2, 未添加引物标签前用于扩增 HLA-A/B/DRB1相应外显 子的 PCR引物
A-F4 GTGTCCCATGACAGATGCAAAA 扩 HLA-A基因 4
430bp
A-R4 GGCCCTGACCCTGCTAAAGG 号外显子
B-F2 AGGAGCGAGGGGACCGCA 扩 HLA-B基因 2
400bp
B-R2 CGGGCCGGGGTCACTCAC 号外显子
B-F3 CGGGGCCAGGGTCTCACA 扩 HLA-B基因 3
370bp
B-R3 GAGGCCATCCCCGGCGAC 号外显子
B-F4 GCTGGTCACATGGGTGGTCCTA 扩 HLA-A基因 4
380bp
B-R4 CTCCTTACCCCATCTCAGGGTG 号外显子
D2-F1 CACGTTTCTTGGAGTACTCTA
D2-F2 GTTTCTTGTGGCAgCTTAAgTT
D2-F3 CCTGTGGCAGGGTAAGTATA
D2-F4 GTTTCTTGAAGCAGGATAAGTT 扩 HLA-DRB1基
300bp
D2-F5 GCACGTTTCTTGGAGGAGG 因 2号外显子
D2-F6 TTTCCTGTGGCAGCCTAAGA
D2-F7 GTTTCTTGGAGCAGGTTAAAC
D2-R CCTCACCTCGCCGCTGCAC
D2-F1, D2-F2, D2-F3, D2-F4, D2-F5, D2-F6, D2-F7为扩增 HLA-DRBl 2号外显子的正向引物， D2-R为扩增 HLA-DRB1 2号 外显子的反向引物。
HLA-A/B/DRB1 的 PCR程序如下：
96 2min
95 °C 30s 60 30s 72 "C 20s (32cycles)
∞ HLA-A/B的 PCR反应体系如下所有试剂均购自普洛麦格（北 生物技术有限公司 （Promega )
HLA-DRBl的 PCR反应体系如下:
其中 PI Ar A/B/D2-F 1/2/3/4/5/6/7 表示引物 5，末端带有第 n号正向引 物标签序列（表 1 )的 HLA-A/B/DRB1的 F引物， PI nr A/B/D2-R 2/3/4 表示引物 5，末端带有第 n号反向引物标签序列的 HLA-A/B/DRB1 的 R引物（此处 n < 95 ) ， 其它依次类推。 且每个样本对应特定的 一套 PCR引物 （ nr 删 -Έ聽 l4/sl6n , PI nr A/B/D2-R 2/3/4 ) 。
PCR反应在 Bio-Rad公司的 PTC-200 PCR仪上运行。 PCR完 成后， 取 2ul PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电泳检测。 图 2显示 了 1号样本 HLA-A/B/DRB1相应外显子 PCR产物电泳结果， DNA 分子标记为 DL 2000 ( Takara公司）， 胶图上有一系列片段大小为 300bp-500bp单一条带， 表明 1号样本的 HLA-A/B/DRB1各外显 子 （A2、 A3、 A4、 B2、 B3、 B4、 DRB1-2 ) PCR扩增成功， 阴性 对照 （N )无扩增条带。 其它样品的结果与此类似 实施例 3
PCR产物混合和纯化
从 96孔板 HLA-P-A2剩余的 PCR产物中 （阴性对照除外） 各取 20ul混合在一个 3ml的 EP管中， 标记为 HLA-A2-Mix， 对 其它 6个 96孔板进行同样的操作， 分别标记为 HLA-A3-Mix、 HLA-A4-Mix、 HLA-B2-Mix、 HLA-B3-Mix v HLA-B4-Mix 和 HLA-D2-Mix， 震荡混匀， 从 HLA-A2-Mix、 HLA-A3-Mix、 HLA-A4-Mix、 HLA-B2-Mix、 HLA-B3-Mix、 HLA-B4-Mix 和 HLA-D2-Mix中各取 200ul混合在一个 3ml的 EP管中， 标记为 HLA-Mix, 从 HLA-Mix中取 500ul DNA混合物经 Qiagen DNA Purification kit试剂盒（QIAGEN公司） 过柱纯化 （具体纯化步 骤详见说明书 ） ， 纯化所得的 200ul DNA , 经 Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司）测定 HLA-Mix DNA浓度为 48ng/ul. 实施例 4
PCR产物的打断， 以及 Illumina GA PCR-Free测序文库的 构建
1. DNA打断
从纯化后的 HLA-Mix中取总量 5ug的 DNA 用带 AFA纤维 扣盖的 Covaris 微管在 Covaris S2DNA打断仪 (Covaris公司）上 打断。 打断条件如下：
频率扫描 ( fre uency sweeping )
2. 打断后纯化
将 HLA-Mix的所有打断产物用 QIAquick PCR Purification Kit 回收纯化， 分别溶于 37.5ul 的 EB ( QIAGEN Elution Buffer ) 中；
