ACEITE ESENCIAL DE Eucalyptus globulus.

SECTOR TECNICO

La tecnología que se describe está destinada al sector salud y cosmético, corresponde a una formulación innovadora con efecto pediculicida a base de extractos de origen vegetal, inocuo y con bajo riesgo de generar resistencia por parte del parásito, que contribuye a optimizar el tratamiento de la Pediculosis capitis. TECNICA ANTERIOR

La Pediculosis capitis es un problema de salud pública cosmopolita que ha afectado a la humanidad a lo largo de toda su historia. Ha tenido una alta prevalencia en las últimas décadas siendo una de las enfermedades parasitarias más frecuentes en la infancia. En Chile actualmente afecta más del 15% de la población general y más del 30% de la población infantil, principalmente en ambientes escolares.

El agente etiológico el Pediculus capitis humanus es un insecto que vive sobre el cuero cabelludo y cabellos del ser humano. Su ciclo reproductivo es complejo lo que aumenta la dificultad para erradicarlo. Los efectos colaterales como escoriaciones dérmicas como consecuencia del rascado y su posterior infección, hacen de esta patología un cuadro multifactorial.

En el ámbito económico tiene alto impacto, debido a los costos relativamente elevados que se deben gastar para su tratamiento, y a lo cual se debe añadir los gastos ocasionados por lavado doméstico y/o lavandería comercial, además del tiempo que debe emplearse para esto. Desde el punto de vista emocional la familia se conmociona al tener la creencia que los piojos de la cabeza son el producto de tener una vivienda sucia. Por otra parte, los escolares son muchas veces enviados a sus hogares, y no se les permite el regreso a clases hasta que no se les desparasite, lo que es causa de vergüenza para sus representantes y muchas veces reciben el rechazo social de amigos y vecinos. Así mismo, se asociaron los piojos de la cabeza con ansiedad y miedo (Cazorla etal. 2007).

La presencia del parásito es constante durante el año y se observa un incremento durante el primer mes de inicio del período escolar. Su aparición no involucra necesariamente malos hábitos higiénicos, de hecho el insecto prefiere los cabellos limpios para vivir (¿Problemas con los piojos? Boletín informativo). Es más frecuente en zonas urbanas o suburbanas, de preferencia aquellas sobrepoblados. La relación de infección hombre/mujer es de 1:2.

Hoy en día se estima que existe un aumento en la prevalencia de la Pediculosis capitisa nivel mundial, producto de la falta de eficacia de los actuales pediculicidas, así como también, el aumento de la resistencia hacia los productos actualmente disponibles.

Los insecticidas utilizados en Chile para el tratamiento de la pediculosis incluyen algunos piretroides y piretrinas, como la permetrina y la decametrina. También el crotamitón y el tiabendazol, aunque éstos se utilizan mayormente como escabicidas, en sarna. En algunos países es frecuente la rotación periódica de los fármacos para el tratamiento de la P. capitis con el fin de reducir la aparición de resistencia. Este problema se ha observado tanto con los piretroides nuevos como con insecticidas más antiguos como el lindano, aunque la efectividad de estas políticas de rotación es discutible.

El lindano (Gamma hexacloruro de benceno), se usa contra P. capitis en solución al 1%, aplicándose en forma tópica, durante 6 a 24 horas, debiendo repetirse a la semana, pues carece de actividad ovicida. Su uso tópico puede provocar reacciones de hipersensibilidad local y en casos agudos e importantes involucra compromiso del Sistema Nervioso Central. Se absorbe en aproximadamente un 10%, pasando a la circulación sanguínea, donde su vida media es de 24 horas; su eliminación es predominantemente renal. En niños pequeños la absorción es mayor. El rango de toxicidad en adultos, corresponde a 28 g que puede ser letal, pero se ha descrito que ingestiones de 45 mg pueden ya causar cierto compromiso sistémico; en niños bajo 4 años de edad, dosis de 5 mi al 1% pueden causar depresión respiratoria.

En Chile, vistos los antecedentes del D.S. N° 54 de 2009 del Ministerio de Salud, por medio del cual se prohibe el empleo de lindano o de hexaclorociclohexano en plaguicidas de uso sanitario y doméstico y en fármacos, y considerando que el uso de lindano en productos farmacéuticos podría producir un cuadro tóxico, afectando la salud de quien lo utiliza, se resolvió cancelar el Registro Sanitario a los productos farmacéuticos que contengan este principio activo, con fecha 05.03.2012. (Bll/Ref: 3385/11 - Resolución exenta 601). Dentro de los derivados piretroides podemos destacar a la decametrina 0,2%, la que generalmente se utilizan en dos aplicaciones, con un intervalo de 7 días entre cada una. Se han descrito numerosos casos de sensibilización y dermatitis de contacto, asociadas a escoriaciones. También numerosos casos de resistencia. La permetrina (Piretroide sintético) tienen efecto neurotoxico para P. humanus, Pthirus pubis y Sarcoptes scabiei. Se utiliza en solución al 1 a 3%. Su actividad pediculicida continúa durante 10 a 14 días, lo que permitiría emplear una dosis única; sin embargo, la experiencia muestra mejores resultados luego de aplicar una segunda dosis a los 7 días del tratamiento inicial, e incluso actualmente se sugiere un esquema con tres aplicaciones durante una semana, espaciadas cada dos días, por la resistencia del parásito a este y a otros piretroides. Las piretrinas (0,02-5%), son sustancias de uso tópico extraídas desde los crisantemos, que se presentan como shampoo. Por carecer de actividad ovicida, debe repetirse su aplicación 7 días después. Parecen ser tanto o más efectivas que el lindano, aunque han aparecido numerosos casos de resistencia. Se han presentado reacciones alérgicas en pacientes sensibles, incluso reacciones alérgicas sistémicas. Su inhalación puede provocar una reacción de hipersensibilidad sobre las vías aéreas. La ingestión de las piretrinas puede producir fatiga, cefalea, anorexia, náuseas y vómitos. La ingestión masiva (200-500 mL) de fórmulas concentradas, podría llevar rápidamente al coma. Se han descrito efectos cardiovasculares, neurológicos e inmunológicos. El crotamitón (N-etil-0- crotonotoluidido)

