BASADOS EN DICHO USO

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención pertenece al sector de la medicina clínica y, más concretamente, al del tratamiento de cáncer de pulmón con fármacos anti-EGFR y anti-FGFR.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los inhibidores de los receptores de factores de crecimiento constituyen una de las estrategias clínicas más relevantes para el tratamiento del cáncer en la actualidad.

Los factores de crecimiento son compuestos generalmente proteicos, producidos por el cuerpo, que controlan el crecimiento y el ciclo celular, manteniendo la supervivencia celular, estimulando la migración y la diferenciación celular y la apoptosis. Son sintetizados por un gran número de células ante estímulos, tales como una lesión. Su mecanismo de acción comienza al unirse a un receptor celular específico (receptor tirosina quinasa), que transduce la señal al interior de la célula, disparando una cadena de reacciones químicas que van a determinar la respuesta de la célula al estímulo.

Existen varios factores de crecimiento y cada uno de ellos tiene un efecto determinado en la célula. Los factores de crecimiento principales relacionados con receptores tirosina quinasa son: el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Cada uno de ellos se une a su correspondiente receptor en la superficie celular, miembro de la familia de receptores tirosina quinasa. Mutaciones en estos receptores a menudo están relacionadas con la oncogénesis, favoreciendo el desarrollo de células cancerígenas.

Por este motivo, se han desarrollado inhibidores de tirosina quinasa para el tratamiento del cáncer, tales como el imatibib, que bloquea la unión del receptor de BCR-ABL al ATP impidiendo su fosforilación, o el gefinitib que inhibe los receptores EGFR. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR, ErbB1 o HER1) es un receptor tirosina quinasa implicado en la proliferación y la diferenciación de muchos tipos celulares. Está codificado por el gen EGFR. El receptor se activa mediante la unión de ligandos específicos (EGF o TGFa) que inducen su homodimerización, o se une a otros miembros de la familia ERBB. Esta dimerización estimula la actividad tirosina quinasa intrínseca del receptor y el dominio citoplasmático carboxi-terminal se autofosforila en varios residuos tirosina, activando varias cascadas de transducción de señales tales como MAPK, AKT o JNK, que estimulan la síntesis de ADN, la proliferación celular, angiogénesis, metástasis y que disminuyen la apoptosis. Se ha descrito que la actividad tirosina quinasa del receptor puede desregularse debido a la sobreexpresión del receptor y/o mutaciones en EGFR, por lo que se han desarrollado inhibidores de EGFR como terapia en el tratamiento del cáncer en pacientes que presentan mutaciones en el receptor. Sin embargo, los inhibidores de EGFR desarrollados hasta el momento para el tratamiento del cáncer han resultado no ser eficientes en todos los enfermos. Se ha confirmado la relación entre las mutaciones en el gen EGFR y la respuesta clínica a inhibidores dirigidos contra este receptor, aunque hay parte de la población que, aun portando las mutaciones, no responde al tratamiento y sujetos con EGFR nativo que sí lo hacen, lo que sugiere que debe haber biomarcadores adicionales implicados en la respuesta a este tipo de fármacos. Existe, por lo tanto, la necesidad de encontrar un método para predecir si un sujeto que padezca cáncer de pulmón va a responder o no a un determinado tratamiento, así como saber qué tipos de tratamientos van a ser más efectivos en dicho sujeto que padece cáncer de pulmón.

Los receptores de factores de crecimiento fibroblásticos (FGFRs) también son receptores de membrana con actividad tirosina quinasa que se unen a miembros de la familia de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). La activación de los FGFRs también está relacionada con la regulación de la supervivencia, proliferación, migración y diferenciación celular. Se han identificado cinco miembros de la familia FGFR (FGFR1 , FGFR2, FGFR3, FGFR4 y FGFRL1). Hasta la fecha, los inhibidores dirigidos contra FGFRs no han demostrado buena eficacia en ensayos clínicos a pesar de que la señalización FGFR ha demostrado ser relevante en la oncogénesis en modelos preclínicos de diferentes tipos de cáncer. Solo algunos de los pacientes en estos ensayos responden a la terapia, lo que podría indicar que los criterios de selección de pacientes para los ensayos con estos inhibidores no son los más adecuados.

Se ha descrito que la inhibición de EGFR con gefitinib (ZD1839) está contrarrestada por factores de crecimiento como FGF2. Este factor de crecimiento protege a las células del efecto antiproliferativo del fármaco, haciendo a las células tumorales resistentes. Se ha visto en experimentos in vitro que el tratamiento conjunto del fármaco gefitinib con un inhibidor de MEK (GSK2126458) vence esta resistencia (Koch 2016).

También se ha descrito que la combinación de lapatinib (INN, inhibidor de EGFR) con el fármaco BGJ398 (inhibidor selectivo de FGFR) retrasa la recurrencia de tumores en modelos murinos de cáncer de mama inducido por FGFR1 , aunque sin observarse diferencias respecto al tratamiento con BGJ398 en monoterapia (Holdman 2015).

También se ha descrito la combinación de fármacos para vencer la resistencia adquirida a la terapia con inhibidores de EGFR o ALK en el tratamiento del cáncer en líneas celulares generadas a partir de biopsias de tumores de pulmón. Se definen múltiples terapias combinadas efectivas, como, por ejemplo, la combinación de los inhibidores ALK y MEK en muestras resistentes a ALK que llevan la mutación MAP2K1 y la combinación de inhibidores de EGFR y de FGFR únicamente en muestras que llevan la mutación FGFR3 (Crystal 2014).

En un estudio con xenoinjertos de líneas celulares de mama, se observó que la combinación de un inhibidor anti-pan-ErbB (AEE788) con un inhibidor no selectivo de FGFR (Dovitinib), o la combinación Dovitinib con NVP-BEZ235 (inhibidor de la vía PI3K/mTOR), inhibe el crecimiento tumoral y bloquea la expansión de la metástasis. Por lo que se sugiere una inhibición conjunta de EGFR y FGFR para el tratamiento de tumores de mama que co-expresen estos receptores (Issa 2013). Se sabe que el receptor FGFR1 está sobreexpresado en clones con resistencia adquirida al inhibidor de EGFR afatinib en modelos in vitro de cáncer de pulmón, no así los receptores FGFR2, FGFR3 o FGFR4. El receptor FGFR1 se encuentra constitutivamente fosfori lado en los clones resistentes y, además, está relacionado con la resistencia de las células a afatinib (Azuma 2014). Este método no podría usarse como primera línea de tratamiento, dado que requiere muestras con resistencia adquirida a inhibidores de EGFR.

Además, también se ha detectado la inducción de la expresión de FGFR1 en muestras de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), con resistencia adquirida al inhibidor de EGFR AZD9291 , por lo que este receptor y su ligando podrían constituir un mecanismo de resistencia adquirida de las células al fármaco (Kim 2015). El documento WO 2016/112302A1 se refiere a un método para el tratamiento del cáncer de pulmón mediante la administración de la combinación de un inhibidor de EGFR y de un inhibidor de FGFR en los que los niveles de expresión de mRNA de FGFR1-lllc o FGFR2-lllc están elevados, en muestras, con mutaciones en EGFR, previamente determinadas como resistentes al tratamiento con inhibidores de EGFR. La combinación de fármacos se les administra a pacientes identificados como resistentes a inhibidores de EGFR en un tratamiento previo, que expresan ARNm de FGFR1-lllc o FGFR2-lllc, variantes de FGFR1 y FGFR2 respectivamente. Los autores sugieren que es este incremento en la expresión del ARNm de FGFR1-IIIC o FGFR2-IIIC el responsable de la resistencia de los pacientes al tratamiento con inhibidores de EGFR. El documento WO 2016/1 12302A1 dice lo contrario a lo expuesto en este documento, que los tumores con alta expresión del ARNm de FGFR1 total (FGFR1-lllb y FGFR1-lllc) no presentan sensibilidad a la combinación de fármacos. Además, el tratamiento descrito en este documento nunca podría usarse como primera línea de tratamiento, dado que es necesario, en primer lugar, identificar a aquéllos pacientes con resistencia previa al tratamiento con inhibidores de EGFR. Por el contrario, el método de la presente invención selecciona a los pacientes que van a responder el tratamiento combinado frente a EGFR y FGFR incluso antes de tratarse con los inhibidores de EGFR y que generen resistencia.

El documento WO 2014/138364A2 divulga un método de tratamiento del cáncer de pulmón mediante la administración concomitante de un antagonista de FGFR y un antagonista de EGFR. El objetivo es aumentar el periodo de sensibilidad en muestras resistentes a inhibidores de EGFR. Se señala un incremento de la expresión y activación de FGFR1. Como en el caso anterior, el método descrito nunca podría usarse como primera línea de tratamiento, dado que requiere muestras con resistencia adquirida a inhibidores de EGFR.

Los documentos del estado del arte describen, por lo tanto, experimentos in vitro con combinaciones de fármacos anti-EGFR y anti-FGFR de distintos tipos de cáncer con resistencia adquirida a inhibidores de EGFR. Se sabe que el contexto génico de los receptores es importante, pero se desconoce cómo predecir el efecto de respuesta/resistencia de un sujeto al tratamiento.

La presente invención describe un mecanismo de cooperación del receptor EGFR con los receptores FGFR1 y/o FGFR4. La expresión de estos dos FGFRs en un contexto tumoral con alta activación de EGFR nativo o mutado produce una sobre-activación del receptor, que se traduce en una inducción de la señalización pro-tumorigénica aguas abajo y en un aumento de las características tumorales in vitro e in vivo. Se ha observado en modelos tumorales dependientes de la señalización EGFR in vitro e in vivo, isogénicos con y sin sobreexpresión de FGFR1 y/o FGFR4, que la alta expresión de los receptores FGFR1 y/o FGFR4 induce una mayor resistencia a los fármacos anti-EGFR. Además, el uso combinado de inhibidores anti- EGFR y anti-FGFR en modelos tumorales dependientes de señalización EGFR, con alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4, ha demostrado, por primera vez, tener efectos sinérgicos in vitro y alta eficacia in vivo en xenoinjertos de líneas celulares y en xenoinjertos derivados de pacientes, en el contexto del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) no tratado previamente con inhibidores de EGFR.

Se ha observado amplificación del gen FGFR1 en un 20% de los carcinomas escamosos (o epidermoides) y en un 1-3% y adenocarcinomas, dos tipos de cáncer de pulmón no microcítico. Además, se han descrito mutaciones de FGFR4 en adenocarcinoma y su expresión se ha asociado a una menor supervivencia en pacientes que padecen cáncer de pulmón no microcítico. Todos estos datos, junto a diferentes estudios preclínicos, sugieren que ambos genes podrían ser relevantes en cáncer de pulmón. Sin embargo, los mecanismos oncogénicos descritos para estos genes hasta la fecha no parecen traducirse en beneficio clínico, a excepción de algunos resultados obtenidos en los ensayos clínicos con inhibidores dirigidos frente a EGFR. No está descrita en el estado de la técnica la combinación de inhibidores de EGFR y de FGFR como estrategia terapéutica a nivel clínico en el tratamiento del cáncer de pulmón en tumores no previamente tratados con inhibidores de EFGR sin resistencia adquirida al tratamiento con inhibidores de EGFR. La presente invención muestra que esta aproximación terapéutica podría ser clínicamente relevante en pacientes cuyos tumores dependen de la señalización EGFR y que además tienen alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4. Se ha comprobado que la expresión de estos FGFRs confiere mayor resistencia a los fármacos anti-EGFR, pero, sorprendentemente, la combinación de estos fármacos con inhibidores de FGFR podría ser una estrategia terapéutica eficaz para estos pacientes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve descripción de la invención

El objeto principal de la presente invención es la combinación de fármacos anti-EGFR y anti- FGFR para uso en terapia, en pacientes con cáncer de pulmón que no han sido tratados previamente con fármacos inhibidores de EFGR por lo que no han podido desarrollar resistencia adquirida a dichos tratamientos con fármacos inhibidores de EGFR. Dichos pacientes, objeto de la presente invención, tienen activación de EGFR y, además, alta expresión de los genes FGFR1 y/o FGFR4 o altos niveles de las proteínas FGFR1 y/o FGFR4, en las muestras analizadas.

A efectos de la presente descripción, fármacos o compuestos anti-EGFR o anti-FGFR, anti- FGFR1 o anti-FGFR4 son, respectivamente, sinónimos de fármacos o compuestos inhibidores de EGFR, FGFR, FGFR1 o FGFR4.

En una realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para predecir la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón a un tratamiento con al menos un inhibidor de FGFR y con al menos un inhibidor de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, que comprende:

a) detectar en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto la expresión del biomarcador EGFR activado (pEGFR), nativo o mutado, en combinación con la expresión de al menos un segundo biomarcador seleccionado entre FGFR1 y/o FGFR4,

b) comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia, en el que la presencia de altos niveles de los marcadores detectados es indicativa de que el sujeto va a responder al tratamiento.

En una realización más preferida, la determinación del nivel de expresión de los biomarcadores se realiza midiendo la cantidad de proteína de pEGFR y la cantidad de proteína de FGFR1 y/o FGFR4 en la muestra, o midiendo la cantidad de proteína pEGFR y la cantidad de ARNm de los genes FGFR1 y/o FGFR4 en la muestra. En una realización más preferida, el cáncer de pulmón en el método in vitro de acuerdo con las realizaciones anteriores, es un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). En una realización todavía más preferida, el CPNM se selecciona entre adenocarcinoma y carcinoma escamoso o epidermoide.

En una realización más preferida de cualquiera de las realizaciones anteriores, la muestra analizada en el paso a) se selecciona del grupo que comprende: entre sangre completa, suero, plasma, esputo, sudor, orina, lavado bronquioalveolar, biopsia del tejido tumoral primario o metastásico. En una realización todavía más preferida, la muestra biológica es una biopsia del tumor primario del sujeto.

En una realización preferida de la invención, la detección de la cantidad de los biomarcadores de las realizaciones anteriores se realiza mediante al menos uno de los métodos seleccionados entre: HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), LC/MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, ELISA, DAS ELISA, inmunoprecipitación de proteínas, inmunoelectroforesis, Western Blot, inmunotinción de proteínas, Northern Blot, PCR con transcripción reversa (RT-PCR), PCR cuantitativa (q-PCR), RIA (radioinmunoensayo), hibridación in situ, ensayo de protección frente a nucleasas, técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas microarrays de ADN genómico, microarrays de proteínas, microarrays de ARN mensajero, microarrays de ADNc, microarrays de péptidos, microarrays de tejido, microarrays celulares o de transfección, microarrays de anticuerpos, microarrays de lisados o suero, microarrays de proteínas de fase reversa, microarrays de péptidos o microarrays de genotipado, entre otros. En una realización más preferida, la detección del ARN mensajero de los biomarcadores se realiza por PCR con transcripción reversa (RT-PCR) o PCR cuantitativa (q-PCR).

En una realización preferida del método in vitro de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, altos niveles de los biomarcadores detectados se corresponden con un nivel al menos dos veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referencia. En una realización preferida del método in vitro de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, los inhibidores de FGFR se seleccionan entre el grupo que comprende BGJ398, AZD4547, Debio-1347, Dovitinib, BLU9931 , FIIN-2, JNJ-42756493, LY2874455, Ponatinib, BIBF1 120, PD173074, PD166866, BLU554, S49076, NSC12, PHA-739358, TSU-68, BMS- 540215, TKI-258, MK-2461 , BMS-582664, AG 1296, SSR128129E, LY2874455 y SU5402.

En una realización preferida del método in vitro de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores, los inhibidores de EGFR se seleccionan del grupo que comprende gefitinib, eriotinib HCI (OSI-744), afatinib (BIBW2992), brigatinib, icotinib, osimertinib (AZD9291), cetuximab, ditosilato de lapatinib (GW-572016), neratinib (HKI-272), nazartinib (EGF816, NVS-816), naquotinib (ASP8273), olmutinib (HM61713, BI1482694), canertinib (HM61713, Bl 1482694), lapatinib, AG-490, CP-724714, dacomitinib (PF299804, PF299), WZ4002, sapitinib (AZD8931), CUDC-101 , AG-1478, PD153035, pelitinib (EKB-569), AC480 (BMS-599626), AEE788 (NVP- AEE788), análogo de AP26113 (ALK-IN-1), OSI-420, WZ3146, WZ8040, AST-1306, rociletinib (CO-1686, AVL-301), genisteína, varlitinib, TAK-285, WHI-P154, dafnetina, PD168393, tirofostina 9, CNX-2006, AG-18, AZ5104, CL-387785 (EKI-785), (-)-epigalocatequina galato (EGCC), eriotinib, dimaleato de afatinib (BIBW2992), AZD3759, poziotinib (HM781-36B), ácido crisofánico o buteína.

Otra realización de la invención se refiere a la combinación del biomarcador pEGFR y al menos un segundo biomarcador seleccionado entre FGFR1 y/o FGFR4, para uso en el pronóstico y/o la predicción de la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón, al tratamiento combinado con inhibidores de FGFR y de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR.