3. 末端修复反应
对打断后纯化的 HLA-Mix进行 DNA末端修复反应， 体系如
多核苷酸激酶緩冲液（ 10x Polynucleotide Kinase Buffer( B904 ) ) 10
dNTP混合物 （每种 lOmM ) ( Solution Set ( lOmM each ) ) 4 μL
T4 DNA聚合酶（ T4 DNA Polymerase ) 5μ
Kleno 片段 ( Klenow Fragment )
T4多聚核苷酸激酶（ T4 Polynucleotide Kinase )
总体积 ( Total volume ) 100
反应条件为： 恒温混匀器 (Thermomixer, Eppendorf 公司）
20 温浴 30 min。
反应产物经 QIAquick PCR Purification Kit回收纯化， 溶于 34 μΐ的 EB ( QIAGEN Elution Buffer ) 中。
4. 3， 末端加 A反应
上一步回收 DNA的 3， 末端加 A反应， 体系如下 （试剂均 购自 Enzymatics公司 ) ：
上一步所得 DNA 32
10x 蓝色緩沖液（ 10x blue buffer ) 5 μL·
dATP(lmM, GE公司） 10
Klenow (3'-5' exo-) 3
总体积 ( Total volume ) 50
反应条件为： 恒温混匀器（Thermomixer， Eppendorf 公 司） 37 温浴 30 min。
反应产物经 MiniElute PCR Purification Kit( QIAGEN公司） 回收纯化， 溶于 13 μΐ的 EB溶液（ QIAGEN Elution Buffer ) 中。
5. 连接 Illumina GA PCR-Free文库接头 （adapter ) 术语 "PCR-Free文库接头 （adapter ) " 是指经设计的一段 碱基， 其主要作用是辅助固定 DNA分子在测序芯片上以及提供 通用测序引物的结合位点， PCR-Free文库接头可以通过 DNA连 接酶将其直接连接至测序文库中的 DNA 片段两端， 文库接头的 导入过程因为没有 PCR的参与， 因此称作 PCR-Free文库接头。
加 A后的产物连接 Illumina GA PCR-Free文库接头， 体系 如下 （试剂均购自 Illumina公司） ：
上一步所得 DNA Ιΐμί
2x 快速连接緩沖液 ( 2x Rapid ligation buffer )
PCR-free寡核苷酸接头混合物 (30mM) ( PCR-free Adapter Ιμί
oligo mix )
T4 DNA连接酶 ( T4 DNA Ligase ) (Rapid, L603-HC-L) 3μΙ 总体积 ( Total volume ) 30
反应条件为： 恒温混匀器（Thermomixer， Eppendorf 公 司） 20X温浴 15 min。
反应产物经 Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)纯化 后溶于 50ul去离子水， 经荧光定量 PCR ( QPCR )检测到 DNA 浓度结果如下：
6. 割胶回收
取 3(^L HLA-Mix用 2%低熔点琼脂糖胶进行回收。电泳条件 为 100V， 100min。DNA marker为 NEB公司的 50bp DNA marker。 割胶回收 450-750bp长度范围的 DNA片段（附图 3 ) 。 胶回收产 物经 QIAquick PCR Purification Kit ( QIAGE 公司）回收纯化， 纯化后体积为 32ul， 经荧光定量 PCR ( QPCR )检测到 DNA浓 度结果为 10.16nM。 实施例 5
Illumina GA测序
根据 QPCR 检测结果， 取 lOpmol DNA 用 Illumina GA PE-100程序测序， 具体操作流程详见 Illumina GA操作说明书 ( Illumina GA Π x ) 。 实施例 6
结果分析
Illumina GA产出的测序结果是一系列 DNA序列，通过查找 测序结果中的正反引物标签序列和引物序列， 建立各个引物标签 对应样本 HLA-A/B/DRB1 各外显子 PCR产物测序结果的数据 库。 通过 BWA(Burrows-Wheeler Aligner)把各外显子的测序结果 定位在相应外显子的参考序列上 （ 参考序列来源： http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/ ) 同时， 构建各个数据库的一致性
( consensus )序列， 再对数据库中 DNA序列进行筛选和测序错 误校正。 校正后的 DNA 序列通过序列重叠 （overlap ) 和连锁