Es un pediculicida y escabicida de uso tópico, se expende en crema o loción al 10% que también contiene sulfato de oxiquinolina, los preparados generalmente tienen propiedades antipruriginosas. El principal efecto adverso de su uso es una dermatitis de contacto, especialmente en piel previamente inflamada, o cuando es aplicado por tiempo muy prolongado, no hay estudios concluyentes respecto a su absorción percutánea. Su ingestión podría causar somnolencia, náuseas, vómitos, hipotensión, compromiso general e incluso, coma con hiperreflexia. El tiabendazol proviene de compuestos sustituidos del benzoimidazol, algunos de los cuales manifiestan actividad larvicida total in vitro, lo que sumado a la ausencia de actividad contra otros microorganismos y a su relativa baja toxicidad para los mamíferos, hace recomendable su uso contra algunas parasitosis como la larva migrante cutánea o la triquinosis. Puede aplicarse sobre la piel en suspensión al 10% para el tratamiento de escabiosis o pediculosis, aunque no hay estudios que avalen su eficacia. Tiabendazol es absorbido en forma percutánea, siendo eliminado, con una vida media de 70 minutos.

Además se han desarrollado nuevos pediculicidas como el Levamisol que es un agonista de los receptores nicotínicos para acetilcolina, el cual es rápida y casi completamente absorbido desde el tracto gastrointestinal. Es muy efectivo para erradicar Áscaris y Tricostrongilus. Un estudio realizado por Namazi, (2001), demostró efectividad del fármaco en el tratamiento de la pediculosis. Lamentablemente su efectividad es baja (19%), la que puede deberse a resistencia del parásito al fármaco, debido al amplio uso de éste en el tratamiento de parasitosis intestinales en el área de estudio, donde muchos niños presentaban tanto parásitos intestinales como también piojos.

Las Lactonas alifáticas se encuentran en muchas frutas, jugando un importante rol en su sabor. Toloza et al., (2006), evaluaron la actividad fumigante y repelente de tres lactonas alifáticas, contra Pediculus humanus capitis resistentes a permetrina, en un estudio realizado en Argentina. En sus resultados, no encontraron actividad fumigante en las lactonas alifáticas, pero sí actividad repelente significativa con la σ- dodelactona.

Se han estudiado varios aceites esenciales derivados de plantas con un fin pediculicida, los cuales han sido utilizados ampliamente en medicina tradicional para la erradicación de los piojos. Estos aceites están compuestos por numerosos terpenos, muy volátiles, de bajo peso molecular. Yang et al., (2005), estudiaron el efecto pediculicida del Cinnamonum zeylanicum (canela), encontrando alguna actividad pediculicida, sin embargo los autores concluyeron que se necesitan más estudios en cuanto a la inocuidad de su utilización en humanos, y también en cuanto a formulaciones farmacéuticas que mejoren la efectividad de los compuestos y su estabilidad, reduciendo así los costos.

Otros estudios se han enfocado en la actividad pediculicida de aceite esencial de Eucaliptus. Toloza et al., (2010), concluyeron que varios aceites esenciales de eucaliptus presentaban fuerte actividad fumigadora contra piojos resistentes a permetrina. Yang et al., (2004), identificaron que los compuestos pediculicidas presentes en el aceite esencial de hojas de Eucaluyptus globulus, tales como 1,8- cineol, (-) α-pineno, 2-a-pineno, (£)-pinocarveol, Afelandreno, α-terpineno, y 1-a- terpineol fueron tan efectivos como el δ-fenotrina o el piretro, dos pediculicidas usados comúnmente. Otro aceite esencial estudiado como pediculicida ha sido el obtenido de ~- " *- a*w■ ^w / U U U V ^{1 1}

Eugenia caryophyllata (hierba del clavo), siendo uno de sus compuestos principales el eugenol. En este estudio se observó una eficacia del aceite esencial comparable a la de los productos comerciales en base a α-fenotrina y piretro, sin embargo, se observó una eficacia significativamente menor que los piretroides. También el aceite esencial de orégano ha sido fruto de estudio. Yang et al., (2009), estudiaron la actividad pediculicida de aceites esenciales provenientes de Origanum majorana (orégano) sobre Pediculus humanus capitis resistentes a piretroides y a malatión. Sus resultados indican que algunos de los componentes de este aceite esencial son tan efectivos como los pediculicidas comerciales a base de α-fenotrina y piretro, algunos con mayor rapidez de acción que éstos, y otros tuvieron menor o nula actividad pediculicida.

En general, en todos los estudios realizados con aceites esenciales provenientes de plantas los autores sugieren mayores análisis relacionados con la inocuidad del producto en seres humanos, y con mejorar su eficacia pediculicida y estabilidad de la formulación.

Heukelbach et al., (2006), evaluaron la eficacia de un champú pediculicida comercial en base a extractos de Azadirachta indica (árbol de Neem), mediante estudios in vitro. La muerte de la totalidad de los parásitos ocurrió después de tres horas de la inmersión de los parásitos en el champú.