En una realización preferida de dicho uso, el nivel de expresión de cada biomarcador se determina midiendo el nivel de proteína de pEGFR y el nivel de ARNm de al menos uno de los genes FGFR1 y/o FGFR4, o el nivel de proteína de pEGFR y el nivel de proteína de, al menos, FGFR1 y/o FGFR4.

En otra realización preferida de dicho uso, los inhibidores de FGFR en la combinación de los biomarcadores para uso, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de uso anteriores, se seleccionan entre el grupo que comprende: BGJ398, AZD4547, Debio-1347, Dovitinib, BLU9931 , FIIN-2, JNJ-42756493, LY2874455, Ponatinib, BIBF1120, PD173074, PD166866, BLU554, S49076, NSC12, PHA-739358, TSU-68, BMS-540215, TKI-258, MK-2461 , BMS- 582664, AG 1296, SSR128129E, LY2874455 y SU5402.

En otra realización preferida de dicho uso, los inhibidores de EGFR en la combinación de los biomarcadores para uso, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones de uso anteriores, se seleccionan entre el grupo que comprende: gefitinib, erlotinib HCI (OSI-744), afatinib (BIBW2992), brigatinib, icotinib, osimertinib (AZD9291), cetuximab, ditosilato de lapatinib (GW- 572016), neratinib (HKI-272), nazartinib (EGF816, NVS-816), naquotinib (ASP8273), olmutinib (HM61713, BI 1482694), canertinib (HM61713, Bl 1482694), lapatinib, AG-490, CP-724714, dacomitinib (PF299804, PF299), WZ4002, sapitinib (AZD8931), CUDC-101 , AG-1478, PD153035, pelitinib (EKB-569), AC480 (BMS-599626), AEE788 (NVP-AEE788), análogo de AP26113 (ALK-IN-1), OSI-420, WZ3146, WZ8040, AST-1306, rociletinib (CO-1686, AVL-301), genisteína, varlitinib, TAK-285, WHI-P154, dafnetina, PD168393, tirofostina 9, CNX-2006, AG- 18, AZ5104, CL-387785 (EKI-785), (-)-epigalocatequina galato (EGCC), erlotinib, dimaleato de afatinib (BIBW2992), AZD3759, poziotinib (HM781-36B), ácido crisofánico o buteína.

Otra realización de la invención se refiere a un kit para pronosticar y/o predecir la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón a un tratamiento combinado con un inhibidor FGFR y con un inhibidor de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, que comprende:

(a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto los niveles del biomarcador pEGFR, nativo o mutado, y la expresión de al menos uno de los biomarcadores FGFR1 y/o FGFR4,

(b) medios para comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia,

(c) instrucciones para que un profesional médico administre el tratamiento con un inhibidor de FGFR y un inhibidor de EGFR a aquellos sujetos que muestren alta expresión de pEGFR, nativo o mutado, y además alta expresión de al menos FGFR1 y/o FGFR4. En una realización preferida de dicho kit, el cáncer de pulmón es un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). En una realización más preferida de dicho kit, el CPNM se selecciona entre adenocarcinoma y carcinoma escamoso o epidermoide.

En otra realización preferida del kit, la determinación de los niveles de expresión de los biomarcadores se realiza midiendo la cantidad de proteína de pEGFR y la cantidad de proteína de FGFR1 y/o FGFR4 en la muestra, o midiendo los niveles de expresión de la proteína pEGFR y la cantidad de ARNm de al menos uno de los genes FGFR1 y/o FGFR4 en la muestra.

En otra realización preferida del kit de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del kit anteriores, los medios para detectar los niveles de los biomarcadores comprenden anticuerpos que reconocen específicamente las proteínas pEGFR y anticuerpos que reconocen específicamente las proteínas FGFR1 y/o FGFR4, o anticuerpos que reconocen específicamente la proteína pEGFR y además primers y/o sondas que detectan específicamente la presencia del ARNm de los genes FGFR1 y/o FGFR4.

En otra realización preferida del kit de acuerdo con cualquiera de las realizaciones del kit anteriores, la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende: sangre completa, suero, plasma, esputo, sudor, orina, lavado bronquioalveolar, biopsia del tejido tumoral primario o metastásico. En una realización más preferida, la muestra biológica es una muestra de tejido tumoral primario.

En otra realización preferida del kit, la detección de los biomarcadores de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores del kit, se realiza mediante al menos uno de los métodos seleccionados entre: HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), LC/MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, ELISA, DAS ELISA, inmunoprecipitación de proteínas, inmunoelectroforesis, Western Blot, inmunotinción de proteínas, Northern Blot, PCR con transcripción reversa (RT-PCR), PCR cuantitativa (q-PCR), RIA (radioinmunoensayo), hibridación in situ, ensayo de protección frente a nucleasas, secuenciación masiva, técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas microarrays de ADN genómico, microarrays de proteínas, microarrays de ARN mensajero, microarrays de ADNc, microarrays de péptidos, microarrays de tejido, microarrays celulares o de transfección, microarrays de anticuerpos, microarrays de lisados o suero, microarrays de proteínas de fase reversa, microarrays de péptidos o microarrays de genotipado, entre otros. En una realización más preferida, la detección del ARNm de los biomarcadores se realiza por PCR con transcripción reversa (RT-PCR) o PCR cuantitativa (q-PCR).

Descripción de las Figuras

Figura 1. Expresión de FGFR1, FGFR4 y EGFR en líneas celulares de adenocarcinoma (ADC) y líneas inmortales de pulmón. Expresión de los receptores FGFR1 , FGFR4, EGFR y la forma activada (fosforilada) de EGFR (pEGFR). Se usa tubulina como control de carga. I = Inmortalizadas, KRAS = KRAS mutadas, EGFR = EGFR mutadas, ALK = Portadoras de translocaciones EML4-ALK, TN = Triple negativas.

Figura 2. Efecto de la sobreexpresión de FGFR1 en líneas de adenocarcinoma dependientes de EGFR. Análisis de las líneas celulares H1975 y H1650, que tienen activación de EGFR y no expresan FGFR1 ni FGFR4, y de la línea celular HCC827, que tiene EGFR activado y además expresa FGFR4. Curva de crecimiento al 10% de SFB(A), clonabilidad (B) y crecimiento libre de anclaje (C). Medida de la activación de las rutas de señalización relacionadas con FGFR en presencia o ausencia de EGF (D). EV = Línea celular con el vector vacío, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , EGF = Factor de crecimiento epidérmico. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0,05; **, p<0,01 ; ***, p<0,001).

Figura 3. Efecto de la sobreexpresión de FGFR4 en líneas de adenocarcinoma dependientes de EGFR. Análisis de las líneas celulares H1975 y H1650, que tienen activación de EGFR y no expresan FGFR1 ni FGFR4, y de la línea celular HCC827, que tiene EGFR activado y además expresa FGFR4. Curvas de crecimiento al 10% de SFB (A), clonabilidad (B) y crecimiento libre de anclaje (C). Medida de la activación de rutas de señalización relacionadas con FGFR en presencia o ausencia de EGF (D). EV = Línea celular con el vector vacío, FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4, EGF = Factor de crecimiento epidérmico. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0,05; **, p<0,01 ; ***, p<0,001).

Figura 4. Efecto de la estimulación con factores de crecimiento específicos de las líneas celulares dependientes de EGFR que sobreexpresan FGFR1 o FGFR4. Análisis de la activación de diferentes rutas por western blot de la línea celular H1975 que tiene activación de EGFR y no expresa ni FGFR1 ni FGFR4, y de la línea celular HCC827 que tiene activación de EGFR y expresa FGFR4. EV= Línea celular con el vector vacío, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4, FGF1 = Factor de crecimiento fibroblástico 1 , FGF19 = Factor de crecimiento fibroblástico 19.

Figura 5. Efecto del silenciamiento de FGFR4 en una línea celular de adenocarcinoma con alta activación constitutiva de EGFR. Análisis de la línea celular Calu-3 que tiene activación de EGFR y expresa FGFR4. Curvas de crecimiento al 10% de SFB (A), clonabilidad (B) y crecimiento libre de anclaje (C). Medida de la activación de rutas de señalización con implicación en cáncer por western blot (D) en presencia o ausencia de SFB. Control = shRNA inespecífico, shFGFR4 = línea celular con silenciamiento de FGFR4 (sh1-FGFR4 y sh2-FGFR4 corresponden a dos shRNAs distintos para el silenciamiento de FGFR4), SFB = Suero fetal bovino. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0,05; **, p<0,01 ; ***, p<0,001).

Figura 6. Efecto de la co-sobreexpresión de EGFR nativo o mutado con FGFR1 o FGFR4 en la línea inmortalizada de pulmón NL20. Crecimiento relativo al 0,5% FBS de las líneas establecidas con co-sobreexpresión de EGFR (mutado o nativo) y FGFR1 o FGFR4 (A), clonabilidad (B) y crecimiento libre de anclaje (C). EV1 = Línea celular con el vector vacío 1 , EV2 = Línea celular con el vector vacío 2, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4, EGFR = Línea celular con sobreexpresión de EGFR nativo, EGFRm = Línea celular con sobreexpresión de EGFR con las mutaciones L858R/T790M. Figura 7. Efecto de la co-sobrexpresión de EGFR nativo o mutado con FGFR1 o FGFR4 en la activación de rutas de señalización relacionadas con FGFR, en la línea inmortalizada de pulmón NL20. Co-sobreexpresión de EGFR nativo o mutado y FGFR1 (A) o FGFR4 (B) en presencia o ausencia de SFB. EV1 = Línea celular con el vector vacío 1 , EV2 = Línea celular con el vector vacío 2, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4, EGFR = Línea celular con sobreexpresión de EGFR nativo, EGFRm = Línea celular con sobreexpresión de EGFR con las mutaciones L858R/T790M, SFB = suero fetal bovino.

Figura 8. Interacción física de EGFR con FGFR1 y con FGFR4. (A) Co-inmunolocalización de EGFR y FGFR1 (parte superior) y de EGFR y FGFR4 (parte inferior) en la línea celular NL20 con sobreexpresión exógena de los receptores correspondientes. (B) Co-inmunoprecipitación de EGFR con FGFR1 en la línea celular H 1975 y de EGFR con FGFR4 en la línea Calu-3. Se usó Tubulina como control de carga.

Figura 9. Efecto de FGFR1 y FGFR4 en el crecimiento tumoral de xenoinjertos generados con líneas celulares dependientes de EGFR. Efecto de la sobreexpresión de FGFR1 o FGFR4 en xenoinjertos de las líneas celulares H1975 y HCC827 con EGFR mutado (gráfica superior y central) y del silenciamiento de FGFR4 (gráfica inferior) en la línea celular Calu-3 con expresión de EGFR nativo. EV = Línea celular con el vector vacío, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4, control = shRNA inespecífico, shFGFR4 = silenciamiento de FGFR4 (sh1-FGFR4 y sh2-FGFR4 corresponden a dos shRNAs distintos para el silenciamiento de FGFR4).

Figura 10. Efecto del tratamiento con inhibidores frente a EGFR y FGFR en líneas celulares de adenocarcinoma no dependientes de la señalización EGFR (H2009, H3122, H1437). Medida de la IC50 (nM) en cada línea celular tratada con cada uno de los inhibidores: (A) BGJ398, (B) AZD4547, (C) Eriotinib, y (D) Osimertinib. EV = Línea celular control con el vector vacío, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4.

Figura 11. Efecto del tratamiento con inhibidores de FGFR y EGFR, en monoterapia y en combinación, in vitro en líneas celulares de adenocarcinoma dependientes de la señalización de EGFR. (A) Sensibilidad a los inhibidores selectivos de FGFR BGJ398 y AZD4547 y a los inhibidores de EGFR eriotinib y osimertinib en monoterapia medidos por su IC50 (nM) en las líneas celulares H1975 y HCC827 que sobreexpresan FGFR1 o FGFR4. (B) Efecto de la combinación de los inhibidores en las líneas celulares. (C) Efecto del tratamiento con AZD4547 y eriotinib en monoterapia y en combinación, en las rutas de señalización oncogénicas relacionadas con FGFR en estas líneas. EV = Línea celular control con el vector vacío, FGFR1 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = Línea celular con sobreexpresión de FGFR4.

Figura 12. Efecto de la combinación de inhibidores de FGFR y EGFR in vivo en xenoinjertos de líneas celulares con mutaciones activadoras de EGFR. (A) Efecto de la administración de erlotinib y AZD4547 en monoterapia y en combinación, en el crecimiento de los tumores generados por las líneas celulares H1975 y HCC827 que sobreexpresan FGFR1 o FGFR4. (B) Imagen de los tumores extraídos al final del tratamiento de los modelos con sobreexpresión de FGFR4. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0,05; **, p<0,01 ; ***, p<0,001). Figura 13. Efecto de la combinación de erlotinib y AZD4547 en modelos PDX de adenocarcinoma de pulmón con alta activación de EGFR (nativo o mutado) y con alta expresión de FGFR1. (A) Efecto de la administración de erlotinib y AZD4547 en monoterapia y en combinación, en el crecimiento de los tumores de los modelos TP103 (EGFR mutado), TP57 y TP126 (EGFR sobre-activado). (B) Efecto de los tratamientos en la señalización oncogénica relacionada con EGFR y FGFR en los modelos TP103 y TP57. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0,05; **, p<0,01 ; ***, p<0,001).

Figura 14. Efecto de la expresión de FGFR1 y FGFR4 en la respuesta a terapia anti-EGFR en una cohorte de pacientes con adenocarcinoma tratados (N=47). (A) Correlación de la supervivencia libre de progresión de pacientes tratados con erlotinib o gefitinib con la expresión de ARNm de FGFR1 o FGFR4, o de ambos (B). El criterio para discernir entre baja y alta expresión es el valor de la mediana de expresión para cada gen. ADC = Adenocarcinoma.

Figura 15. Efecto de la expresión de FGFR1 y FGFR4 en la respuesta a terapia anti-EGFR en una cohorte de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico tratados (N=87). (A)

Correlación de la supervivencia libre de progresión de pacientes tratados con erlotinib o gefitinib con la expresión de ARNm de FGFR1 o FGFR4, o de ambos (B). El criterio para discernir entre baja y alta expresión es el valor de la mediana de expresión para cada gen. CPNM = Cáncer de pulmón no microcítico.

Descripción detallada de la invención La presente invención demuestra por primera vez que los genes FGFR1 y FGFR4 tienen un papel oncogénico en el cáncer de pulmón con alta activación de EGFR. La alta expresión de los genes que codifican los receptores FGFR1 y FGFR4 induce una mayor resistencia a los fármacos anti-EGFR en el tratamiento del cáncer de pulmón en tumores que no han recibido tratamiento previo con inhibidores de EGFR que tienen alta activación del receptor EGFR, independientemente de si éste se encuentra en estado nativo o mutado.

La identificación de mutaciones en el gen EGFR1 ha sido el criterio más extendido de administración de inhibidores de EGFR y de inclusión de pacientes de cáncer de pulmón en ensayos clínicos con estos inhibidores, pero se ha comprobado que existen pacientes con EGFR mutado no tratados previamente con inhibidores de EGFR que no responden al tratamiento. Además, existe la necesidad de encontrar mejores tratamientos dirigidos para los sujetos con tumores que tienen EGFR nativo, es decir, sin mutaciones. Los resultados descritos en el presente documento de patente muestran que los receptores EGFR y FGFR1 y/o EGFR y FGFR4 están funcional y físicamente, relacionados. La presente invención muestra que existen pacientes con tumores dependientes de EFGR, que a pesar de no haber recibido tratamiento previo con inhibidores de EFGR, presentan altos niveles de expresión de FGFR1 y/o FGFR4, lo que disminuye la eficacia del tratamiento con inhibidores de EGFR. El uso combinado de inhibidores dirigidos a estos receptores en pacientes que tienen alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4 y además sobre-activación del receptor EGFR, tiene un efecto sinérgico nunca descrito hasta la fecha, que, además, es independiente de la presencia de mutaciones en EGFR, lo que permite el tratamiento con estos fármacos a subpoblaciones de pacientes que tienen sobreactivación de EGFR pero no mutación y, por lo tanto, actualmente quedan excluidos de los ensayos clínicos. El análisis de la expresión de los biomarcadores EGFR activado (pEGFR), FGFR1 y/o FGFR4 permitirá seleccionar los pacientes candidatos para administrarles un tratamiento combinado con fármacos anti-EGFR y anti-FGFR, evitando innecesariamente tratar a pacientes que no van a responder al tratamiento o impidiendo el acceso al tratamiento de pacientes que sí van a responder.

Definiciones: Biomarcador: Cualquier parámetro biológico que permite medir objetivamente la presencia de una actividad biológica. Por ejemplo, permite determinar si un tratamiento farmacológico va a ser eficaz o evaluar la tolerancia a un medicamento.