( Pair-End连锁） 关系可组装成 HLA-A/B/DRB1 各外显子相应 的序列。 所得 DNA 序列利用与 IMGT HLA 专业数据库中 HLA-A/B/DRB1 相应各外显子的序列数据库比对，序列比对结 果 100%匹配的即为对应样本的 HLA-A/B/DRB1基因型别。 可参考 图 4示例说明的 1号样品的 HLA-A位点的 2号外显子一致性序 列构建程序的截图。 所有 95 个样本， 得到的分型结果与原已知分型结果完全相 ， 其中 1-32号样本的具体结果如下：
样本编号 原 HLA-A/B/DRB1型别
Α*02:03 A*ll:01 38:02 B' *48:01 DRB1' "=14:54 DRB1*15:01
2 Α*01:01 Α*30:01 B J ¾ 08:01 B*13:02 DRB1' ¾ 03:01 DRB1*07:01
3. Α*01:01 Α*02:01 B J 45:11 B*47:01 DRB1*13:02 DRB1*15:01
4 Α*24:08 Α*26:01 k 40:01 B' k 51:01 DRB1' "04:04 DRB1*09:01
5 Α*01:01 Α*24:02 B J fe 54:01 B' "55:02 DRB1' "04:05 DRB1*09:01
6 Α*01:01 Α*03:02 fe 15:ll B' ^37:01 DRB1' "=10:01 DRB1*14:54
7 Α*11:01 Α*30:01 43:02 B' "15:18 DRB1' "=04:04 DRB1*07:01
8 Α*01:01 Α*02:01 "35:03 B' "81:01 DRB1' "11:01 DRB1*15:01
9 Α*02:06 Α*31:01 k 27:07 B' "40:02 DRB1' "03:01 DRB1*13:02
10 Α*01:01 Α*66:01 k 37:01 B' "49:01 DRB1' fe 10:01 DRB1*13:02
11 Α*01:01 Α*03:01 35:01 B ! k 52:0l DRB1' ¾ 01:01 DRB1*15:02
12 Α*11:01 Α*11:01 45:01 B*15:05 DRB1' "04:06 DRB1*15:01
13 Α*01:01 Α*11:02 Β*07:02 B*15:02 DRB1' "09:01 DRB1*15:01
14 Α*01:01 Α*02:01 k 52:01 B' "67:01 DRB1' "15:02 DRB1*16:02
15 Α*01:01 Α*02:05 Β*15:17 B' fc 50:01 DRB1' "=07:01 DRB1*15:01
16 Α*01:01 Α*11:01 Β*37:01 B' 0:02 DRB1' k 10:01 DRB1*12:02
17 Α*24:07 Α*32:01 Β*35:05 B*40:01 DRB1' "03:01 DRB1*04:05
18 Α*11:01 Α*24:02 k 13:01 B' "35:01 DRB1*16:02 DRB1*16:02
19 Α*11:01 Α*11:01 "40:02 B*55:12 DRB1' k 04:05 DRB1*15:01
20 Α*02:11 Α*24:02 k 40:01 B' 0:06 DRB1*11:01 DRB1*15:01
21 Α*01:01 Α*02:06 k 51:01 B' 7:01 DRB1*07:01 DRB1*12:01
22 Α*01:01 Α*29:01 k 07:05 B' "15:01 DRB1' k 04:05 DRB1*07:01
23 Α*01:01 Α*02:07 ^37:01 B' fe 46:01 DRB1' k 04:03 DRB1*10:01
24 Α*24:85 Α*30:01 Β ν 43:02 B' "55:02 DRB1' fe 07:01 DRB1*15:01
25 Α*11:01 Α*31:01 ^07:06 B' "51:01 DRB1' "12:02 DRB1*14:05
26 Α*01:01 Α*11:01 k 46:01 B' "57:01 DRB1' ¾ 07:01 DRB1*08:03
27 Α*01:01 Α*02:01 45:18 B*37:01 DRB1' ¾ 04:01 DRB1*15:01
28 Α*01:01 Α*24:02 Β*37:01 B' "46:01 DRB1' k 09:01 DRB1*10:01
29 Α*26:01 Α*66:01 Β ν k 40:40 B' ¾ 41:02 DRB1' ni:0l DRB1*1S:01
30 Α*02:01 Α*29:02 43:02 B' "45:01 DRB1' "03:01 DRB1*12:02
31 Α*01:01 Α*11:03 Β ν 5:01 B' "57:01 DRB1' fe 07:01 DRB1*15:01
32 Α*11:01 Α*26:01 Β*35:03 B' "38:01 DRB1' "11:03 DRB1*14:04 样本编号 测得的 HLA-A/B/DRB1型别