La dimeticona provoca la muerte del parásito por un mecanismo físico, interrumpiendo la entrada de oxígeno al insecto, en general, y siendo una buena alternativa a los pediculicidas clásicos, los buenos resultados observados se produjeron utilizando altas concentraciones de dimeticona o cuando se aplica a individuos con infestación moderada.

Hoy en día las formulaciones comercializadas en Chile, poseen los activos que han demostrado ser parcialmente eficaces en el tratamiento de la pediculosis, y que han desarrollado resistencia de los parásitos a su actividad farmacológica. Estos activos, se encuentran incorporados en formulaciones tipo loción con enjuague, crema lavable y champús. Además se utilizan ácidos orgánicos como coadyuvantes a tratamientos convencionales para favorecer el efecto anti adherencia de estados jóvenes del parásito.

La siguiente tabla muestra los principales agentes utilizados en el tratamiento del Pediculus humanus en nuestro país y su actual situación clínica. Tabla N°l: Principales agentes utilizados en el tratamiento del Pediculus humanus en Chile y su actual situación clínica.

MODO DE

PRODUCTO CATEGORIA TOXICIDAD COMENTARIOS USO

Decametrina

Dos

Loción 20% Hipersensibilidad

Pediculicida aplicaciones, Desarrollo de (Derivado local.

Larvicida repetir a la resistencia Piretroide) Neurotóxico

semana

Permetrina

Loción y Shampoo Desarrollo de

Tres Hipersensibilidad

1-3% Pediculicida resistencia.

aplicaciones en local.

(Derivado Larvicida Más efectivo que el una semana. Neurotóxico

Piretroide) lindano

Piretrina

Shampoo 0,02-5%

(Butóxido de Hipersensibilidad

Una aplicación,

piperonilo, Pediculicida local y sistémica. Desarrollo de repetir a la

asociación) Larvicida Neurotóxico resistencia semana.

(Derivado

Piretroide)

Crotamitón Pediculicida

Loción 10% Larvicida Una aplicación, Hipersensibilidad

Desarrollo de (Sulfato de (Coadyuvante) repetir a la local y sistémica.

resistencia oxiquinolina, (Mayor uso en semana. Neurotóxico

asociación) sarna)

Siguen la

aplicación de

Ácidos Orgánicos Coadyuvante

pediculicida a No descritos

(Vinagres)

que

acompañen.

La aparición de resistencia del parásito a los pediculicidas convencionales en uso actualmente es un problema de gran preocupación a nivel mundial. Los costos de esta patología son económicos y sociales; las fallas en el diagnóstico y el uso incorrecto de los medicamentos pediculicidas han contribuido a disminuir la eficacia de estos productos. En este contexto se considera de urgencia la obtención de nuevas alternativas pediculicidas más efectivas y seguras introduciendo mejores opciones de tratamiento.

Si bien la pediculosis humana es una condición muy común a nivel mundial, pocos grupos de investigadores han experimentado alternativas a su tratamiento. Existen antecedentes que indican actividad pediculicida de compuestos volátiles de naturaleza terpénica y fenólica, usualmente concentrados en plantas aromáticas introducidas, pero que se encuentran dentro de productos de amplia distribución y comercialización nacional por su uso como especias. Estos extractos han mostrado una acción comparable a grandes pediculicidas como el lindano, permetrinas y con acción larvicida, pero con baja toxicidad vislumbrándose como tratamientos alternativos frente a parásitos que han adquirido resistencia frente a fármacos convencionales.

Algunos artículos mencionan fallas en el diagnóstico, falta de apego al tratamiento y/o mala utilización de los medicamentos y sobredosis-sobreexposición como posibles causas de aparición de resistencia a los piretroides, piretrinas y lindano.

Por otra parte, se han estudiado varios aceites esenciales derivados de plantas con un fin pediculicida, los que se han usado ampliamente en medicina tradicional para la erradicación de los parásitos. Algunos estudios (Priestly et al., 2006), han descrito que los compuestos mono-oxigenados que poseen estructuras con un alcohol simple, o grupos funcionales cetona o fenoles, han sido los más activos como pediculicidas. Los terpenos no oxigenados fueron inactivos en los estudios realizados. También se describen que algunos compuestos presentaban buena actividad ovicida, pero ninguna actividad pediculicida; y, al revés, otros compuestos presentaban sólo actividad pediculicida.

Yang et al., (2005), estudiaron el efecto pediculicida de la canela, encontrando alguna actividad pediculicida, sin embargo los autores concluyeron que se necesitan más estudios en cuanto a la inocuidad de su utilización en humanos, y también en cuanto a formulaciones farmacéuticas que mejoren la efectividad de los compuestos y su estabilidad, reduciendo así los costos. Otros estudios se han enfocado en la actividad pediculicida de aceite esencial de eucaliptus, Toloza et al., (2010), concluyeron que varios aceites esenciales de eucaliptus presentaban fuerte actividad fumigadora contra parásitos resistentes a permetrina. Yang et al., (2004), identificaron que los compuestos pediculicidas presentes en el aceite esencial de hojas de Eucalyptus globulus, tales como 1,8-cineol, (-) α-pineno, 2-a-pineno, (E)-pinocarveol, I- felandreno, α-terpineno, y 1-a-terpineol fueron tan efectivos como el δ-fenotrina o el piretro, dos pediculicidas usados comúnmente.