EGFR: A efectos de la presente invención, EGFR se refiere al receptor del factor de crecimiento epidérmico, o al gen que lo codifica. Se considera que un receptor EGFR es nativo cuando no presenta mutaciones en su secuencia génica

EGFR sobre-activado: Alta expresión de EGFR fosforilado (pEGFR) que puede ser debido, entre otras causas, a una mutación activante en su secuencia.

FGFR: A efectos de la presente invención, FGFR se refiere a los receptores del factor de crecimiento fibroblástico, o a los genes que los codifican. Hay cinco miembros de la familia FGFR (FGFR1 , FGFR2, FGFR3, FGFR4 y FGFRL1). En la presente invención FGFR1 y FGFR4 se refieren al receptor correspondiente, así como a los genes FGFR1 y FGFR4 que los codifican.

Cáncer de pulmón: Conjunto de enfermedades resultantes del crecimiento maligno de células del tracto respiratorio, en particular del tejido pulmonar. El cáncer de pulmón suele originarse a partir de células epiteliales, y puede derivar en metástasis e infiltración a otros tejidos del cuerpo. Los tipos de cáncer de se dividen en dos tipos:

Carcinomas de células pequeñas o microcíticos: Se corresponde aproximadamente con un 20% de los cánceres de pulmón. Se localizan preferentemente en la zona central de los pulmones, Se caracterizan por su alta agresividad y crecimiento rápido.

Carcinomas no microcíticos (CPNM): representan el 80% restante de los cánceres de pulmón. Los tipos más frecuentes son:

a) Carcinoma escamoso o epidermoide: Es la variedad de cáncer broncopulmonar más frecuente en España, representando el 40% de los carcinomas no microcíticos. b) Adenocarcinoma: Representa el 30% de los carcinomas de pulmón no microcíticos.

Es el menos relacionado con el consumo de tabaco, pero, aun así, es más frecuente en fumadores.

c) Carcinoma de células grandes: Se denomina así por el tamaño de las células que lo componen. Es el tipo menos frecuente de los carcinomas broncopulmonares, representando el 10% de ellos.

Expresión (o nivel de expresión): A efectos de la presente invención, se entiende como expresión a la presencia o no, detectable por las técnicas estándar conocidas en el estado del arte, de una proteína o un ARN mensajero.

Alta o baja expresión: A efectos de la presente invención, se entiende como alta o baja expresión a la presencia, detectable por las técnicas estándar conocidas en el estado del arte, de una proteína o un ARN mensajero, por encima de un valor de referencia en comparación con una muestra de referencia, o respecto a la mediana de una población de referencia. Para que se considere que hay alta expresión de un biomarcador, ésta debe ser al menos 2 veces superior al de la expresión de la muestra de referencia.

Muestra de referencia: A efectos de la presente invención, se considera que la muestra de referencia con la que se compara la cantidad de proteína o ARN mensajero de un biomarcador analizado aquélla que tiene baja o nula expresión de dicho biomarcador. En la presente invención, pero sin por ello limitar el alcance de la misma, la muestra de referencia de un biomarcador determinado, consiste en la media aritmética de la cuantificación de la expresión de dicho biomarcador en al menos tres líneas celulares descritas previamente en el estado del arte porque no expresan dicho biomarcador, o porque lo hacen a un nivel que no tiene efecto en la célula en relación a lo tratado en esta invención. La muestra de referencia puede obtenerse también a partir de muestras de uno o más individuos que presentan cáncer de pulmón no microcítico y no responden al tratamiento con inhibidores de FGFR y/o de EGFR, pueden ser líneas celulares, "pool" de células, se pueden obtener comercialmente, de un biobanco de tejidos o sangre, de estudios clínicos publicados para cohorte de individuos, o de muestras de referencia reconocidas en el campo como son las de la cohorte TCGA (The Cáncer Genome Atlas del National Cáncer Insitute y National Human Genome Research Instiute). En este caso en vez de la media aritmética se emplearía la mediana. Se considera "valor de referencia" al nivel de expresión de un biomarcador de la invención en la muestra de referencia. Sobreexpresion: A efectos de la presente invención, se entiende como sobreexpresion a la expresión inducida de un gen en una línea celular, mediante la transfección con un plásmido que expresa un gen de interés. La sobreexpresion puede determinarse como un incremento en el ARNm que codifica una proteína determinada o un incremento en la cantidad de proteína.

Activación de un receptor: A efectos de la presente invención, se entiende que un receptor está activado cuando es capaz de ejercer su actividad tirosina quinasa, desencadenando las cascadas de señalización celular específicas. La activación se produce en condiciones fisiológicas al unirse al receptor un ligando o agonista. Condiciones como las mutaciones en el receptor, o la sobreexpresion de éste, pero no limitándose a éstas, pueden dar lugar a una activación constitutiva independiente de ligando, lo que da lugar a la activación de las cascadas de señalización celular aguas abajo del receptor, incrementando el efecto de las rutas en la célula. La activación constitutiva de receptores está relacionada con la aparición de enfermedades. Los inhibidores de un receptor disminuyen o eliminan su activación por lo que son comúnmente utilizados como fármacos en el tratamiento de enfermedades. Se han descrito mutaciones activantes en los genes EGFR, FGFR1 y FGFR4 que podrían estar implicadas en la tumorigénesis del cáncer de pulmón. Sin embargo, se ha comprobado que pacientes que portan dichas mutaciones no necesariamente responden a un tratamiento con inhibidores de FGFR o EGFR.

EGFR activado: A efectos de la presente invención, se considera que el receptor EGFR está activado cuando se detecta su forma fosforilada (pEGFR) por medio de algún método de análisis de la expresión proteica, lo que indica el desarrollo de su actividad tirosina quinasa y la señalización intracelular, lo que provoca a su vez la activación de las cascadas de señalización que estimulan la síntesis de DNA, la proliferación celular y la angiogénesis. En el presente documento el receptor EGFR activado se indicará como pEGFR.

Líneas celulares dependientes de EGFR: Líneas celulares que presentan alta activación de EGFR independientemente del estado mutacional del receptor. Estas líneas celulares dependen de la señalización ejercida por EGFR para mantener sus características tumorigénicas y muestran sensibilidad a la inhibición del receptor.

Mutaciones EGFR: Las mutaciones del gen EGFR activadoras o asociadas con cáncer tienen lugar generalmente en los exones 18-21 del gen, que codifican el dominio tirosina quinasa. Normalmente son mutaciones heterocigóticas. La mayoría de estas mutaciones son deleciones cortas en el exón 19 o mutaciones puntuales en los exones 19 y 21 (G719S, L858R, L861 Q y T790M). Estas mutaciones producen una hiperactivación constitutiva del receptor y de las cascadas de señalización aguas abajo del receptor, estimulando los efectos pro-cancerígenos.

Sinergia: A efectos de la presente invención, se considera que el efecto de la combinación de dos fármacos es sinérgico cuando el efecto combinatorio es mayor que la suma de los efectos de cada fármaco por separado y al efecto aditivo de los mismos.

A efectos de la presente invención, las expresiones "anti-FGFR" o anti-EGFR" e "inhibidor de FGFR" o "inhibidor de EGFR" se consideran equivalentes por dirigirse a terapias cuyo efecto es el de disminuir o eliminar la activación de receptores EGFR o FGFR. A efectos de la presente invención, las expresiones "individuos" y "sujetos" se consideran sinónimos y se refieren a cualquier ser vivo animal. En una realización preferente, los "individuos" o "sujetos" en la presente invención se refieren a seres humanos.

En una realización de la invención, se describe un método in vitro para predecir la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, a un tratamiento con al menos un inhibidor de FGFR y con al menos un inhibidor de EGFR, que comprende:

a) detectar en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto la expresión del biomarcador pEGFR (receptor EGFR fosforilado) y, además, la expresión de al menos uno de los biomarcadores FGFR1 y/o FGFR4,

b) comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia,

c) administrar el al menos un inhibidor de FGFR y el al menos un inhibidor de EGFR a los sujetos que tienen expresión de los biomarcadores superior a la expresión de los mismos biomarcadores en la muestra de referencia.

En una realización más preferida del método, el nivel de expresión de los biomarcadores FGFR1 y FGFR4 se determina midiendo la cantidad de proteína o midiendo la cantidad de ARNm de los genes que codifican para dichas proteínas en la muestra, y el nivel de expresión del biomarcador pEGFR se determina midiendo la cantidad de proteína fosforilada en la muestra. En una realización más preferida de dicho método, las secuencias de los biomarcadores se pueden encontrar en las bases de datos de acceso público, con las que un experto medio en la materia está familiarizado. A modo de ejemplo y sin por ello limitar el alcance de la presente invención, la secuencia de la proteína EGFR nativa se corresponde con el código P00533 de UniProtKB o Secuencia de referencia NCBI NP_005219.2 (National Center for Biotechnology Information, US National Library of Medicine). A modo de ejemplo y sin por ello limitar el alcance de la presente invención, la secuencia de la proteína FGFR1 , se corresponde con el código P11362 de UniProtKB o la Secuencia de referencia NCBI NP_075598.2. A modo de ejemplo, y sin por ello limitar la invención, el ARN de FGFR1 se corresponde con la secuencia de referencia de NCBI NM_023110.2, la secuencia SEQ ID NO:3, o cualquiera que tenga un grado de identidad con ellas de al menos un 80%, preferiblemente de al menos un 85%, más preferiblemente de al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% respecto a dicha secuencia. A modo de ejemplo y sin por ello limitar el alcance de la presente invención, la secuencia de la proteína FGFR4, se corresponde con el código P22455 de UniProtKB o con la Secuencia de referencia NCBI NP_002002.3. A modo de ejemplo, y sin por ello limitar la invención, la secuencia del ARN mensajero de FGFR4 se corresponde con la secuencia de referencia de NCBI NM_002011.3, la secuencia SEQ ID NO:4 o cualquiera que tenga un grado de identidad con ellas de al menos un 80%, preferiblemente de al menos un 85%, más preferiblemente de al menos un 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% respecto a dicha secuencia. El grado de identidad entre dos secuencias se puede determinar por métodos convencionales, como, por ejemplo, BLAST (Altschul SF 1999).

En una realización del método de la invención el cáncer de pulmón es un carcinoma de pulmón no microcítico. En una realización más preferida de dicho método, el carcinoma de pulmón no microcítico se selecciona entre adenocarcinoma y carcinoma escamoso o epidermoide. En una realización del método de la invención, la muestra analizada se selecciona entre sangre completa, plasma, suero, orina, esputo, sudor, lavado broncoalveolar, biopsia del tejido tumoral primario o metastásico. En una realización más preferida de dicho método, la muestra biológica es una muestra de tejido tumoral primario. A efectos de la presente invención, la sangre completa se define como aquella que contiene todos sus componentes, es decir, el plasma sanguíneo y todos los elementos formes (glóbulos rojos, glóbulos blancos y plaquetas). El plasma se define como el componente líquido de la sangre, sin la fracción celular. El suero se define como el líquido obtenido después de la coagulación de la sangre y eliminación del coágulo. Difiere del plasma en la ausencia de factores de coagulación. La orina es una secreción líquida de color amarillo que es secretada por los ríñones como resultado de la depuración y el filtrado de la sangre; se acumula en la vejiga y se expulsa por la uretra. El esputo es la secreción procedente de la nariz, la garganta o los bronquios que se escupe de una vez por la boca en una expectoración. El sudor es el líquido transparente que expulsan las glándulas sudoríparas de la piel de los mamíferos y que se expulsa a través de los poros. El lavado broncoalveolar (LBA) se define como la instilación y posterior aspiración de líquido en uno o varios segmentos o subsegmentos pulmonares. Se estima que con la realización del LBA se toma muestra de alrededor de un millón de alvéolos (1 % de la superficie pulmonar), obteniéndose aproximadamente 1 mi de secreciones reales pulmonares en el total del líquido recuperado. La biopsia es un trozo de tejido o una parte de líquido orgánico que se extrae de un ser vivo, con fines diagnósticos o pronósticos. La biopsia de tejido tumoral primario es una biopsia del tumor en el lugar en el que se origina el cáncer, en este caso el pulmón. La biopsia de tejido tumoral metastásico se refiere a una biopsia de nodulos ganglionares obtenida mediante aguja o punción-aspiración de una muestra de tejido a partir de un nodulo en un ganglio, o una biopsia del tumor en una parte del cuerpo distinta a la que originalmente se formó un cáncer. La muestra puede usarse fresca (directamente obtenida del sujeto), o criopreservada, o fijada en formalina y conservada en parafina. En una realización del método de la invención, la detección de los biomarcadores puede hacerse con cualquier método que refleje su presencia, como la detección del biomarcador en su forma proteica, en el caso de pEGFR, FGFR1 y FGFR4, o la detección del ARN mensajero que codifica dicha proteína (en el caso de FGFR1 y FGFR4) (o fragmentos de los mismos). Son conocidos extensamente en el estado del arte métodos para la detección de este tipo de moléculas. A modo de ejemplo, pero no por ello limitando el alcance de la presente invención, la detección de los biomarcadores se puede realizar por cualquiera de los siguientes métodos: HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), LC/MS (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, ELISA, DAS ELISA (ELISA tipo sándwich con doble anticuerpo), inmunoprecipitación de proteínas, inmunoelectroforesis, Western Blot, inmunotinción de proteínas, Northern Blot, PCR con transcripción reversa (RT-PCR), PCR cuantitativa (q-PCR), RIA (radioinmunoensayo), hibridación in situ o ensayo de protección frente a nucleasas, técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas o cualquier técnica de "big data" (análisis masivo de datos basado en biochips o microarrays) tales como microarrays de ADN genómico, microarrays de proteínas, microarrays de ARN mensajero, microarrays de ADNc, microarrays de péptidos, microarrays de tejido, microarrays celulares o de transfección, microarrays de anticuerpos, microarrays de lisados o suero, microarrays de proteínas de fase reversa, microarrays de péptidos o microarrays de genotipado, entre otros. En una realización más preferida de dicho método de la invención, la detección del ARNm de los biomarcadores se realiza por PCR con transcripción reversa (RT-PCR) o PCR cuantitativa (q-PCR). En una realización del método de la invención, se considera que un biomarcador está presente en una muestra y sirve para la predicción de la respuesta del sujeto al tratamiento, si el nivel de los biomarcadores detectados en la muestra es al menos dos veces superior al nivel del mismo marcador en una muestra de referencia. En una realización más preferida de dicho método de la invención, la expresión del biomarcador debe ser al menos 5 veces superior a la de la muestra de referencia. En una realización todavía más preferida del método de la invención, la expresión del biomarcador debe ser al menos 10 veces superior a la de la muestra de referencia.

En una realización del método de la invención, el sujeto que sufre cáncer de pulmón es un ser humano.

En otra realización del método de la invención, el inhibidor de FGFR empleado se selecciona del grupo que comprende, sin limitar por ello el alcance de la invención: BGJ398, AZD4547, Debio-1347, Dovitinib, BLU9931 , FIIN-2, JNJ-42756493, LY2874455, Ponatinib, BIBF1 120, PD173074, PD166866, BLU554, S49076, NSC12, PHA-739358, TSU-68, BMS-540215, TKI- 258, MK-2461 , BMS-582664, AG 1296, SSR128129E, LY2874455 y SU5402.

En otra realización de la invención, el inhibidor de EGFR empleado se selecciona del grupo que comprende, sin limitar por ello el alcance de la invención: gefitinib, erlotinib HCI (OSI-744), afatinib (BIBW2992), brigatinib, icotinib, osimertinib (AZD9291), cetuximab, ditosilato de lapatinib (GW-572016), neratinib (HKI-272), nazartinib (EGF816, NVS-816), naquotinib (ASP8273), olmutinib (HM61713, BI1482694), canertinib (HM61713, Bl 1482694), lapatinib, AG-490, CP-724714, dacomitinib (PF299804, PF299), WZ4002, sapitinib (AZD8931), CUDC- 101 , AG-1478, PD153035, pelitinib (EKB-569), AC480 (BMS-599626), AEE788 (NVP-AEE788), análogo de AP261 13 (ALK-IN-1), OSI-420, WZ3146, WZ8040, AST-1306, rociletinib (CO-1686, AVL-301), genisteína, varlitinib, TAK-285, WHI-P154, dafnetina, PD168393, tirofostina 9, CNX- 2006, AG-18, AZ5104, CL-387785 (EKI-785), (-)-epigalocatequina galato (EGCC), erlotinib, dimaleato de afatinib (BIBW2992), AZD3759, poziotinib (HM781-36B), ácido crisofánico, buteína o cualquier inhibidor de EGFR en fase de desarrollo. La presente invención también describe la combinación del biomarcador pEGFR y de al menos un segundo biomarcador seleccionado entre FGFR1 y FGFR4 para uso en la predicción de la respuesta de un sujeto, que sufre cáncer de pulmón, al tratamiento combinado con inhibidores de FGFR y de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR. En una realización particular de dicho uso, el nivel de expresión de los biomarcadores se selecciona entre el nivel de ARNm o el nivel de proteína de FGFR1 o FGFR4 y además el nivel de proteína fosforilada de EGFR (pEGFR).