1 A*02:03 A*ll:01 B*38:02 B*48:01 DRB1*14:54 DRB1*15:01 2 A*01 01 A*30:01 B*08:01 B*13:02 DRB1*03:01 DRB1*07:01
3 A*01 01 A*02:01 B*15:ll B*47:01 DRB1*13:02 DRB1*15:01
4 A*24 08 A*26:01 B*40:01 B*51:01 DRB1*04:04 DRB1*09:01
5 A*01 01 A*24:02 B*54:01 B*55:02 DRB1*04:05 DRB1*09:01
6 A*01 01 A*03:02 B*15:ll B*37:01 DRB1*10:01 DRB1*14:54
7 A*ll 01 A*30:01 B*13:02 B*15:18 DRB1*04:04 DRB1*07:01
8 A*01 01 A*02:01 B*35:03 B*81:01 DRB1*11:01 DRB1*15:01
9 A*02 06 A*31:01 B*27:07 B*40:02 DRB1*03:01 DRB1*13:02
10 A*01 01 A*66:01 B*37:01 B*49:01 DRB1*10:01 DRB1*13:02
11 A*01 01 A*03:01 B*35:01 B*52:01 DRB1*01:01 DRB1*15:02
12 A*ll 01 A*ll:01 B*15:01 B*15:05 DRB1*04:06 DRB1*15:01
13 A*01 01 A*ll:02 B*07:02 B*15:02 DRB1*09:01 DRB1*15:01
14 A*01 01 A*02:01 B*52:01 B*67:01 DRB1*15:02 DRB1*16:02
15 A*01 01 A*02:05 B*15:17 B*50:01 DRB1*07:01 DRB1*15:01
16 A*01 01 A*ll:01 B*37:01 B*40:02 DRB1*10:01 DRB1*12:02
17 A*24 07 A*32:01 B*35:05 B*40:01 DRB1*03:01 DRB1*04:05
18 A*ll 01 A*24:02 B*13:01 B*35:01 DRB1*16:02 DRB1*16:02
19 A*ll 01 A* 11 :01 B*40:02 B*55:12 DRB1*04:05 DRB1*15:01
20 A*02 11 A*24:02 B*40:01 B*40:06 DRB1*11:01 DRB1*15:01
21 A*01 01 A*02:06 B*51:01 B*57:01 DRB1*07:01 DRB1*12:01
22 A*01 01 A*29:01 B*07:05 B*15:01 DRB1*04:05 DRB1*07:01
23 A*01 01 A*02:07 B*37:01 B 6.01 DRB1*04:03 DRB1*10:01
24 A*24 85 A*30:01 B* 13:02 B*55:02 DRB1*07:01 DRB1*15:01
25 A*ll 01 A*31:01 B*07:06 B*51:01 DRB1*12:02 DRB1*14:05
26 A*01 01 A*ll:01 B*46:01 B*57:01 DRB1*07:01 DRB1*08:03
27 A*01 01 A*02:01 B*15:18 B*37:01 DRB1*04:01 DRB1*15:01
28 A*01 01 A*24:02 B*37:01 B*46:01 DRB1*09:01 DRB1*10:01
29 A*26 01 A*66:01 B*40:40 B*41:02 DRB1*12:01 DRB1*15:01
30 A*02 01 A*29:02 B*13:02 B*45:01 DRB1*03:01 DRB1*12:02
31 A*01 01 A*ll:03 B*15:01 B*57:01 DRB1*07:01 DRB1*15:01
32 A*ll 01 A*26:01 B*35:03 B*38:01 DRB1*11:03 DRB1*14:04 注 ： HLA-DRBl 型 别 中 的 DRB1*1201 不 排 除 DRB1*1206/1210/1217的可能性， DRB1*1454不排除 DRB1*1401 的可能性， 因为上述等位基因在 HLA-DRBl 2号外显子的序列完 全相同。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述， 本领域技 术人员将会理解。 根据已经公开的所有教导， 可以对那些细节进 行各种修改和替换， 这些改变均在本发明的保护范围之内。 本发 明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物 给出。 参考文献
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