Otro aceite esencial estudiado como pediculicida ha sido el obtenido de la hierba del clavo, siendo uno de sus compuestos principales el eugenol, en un estudio se observó una eficacia del aceite esencial comparable a la de los productos comerciales en base a α-fenotrina y piretro, sin embargo, se observó una eficacia significativamente menor que los piretroides. También el aceite esencial de orégano ha sido fruto de estudio, Yang et al., (2009), estudiaron la actividad pediculicida de este aceite esencial sobre P. humanus capitis resistentes a piretroides y a malatión. Sus resultados indican que algunos de los componentes de este aceite esencial son tan efectivos como los pediculicidas comerciales a base de α-fenotrina y piretro, algunos con mayor rapidez de acción que éstos, y otros tuvieron menor o nula actividad pediculicida.

En general, en todos los estudios realizados con aceites esenciales provenientes de plantas, los autores sugieren mayores análisis relacionados con la inocuidad del producto en seres humanos, y con mejorar su eficacia pediculicida y estabilidad de la formulación. El mecanismo de acción que poseen los aceites esenciales está dado por los terpenos, y otros componentes que cumplen un rol antimicrobiano e insecticida fundamental dada su naturaleza lipofílica. Es así como estos componentes, han mostrado interacción con barreras lipídicas de microorganismos desestabilizando la integridad de las membranas y otras estructuras ricas en moléculas de lipopolisacáridos y asociadas a enzimas las cuales son capaces de romper las moléculas introducidas desde el exterior. Se ha propuesto la formación espontánea de complejos entre moléculas terpenoides y colesterol de membrana, por ejemplo, lo que causaría un incremento en la permeabilidad de la membrana permitiendo la circulación de iones y macromoléculas entre proteínas. Como consecuencia se extraerían esteróles a través de vesículas y la muerte por falla funcional en el organismo invasor.

El desarrollo de nuevas formulaciones para el tratamiento de la pediculosis es un desafío importante para el control de poblaciones resistentes de Pedicufus humanus capitis a los pediculicidas convencionales. Se requiere de formulaciones eficaces, estables, con óptima biodisponibilidad, buena tolerancia dérmica y libre de efectos tóxicos. Las formulaciones utilizadas como vehículos de los agentes pediculicidas deben cumplir con una serie de características; i) deben facilitar una aplicación cómoda sencilla y agradable; ii) deben permitir que el principio activo actúe sin interferencia y dilate su permanencia sobre la zona a tratar; iii) debe ser capaz de conferir al cabello un efecto protector y acondicionador, no irritante, ni agresivo; iv) sus propiedades organolépticas no deben crear en el usuario del producto una sensación de rechazo. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Cromatograma aceite esencial eucaliptos.

Figura 2: Actividad pediculicida ¡n vitro, de los diferentes aceites esenciales.

Figura 3: Toxicidad en fase vapor del producto final.

Figura 4: Toxicidad sobre pedículos por inmersión del producto final

DIVULGACION DE LA INVENCIÓN

La presente tecnología corresponde a una formulación innovadora con efecto pediculicida a base de extractos de origen vegetal, inocuo y con bajo riesgo de generar resistencia por parte del parásito, que contribuye a optimizar el tratamiento de la Pediculosis capitis.

El producto es efectivo sobre el P. humanus capitis,, presenta actividad ovicida, y sobre la adherencia del huevo de P. humanus, corto tiempo de muerte estimado, nula toxicidad, imposibilidad del parásito de adquirir resistencia, amplia distribución de la materia prima, producto orgánico cuyo procesamiento es amigable con el medio ambiente, aspectos distintivos a los productos actualmente en el comercio.

Esta formulación ha mostrado una acción superior a pediculicidas conocidos como el lindano, permetrinas, además presenta acción larvicida, pero con baja toxicidad proponiéndose como tratamientos alternativos frente a parásitos que han adquirido resistencia frente a fármacos convencionales.

Esta formulación corresponde a una loción hidroalcohólica que contiene aceite esencial de Eucalyptus globulus. La composición de la loción está descrita en la tabla 2:

Tabla 2: Composición loción.

Materia prima Concentración (%v/v)

Etanol 96° 20 - 35 %

Isopropanol 20 - 35 %

Aceite esencial de

1 - 10%

Eucalyptus globulus

Opcionalmente

35 - 45 %

Miristato de Isopropilo

Agua destilada c. s. Donde el etanol es el solvente de la formulación, el ¡sopropanol es el vehículo, el compuesto activo es el Aceite esencial de Eucalyptus globulus, el miristato de isopropilo es utilizado como emoliente, y se completa con agua destilada en cantidad suficiente. La loción que contiene miristato de isopropilo presenta un aspecto tipo emulsión w/o.

La formulación al estar presentada en forma de loción permite una fácil y eficiente extensión en zonas de alta densidad capilar. Son formas farmacéuticas líquidas que permiten que el tiempo de contacto entre el preparado pediculicida y el parásito, sea más prolongado que el que ofrece otras formas de aplicación. Permiten por lo tanto, una mayor penetración, una mayor actividad residual, confiriendo un poder ovicida a la formulación, mayor que las cremas. Estas características hacen que las lociones sean consideradas las formas de elección en el tratamiento de estas parasitosis.

Algunos elementos diferenciadores con respecto a soluciones cercanas del nuevo producto:

- Presenta una actividad ovicida 100% superior a los productos actuales,

- Actividad 100% efectiva sobre la adherencia del huevo,

- Imposibilidad del parásito de adquirir resistencia,

- Corto tiempo de muerte estimado (1-3 minutos),

- Toxicidad cercana a 0.

El aceite esencial de eucaliptus utilizado en la formulación es obtenido a partir de materia prima recolectada de faenas forestales, lo que implica un bajo costo debido a que las hojas son consideradas como residuos. El proceso de extracción consiste básicamente en hidrodestilación, pero también puede considerarse la utilización de fluidos supercríticos de C0 ₂ , para la extracción.