En una realización preferida del uso anterior, el cáncer de pulmón se selecciona entre adenocarcinoma y carcinoma escamoso o epidermoide. En una realización del uso anterior, el inhibidor de FGFR se seleccionan, sin limitar por ello la invención, entre el grupo que comprende BGJ398, AZD4547, Debio-1347, Dovitinib, BLU9931 , FIIN-2, JNJ-42756493, LY2874455, Ponatinib, BIBF1 120, PD173074, PD166866, BLU554, S49076, NSC12, PHA-739358, TSU-68, BMS-540215, TKI-258, MK-2461 , BMS-582664, AG 1296, SSR128129E, LY2874455 y SU5402 y el inhibidor de EGFR empleado se selecciona del grupo que comprende, sin limitar por ello la invención, gefitinib, erlotinib HCI (OSI-744), afatinib (BIBW2992), brigatinib, icotinib, osimertinib (AZD9291), cetuximab, ditosilato de lapatinib (GW- 572016), neratinib (HKI-272), nazartinib (EGF816, NVS-816), naquotinib (ASP8273), olmutinib (HM61713, BI 1482694), canertinib (HM61713, Bl 1482694), lapatinib, AG-490, CP-724714, dacomitinib (PF299804, PF299), WZ4002, sapitinib (AZD8931), CUDC-101 , AG-1478, PD153035, pelitinib (EKB-569), AC480 (BMS-599626), AEE788 (NVP-AEE788), análogo de AP26113 (ALK-IN-1), OSI-420, WZ3146, WZ8040, AST-1306, rociletinib (CO-1686, AVL-301), genisteína, varlitinib, TAK-285, WHI-P154, dafnetina, PD168393, tirofostina 9, CNX-2006, AG- 18, AZ5104, CL-387785 (EKI-785), (-)-epigalocatequina galato (EGCC), erlotinib, dimaleato de afatinib (BIBW2992), AZD3759, poziotinib (HM781-36B), ácido crisofánico, buteína o cualquier inhibidor de EGFR en fase de desarrollo.

En otra realización, la presente invención se refiere a una terapia combinada de fármacos anti- EGFR y anti-FGFR para uso en el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón que tienen alta expresión de pEGFR y además tienen alta expresión de los genes FGFR1 y/o FGFR4 o alta expresión de pEGFR y además tienen alta expresión de los receptores FGFR1 y/o FGFR4. En una realización más preferida de esta realización de uso, los pacientes tienen alta expresión de pEGFR y además alta expresión de los genes FGFR1 y FGFR4 o alta expresión de pEGFR y además tienen alta expresión de los receptores FGFR1 y FGFR4.

En una realización preferida de dicho uso en terapia, el tratamiento combinado con inhibidores de FGFR y de EGFR, es un tratamiento de primera, segunda o tercera línea. En una realización más preferida, es primera línea de tratamiento. A efectos de la presente invención, se define una primera línea de tratamiento al primer tratamiento que se administra para tratar una enfermedad. Cuando se usa en forma separada, la terapia de primera línea es el tratamiento que se acepta como el mejor. Si no cura la enfermedad o produce efectos secundarios graves, se puede agregar otro tratamiento o remplazado con otro (tratamiento de segunda línea). El tratamiento de segunda linea se administra cuando el tratamiento inicial {primera linea) no es eficaz o deja de ser eficaz. Si la segunda línea de tratamiento tampoco es eficaz, se administra un tratamiento de tercera línea.

En una realización preferida de dicho uso terapéutico, el sujeto que sufre cáncer de pulmón no ha desarrollado resistencia adquirida a inhibidores de EGFR. En una realización más preferida de dicho uso terapéutico, el sujeto que sufre cáncer de pulmón no ha desarrollado resistencia adquirida a inhibidores de EGFR tras recibir tratamiento previo con dichos inhibidores de EGFR.

La presente invención también describe un método para predecir si un sujeto que sufre cáncer de pulmón va a responder a un tratamiento con una combinación de al menos un inhibidor de EGFR y al menos un inhibidor de FGFR, que comprende el detectar la presencia de la combinación de los biomarcadores pEGFR y FGFR1 y/o pEGFR y FGFR4.

En una realización más preferida del método de predicción anterior, la expresión combinada del biomarcador pEGFR y de al menos otro biomarcador seleccionado entre FGFR1 y/o FGFR4, es indicativa de que el sujeto será respondedor al tratamiento.

En una realización preferida, la presente invención se refiere a un kit para pronosticar y/o predecir la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón a un tratamiento combinado con inhibidores FGFR y con inhibidores de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, que comprende:

(a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto la expresión del biomarcador pEGFR nativo o mutado y además medios para detectar la expresión de los biomarcadores FGFR1 y/o FGFR4,

(b) medios para comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia,

(c) instrucciones para que un profesional médico administre el tratamiento combinado de al menos un inhibidor de EGFR y al menos un inhibidor de FGFR, únicamente a aquellos sujetos que muestren alta expresión de EGFR fosforilada y además alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4. En una realización preferida del kit, los medios para detectar expresión de los biomarcadores se seleccionan del grupo que comprende anticuerpos para detectar las proteínas pEGFR y FGFR1 y/o FGFR4, y sondas específicas para detectar el ARN mensajero de FGFR1 o de FGFR4, así como reactivos para llevar a cabo dicha detección, tales como, por ejemplo, sondas y primers que reconocen específicamente dicho ARN mensajero. En una realización de dicho kit, las sondas para la detección del ARN mensajero de los genes FGFR1 y/o FGFR4 se seleccionan entre cualquier secuencia que hibride específicamente con el ARN de estos genes. A modo de ejemplo, se pueden usar ensayos tipo TaqMan específicos, como los descritos en la Tabla 1 (Thermo Fisher). En una realización preferida, el kit comprende primers para amplificar por PCR al menos parte de las secuencias de ARN mensajero que codifican las proteínas FGFR1 y/o FGFR4. Las secuencias de los biomarcadores de la invención (ARN mensajero y proteína) son conocidas en el estado del arte y cualquier experto medio podría diseñar primers, sondas y anticuerpos para su detección.

En otra realización del kit de la invención, los anticuerpos empleados para la detección de las proteínas pEGFR, FGFR1 y FGFR4 se seleccionan entre cualquier anticuerpo monoclonal o policlonal que reconozca específicamente estas proteínas. A modo de ejemplo, los anticuerpos que reconocen los biomarcadores son los que se describen en la Tabla 2 de la presente memoria. En una realización preferida, el kit comprende anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen específicamente la proteína pEGFR y además anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen específicamente las proteínas FGFR1 y/o FGFR4. Dichos anticuerpos pueden estar, o no, marcados con isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc.

En una realización del kit de la invención, los medios para comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados con una muestra que no expresa dichos marcadores, o con una muestra que sí expresa dichos marcadores, se realiza mediante la cuantificación de los niveles de expresión de los biomarcadores previamente detectados en la muestra biológica y en la muestra de referencia. Los niveles de expresión pueden ser cuantificados mediante cualquier método convencional del estado del arte. A modo ilustrativo, pero no por ello limitando la invención, los niveles de los biomarcadores se pueden cuantificar, por ejemplo, mediante programas de ordenador específicos de cuantificación acoplados a los sistemas de detección previamente indicados.

En una realización del kit de la invención, las instrucciones para administrar el tratamiento combinado con un inhibidor de EGFR y un inhibidor de FGFR se refieren a un documento, algoritmo, prospecto o programa de ordenador que indique a partir de los datos obtenidos de la muestra del sujeto analizada en dicho kit, si el tratamiento combinado con ambos inhibidores es efectivo en dicho sujeto.

En otra realización, la presente invención se refiere a un dispositivo para diagnosticar y/o pronosticar la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón a un tratamiento combinado con al menos un inhibidor de FGFR y al menos un inhibidor de EGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, que comprende los elementos necesarios para analizar:

a) el nivel de expresión de pEGFR nativa o mutada y

b) el nivel de expresión de FGFR1 y/o FGFR4

en una muestra biológica obtenida del sujeto que sufre cáncer de pulmón. En una realización preferida el kit o el dispositivo de la invención puede contener oligonucleótidos diseñados a partir de una secuencia conocida o un ARNm y/o capaces de hibridar con la secuencia de los genes FGFR1 y/o FGFR4 para la posterior amplificación por PCR. Preferiblemente, el kit o dispositivo de la invención comprende al menos:

a) un anticuerpo anti-pEGFR y

b) un anticuerpo anti-FGFR1 y/o un anticuerpo anti-FGFR4

En una realización preferida del kit o dispositivo según la invención, cada anticuerpo reconoce la proteína humana correspondiente y puede ser humanizado o no humanizado, producido en ratón, conejo o en cualquier otra especie o sintético. En otra realización más preferida, el anticuerpo es monoclonal. En otra realización más preferida del kit o dispositivo de la invención, el anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo. Más preferiblemente, el fluorocromo se selecciona de la lista que comprende Fluoresceína (FITC), Tetrametilrodamina y derivados, Ficoeritrina (PE), PerCP, Cy5, Texas, aloficocianina, o cualquiera de sus combinaciones. Más preferiblemente, el kit y el dispositivo de la presente invención comprenden los medios necesarios para comparar el nivel de expresión detectado con una muestra de referencia.

El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado, el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo cualquiera de los métodos de la invención.

En otra realización, la presente invención describe un método de tratamiento de un sujeto que sufre de cáncer de pulmón, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR que comprende:

(a) determinar la presencia del biomarcador pEGFR en una muestra biológica obtenida de dicho sujeto,

(b) determinar la presencia del biomarcador FGFR 1 y/o FGFR4 en la misma muestra,

(c) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprenda un inhibidor de EGFR y un inhibidor de FGFR, si el sujeto tiene alta expresión del biomarcador pEGFR nativo o mutado y además tiene expresión alta de los biomarcadores FGFR1 y/o FGFR4, al compararlo con una muestra de referencia, en la que la determinación de la presencia de los biomarcadores en las etapas (a) y (b) puede realizarse simultánea o secuencialmente. En otra realización, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de cáncer de pulmón en un paciente, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, dicho método comprende detectar en una muestra del paciente la expresión del biomarcador proteico pEGFR y además la expresión de los genes FGFR1 y/o FGFR4, o la expresión de las proteínas pEGFR y además FGFR1 y/o FGFR4, administrar un tratamiento que comprende al menos un inhibidor de EGFR y al menos un inhibidor de FGFR a los pacientes que muestran alta expresión de pEGFR y además alta expresión de los genes FGFR1 y/o FGFR4, o a los pacientes que muestren alta expresión de las proteínas pEGFR y además alta expresión de las proteínas FGFR1 y/o FGFR4, y no administrar un tratamiento que comprenda al menos un inhibidor de EGFR y al menos un inhibidor de FGFR a los pacientes que no muestren alta expresión de pEGFR y además alta expresión de los genes FGFR1 y/o FGFR4, o a los pacientes que no muestren alta expresión de la proteína pEGFR y además alta expresión de las proteínas FGFR1 y/o FGFR4, en el que la alta expresión se basa en la comparación del nivel de expresión de estos biomarcadores con el nivel de expresión en muestras de referencia para cada biomarcador. En una realización preferida del método de tratamiento de la invención, el cáncer de pulmón se selecciona entre adenocarcinoma y carcinoma epidermoide. En una realización todavía más preferida del método de tratamiento de la invención, el cáncer de pulmón es adenocarcinoma. En otra realización, la presente invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar la respuesta de un sujeto que sufre cáncer de pulmón a un tratamiento combinado con al menos un inhibidor de EGFR y con al menos un inhibidor de FGFR, en el que dicho sujeto no ha recibido un tratamiento previo con inhibidores de EGFR y no ha desarrollado por tanto resistencia adquirida a dicho tratamiento con inhibidores de EGFR, que comprende determinar en una muestra del sujeto la expresión de pEGFR y, además, determinar la expresión de al menos uno de los biomarcadores FGFR1 y/o FGFR4, comparar dicha expresión con una muestra de referencia, en el que la alta expresión de pEGFR y además la alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4 es indicativa de que el sujeto que sufre cáncer de pulmón va a responder al tratamiento. Otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención.

Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos aquí usados tienen el mismo significado a los habitualmente entendidos por una persona experta en el campo de la invención. Métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos pueden ser usados en la práctica de la presente invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes, no tienen carácter limitativo y por lo tanto no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El término "comprende", además, incluye el término "consiste".

La presente invención demuestra por primera vez que la función pro-oncogénica de los genes FGFR1 y FGFR4 en el cáncer de pulmón está relacionada, funcional y físicamente, con el receptor EGFR.

Actualmente, no hay nada descrito acerca de que FGFR1 y/o FGFR4 cooperen con EGFR provocando resistencia primaria a fármacos anti-EGFR. La presente invención propone la determinación de los niveles proteicos de pEGFR y los niveles proteicos o de ARNm de FGFR1 y/o FGFR4, para seleccionar pacientes que van a responder bien a la terapia combinada de inhibidores EGFR y FGFR. Todo lo descrito hasta la fecha sobre la administración conjunta de inhibidores EGFR y FGFR se refiere a resistencias adquiridas, es decir, resistencias que han aparecido en los sujetos tras el tratamiento con inhibidores de EGFR en monoterapia. Está descrito que tras el tratamiento con inhibidores de EGFR puede inducirse en el tumor la expresión de FGFR1 o FGFR2, o pueden producirse mutaciones en estos genes que generen resistencia adquirida a la inhibición EGFR. Los pacientes que tienen este tipo de tumores ya resistentes a la terapia anti-EGFR podrían beneficiarse teóricamente de la combinación de inhibidores anti-EGFR y anti-FGFR. La presente invención demuestra por primera vez que hay tumores que, antes de ser tratados con inhibidores anti-EGFR, presentan alta expresión de FGFR1 y/o de FGFR4, lo que les confiere resistencia primaria al tratamiento con inhibidores de EGFR (en contraposición con la resistencia adquirida después del tratamiento), lo que permite a estos sujetos beneficiarse de terapias para el tratamiento de cáncer de pulmón que comprendan una combinación de los inhibidores anti-EGFR y anti-FGFR.

El presente documento de patente también muestra por primera vez que los tumores con alta activación de EGFR y alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4 incluso en el caso de los tumores con EGFR nativo, pueden beneficiarse de la terapia combinada de dichos inhibidores anti- EGFR y anti-FGFR, siempre que presenten alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4.

En todas las realizaciones anteriores de la invención o grupo de invenciones relacionadas entre sí debe interpretarse que la "alta expresión de pEGFR", "alta expresión de FGFR1" y "alta expresión de FGFR4", se refieren a que dicha expresión es, al menos, 2 veces superior a la expresión de los mismos biomarcadores en una muestra de referencia. En una realización más preferida, la expresión del biomarcador debe ser al menos 5 veces superior a la de la muestra de referencia. En una realización todavía más preferida, la expresión del biomarcador debe ser al menos 10 veces superior a la de la muestra de referencia.

EJEMPLOS

Materiales y métodos Análisis de la expresión génica

Extracción de ARN

Para la extracción del ARN de las líneas celulares se usó el reactivo Trizol (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. Posteriormente, el ARN se precipitó con isopropanol, se lavó con etanol al 75% y fue resuspendido en agua DEPC (agua tratada con dietilpirocarbonato).

Para la extracción de ARN total de tejido fijado con formalina y conservado en parafina se desparafinaron las láminas de tejido tumoral mediante el uso de Xilol. El ARN total se extrajo usando el kit de extracción RecoverAII (Life Technologies), usando las instrucciones del fabricante para la extracción de ARN de tejido biológico.

Una vez extraído el ARN, su concentración se cuantificó por medio del equipo NanoDrop (ThermoScientific) y se conservó a -80°C para su posterior uso.

Retrotranscripcion de ARN Se retrotranscribieron las muestras de ARN usando el kit de retrotranscripcion TaqMan Reverse Transcription (Life Technologies), siguiendo las instrucciones del fabricante. En cada reacción se utilizaron 1000 ng de RNA en 10 μί, con 10 L de master mix, en un volumen final de 20 μί. Las reacciones fueron sometidas al protocolo de termociclación 10 minutos a 25°C, 120 minutos a 37°C y 5 minutos a 85°C. Preamplificación del ADNc

El ARN extraído del tejido parafinado se preamplificó usando el kit TaqMan Preamp Master Mix kit (Applied Biosystems), siguiendo las instrucciones del fabricante. El volumen final de la reacción de amplificación fue de 10 y se añadieron 100 ng de cDNA totales por reacción. Empleamos el protocolo de preamplificación de 14 ciclos descrito en las instrucciones del fabricante (10 minutos a 95°C, 14 ciclos de: 15 segundos a 95°C y 4 minutos a 60°C). Tras la preamplificación, las muestras se diluyeron 1 :20 previamente a la realización de la PCR cuantitativa. PCR cuantitativa a tiempo real

Cada reacción de PCR a tiempo real se realizó por triplicado, según el protocolo indicado por el fabricante para las sondas Taqman (ThermoFisher) y la master mix de TaqMan para qPCR (ThermoFisher). El volumen final de cada reacción fue de 10 μΙ_, que contenían 5 μΙ_ de la master mix, 2,5 μΙ_ de la sonda TaqMan del gen en estudio, y 2,5 μΙ_ de muestra de cDNA. La concentración de las muestras de cDNA fue de 25 ng/μί en el caso de las muestras no preamplificadas. En las muestras previamente preamplificadas, se usaron 2,5 μΙ_ de la dilución 1 :20 de la reacción de preamplificación. Además, para cada sonda se llevó un control negativo sin muestra de cDNA, para descartar contaminaciones en el agua, en la master mix o en la sonda. Se siguió un protocolo de termociclación de 40 ciclos (10 minutos a 95°C, 40 ciclos de: 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C).

La cuantificación relativa de la expresión de ARNm se determina a partir de los valores Ct obtenidos en la reacción, definiendo Ct como el número del ciclo en el que se detecta señal de amplificación del gen diana por encima de un umbral predeterminado, que permite discernir entre una señal de amplificación real y ruido. Para cada muestra se calculó la media de tres replicados técnicos para cada gen, y este valor medio de Ct se normalizó con el Ct del gen endógeno de control de carga (Gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, GAPDH, para extractos de líneas celulares y Beta-2-microglubina, B2M, para extractos de tumores), obteniéndose el valor ACt. Los niveles de expresión se representaron en la forma 2 ^"Δα que es más intuitiva debido a que valores más altos de 2 ^"Δα indican mayor expresión del gen.

En el caso de la determinación de expresión de ARNm en extractos procedentes de líneas celulares, se calculó la media y desviación estándar de los valores de 2 ^"Δα procedentes de tres replicados biológicos independientes. Los ensayos empleados en la preamplificación y en la determinación de la expresión de ARNm están descritos en la Tabla 1. Tabla 1. Ensayos usados para la determinación de la expresión de ARNm de genes de interés.

Gen diana Referencia Proveedor

FGFR1 Hs00917379 m1 Life technologies

FGFR4 Hs01 106908 m1 Life technologies

B2M Hs99999907 m1 Life technologies

GAPDH Hs99999905 m1 Life technologies

Análisis de proteínas

Para determinar la expresión de proteínas de las muestras, en primer lugar, se extrajeron las proteínas totales. Las células de las líneas celulares se lavaron con PBS dos veces y se añadió tampón de lisis (RIPA (Sigma), suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (cOmplete Mini EDTA-free, Roche) y un cóctel de inhibidores de fosfatasas (PhosSTOP EASYpack, Roche) a la concentración recomendada por el fabricante). Los lisados celulares se recogieron mediante raspado en hielo y se añadieron a un tubo. Los restos de celulares se eliminaron por centrifugación a 15000 x g durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante (extracto proteico) se guardó en alícuotas a -80°C. La cuantificación de los extractos proteicos se realizó usando el método Bradford modificado (BioRad), según las instrucciones del fabricante, utilizando como control concentraciones conocidas de albúmina sérica (BSA).

Las proteínas totales de los tumores procedentes de xenoinjertos se obtuvieron añadiendo el tampón de lisis sobre el fragmento de tejido previamente pulverizado en un mortero pre-enfriado con nitrógeno líquido para evitar la descongelación del fragmento, se incubó en hielo durante 2 horas, agitando cada 10 minutos, y se recogió el volumen en tubos de 2 mL que se centrifugaron a 15000 xg durante 10 minutos a 4°C para eliminar los restos de tejido sin disgregar y el sobrenadante se guardó a -80°C. El buffer de extracción y el método de cuantificación usados fueron los mismos que en el caso de la extracción proteica de líneas celulares.

Western blot

Se añadió a las muestras tampón de carga 5X (Tris-HCI 62,5 mM pH 6,8, glicerol 10%, SDS 1 %, 2-mercaptoetanol 5%, azul de bromofenol 0,0025% (Sigma)) y se desnaturalizaron durante 5 minutos a 95°C. A continuación, se procedió a su carga en el gel de electroforesis para realizar el western blot, o se almacenaron a -20°C.

La inmunodetección de proteínas se realizó de acuerdo a un protocolo estándar sobre membranas de PDVF (GE Healthcare). Las proteínas se separaron en geles de poliacrilamida- SDS utilizando un tampón de electroforesis IX Tris HCI 0,13 M, glicina 0,95 M, SDS 0,5% y se transfirieron a membranas de PDVF utilizando un equipo Trans-Blot Turbo (BioRad). La transferencia se realizó a 400 mA durante 3 horas en tampón de transferencia (TrisHCI 0,025 M, glicina 0,2 M, 20% metanol). Las membranas se bloquearon durante 1 hora en agitación con el tampón de bloqueo (TBS, 0,1 % Tween20 y 1 % BSA). Posteriormente las membranas se incubaron con la dilución adecuada de anticuerpo primario durante 16 horas a 4°C. Tras esta incubación, las membranas se lavaron con buffer de lavado (TBS 0,1 % Tween-20) y se incubaron con una dilución 1 :5000 del anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado, durante una hora a temperatura ambiente. La detección se realizó mediante una reacción quimioluminiscente (ECL Clarity, Biorad) y la visualización mediante un equipo de detección de luminiscencia (ChemiDoc, BioRad).

Los anticuerpos empleados en los ensayos aquí descritos se indican en la Tabla 2. Tabla 2: Anticuerpos empleados para determinar la expresión proteica de las proteínas de interés

Tipo Diluc. Diluc.

Proteína diana Peso mol. Ref. Proveedor

anticuerpo western blot inmunofl

FGFR1 Mon. conejo 150 kDa 9740 CST 1 : 1000 1 : 100

FGFR4 Mon. conejo 100 kDa 8562 CST 1 : 1000 1 : 100 pFGFRI Pol. conejo 150 kDa 06-1433 Millipore 1 :2000 -

(Tyr653/654)

pFGFR4 (Tyr642) Pol. conejo 100 KDa MBS856043 MyBiosource 1 :2000 -

AKT Pol. conejo 60 KDa 9272 CST 1 : 1000 - pAKT (Ser473) Pol. conejo 60 KDa 9271 CST 1 : 1000 - p42/p44 (ERK1/2) Pol. conejo 42/44 kDa 9102 CST 1 : 1000 - p-p42/p44 Pol. conejo 42/44 kDa 9101 CST 1 : 1000 -

(ERK1/2)

(Thr202/Tyr204)

STAT3 Mon. ratón 80 kDa 9139 CST 1 : 1000 - pSTAT3 (Tyr705) Pol. conejo 80 kDa 9145 CST 1 : 1000 -

EGFR Mon. conejo 160 kDa 4267 CST 1 : 1000 -

EGFR Mon. ratón 160 kDa MA5- 13269 ThermoFisher - 1 : 100 pEGFR (Tyr1068) Pol. conejo 160 kDa 2234 CST 1 : 1000 - a-Tubulina Mon. ratón 55 kDa T9206 Sigma 1 :5000 -

Sec. anti-conejo Pol. cabra 7074 CST 1 :5000 -

(HRP)

Secundario antiPol. caballo 7076 CST 1 :5000 - ratón (HRP)

Sec. anti-conejo Pol. cabra R371 16 ThermoFisher - 1 :250

(Alexa Fluor 488)

Sec. anti-ratón Pol. burro A-31570 ThermoFisher - 1 :250

(Alexa Fluor 555)

Mon = Anticuerpo monoclonal. Pol = anticuerpo policlonal. Peso mol = peso molecular. Ref = referencia. Diluc = Dilución. Inmunofl = inmunofluorecencia. HRP = peroxiadasa de rábano. Para cuantificar las bandas detectadas en los ensayos de western blot, se utilizó el software incluido en el equipo de detección de quimioluminiscencia (ImageLab, BioRad). Se cuantificó el volumen de la banda de la proteína de interés y éste fue normalizado con el volumen de la banda correspondiente al gen de expresión constitutiva, que sirvió como control de carga (alfa tubulina, también llamado tubulina). El valor de referencia de un biomarcador en una muestra de referenciase calcula a partir del valor de la cuantificación de su expresión en tres líneas celulares que no expresan o tienen un nivel de expresión que no tiene efecto en la célula. Los valores de esta cuantificación se normalizan como se ha indicado anteriormente y se calcula la media aritmética de la expresión normalizada del biomarcador en las tres líneas celulares. En el caso de los biomarcadores FGFR1 y de FGFR4, la expresión de la muestra de referencia se ha calculado a partir de las líneas celulares H2009, H358 y H1650. En el caso de pEGFR, la muestra de referencia se ha calculado a partir de la expresión del biomarcador en las líneas celulares A459, H460 y H2009. Biología celular

Se utilizó un panel de líneas celulares cuyas características se recogen en la Tabla 3.

Tabla 3: Líneas celulares de pulmón

Línea Tipo Mutación conductora

Ref. Medio de cultivo celular histológico descrita

A549 ADC KRAS p.G12S Helfrich 2006 DMEM suplementado con piruvato de sodio, HEPES y aminoácidos no esenciales

H460 ADC KRAS p.Q61 H Helfrich 2006 RPMI 1640

H2009 ADC KRAS p.G12A COSMIC RPMI 1640

H358 ADC KRAS p.G12C Helfrich 2006 RPMI 1640

H1650 ADC EGFR E746-E750 del Blanco 2009 RPMI 1640

H1975 ADC EGFR L858R/T790M COSMIC RPMI 1640

HCC827 ADC EGFR E746-E750 del Helfrich 2006 RPMI 1640

H3122 ADC Translocación EML4-ALK v1 COSMIC RPMI 1640

H2228 ADC Translocación EML4-ALK v3 COSMIC RPMI 1640

H1781 ADC

H1437 ADC

Calu-3 ADC TN Helfrich 2006 DMEM

NL20 I TN COSMIC F12 suplementado siguiendo las indicaciones de la ATCC

NuLi-1 I TN COSMIC LHC9

ADC = Adenocarcinoma, ESC = Carcinoma epidermoide, TN = Triple negativo (nomenclatura referida a líneas celulares sin alteraciones en KRAS, EGFR o ALK), I = Inmortalizada

Cultivo de las líneas celulares

Las líneas celulares se cultivaron siguiendo las indicaciones de la ATCC suplementando además todos los medios con 40 μ/mL de penicilina (Sigma), 40 μg/mL de esteptomicina (Sigma) y 1 μg/mL de anfotericina B (Sigma) y con glutamina (Sigma) en el caso de los medios que no incluían en su composición glutamina estable. Las células se cultivaron en placas de 10 cm y se subcultivaron 1 :4 cada 2-3 días mediante tratamiento con tripsina. La manipulación de las líneas celulares se realizó en una cabina de flujo laminar de tipo ll-Bio-ll-A (nivel de bioseguridad 2) y su cultivo de realizó en incubadores (ThermoScientific, Series 8000 Water- Jacketed CO2 I ncubators) al 95% de humedad relativa y al 5% de CO2. Los ensayos en los que se estimularon las líneas celulares con suero fetal bovino (SFB) se sembraron y al alcanzar un 60-70% de confluencia se incubaron durante 5 horas con medio sin SFB. Entonces, por un lado, se obtuvieron extractos proteicos correspondientes al estado basal, y por otro lado se procedió a la estimulación con SFB al 10%. Las células se estimularon durante 15 minutos y se procedió a la extracción proteica (explicada anteriormente).

Transfeccion celular

Las líneas celulares se transfectaron con los plásmidos descritos en la Tabla 4. Para ello se empleó el reactivo de transfeccion TranslT-X2 (Mirus), siguiendo las instrucciones del fabricante. 24 horas antes de la transfeccion se sembraron las células en placas de 6 pocilios, buscando aproximadamente un 40% de confluencia en cada pocilio para el día de la transfeccion. Antes de la transfeccion, se cambió el medio a las células añadiendo 2,5 mL de medio. A continuación, se añadieron las partículas de transfeccion con el ADN y las células se incubaron con éstas durante 72 horas. Tras este tiempo, las células se pasaron a placas de 10 cm y, una vez adheridas a la placa (tras unas 24 horas), se añadió medio fresco con el antibiótico de selección a la concentración adecuada. Como control negativo de la transfeccion se utilizó una placa con la línea celular sin transfectar también expuesta al medio de selección. Durante el proceso de selección de las células transfectadas (3 o 4 semanas), el medio de cultivo con antibiótico se fue renovando 3 veces por semana. Tras este periodo, se comprobó que en el control negativo ninguna célula sobreviviera. Las colonias generadas se tripsinizaron y se resembraron en una nueva placa, estableciendo un pool de los diferentes clones transfectados, con el que se constituyó una línea celular transfectada estable. En la línea generada se confirmó la sobre-expresión o el silenciamiento realizado de acuerdo con los ejemplos descritos a continuación y se criopreservó. Durante el cultivo de las líneas generadas se mantuvo en presencia de antibiótico de selección a la mitad de concentración de la utilizada durante la selección. En cada transfeccion se utilizó el antibiótico apropiado según el plásmido transfectado a la concentración adecuada según la línea celular (Tabla 5): puromicina (Calbiochem), blasticidina (Sigma) o G418 (Santa Cruz). En el caso de las transfecciones con plásmidos con un gen reportero (GFP) se amplificaron las células y posteriormente se separaron las transfectadas mediante un separador celular por citometría de flujo usando el equipo BD LSRFortessa (BD).

En el caso de las transfecciones de RNAs de interferencia ("short hairpin shRNAs", shRNAs), se generaron dos líneas celulares estables con silenciamiento de la expresión del gen de interés, utilizando en cada una un shRNA diferente, a fin de asegurar que los efectos observados no derivaban del silenciamiento inespecífico de la expresión de un gen diferente. La transfeccion se llevó a cabo utilizando los plásmidos pRS (puromicina) o pB-RS (blastomicina) de acuerdo con la Tabla 4.

En el caso de las co-transfecciones de más de un plásmido en una misma línea celular, las transfecciones se realizaron de forma independiente y subsecuente. Los antibióticos de selección de los plásmidos transfectados se mantuvieron en el medio a la concentración de mantenimiento para mantener una presión selectiva, combinando dos o tres antibióticos. El único momento en que el/los antibióticos de selección no estuvieron presentes fueron durante el periodo de incubación de las células con el reactivo de transfeccion (72 horas), ya que éstos podrían interferir con la transfeccion, disminuyendo su eficiencia.

Tabla 4. Plásmidos empleados en los ensayos

Método de

Nombre Vector Ref. Proveedor Uso

selección

pCMV6 pCMV6 G418 PS100001 Origene Control sobreexpresión de

FGFR1 y FGFR4

PCMV6-FGFR1 pCMV6 G418 RC202080 Origene Sobreexpresión de FGFR1

PCMV6-FGFR4 pCMV6 G418 RG204230 Origene Sobreexpresión de FGFR4 pRS scramble pRS Puromicina TR20003 Origene Control del silenciamiento de shRNA FGFR1 y FGFR4

pRS-shRNA- pRS Puromicina TR320356 Origene Silenciamiento por shRNA de

FGFR4 FGFR4

pBABE pBABE Puromicina #51070 Addgene Control sobreexpresión de

EGFR silvestre y mutado pBABE-wtEGFR pBABE Puromicina #1 101 1 Addgene Sobreexpresión de EGFR silvestre

pBABE-EGFR pBABE Puromicina #32073 Addgene Sobreexpresión de EGFR con

(L858R/T790M) Imutaciones L858R/T790M

Los vectores control se corresponden con los vectores vacíos. Tabla 5: Concentraciones de antibióticos empleadas.