La formulación cumple con los controles de rutina y mantienen sus características físico-organolépticas y la concentración del marcador químico elegido se mantiene al menos durante los 180 días de estudio

Esta formulación provoca en individuos adultos y jóvenes, un tiempo de muerte que varía entre 1 a 2 minutos, versus el pediculicida Launol® (control), el cual atenuaba las reacciones de los parásitos manteniéndolos inmóviles por 10 minutos, luego de los cuales se reanimaban. Debido a su mecanismo de acción frente a Pediculosis capitis, esta formulación también permite su utilización en otras ectoparasitosis como:

- Pediculosis por Pediculus humanus vestimentis (piojo de ropa)

- Pediculosis pubis por Phthirus pubis (ladilla)

- Escabiosis por Sarcoptes scabiei (sarna)

- Infestación por Ixodoideos como la súper familia Lxodidae (garrapata dura).

Además se puede utilizar como repelente de mosquitos. EJEMPLOS DE APLICACIÓN

Ejemplo 1: Obtención y caracterización de aceite esencial.

La obtención de aceite esencial de Eucalyptus globulus se realizó a través de hidrodestilación en aparato Clavenger. Se sumergieron aproximadamente 800 gramos de hojas y partes aéreas de las plantas frescas en 5 litros agua, dentro de un balón, durante al menos 12 horas. Luego se llevó a ebullición por 90 minutos, gracias a un manto calefactor que se encontraba en contacto directo con el balón. El aceite esencial obtenido se secó con sulfato de sodio anhidro y se almacenó refrigerado a 4°C en un recipiente ámbar, previamente rotulado, hasta el momento de su utilización. El rendimiento se determinó como mi de aceite esencial obtenido por cada 100 gramos de planta utilizada.

Con el fin de caracterizar el extracto se disolvió 15 pL de aceite esencial en 10 mi de etanol absoluto, para ser analizados mediante cromatografía de gas con las siguientes condiciones:

• Cromatógrafo de Gas Clarus 500, Perkin Elmer.

• Temperatura inyector: 260°C

• Temperatura columna: gradiente 80 - 130 °C

• Temperatura detector: 240 °C

· Columna: Fenilmetilsilicona, 30 m x 0,53 mm x 1,0 μιτι

• Detector: Ionización de llama (FID)

En el análisis cromatográfico se obtuvo un perfil con la aparición de 4-5 compuestos principales (Figura 1, Tabla 3). Tabla 3: Compuestos identificados en el aceite esencial de eucaliptus y su porcentaje.

Compuesto Porcentaje

a-pineno 0,05-10,0,

β-pineno 0,05-1,5

Sabineno máximo 0,3

a-fellandreno 0,05-1,5

Limoneno 0,05-15,0

1,8 cineol mínimo 70,0

Alcanfor máximo 0,1

Ejemplo 2: Bioensayos y Estudios de Toxicidad in vitro de los aceites esenciales.

Con el fin de comprobar la eficacia del extracto activos frente al Pediculus humanus se realizaron ensayos in vitro, de Eucaliptus globulus (eucaliptus), Lavandula angustifolia (lavanda), Rosmarinus offícinalis (romero), Origanum vulgare (orégano). Un promedio de 4 parásitos en sus formas adultas y jóvenes se depositaron en cápsulas Petri de vidrio con cabello humano desde el lugar de recolección. Se expusieron a distintas diluciones de algunos extractos en mezclas alcohol agua. La mortalidad de los parásitos se evaluó cada minuto hasta observar cambios durante una hora. Los adultos se consideraron muertos cuando sus apéndices dejaron de moverse estimulados con una tórula o pérdida del reflejo de enderezamiento. Como sustancia control se usó Launol®.

La tabla 4 muestra la actividad de diferentes aceites esenciales frente a los parásitos y el tiempo de muerte que provocaron en individuos adultos en distintas diluciones. Los mejores resultados, tiempo de muerte (1 y 2 minutos), se observan con Eucaliptus globulus y Lavandula angustifolia en concentraciones de 3 a 5% para eucaliptus y 4 a 10% para lavanda. Concentraciones al 10% de Rosmarinus offícinalis Origanum vulgare provocaron tiempos de muerte menores a dos minutos en individuos adultos. Tabla 4: Tiempo de muerte provocado por los diferentes aceites esenciales.

Aceite N° total de Tiempo

Concentración especímenes Especímenes muerte esencial

adultos (minutos)

1 1

Romero 10 % 3 1 2

1 6

6 2

5 % 10 3 3

Orégano

1 6

10 % 1 1 1,5

2 1,5

4 % 4

2 2,5

Eucaliptus 4 1

5 % 11 2 2

5 3

3 1,5

4% 6 1 3

Lavanda

2 3,5

10 % 4 4 1

Todos los aceites esenciales fueron disueltos en EtOH 50% (100 μΙ)

El producto control utilizado (Launol®) atenuaba las reacciones de los parásitos manteniéndolos inmóviles por 10 minutos, luego de los cuales se reanimaban. Esto no ocurrió en presencia de las diluciones de aceites esenciales.

Para las próximas pruebas se utilizaron concentraciones de los aceites esenciales de un 5%, a fin de comparar su actividad frente a los diferentes estadios de Pediculosis capitis.

Recolección de especímenes: Para la muestra, se recolectaron P. capitis adultos y huevos, desde la cabeza de niños de entre 5 a 14 años, pertenecientes a escuelas básicas de diversos sectores de la comuna de Concepción.