Línea celular G418 Puromicina Blasticidina

A549 2 ug/mL

H460 2 mg/mL

H2009 1 mg/mL 3 ug/mL

H1650 1 mg/mL

H1975 1 mg/mL

HCC827 1 mg/mL

H3122 2 mg/mL 3 ug/mL

Calu-3 2 ug/mL

NL20 1 mg/mL 1 ug/mL 2 ug/mL

Ensayos de tumorigenicidad

Los ensayos de tumorigenicidad se repitieron un mínimo de tres veces a fin de confirmar los resultados. Además, dentro de cada repetición del experimento, cada condición se sembró por triplicado. a) Curva de crecimiento

Se sembraron 3500 células por pocilio en placas de 12 pocilios. A las 24 horas (día 0) se fijaron las células del primer punto de la curva, y cada 24-48 horas se fijó un nuevo punto de la curva y se cambió el medio al resto. Las placas fijadas se conservaron con las células en PBS a 4°C hasta que todos los puntos de la curva estuvieron fijados. A continuación, se tiñeron las placas con cristal violeta durante 20 minutos, las placas se lavaron y se dejaron secar. Una vez secas, se añadió ácido acético al 20% en cada pocilio para diluir el cristal violeta y se midió la absorbancia a 595 nm en un equipo de lectura óptica VICTOR (PerkinElmer). Todas las absorbancias se normalizaron con respecto a la absorbancia del día 0 de cada condición experimental. Por último, se representó este valor normalizado (crecimiento relativo al día 0 en el eje Y) con respecto al tiempo (días, eje X).

b) Ensayo de clonabilidad

Se sembró un número de células de entre 1000 y 5000 células, según la línea celular, en placas de 10 cm. El medio se renovó una vez a la semana durante 2 o 3 semanas dependiendo de la línea celular. Tras este tiempo, las células se fijaron con una solución de glutaraldehído en PBS al 0,5% durante 20-30 minutos y se tiñeron con una solución de cristal violeta al 1 % en agua. Tras lavar y secar las placas, se cuantificó el número de colonias.

b) Crecimiento libre de anclaje (Ensayo de agar blando)

Se resuspendieron 100000 células/pocilio en medio con agarosa al 0,35%, que se sembraron sobre una base de medio con agarosa al 0,7% previamente solidificado en placas de 6 pocilios. Tras 24 horas se añadieron 3 mL de medio completo a cada pocilio, que se renovó dos veces por semana. Tras uno o dos meses, dependiendo de la línea en ensayo, se tomaron fotos de las colonias por medio de un microscopio (#IX2-SLP, Olympus) con cámara integrada (#U- CMAD3, Olympus). En estas fotos se cuantificó el número de colonias y se determinó su tamaño. El resultado se representa en una gráfica que muestra el número de colonias relativo (respecto al tiempo 0) de las células que sobreexpresan o inhiben la expresión de un gen comparado con las células control, transfectadas con el vector vacío. Se determinó si la diferencia en el número relativo de colonias respecto al control es estadísticamente significativa (*p-valores menores de 0,05, ** p-valores menores de 0,01 , y *** p-valores menores de 0,001). Co-inmunolocalización

Se sembraron las células en cubreobjetos estériles y se fijaron con una solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 15 minutos. Tras dos lavados con PBS, las células se impermeabilizan con una solución al 0,1 % de Tritón X-100 en PBS durante 5 minutos. A continuación, se incuban durante una hora en solución de bloqueo (PBS, 0, 1 % Tritón X-100, 1 % SAB) a temperatura ambiente. Posteriormente, se incuban con la dilución apropiada en solución de bloqueo de anticuerpo primario, durante 3 horas a temperatura ambiente. Tras tres lavados con PBS 0, 1 % Tritón X-100 de 5 minutos de duración y en agitación, se incubaron las células con el anticuerpo secundario a la dilución apropiada, en solución de bloqueo, 1 hora a temperatura ambiente. En un microscopio confocal (SP5-WLL), se realizan fotos de al menos 20 células por condición experimental en las distintas réplicas del experimento para analizar la co-localización de las proteínas en estudio.

Co-lnmunoprecipitación de proteínas de membrana

Se extrajeron las proteínas totales tal y como se ha descrito anteriormente, pero usando un tampón de extracción 50 mM HEPES, 150 mM NaCI y al 1 % de n-octilglucósido, suplementado con un cóctel de inhibidores de proteasas (cOmplete Mini EDTA-free, Roche) y de fosfatasas (PhosSTOP EASYpack, Roche). Se cuantificó la concentración de proteínas totales de los extractos como se indica previamente y se prepararon alícuotas de 2 mg. En estas alícuotas, se realizó un pre-aclaramiento proteico mediante una incubación con 10 μΙ_ de resina EZ View Red Protein G Affinity Gel (Sigma), que se utilizó como sustrato de inmunoprecipitación durante 2 horas a 4°C en agitación suave. A continuación, se retiró la resina mediante centrifugación a 6000 g a 4°C durante 1 minuto. En paralelo al pre-aclaramiento, se conjugó la resina con el anticuerpo primario contra la proteína a inmunoprecipitar (anti-N-cadherina, descrito en la Tabla 2), incubando 10 μΙ_ de resina con 2 μg de anticuerpo por cada mg de proteína en la muestra en tampón de lisis al 3% de seroalbúmina bovina (SAB), durante 2 horas en agitación suave a 4°C. Como control negativo de la inmunoprecipitación, se utilizó una alícuota de la muestra proteica incubada con partículas conjugadas a un anticuerpo inespecífico del mismo isotipo que el anticuerpo contra la proteína de interés, a la misma concentración que éste. A continuación, se realizaron tres lavados de la resina conjugada con el anticuerpo con tampón de lisis, centrifugando entre lavados 1 minuto a 6000 g a 4°C para retirar el tampón usado y añadir nuevo. Posteriormente, se incubó la resina conjugada con el anticuerpo con la muestra durante 16 horas en agitación suave a 4°C. A continuación, se realizaron 5 lavados de la resina con el inmunoprecipitado resuspendiéndolo en tampón de lisis y posterior centrifugando 1 minuto a 6000 g a 4°C. Se descartó el sobrenadante, se añadieron 20-30 μΙ_ de tampón de lisis y se añadió tampón de carga 5X, como indicado anteriormente. Se hirvieron las muestras 5 minutos a 95°C y se centrifugaron a 12000 g durante 3 minutos. El sobrenadante se usó para realizar un western blot, tal como se ha descrito anteriormente, con el objetivo de detectar con anticuerpos específicos anti-N-cadherina, anti-FGFR1 y anti-FGFR4 la presencia de los biomarcadores en cada etapa de la inmunoprecipitación. De esta forma, se detecta si hay biomarcadores que co-inmunoprecipiten con N-cadherina, indicando una unión en la membrana celular. Como controles de la inmunoprecipitación, se conservaron dos alícuotas del extracto proteico, una anterior y otra posterior a la inmunoprecipitación. Inhibidores químicos

Se emplearon diferentes moléculas inhibidoras pequeñas en los tratamientos de líneas celulares y xenoinjertos celulares y de tumores derivados de pacientes ("Patient-derived xenografís", PDXs). Se seleccionaron dos inhibidores selectivos de FGFR: BGJ398 (#S2183, Selleckchem) y AZD4547 (#S2081 , Selleckchem); y dos inhibidores de EGFR: erlotinib (Tarceva, Genetech) y osimertinib (#S7297, Selleckchem).

Estimulación de líneas celulares con factores de crecimiento

Se sembraron las células, y al alcanzar un 60-70% de confluencia se incubaron durante 5 horas con medio sin SFB. Entonces, por un lado, se obtuvieron extractos proteicos correspondientes al estado basal, y por otro lado se procedió a la estimulación con diferentes factores de crecimiento añadiendo medio sin suero con FGF1 (50 ng/mL, Immunostep), FGF19 (100 ng/mL, Immunostep), EGF (50 ng/ml, Immunostep) o SFB al 10%. Las células se estimularon durante 15 minutos y se procedió a la extracción proteica.

Técnicas de experimentación animal

Todos los procedimientos realizados con animales fueron aprobados por el Comité de Protección Animal de la Comunidad autónoma de Madrid (PROEX134/16).

a) Xenoinjertos con líneas celulares en ratones inmunodeprimidos

Se contaron las células de la línea celular a xenoinjertar y se preparó a una concentración final de 2 millones de células en 100 μΙ_ de PBS. A continuación, se añadió solución de Matrigel (BD #356234) a la suspensión celular, a razón de 1 :1 , y se inyectaron subcutáneamente 200 μΙ_ en ambos flancos de ratones desnudos inmunodeprimidos de 5-6 semanas de edad, bajo anestesia por inhalación de isuoflurano.

b) Xenoinjertos de tumores derivados de pacientes (PDXs)

Los tumores, provenientes de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico, se implantan cubiertos de Matrigel (BD #356234) en el flanco de ratones desnudos inmunodeprimidos de 5- 6 semanas de edad, bajo anestesia por inhalación de isuofuorano y bajo analgesia por buprenorfina. Para realizar el implante, se realiza un pequeño corte en el flanco del ratón bajo anestesia y analgesia y se introduce el fragmento tumoral, de unos 100 mm ³ de volumen. c) Determinación del crecimiento tumoral de los xenoinjertos

El tamaño de los tumores generados por los xenoinjertos se midió semanalmente mediante un calibre de medición. Se midió la longitud más corta y la más larga de cada tumor y el volumen tumoral se calculó con la fórmula: 0,5 x (dimensión más larga) x (dimensión más corta) ² . Se representó la media de los volúmenes tumorales normalizados con respecto al tiempo. Ésta se calculó normalizando el volumen tumoral de cada medida a la primera medida realizada (7 días tras la implantación). El error medio se calculó con la fórmula: desviación estándar/Vñ, donde n es el número de tumores en cada grupo.

Una vez que los tumores alcanzaron los 1000 mm ³ de volumen, los ratones fueron sacrificados y los tumores extraídos. Las muestras tumorales fueron troceadas y se congelaron rápidamente en criotubos, para su conservación a -80°C y posterior extracción de ADN, ARN o proteína. d) Tratamientos de xenoinjertos de líneas celulares y PDXs

Se realizaron tratamientos con inhibidores de FGFR y EGFR mencionados anteriormente para comprobar su efecto en el crecimiento de los tumores producidos por los xenoinjertos de líneas celulares o por los PDXs. Para ello, se implantó el modelo de interés en el número de ratones apropiado para cada experimento (N=5 por cada grupo de tratamiento) y se monitorizó el crecimiento de los tumores generados. Una vez éstos alcanzaron un volumen de entre 150-200 mm ³ , los ratones se distribuyeron en los diferentes grupos de tratamiento incluyendo en cada grupo aquéllos con una media y desviación estándar similar de los tamaños de los tumores y dejando como control un grupo sin tratar. Una vez establecidos los grupos, comenzaron los tratamientos, de entre 3 y 5 semanas de duración, dependiendo de la velocidad de crecimiento de cada modelo.

Las concentraciones de fármacos utilizadas fueron de 7,5 mg/kg/día, administrado por vía oral de lunes a viernes, en el caso de AZD4547 en monoterapia. En los tratamientos combinatorios de erlotinib y AZD4547, se administró AZD4547 a 5 mg/kg/día de lunes a viernes, en monoterapia o en combinación con erlotinib por vía oral. La concentración de erlotinib, tanto en el grupo en monoterapia como en el grupo en combinación con AZD4547, fue de 50 mg/kg/día en el caso de los modelos que presentaban algún indicador de resistencia a erlotinib (generalmente la mutación L858R en EGFR), o de 20 mg/kg/día en el resto de modelos, tratándose de lunes a viernes en ambos casos. Al final del tratamiento, los ratones fueron sacrificados y los tumores procesados y almacenados como se indicaba anteriormente. e) Determinación de la inhibición del crecimiento de líneas celulares de fármacos en monoterapia (IC50)

Para determinar la sensibilidad a diferentes fármacos se empleó el ensayo de citotoxicidad de determinación de la IC50 (concentración de fármaco a la cual la proliferación celular se reduce al 50% con respecto al control no tratado). Se siembran en placas de 96 pocilios tres filas de 12 columnas con cada línea celular en ensayo y se añaden concentraciones decrecientes de fármaco en las 11 primeras columnas, dejando la última sin tratar. Este rango de concentraciones se decide en primer lugar buscando en la bibliografía los valores de IC50 de líneas celulares similares para el fármaco en estudio y se va ajusfando en función de la sensibilidad de la línea. Tras 96 horas de exposición al fármaco, las células se fijan y se tiñen con cristal violeta, como indicado anteriormente y las placas se lavan y se dejan secar. A continuación, el cristal violeta adherido a las células se disuelve en una solución de ácido acético al 20% y la absorbancia (595 nM) se mide en un equipo detector VICTOR (PerkinElmer). Posteriormente, se calcula la concentración que inhibe el 50% del crecimiento mediante el software de análisis bioestadístico GraphPad Prism.

f) Determinación de la sensibilidad a fármacos en combinación

Para determinar el efecto de la combinación de diferentes inhibidores se realizaron ensayos de determinación de IC50. Se seleccionó el valor medio aproximado de IC20 (concentración que inhibe el crecimiento un 20%) y el doble de esta concentración, para el inhibidor FGFR en ensayo, y estas concentraciones se combinaron con concentraciones decrecientes del inhibidor EGFR en ensayo. Para determinar el efecto de la combinación de dos fármacos, se utilizó la fórmula del método de Chou-Talalay. Esta fórmula calcula el índice de combinación ("Combination Idex", Cl), que compara la sensibilidad a los dos fármacos en combinación con respecto a la sensibilidad de los fármacos por separado, e informa sobre si la combinación de dos fármacos tiene un efecto antagónico (Cl>1), aditivo (Cl=1), o sinérgico (Cl<1).

/C50 Fármacol en combinación Concentración del fármaco! en combinación

Cl = +

/C50 Farmacol en monoterapia /C50 Farmaco2 en monoterapia

Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron usando el paquete de software estadístico SPSS (IBM), usando los test estadísticos que se detallan a continuación para obtener los p-valores. Se consideraron estadísticamente significativos aquéllos por debajo de 0.05, y estos valores se representaron gráficamente como * para p-valores < 0,05, ** para p-valores < 0,01 y *** para valores < 0,001.

a) Análisis de los experimentos in vitro e in vivo

Para analizar si las diferencias encontradas entre las diferentes condiciones testadas en los experimentos in vitro son estadísticamente significativas, se realizó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney, en los valores correspondientes a las réplicas biológicas independientes de los experimentos.

Para analizar si las diferencias de crecimiento de los tumores de las diferentes condiciones experimentales en los ensayos in vivo alcanzaban la significancia estadística, se realizó el mismo test en los valores correspondientes a los valores normalizados de los tamaños tumorales.

b) Análisis de las cohortes clínicas

Respecto a los datos clínicos, se usó el método de Kaplan Meier para el análisis de la supervivencia, usando el modelo de Log-Rank y el modelo de Cox de riesgos proporcionales para ajustar a las variables explicativas y obtener los p-valores. La supervivencia global se definió como el periodo de tiempo entre el diagnóstico y la última revisión clínica o fallecimiento, y la supervivencia libre de progresión se definió como el periodo de tiempo entre el diagnóstico inicial y el diagnóstico de recidiva.

Ejemplo 1. Expresión endógena de EGFR, FGFR1 y FGFR4 en líneas celulares de cáncer de pulmón

En primer lugar, se analizó la expresión endógena de EGFR, FGFR1 , FGFR4 y actividad de EGFR (pEGFR) en las líneas celulares descritas en la Tabla 3. Se seleccionaron líneas celulares con las diferentes alteraciones moleculares de mayor relevancia terapéutica en cáncer de pulmón (mutación en KRAS, mutación en EGFR, translocación EML4-ALK, o líneas sin ninguna de las alteraciones citadas, a las que denominaremos "triples negativas"), y dos líneas celulares de pulmón inmortalizadas.

Se determinó la expresión de EGFR, pEGFR, FGFR1 y FGFR4 a nivel proteico. Para ello se extrajeron las proteínas totales de las líneas celulares, se desnaturalizaron y se detectó la presencia de las proteínas mediante western blot utilizando los anticuerpos monoclonales correspondientes descritos en la Tabla 2. Como control de carga se utilizó tubulina. La Figura 1 muestra que la expresión de EGFR, pEGFR, FGFR1 y FGFR4 es desigual en las diferentes líneas celulares.

A continuación, se cuantificaron las bandas detectadas en el ensayo de western blot tal y como se ha descrito en los materiales y métodos de la presente memoria. Como muestra de referencia para evaluar la expresión de FGFR1 y de FGFR4, se usó la media de la expresión de estos receptores normalizada con tubulina en las líneas celulares H2009, H358 y H1650. En el caso de pEGFR, la muestra de referencia fue la media de la expresión del biomarcador normalizada con tubulina en las líneas celulares A459, H460 y H2009. Tabla 6. Cuantificación de la expresión de los biomarcadores en las muestras de referencia

Ejemplo 2. Efecto de la sobreexpresión de FGFR1 o FGFR4 en líneas celulares de adenocarcinoma dependiente de EGFR

Con el fin de evaluar si la expresión de FGFR1 y/o FGFR4 en células con alteraciones en EGFR tiene efectos tumorigénicos, se sobreexpresaron ambos receptores por separado en las tres líneas celulares de adenocarcinoma con EGFR mutado: H1975, HCC827 y H1650.

Se analizó la proliferación, la clonabilidad, el crecimiento libre de anclaje y el efecto en las rutas de señalización pro-oncogénicas sobreexpresando FGFR1 , con el fin de ver el efecto de la expresión de este receptor en la tumorigenicidad de líneas celulares con EGFR mutado.

La Figura 2 muestra la curva de crecimiento al 10% de SFB (A), la clonabilidad (B) y el crecimiento libre de anclaje (C). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Se muestran curvas de crecimiento representativas. Para la clonabilidad y el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra la media y desviación estándar de las réplicas, tras haber sido normalizadas a la condición control, que toma el valor de 1. Para el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra además la media y desviación estándar del tamaño de las colonias. EV = vector vacío, FGFR1 = línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , EGF = Factor de crecimiento epidérmico. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001). Se observa que la proliferación y la clonabilidad están aumentadas en las tres líneas celulares que sobreexpresan FGFR1. De entre estas líneas, solo la HCC827 es capaz de generar colonias en medio semisólido. El número de colonias producidas y su tamaño fueron mayores en condiciones de sobreexpresión de FGFR1 , con respecto a la línea control.