Se invitó a participar a aquellos niños con diagnóstico de pediculosis, con previa autorización de los padres y firma de un consentimiento informado, que quisieron participar del estudio. Se descartó a todos aquellos niños que hayan recibido algún tipo de tratamiento para esta enfermedad en un período previo de al menos un mes. Los piojos fueron recolectados mediante peinetas de metal (lendreras) de dientes finos, y serán transportados al laboratorio mediante cápsulas Petri siguiendo el protocolo de Picollo et al. (1998, 2000), en un período máximo de 2 horas. Se descartarán (bajo microscopio) aquellos especímenes lesionados. Para la mayor sobrevivencia se mantuvieron los especímenes seleccionados en la oscuridad a 18°C con un 70-80% de humedad relativa para reducir la deshidratación que sufre el insecto al apartarlo del micro-hábitat.

Los huevos fueron recolectados utilizando una peineta de dientes finos o bien cortando el pelo con tijeras. Se utilizará aquellos huevos que se encuentren a < 1 cm del cuero cabelludo. Una vez recolectados fueron transportados al laboratorio, donde se separarán en base al grado de desarrollo, y serán utilizados inmediatamente en los estudios y establecimiento de colonias.

Para establecer las colonias de P. humanus capitis se utilizó sangre heparinizada de donantes. Un volumen de esta sangre (1 mL) se adsorbe en una mota de algodón de un diámetro de 35 mm. Luego, la mota de algodón fue aislada entre dos láminas de parafilm que han sido previamente estiradas para formar una lámina con un espesor cercano a 0,1 mm. Este "Pad de sangre", será recortado para luego ser depositado dentro de una placa Petri de 90 mm de diámetro. La placa Petri se tapa con una rejilla fina para permitir la ventilación y luego se coloca sobre una plancha calefactora ajustada a 37°C, donde se deja equilibrar unos minutos. Cuando no se están alimentando, los ejemplares adultos se mantienen a 30°C en placas Petri con un trozo de fieltro negro para facilitar su desplazamiento (75% humedad relativa). Este trozo de fieltro (2 cm diámetro) con los piojos se coloca diariamente sobre la placa Petri que contiene el Pad en el sistema pre-calefaccionado. Se les deja alimentar por 15 minutos. Este sistema permitirá mantener colonias de piojos adultos por al menos 1 mes. Se evaluó periódicamente la supervivencia de los individuos adultos y los huevos viables (liendres) depositados. Se seleccionarán los piojos adultos y las ninfas que se encuentren en buenas condiciones. Criterios de Evaluación de la Letalidad: La mortalidad de los adultos se evaluará cada 5 min durante 5 horas. Los adultos serán considerados muertos si sus apéndices dejan de moverse cuando son estimulados con una tórula de madera o hay pérdida del reflejo de enderezamiento. En el caso de los huevos, dicha evaluación se basará en el número de huevos sin eclosionar al cabo de 12 días después del tratamiento. Como control positivo se usará piretrinas y lindano. Los valores de la mediana del tiempo de letalidad (LT ₅ o) serán calculados por análisis de probit.

Actividad Pediculicida in vitro: Para evaluar el tiempo de letalidad en individuos adultos se usará un bio-ensayo de contacto entre el parásito y los compuestos depositados en un disco de papel filtro. Las hembras serán expuestas a diferentes concentraciones (en mg/cm ² ) de las sustancias disueltas en acetona y aplicadas a discos de papel filtro N°2 de 2,5 cm de diámetro. Como control se usará discos impregnados sólo con acetona.

Después de secar los discos bajo campana de extracción, por 2 min, cada uno se coloca en el fondo de una cápsula Petri. Grupos de 20 hembras (7-9 días de edad), alimentadas con sangre humana 4 h previo al ensayo, serán colocadas en cada cápsula Petri. Luego se agrega unas cuantas hebras de cabello humano y se cierran incubados a 18°C con 70-80% de humedad relativa.

En la figura 2 se observa el gráfico de la actividad pediculicida donde se aprecia que el aceite esencial de Eucaliptus actúa más rápido que el producto de referencia Launol®. Además se consigue casi un 100% de efectividad a esta concentración para 3 de los aceites esenciales exceptuando al de Lavandula angustifolia. Actividad Ovicida in vitro. para evaluar el tiempo de letalidad en huevos de P. humanus capitis, se ensayará diferentes concentraciones (en mg/cm ² ) de las muestras disueltas en acetona, aplicadas en discos de papel filtro. Los papeles filtro utilizados como control sólo reciben acetona. Después de secar durante 2 min, los huevos (3 a 4 días de edad) adheridos a hebras de cabello, serán colocados sobre los papeles filtro tratados en cada cápsula Petri y cubiertos con su tapa durante 24 hrs (18°C/70-80%). El porcentaje de inhibición de la eclosión (PIE) se calcula mediante la fórmula: PIE (%) = [(C-T)/C] ^x100 ' donde C es el porcentaje de eclosión del control y T es el porcentaje de eclosión de los tratamientos.

Donde el PIE del Aceite esencial de Eucaliptus fue de un 100%, para el Aceite esencial de Orégano un 80%, y para Aceite esencial de Ruda también un 80%.

En base a los resultados señalados se procede a crear una formulación con aceite esencial de Eucalyptus globulus al 5%, que corresponde al aceite que muestra mejores resultados. Ejemplo 3: Desarrollo y caracterización de la formulación.

Para caracterizar la eficacia de la tecnología se realizaron dos tipos de formulaciones con aceite esencial de Eucalyptus globulus al 5% (Tabla 5), donde una de ellas incluye Miristato de Isopropilo que sirve como emoliente (Tabla 6). Estas formulaciones se presentan en forma de loción, lo cual le confiere propiedades óptimas para su aplicación, facilitando la administración del producto.

Tabla 5: Loción Hidroalcohólica.

Materia prima Concentración (%v/v)

Etanol 96° 32,5%

Isopropanol 32,5%

Aceite esencial de Eucalyptus

5%

globulus

Agua destilada 30%

Tabla 6: Loción tipo emulsión o/w.

Materia prima Concentración (%v/v)

Etanol 96° 25%

Isopropanol 25%

Aceite esencial de

5%

Eucalyptus globulus

Miristato de Isopropilo 40%

Agua destilada 5%

A la formulación se le realizaron controles in totales como:

- Viscosidad: se utilizó un viscosímetro de Brookfield para medir la viscosidad a muestras almacenadas. Se tomaron muestras a 0, 30, 60, 90 y 180 días.

- Pérdida de agua por evaporación: frecuente en preparaciones que contienen compuestos volátiles. Se midió en muestras almacenadas por 0, 30, 60, 90 y 180 días.

- Tamaño y distribución de tamaño de partícula: se determinó el tamaño de gota para las lociones en emulsión, mediante microscopía óptica en las muestras almacenadas por 0, 30, 60, 90 y 180 días. Cambios en el tamaño y distribución de tamaño de gota pueden ser indicativos de procesos de inestabilidad física como floculación y coalescencia.

- Cantidad y liberación de principios activos mediante el uso de celdas de Franz.

- Estudios de Estabilidad de las Formulaciones: Se realizó un estudio de estabilidad acelerada por seis meses en un mínimo de tres series del producto en su envase final, a una temperatura de 40°C ± 2°C y humedad relativa de 75% ± 5% en cámara climática, según normas de la Conferencia Internacional en Armonización (ICH). Se controló la potencia del producto (estabilidad química) y características físicas. Se evaluó la concentración de un marcador químico a 0, 30, 90 y 180 días para determinar si se encuentra dentro de los límites aceptables, un cambio significativo del producto corresponde a un cambio de un 5% de la concentración inicial de principio activo; cualquier producto de degradación que se encuentre en cantidades fuera de su criterio de aceptación; y cambios en los criterios de aceptación del producto, como atributos físicos (apariencia) y test de funcionalidad (color, separación de fases, dureza, etc.).

Las formulaciones cumplen con los controles de rutina y mantienen sus características físico-organolépticas y la concentración del marcador químico elegido (1,8-cineol, 4476-45%) se mantiene durante el tiempo de estudio en condiciones a tiempo real y en condiciones aceleradas. Ejemplo 4: Bioensayos y Estudios de Toxicidad in vitro las Formulaciones Pediculicidas.

Toxicidad en Fase Vapor del Producto Final: la actividad fumigante de las formulaciones contra las hembras de P. humanus capitis se investigó de acuerdo a Yang et al. (2003). Grupos de 20 hembras (7-9 días de edad), fueron colocadas en el fondo de una cápsula Petri y cubiertas con una tapa provista de una malla fina de alambre (4,7 cm de diámetro). Cada papel filtro (5 cm de diámetro), tratado con las sustancias (mg/cm ² ) disueltas en acetona, se colocaron en sobre la malla de alambre (18°C con 70-80%). Esto impide el contacto directo de las hembras con los compuestos testeados. Con el fin de investigar la toxicidad en fase vapor, cada cápsula Petri fue cubierta con otra tapa. El control estuvo constituido por papel filtro impregnado solamente con acetona. L2016/000015

En la figura 3 se observa una gráfica de la toxicidad del producto final, donde podemos ver una potente actividad fumigante de la loción hidroalcohólica con eucaliptus, y donde no existen diferencias estadísticamente significativas entre la actividad, fumigante de la loción tipo emulsión o/w, control negativo y Launol®.

Ensayo de Toxicidad sobre Pedículos por Inmersión en el Producto Final: para evaluar la efectividad del producto final, se empleó el ensayo de toxicidad por inmersión. Para ello, los piojos adheridos a hebras de cabello fueron sumergidos completamente en los productos durante 3 min. Posteriormente, las hebras se secaron sobre papel filtro. Una vez removido el producto remanente, las hebras se trasladaron a una malla metálica y se lavaron con agua corriente para simular la aplicación por parte del paciente infestado. Una vez lavados se colocaron sobre papel filtro Whatman N°l y se dejaron en período de recuperación por 10 minutos, tiempo en el cual los piojos inactivados por la inmersión pero no intoxicados, recuperan su actividad normal (volteo). El ensayo se aplicó a unas 50 hembras, en las cuales se evaluó la actividad a los 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90 min y 18 hrs (18°C con 70-80%) Se consideró como criterio de mortalidad, cuando el piojo sea incapaz de caminar sobre un papel filtro, permanezca acostado sobre su espalda, no presente movimiento de sus antenas o patas. Los criterios de viabilidad permiten clasificar el tipo de actividad como: 1) individuo totalmente activo con movimientos normales; 2) individuo con signos vitales mayores, pero dificultad para desplazarse en forma progresiva y recuperar el reflejo de enderezamiento; 3) se considera individuos con signos vitales disminuidos a aquellos que presentan leves movimientos internos (estómago), movimiento antenar y movimientos mínimos de las piernas cuando éstas son estimuladas con fórceps; y 4) individuos sin signos vitales, aquellos que no responden a la estimulación por fórceps. Se utilizó un grupo control, en el cual se sumergió los insectos en agua. Los datos de volteo a 10 minutos y mortalidad a 18 horas se procesaron según ANOVA seguido por Prueba de Tukey.