Estos resultados indican que la sobreexpresión de FGFR1 en líneas celulares de adenocarcinoma con mutaciones en EGFR tiene efecto tumorigénico. También se comprobó el efecto de la sobreexpresion de FGFR1 en la activación de rutas de señalización pro-oncogénicas relacionadas con el gen FGFR1 en dos de las líneas anteriores, H1975 y HCC827, en presencia o ausencia del factor de crecimiento EGF. Como se observa en la Figura 2D, en ausencia de estimulación con EGF, (EGF -) la sobreexpresion de FGFR1 produce una mayor activación de EGFR, STAT3 y AKT en ambas líneas y de ERK en HCC827. Tras la estimulación con EGF, la activación de EGFR también es mayor en las líneas con sobreexpresion de FGFR1 , en comparación con las líneas control. En estas líneas, FGFR1 muestra una gran activación tras su sobreexpresion, que se incrementa aún más tras la estimulación con EGF, lo que sugiere la existencia de una cooperación entre ambas vías. De la misma forma se analizó el efecto de la sobreexpresion de FGFR4 en líneas de adenocarcinoma con mutación en EGFR. La Figura 3 muestra las curvas de crecimiento al 10% de SFB (A), clonabilidad (B) y crecimiento libre de anclaje (C) y medida de la activación de rutas de señalización relacionadas con FGFR (D). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Se muestran curvas de crecimiento representativas. Para la clonabilidad y el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra la media y desviación estándar de las réplicas, tras haber sido normalizadas a la condición control, que toma el valor de 1. Para el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra además la media y desviación estándar del tamaño de las colonias. EV = vector vacío, FGFR4 = línea celular con sobreexpresion de FGFR4, EGF = Factor de crecimiento epidérmico. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001). Los resultados muestran que la proliferación y la clonabilidad están aumentadas en las tres líneas celulares que sobreexpresan FGFR4. El número de colonias producidas por la línea HCC827 en medio semisólido fue mayor en condiciones de sobreexpresion de FGFR4, con respecto a la línea control.

Estos resultados indican que la sobreexpresion de FGFR4 en líneas celulares de adenocarcinoma con mutaciones en EGFR tiene efecto tumorigénico.

En la Figura 3D se observa que en ausencia de estimulación con el factor de crecimiento EGF, la activación de EGFR, STAT3 y AKT es mayor cuando se sobreexpresa FGFR4. Al estimular con EGF, se observa mayor activación de EGFR en ambas líneas en condiciones de sobreexpresion de FGFR4, con respecto al control. En el caso de H1975, la sobreexpresion de FGFR4 induce una mayor activación de STAT3 también al estimular con EGF. En HCC827, la sobreexpresion de FGFR4 provoca una mayor activación de AKT y p42/p44 tras la estimulación con EGF. Al igual que ocurre con FGFR1 , se detectaron altos niveles de FGFR4 activado en estas líneas tras la sobreexpresion del receptor, que se ven aún más aumentados en condiciones de estimulación con EGF.

Por lo tanto, a partir de los resultados anteriores se deduce que la sobreexpresion de cualquiera de los FGFRs (FGFR1 o FGFR4) induce una sobreactivación de EGFR en líneas de adenocarcinoma de pulmón, lo que sugiere la existencia de una relación de cooperación entre ambos tipos de receptores.

Con el objetivo de profundizar en el mecanismo de cooperación entre los FGFRs y EGFR, y además, comprobar si la activación de los FGFRs produce también la activación de EGFR, se estimularon con factores de crecimiento que se unen específicamente a FGFR1 y FGFR4, las líneas H1975 y HCC827 con sobreexpresión de estos receptores FGFR.

Como se observa en el western blot de la Figura 4, la estimulación con FGF1 (factor de crecimiento específico de FGFR1) o con FGF19 (Factor de crecimiento específico de FGFR4) de las dos líneas celulares cuando sobreexpresan FGFR1 o FGFR4 respectivamente, incrementa la fosforilación no solo del receptor correspondiente, como cabría esperar, sino también la de EGFR con respecto a su línea control. EV= vector vacío, FGFR1 = línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = línea celular con sobreexpresión de FGFR4, FGF1 = Factor de crecimiento fibroblástico 1 , FGF19 = Factor de crecimiento fibroblástico 19.

Ejemplo 3. Efecto del silenciamiento de FGFR4 en una línea de adenocarcinoma dependiente de EGFR.

Entre las líneas celulares en estudio mostradas en la Figura 1 , se puede observar que la línea celular de adenocarcinoma Calu-3 muestra gran activación de EGFR a pesar de no presentar mutaciones en el gen de este receptor. Además, los niveles de expresión proteica de FGFR4 en esta línea son muy altos. Aprovechando estas características, y a fin de estudiar la cooperación entre FGFR4 y EGFR, se silenció FGFR4 en esta línea celular, tal y como se describe en los materiales y métodos del presente documento.

La Figura 5 muestra el efecto del silenciamiento de FGFR4. Se observa que este silenciamiento provoca una disminución en el crecimiento (Figura 5A), de la clonabilidad (Figura 5B) y de la formación de colonias en el ensayo de crecimiento libre de anclaje (Figura 5C), en comparación con la línea control. En concordancia con estos efectos observados, el silenciamiento también provoca una disminución de la activación de EGFR, FGFR4, STAT3, AKT y p42/p44 (Figura 5D). Todos estos datos sugerían que la cooperación observada entre FGFR4 y EGFR no es exclusivamente dependiente de la presencia de mutaciones activadoras de EGFR, sino que ocurre en otras circunstancias con activación de este receptor.

Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Se muestran curvas de crecimiento representativas. Para la clonabilidad y el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra la media y desviación estándar de las réplicas, tras haber sido normalizadas a la condición control, que toma el valor de 1. Para el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra además la media y desviación estándar del tamaño de las colonias. Control = shRNA inespecífico, shFGFR4 = silenciamiento de FGFR4 (sh1 y sh2 corresponden a dos shRNAs diferentes para silenciar FGFR4), SFB = Suero fetal bovino. Los p-valores se encuentran representados por asteriscos (*, p<0.05; **, p<0.01 ; ***, p<0.001).

Ejemplo 4. Efecto de la co-expresión de EGFR nativo o mutado con FGFR1 o con FGFR4 en una línea inmortalizada de pulmón

A fin de confirmar si la cooperación entre EGFR y los FGFRs es independiente de la presencia de las mutaciones activadoras en EGFR, se generó un modelo in vitro para reproducir esta interacción. Partiendo de la línea celular de pulmón inmortalizada, NL20, se generaron varias líneas celulares con sobreexpresión estable de FGFR1 o FGFR4, en co-sobreexpresión, o no, con EGFR. Se seleccionó una línea inmortalizada, dado que este tipo de líneas generalmente presentan menos alteraciones oncogénicas que las líneas tumorales, y que pueden influir en los efectos observados.

Con el objetivo de analizar si esta cooperación es exclusiva del receptor EGFR mutado, se emplearon la variante nativa de EGFR (SEQ ID NO: 5) y una variante mutada, L858R/T790M (EGFRm, SEQ ID NO: 6), con activación constitutiva del receptor.

El efecto de la co-sobreexpresión de EGFR nativo o mutado junto con FGFR1 o FGFR4 se observa en la Figura 6. Las curvas de crecimiento de las diferentes líneas celulares al 0,5% de SFB muestran diferencias en la proliferación celular (A). Se observa que la sobreexpresión de cualquiera de los dos FGFRs o del EGFR nativo ocasiona un aumento del crecimiento, en comparación con la línea control con el doble plásmido vacío. Al co-sobreexpresar cualquiera de los dos FGFRs junto con EGFR nativo, se produce un mayor incremento en la proliferación. La sobreexpresión de EGFR mutado muestra una mayor proliferación, mayor incluso que la co- sobreexpresión del EGFR nativo con los FGFRs. Además, la co-sobreexpresión de cualquiera de los dos FGFRs con EGFR mutado produce el mayor aumento de todos en la capacidad de proliferación. Estos resultados obtenidos en las curvas de crecimiento se correlacionan con los ensayos de clonabilidad (Figura 6B) y los de crecimiento libre de anclaje (Figura 6C).

Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Se muestran curvas de crecimiento representativas. Para la clonabilidad y el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra la media y desviación estándar de las réplicas, tras haber sido normalizadas a la condición control, que toma el valor de 1. Para el ensayo de crecimiento libre de anclaje, se muestra además la media y desviación estándar del tamaño de las colonias. Para la clonabilidad se muestran tablas con los p-valores de la comparación entre las diferentes condiciones del experimento, dos a dos. EV1 = vector vacío 1 , EV2 = vector vacío 2, FGFR1 = línea celular con sobreexpresión de FGFR1 , FGFR4 = línea celular con sobreexpresión de FGFR4, EGFR = línea celular con sobrexpresión de EGFR nativo, EGFRm = línea celular con sobreexpresión de EGFR con las mutaciones L858R/T790M. Las Tablas 7, 8 y 9 muestran los p-valores de la comparación de la clonabilidad (Tabla 7), el crecimiento libre de anclaje (Tabla 8) y el tamaño relativo de las colonias (Tabla 9) entre las diferentes líneas celulares ensayadas.

Tabla 7. Clonabilidad. P-valores para la comparación del número relativo de colonias entre líneas celulares dos a dos.

FGFR1 - FGFR4- EV1 - FGFR1 - FGFR4- EV1 - FGFR1 -

EV1 -EV2

EV2 EV2 EGFR EGFR EGFR EGFRm EGFRm

EV1 -EV2

FGFR1 -EV2 0,002

FGFR4-EV2 0,040 0,749

EV1 -EGFR 0,040 0,631 0,749

FGFR1 -EGFR 0,002 0,150 0,200 0,078

FGFR4-EGFR 0,002 0,262 0,423 0,262 0,631

EV1 -EGFRm 0,004 0,584 0,715 0,100 0,465 0,715

FGFR1 -EGFRm 0,073 0,361 0,144 0,273 0,584 0,361 0,465

FGFR4-EGFRm 0,004 0,100 0,045 0,361 0,465 0,144 0,251 0,754

Tabla 8. Crecimiento libre de anclaje. P-valores para la comparación del número relativo de colonias entre líneas celulares dos a dos.

FGFR1 - FGFR4- EV1 - FGFR1 - FGFR4- ΛΝ FGFR4-

EV2 EV2 EGFR EGFR EGFR EGFRm EGFRm

EV1 -EV2

FGFR1 -EV2 0,005

FGFR4-EV2 0,005 0,69

EV1 -EGFR 0,008 0,347 0,295

FGFR1 -EGFR 0,008 0,047 0,008 0,175

FGFR4-EGFR 0,008 0,016 0,008 0,047 0,402

EV1 -EGFRm 0,008 0,032 0,008 0,1 17 0,465 0,602

FGFR1 -EGFRm 0,008 0,008 0,008 0,016 0,076 0,347 0,175

FGFR4-EGFRm 0,008 0,008 0,008 0,016 0,1 17 0,602 0,347 0,754

Tabla 9. Tamaño relativo de las colonias. P-valores para la comparación del número relativo de colonias entre líneas celulares dos a dos.

FGFR1 - FGFR4- EV1 - FGFR1 - FGFR4- EV1 - FGFR1 - EV2 EV2 EGFR EGFR EGFR EGFRmEGFRm

FGFR1 -EV2 0,005

FGFR4-EV2 0,005 0,602

EV1 -EGFR 0,008 0,465 0,465

FGFR1 -EGFR 0,008 0,251 0,347 0,602

FGFR4-EGFR 0,008 0,047 0,047 0,465 0,602

EV1 -EGFRm 0,008 0,032 0,028 0,016 0,465 0,602

FGFR1 -EGFRm 0,008 0,008 0,008 0,076 0,1 17 0,347 0,465

FGFR4-EGFRm 0,008 0,008 0,008 0,175 0,028 0,028 0,047 0,047 A continuación, se analizó la activación de varias rutas de señalización en estas líneas, realizando experimentos de estimulación con SFB. La Figura 7 muestra el resultado, en el que se observa de nuevo una correlación entre el aumento en la proliferación y características tumorigénicas con la activación de estas rutas de señalización. Esta correlación es destacable en el caso de la activación de EGFR, STAT3 y AKT. En el caso de la activación de p42/p44 se observa una tendencia similar pero no tan evidente, lo que sugiere que quizás esta ruta podría no ser tan importante en cuanto a los efectos tumorigénicos en estas líneas.

Como conclusión, la sobreexpresión de EGFR nativo o de cualquiera de los dos FGFRs analizados (FGFR1 : Figura 7A; FGFR4: Figura 7B) produce un aumento en la activación de la activación de EGFR y de las rutas STAT3, AKT y p42/p44, en comparación con la línea control, similar en los tres casos. La co-sobre-expresión del receptor EGFR nativo con cualquiera de los dos FGFRs aumenta estos fenotipos, así como la activación de EGFR, mientras que la sobreexpresión de EGFR mutado (L858R/T790M) produce un aumento aún mayor de activación de estas rutas. Las condiciones de mayor aumento son aquéllas que tienen co-sobre- expresión de EGFR mutado junto con la sobre-expresión de FGFR1 o de FGFR4.

Todos estos datos confirman que la interacción entre EGFR y los FGFRs no depende de la presencia de mutaciones activadoras en EGFR y que la cooperación entre receptores se da cuando haya sobreactivación de EGFR, independientemente del mecanismo que conduzca a ésta.

Ejemplo 5. Interacción física de EGFR con FGFR1 y FGFR4

Para estudiar en mayor profundidad la cooperación de EGFR con FGFR1 y FGFR4, se comprobó si los receptores interaccionan físicamente entre ellos. Se realizaron experimentos de co-inmunofluorescencia, tal y como se describe en el apartado de materiales y métodos del presente documento, para comprobar si los receptores co-localizaban en la membrana celular. Para este ensayo se utilizó una línea celular NL20 con sobreexpresión exógena de FGFR1 y EGFR, o FGFR4 y EGFR.

La Figura 8A muestra que existe co-localización parcial de EGFR y FGFR1 (parte superior) así como de EGFR y FGFR4 (parte inferior), en algunas regiones de la membrana celular. Estos resultados sugieren que la interacción entre ambos receptores puede ser física. Para comprobar esta hipótesis, se realizaron experimentos de co-inmunoprecipitación entre los receptores. Para ello, se seleccionaron líneas celulares con alta expresión endógena de EGFR y FGFR1 (H1975) o de EGFR y FGFR4 (Calu-3) (Figura 1A). Se realizó la inmunoprecipitación de EGFR en estas líneas, y se detectó la presencia de FGFR1 o de FGFR4, respectivamente en cada línea, en el inmunprecipitado. La Figura 8B muestra que FGFR1 co-inmunoprecipita con EGFR en los extractos de la línea celular H1975, y con FGFR4 en la línea Calu-3. Este resultado soporta la existencia de una interacción física entre ambos tipos de receptores.

Ejemplo 6. Efecto de la cooperación de EGFR con FGFR1 y FGFR4 in vivo.

Para estudiar el efecto de la cooperación observada in vitro de EGFR con FGFR1 y de EGFR con FGFR4 en un contexto más fisiológico, se generaron xenoinjertos en ratones inmunodeprimidos de diferentes líneas celulares donde esta cooperación ha sido demostrada in vitro como relevante.

Se utilizaron las líneas celulares H1975 y HCC827, que tienen mutación activante en EGFR, en las que se sobreexpresó, o no, FGFR1 o FGFR4. Además, se usó la línea celular Calu-3, que tiene activación constitutiva de EGFR y FGFR4 nativos, en la que se silenció la alta expresión endógena de FGFR4. Los procedimientos se llevaron a cabo tal y como se describe en los materiales y métodos de este documento.

La Figura 9 muestra el resultado del crecimiento tumoral de los xenoinjertos de cada línea en ratones inmunodeprimidos de cada combinación de expresión de los receptores.

Se observa que en los xenoinjertos producidos por la línea H1975 (gráfica superior), la sobreexpresion de FGFR1 o de FGFR4 produce, respectivamente, un aumento del crecimiento tumoral de 2 o 4 veces superior en comparación con la línea control que expresa EGFR mutado de forma endógena.

En el caso de los tumores producidos por HCC827 (gráfica central), la sobreexpresion de cualquiera de los dos FGFRs incrementa la velocidad de crecimiento de los tumores al doble respecto a la línea control que expresa EGFR mutado de forma endógena.

Por último, en los xenoinjertos generados con Calu-3 (gráfica inferior), se observa una velocidad menor de crecimiento tumoral en las líneas que tienen FGFR4 silenciado.

Ejemplo 7. Inhibición conjunta de EGFR y FGFR dirigida a pacientes de adenocarcinoma con dependencia de EGFR.