Se determinó el porcentaje de mortalidad según Mougabure Cueto et al. (2002), los cuales fueron graficados en la figura 4, para 10 minutos de inmersión (Fig. 4A) y 15 minutos de inmersión (Fig. 4B), en ambos los controles tuvieron acciones menores y estadísticamente diferentes a las lociones hidroalcohólica y tipo emulsión o/w, sin embrago el mayor porcentaje de mortalidad fue obtenido con una exposición de 15 minutos. Para el control del efecto ovicida, se utilizó grupos de 10 a 20 huevos viables que se encuentran en etapas de desarrollo tardío. Estos huevos presentan puntos de ojos negros, y se observa claramente el apéndice del embrión. Los huevos fueron adheridos a un portaobjeto mediante una cinta adhesiva de doble cara. El porta objeto con los huevos fue sumergido en los productos innovadores por 0,5; 1 o 2 minutos.

La mortalidad de los huevos tratados (100%) se registró después de 5 días de la eclosión de los controles. El criterio de mortalidad de los huevos fue huevos sin eclosionar o huevos eclosionados con la ninfa en el interior. Los huevos fueron incubados en condiciones óptimas, en una cámara con control de temperatura y humedad, de 27-31 °C y 45-75% de humedad.

Bioensayos de Toxicidad sobre Tejido del Producto Final: uno de los parámetros importantes a evaluados fue la seguridad al momento de la aplicación local sobre la cabellera. Para ello se realizó el ensayo HET-CAM, en el cual se determina la capacidad irritante del compuesto o preparado en uso. Para ello se incubaron huevos fecundados de gallina, los cuales se abren cuidadosamente, dejando al descubierto la membrana corioalantoídea. Sobre esta membrana se depositan 300 mg o 200-300 μΙ de los productos en estudio. Se observó hasta 5 min posteriores a la aplicación la aparición de coagulación intravasal, lisis de los vasos sanguíneos, hemorragia o vasodilatación. En las dos formulaciones testeadas no se observó irritación.

Ejemplo 5: Ensayo Clínico Abierto Prospectivo y Aleatorizado

Se realizó un estudio clínico con 10 participantes correspondientes a niños infestados de edades entre 5 a 15 años, pertenecientes a establecimientos educacionales de la ciudad de Concepción. Los participantes fueron seleccionados por inspección visual por tres minutos o al encontrarse 25 piojos en el cuero cabelludo.

Los criterios de exclusión de los participantes fueron: uso de productos pediculicidas, antihelmínticos o antibióticos dentro de las cuatro semanas previas al tratamiento; desórdenes severos en la piel del cuero cabelludo; tratamiento cosmético del cabello dentro de las cuatro semanas previas al tratamiento; sensibilidad a cualquier ingrediente del producto; enfermedad mental. Se citó a los tutores de los niños infestados a una charla informativa y sólo se incluyeron en el estudio los niños con consentimiento, por escrito, de sus tutores. Éstos recibieron las indicaciones para la aplicación del producto.

Se solicitó a su vez la limpieza de los artículos, personales de vestir y de aseo, de los participantes y contactos directos, con agua hirviendo o calor seco.

Los participantes recibieron una primera aplicación por 30 minutos, repitiéndola 7 días después (las dos formulaciones (n=4 y 4). Se utilizó, en el mismo esquema de tratamiento, el producto comercial launol® para el grupo control (n=2).

Los productos fueron aplicados generosamente en la totalidad del cuero cabelludo del paciente, cubriendo las raíces del pelo y sobre todo detrás de las orejas y cuello, sobre pelo seco. Después del tiempo de exposición se lavaron el cuero cabelludo con abundante agua tibia. Una vez terminado el proceso, se debió peinar el pelo para la eliminación de las liendres, para su posterior observación en el laboratorio.

Se realizó una inspección al segundo, séptimo día de aplicación y dos días después de terminado el tratamiento. Se consideró el tratamiento efectivo a la completa ausencia de piojos vivos sobre el cuero cabelludo húmedo uno o dos días después de la primera aplicación y a la completa ausencia de huevos dos días después de terminado el tratamiento. Se considerará falla a tratamiento con puntajes igual o mayor a 1.

Para clasificar los resultados de este estudio se les asigno un puntaje según número de especímenes encontrados durante el período de evaluación, los cuales son mostrados en la tabla 7:

Tabla 7: Asignación de puntaje según número de especímenes encontrados.

Número de Puntaje

Clasificación

especímenes asignado

No se encuentran liendres 0 0

Infestación leve < de 10 liendres 1

Infestación moderada entre 10 a 20 liendres 2

Infestación severa > 20 liendres 3

Grado de curación: porcentaje de pacientes curados después de la aplicación del tratamiento fue de 100% con un puntaje de (0) para ambas formulaciones, el grupo control presento un puntaje de (3). Se registró el grado de picazón antes, durante y después del tratamiento, a través de una escala análoga visual, donde se evaluó el enrojecimiento, sequedad, irritación y descamación; donde se les asigno un puntaje de 0=ausencia, l=leve, 2=moderado, 3=severo. Para todos los parámetros ambas formulaciones arrojaron un puntaje total de 0, al igual que el grupo que utilizo el producto comercial.

La aceptabilidad cosmética del producto fue evaluada utilizando un resumen de puntuación y un cuestionario estándar que incluye características organolépticas, irritación del cuero cabelludo y cambios cosméticos del cabello. Obteniéndose un puntaje total de 0 para ambas formulaciones; donde la escala de medición de disconfort irritación y picazón utilizada corresponde a: 0=ausencia, l=leve, 2=moderado, 3=severo. El grupo control también tuvo un puntaje de (0).