Los resultados anteriores demuestran la relación física y funcional de los receptores EGFR y FGFR1 , o EGFR y FGFR4 en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón. Se ha demostrado que los receptores FGFR1 y FGFR4 tienen efectos oncogénicos cuando hay sobre- activación del receptor EGFR. Los datos anteriormente presentados demuestran que FGFR1 y FGFR4 interaccionan con EGFR, lo que produce su activación recíproca, incrementando la activación de diferentes rutas de señalización pro-oncogénicas. De esta forma, la inhibición conjunta de estos FGFRs y de EGFR en tumores con dependencia de señalización de EGFR y alta expresión de FGFR1 y/o FGFR4 se postula como una aproximación terapéutica eficaz en el tratamiento de adenocarcinoma de pulmón.

7.7 Ensayo in vitro

Para comprobar esta hipótesis, se estudió el efecto in vitro de dos inhibidores selectivos de FGFR: BGJ398 y AZD4547 y de dos inhibidores de EGFR, erlotinib y osimertinib, en diferentes líneas celulares. Se seleccionaron como controles tres líneas de adenocarcinoma de pulmón sin activación de EGFR (H2009, H3122 y H1437) y dos líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón con mutaciones activadoras de EGFR (H 1975 y HCC827). En todas ellas se sobreexpresó FGFR1 o FGFR4.

La Figura 10 muestra la sensibilidad a cada inhibidor por separado (A-D) de las líneas celulares no dependientes de EGFR (H2009, H3122 y H1437). Se observa que la expresión de cada uno de los FGFRs no altera significativamente la sensibilidad a ninguno de los inhibidores de forma individual con respecto a la respectiva línea control con el vector de sobreexpresión vacío. Sin embargo, como se puede ver en la Figura 11 A, en las dos líneas con activación de EGFR (H1975 y HCC827), la sobreexpresión de cualquiera de los FGFRs (FGFR1 o FGFR4), produce un aumento de la sensibilidad de las células de adenocarcinoma de pulmón a los inhibidores de FGFR, y un aumento de la resistencia frente a los inhibidores de EGFR, en comparación con la respectiva línea control.

A continuación, se testó la sensibilidad de las dos líneas con activación de EGFR (H1975 y HCC827) a las diferentes combinaciones posibles de los inhibidores (anti-EGFR + anti-FGFR) en estudio (Erlotinib + BGJ398; Erlotinib + AZD4547; Osimertinib + BGJ398; Osimertinib + AZD4547) y se determinó el efecto de cada una de las combinaciones probadas por medio del cálculo del índice de combinación.

La Figura 11 B muestra cómo, en las líneas control con el plásmido vacío, el efecto de cualquiera de las combinaciones es aditivo (índice de combinación en torno a 1). Sin embargo, cuando se sobreexpresa FGFR1 o FGFR4, las combinaciones adquieren un efecto sinérgico (índice de combinación menor que 1). Los resultados demuestran que el efecto sinérgico de la combinación de los fármacos es resultado de la sobreexpresión de FGFR1 o de FGFR4, dependientes además de la activación de EGFR y, por lo tanto, la respuesta a un tratamiento combinado con estos fármacos podría estar directamente relacionada con la expresión de los receptores en un sujeto que sufra cáncer de pulmón. La determinación de la expresión de FGFR1 y/o de FGFR4 podría tener carácter predictivo para determinar si un tratamiento que comprenda una combinación de inhibidores frente a EGFR y frente a FGFR va a ser eficiente, en sujetos que además tengan activado el receptor EGFR. Se seleccionó la combinación que mostraba el efecto sinérgico más potente con eriotinib (AZD4547 y eriotinib) y se comprobó el efecto de esta terapia combinada en la activación de las rutas de señalización oncogénicas relacionadas con FGFR. La Figura 11C muestra que, en ambas líneas celulares, el tratamiento con eriotinib en monoterapia alcanza la inhibición parcial de la activación de EGFR, pero solo la terapia combinada consigue la inhibición completa de EGFR en las líneas celulares que sobreexpresan FGFR1 o FGFR4. Además, se observan resultados similares en cuanto a la señalización de la ruta p42/p44. En relación a la ruta de AKT, en la línea celular HCC827 con sobreexpresión de cualquiera de los FGFRs, la combinación alcanzó mayores niveles de inhibición que eriotinib en monoterapia, al contrario que en la línea H1975, donde la combinación no consigue una mayor inhibición de esta ruta que el tratamiento con eriotinib. Respecto a la señalización de STAT3, en la línea H1975 la combinación de ambos inhibidores alcanza mayores niveles de inhibición de la activación de esta ruta que el tratamiento con eriotinib en monoterapia. En la línea HCC827 se observa que el tratamiento con eriotinib no solo no disminuye la activación de STAT3, sino que la induce. Sin embargo, la adición de AZD4547 al tratamiento con eriotinib reduce la activación de esta ruta.

7.2 Ensayo in vivo en xenoinjertos de líneas celulares en ratón

A continuación, se comprobó la eficacia de la combinación de eriotinib y AZD4547 in vivo, en xenoinjertos de líneas celulares en ratones inmunodeprimidos.

Se xenoinjertaron las líneas H1975 y HCC827, que contienen mutaciones activadoras de EGFR, en las que previamente se sobreexpresó de forma exógena el receptor FGFR1 o el receptor FGFR4. Cabe destacar que la línea H1975 también presenta la mutación T790M, conocida por conferir resistencia a los inhibidores de EGFR de primera generación frente a EGFR, como eriotinib.

La Figura 12 muestra el crecimiento tumoral relativo de cada combinación. Se observa que, en ambas líneas celulares, la sobreexpresión de FGFR1 o FGFR4 provoca mayor sensibilidad al inhibidor anti-FGFR en los tumores, de modo que se puede deducir que la administración de AZD4547 en monoterapia produce una reducción del crecimiento tumoral con respecto al control (porcentaje T/C). Además, este efecto parece ser específico de la inhibición de FGFR, ya que la administración del mismo fármaco no tiene efecto en los tumores generados por las líneas celulares control, en las que no se sobreexpresan los FGFRs.

Las gráficas de la izquierda en la Figura 12A muestran que los tumores generados por la línea celular H1975 son intrínsecamente resistentes al tratamiento con eriotinib (anti-EGFR) o AZD4547 (anti-FGFR) administrados en monoterapia. En estos tumores, la combinación de los dos inhibidores tiene mayor eficacia en comparación con los fármacos en monoterapia, en especial en los modelos con sobreexpresión de FGFR1 o FGFR4, donde el efecto en la inhibición del crecimiento del tumor es mucho más acusado, alcanzándose incluso la estabilización del crecimiento en el caso de la línea con sobre-expresión de FGFR4.

Las gráficas de la derecha correspondientes a los tumores generados por la línea HCC827 cuando sobreexpresa FGFR1 o FGFR4 tiene una mayor resistencia a la inhibición de EGFR (valores de T/C de 29, 1 %, 48,2% y 50,2% para los modelos control y con sobreexpresion de FGFR1 y FGFR4, respectivamente). Esta resistencia es revertida por el tratamiento combinado de ambos inhibidores (T/C de 20,7%, 7,2% y 2,7%, respectivamente) (Tabla 10).

Estos datos demuestran la alta eficacia de la combinación de inhibidores anti-EGFR y anti- FGFR en xenograftfs de líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón con activación del receptor EGFR que sobreexpresan FGFR1 o FGFR4.

Tabla 10. Valores comparativos de los tratamientos de los tumores en relación a los controles (T/C).

Incremento de

Modelo Tratamiento T/C (%)

volumen (x)

Erlotinib 92,1 % 2,67

EV AZD4547 99,6% 2,55

Combinación 67,3% 2,30

Erlotinib 74,7% 4,32

H1975 FGFR1 AZD4547 61 ,6% 3,56

Combinación 38,4% 2,10

Erlotinib 48,2% 5,50

FGFR4 AZD4547 45,3% 4,50

Combinación 10,7% 0,99

Erlotinib 29,1 % 0,86

EV AZD4547 84,2% 2,76

Combinación 20,7% 0,68

Erlotinib 48,2% 2,50

HCC827 FGFR1 AZD4547 50,8% 2,60

Combinación 7,2% 0,39

Erlotinib 50,2% 2,84

FGFR4 AZD4547 37,1 % 2,19

Combinación 2,7% 0,16

7.3 Ensayo in vivo en modelos PDX

Por último, se analizó el efecto de la terapia combinada con inhibidores de EGFR y FGFR en varios modelos PDX de adenocarcinoma con alta expresión de FGFR1 : un modelo con la mutación activadora de EGFR L858R y la mutación de resistencia a erlotinib T790M en EGFR (TP103) y dos modelos con expresión del receptor EGFR nativo, pero altamente activado (TP57 y TP126). La Figura 13A muestra que los tratamientos con erlotinib o con AZD4547 en monoterapia consiguen reducir un poco el tamaño de los tumores, en comparación con los tumores sin tratar, pero la combinación de ambos fármacos consigue una reducción mucho más acusada, demostrando la superioridad del tratamiento combinatorio.

Al estudiar los efectos de los tratamientos en las rutas de señalización oncogénicas, se observa que la inhibición conjunta de EGFR y FGFR disminuye la activación de STAT3, p42/p44 y AKT de forma más eficaz que la administración de estos fármacos en monoterapia. Respecto a la señalización de STAT3 en el PDX TP103, además, el tratamiento con erlotinib produce un aumento de la activación de la ruta, que es reducida cuando los fármacos se combinan (Figura 13B).

La Tabla 11 muestra el ratio T/C (crecimiento tumoral en relación al control) de los tratamientos PDXs con cada combinación de fármacos.

Tabla 11. Valores de comparación entre el crecimiento de los tumores tratados en relación a los controles (T/C), expresado como porcentajes.

Modelo Tratamiento T/C (%)

Erlotinib 45,1 %

TP103 AZD4547 41 ,1 %

Combinación 10,6%

Erlotinib 67,0%

TP57 AZD4547 76,2%

Combinación 1 1 ,3%

Erlotinib 66,6%

TP126 AZD4547 76,3%

Combinación 17,5%

Ejemplo 8. FGFR1 y FGFR4 como biomarcadores predictivos de respuesta a la terapia anti-EGFR en cáncer de pulmón no microcítico.

En vista de la cooperación entre EGFR y los FGFRs demostrada tanto in vitro como in vivo, se decidió estudiar si la expresión de FGFR1 y/o FGFR4 es capaz de predecir la respuesta a la terapia frente al receptor EGFR en pacientes con adenocarcinoma de pulmón.

Para ello, se utilizó una cohorte de 47 pacientes diagnosticados con adenocarcinoma de pulmón avanzado en el Hospital Universitario 12 de Octubre (Madrid), que no habiendo recibido terapia inhibitoria de EGFR previamente, fueron tratados con los inhibidores de EGFR erlotinib o gefitinib en primera, segunda o tercera línea. El proyecto de investigación fue valorado y aprobado por el comité ético del hospital. Los pacientes firmaron el preceptivo consentimiento informado del biobanco del hospital. Todo el proyecto se atuvo a los principios éticos universales recogidos en la declaración de Helsinki. Las características clínico-patológicas de interés fueron obtenidas de la historia del paciente y registrados en una base de datos que incluyó los siguientes parámetros: edad, sexo, estado general, estadio del cáncer según el sistema TNM al momento de la cirugía, tratamiento recibido, y resultados terapéuticos del mismo. Las características de la cohorte se encuentran resumidas en la Tabla 12. Tabla 12: Datos de la cohorte de pacientes.

Número de pacientes 47

Sexo

Masculino 25 (53,2%)

Femenino 22 (46,8%)

ECOG

0 15 (31 ,9%)

1 17 (36,2%)

2 9 (19,1 %)

>2 6 (12,8%)

Estadio

I 1 (2,1 %)

II 1 (2,1 %)

III 45(95,8%)

Mutación en EGFR

Sí 25 (53,2%)

No 19 (40,4%)

Desconocido 3 (6,4%)

Tratamiento

Eriotinib

Gefitinib 32 (68,1 %)

Línea de tratamiento 15 (31 ,9%)

Primera

Segunda 18 (38,3%)

Tercera 1 1 (23,4%)

18 (38,3%)

Tal y como se ha visto en los resultados anteriores, la cooperación EGFR-FGFR1/4 se da tanto en pacientes con EGFR mutado como con EGFR nativo, por lo que se incluyó en el estudio un 53,2% de pacientes con EGFR mutado y un 40,4% de pacientes con la versión nativa del gen. El estado mutacional de EGFR en el resto de pacientes se desconocía.

Se determinó el efecto de la expresión de los genes a nivel de ARNm de FGFR1 y FGFR4 en los tumores y se relacionó con la supervivencia libre de progresión en los pacientes tratados, clasificando los casos según si la expresión de cada gen era baja o alta (por debajo o por encima del valor de la mediana).

La Figura 14A muestra la correlación de la supervivencia libre de progresión en los pacientes con adenocarcinoma tratados con eriotinib o con gefitinib (terapia anti-EGFR) y la expresión de los genes FGFR1 o FGFR4 (N=47). Se observa que la alta expresión de FGFR1 y la alta expresión de FGFR4, por separado, se correlacionan con peores valores de supervivencia (cocientes de riesgo de 3.44 [2,09-5,69], p<0,001 y de 3,62 [2,18-6, 11], p<0,001 ; respectivamente).

Al tener en cuenta los datos de expresión de ambos genes, se produce una separación todavía más clara en los valores de supervivencia libre de progresión para ambos grupos (p<0,001) (Figura 14B).

La Figura 15 muestra el efecto de la expresión de FGFR1 y FGFR4 en la respuesta a terapia anti-EGFR en una cohorte ampliada de pacientes incluyendo no solo adenocarcinomas, sino también otros tipos histológicos de cáncer de pulmón no microcítico (N=87), cuyos datos se presentan en la Tabla 13.

Tabla 13: Características de la cohorte de pacientes.

Número de pacientes 87

Sexo

Masculino 55 (62,5%)

Femenino 32 (37,5%)

Histología

Adenocarcinoma 47 (54,7%)

Carcinoma escamoso 35 (40,6%)

Otro 5 (4,7%)

ECOG

0

1

2

>2

Estadio

III IV

Mutación en EGFR

Tratamiento

Erlotinib

Gefitinib

Línea de tratamiento

Primera

Segunda

Tercera o más

En la Figura 15A se observa la correlación de la supervivencia libre de progresión de los pacientes tratados con erlotinib o gefitinib con la expresión de ARNm de FGFR1 o FGFR4, o de ambos, donde la alta expresión de FGFR1 , FGFR4 o de ambos correlaciona con peores valores de supervivencia (Figura 15B).

Estos resultados sugieren que la expresión de FGFR1 y de FGFR4 es predictiva de la eficacia de terapias frente a EGFR, de forma que los pacientes con alta expresión de alguno o de ambos genes progresan más rápidamente al tratamiento con inhibidores de EGFR. Por lo tanto, estos datos indican que existe un subconjunto de pacientes de CNMP (aquéllos con alta activación de EGFR y alta expresión de FGFR1 o FGFR4) que podrían beneficiarse de la terapia combinada frente a EGFR y frente a FGFR.

BIBLIOGRAFÍA

Altschul SF et al. Basic local alignment search tool. J Mol Biol (1990); 215(3): 403-10.

Azuma K et al. GFR1 activation is an escape mechanism in human lung cáncer cells resistant to afatinib, a pan-EGFR family kinase inhibitor. Oncotarget 2014; 5(15):5908-19.

Blanco R et al. A gene-alteration profile of human lung cáncer cell lines. Human mutation 2009; 30: 1199-206.

Chou TC. Drug combination studies and their synergy quantification using the Chou-Talalay method. Cáncer research 2010; 70: 440-6.

Crystal AS et al. Patient-derived models of acquired resistance can identify effective drug combinations for cáncer. Science 2014; 246(6216): 1480-6.

Helfrich BA et al. Antitumor activity of the epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor gefitinib (ZD1839, Iressa) in non-small cell lung cáncer cell lines correlates with gene copy number and EGFR mutations but not EGFR protein levéis. Clinical cáncer research: an official journal of the American Association for Cáncer Research 2006; 12: 71 17-25.

Holdman XB et al. Upregulation of EGFR signaling is correlated with tumor stroma remodeling and tumor recurrence in FGFR1-driven breast cáncer. Breast Cáncer Res 2015; 17-151 : 1-17.

Issa A et al. Combinatorial targeting of FGF and ErbB receptors blocks growth and metastatic spread of breast cáncer models. Breast Cáncer Res 2013: 15(1):R8.

Kim TM et al. Mechanisms of acquired resistance to AZD9291 : A mutation-selective, irreversible EGFR inhibitor. J Thorac Oncol 2015; 10(12): 1736-44.

Koch H et al. Phosphoproteome profiling reveáis molecular mechanisms of growth factor mediated kinase inhibitor resistance in EGFR overexpressing cáncer cells. J Proteome Res 2016; 15(12): 4490-504.