Область применения

Группа изобретений относится к медицине, а именно инфекционным болезням и фармакологии, а также фармацевтической промышленности и биотехнологии, и предназначена для получения пегилированного интерферо- на лямбда, который может быть использован для лечения вирусных гепати- тов, поскольку обладает противовирусным действием в отношении гепато- тропных вирусов и высокой биодоступностью при пероральном применении, что обеспечивает его высокую концентрацию в печени минуя системный кровоток, уменьшает системное побочное действие и увеличивает коплаент- ность терапии.

Уровень техники

Интерфероны лямбда (IFN λ) образуют семейство интерферонов третьего типа, которое состоит из четырех членов - IFN λΐ, IFN λ2, IFN λ3 и IFN λ4, обозначаемых также IL-29, IL-28A, IL-28B и IFN λ4 соответственно

[1, 2, 3]. IFN λ относятся к семейству цитокинов и выполняют функции, схо- жие с семейством интерферонов первого типа (IFN а и/или IFN β), однако значительно отличаются от последних: во-первых, IFN λ действуют прежде всего в эпителиальных клетках, которые подвергаются постоянному воздей- ствию синантропных и патогенных микроорганизмов, и во-вторых, благодаря более целенаправленной передаче сигналов, IFN λ обладают существенными терапевтическими преимуществами, т.к. исключаются многие побочные эф- фекты, ограничивающие клиническое использование IFN а и IFN β. Кроме того, IFN λ обладают иммуномодулирующим действием на врожденную и адаптивную ветви иммунной системы, которые частично совпадают с тако- выми IFN а и IFN β [4, 5, 6, 7].

Противовирусная активность IFN λ in vivo впервые была обнаружена в 2006 г. в отношении вируса простого герпеса второго типа [8]. Дальнейшие исследования на животных моделях выявили противовирусное действие эк- зогенного IFN λ, сравнимое с действием IFN а и IFN β, в отношении таких вирусов как респираторный синцитиальный вирус, ротавирус, вирус ящура, норовирус мышей, вирус лихорадки Западного Нила, вирус простого герпеса 1 типа, вирус гриппа, метапневмовирус человека, коронавирус, вирус оспо- вакцины, вирус гепатита В, вирус пневмонии мышей [1, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]. Было также установлено, что противовирусная активность IFN in vivo более проявлена в отношении вирусов, инфицирующих эпителиаль- ные клетки респираторного, желудочно-кишечного и урогенитального трак- та, а также печени [13]. Это обусловило интерес к IFN λ в качестве потенци- ального терапевтического агента в отношении вирусных гепатитов [17, 18].

Вирусные гепатиты представляют серьезную угрозу общественному здоровью международного масштаба и являются существенным бременем для населения всех регионов мира. В 2016 году Всемирная Организация Здравоохранения приняла «Глобальную стратегию сектора здравоохранения по вирусному гепатиту 2016-2021», в которой отмечается, что вирусный ге- патит уносит большое число человеческих жизней, наносит существенный ущерб местным сообществам и системам здравоохранения. На его долю при- ходится примерно 1,4 миллиона случаев смерти в год в результате острой инфекции, а также рака и цирроза печени, связанных с гепатитом, что сопос- тавимо с показателями смертности от ВИЧ и туберкулеза. Из этого числа примерно 47% случаев смерти вызвано вирусом гепатита В, 48% - вирусом гепатита С, а остальные - вирусами гепатита А и гепатита Е. Вирусный гепа- тит все чаще становится причиной смерти людей, живущих с ВИЧ. Примерно 2,9 миллиона человек, живущих с ВИЧ, коинфицированы вирусом гепати- та С, а 2,6 миллиона человек - вирусом гепатита В. В мировом масштабе примерно 240 миллионов человек хронически инфицированы вирусом гепа- тита В, а 130-150 миллионов человек - вирусом гепатита С. Данная страте- гия направлена на борьбу со всеми пятью вирусами гепатита (А, В, С, D и Е) и прежде всего с вирусами гепатита В и С, учитывая их высокую значимость для общественного здравоохранения. В отношении лечения хронического вирусного гепатита В и С руководство ВОЗ поддерживает подход с позиций общественного здравоохранения, предусматривающий переход к более про- стым и безопасным схемам перорального лечения [19].

Несмотря на то, что новые рекомендации в обновленном «Руководстве

ВОЗ по скринингу, оказанию медицинской помощи и лечению лиц с хрони- ческой инфекцией гепатита С» рекомендуют использовать схемы противови- русных препаратов прямого действия, для особых групп населения в качестве альтернативного варианта лечения по-прежнему рекомендована комбинация софосбувир/пегилированный интерферон и рибавирин [20]. Пегилированные интерфероны обеспечивают стабильный уровень интерферона в сыворотке крови в течение семи дней. Известны пегилированный интерферон-а2Ь (Пе- гИнтрон ^® , фирма «Schering-Plough», США) [21], пегилированный интерфе- рон-а2а (Пегасис ^® , «Roche», Швейцария) [22] и цепегилированный интерфе- рон-а2Ь (Альгерон ^® , «Биокад», Россия) [23]. Основными недостатками этих препаратов являются:

- еженедельные подкожные инъекции при продолжительности лечения от 12 недель, что существенно снижает комплаентность лечению;

- часто возникающие побочные эффекты лечения в виде гриппоподоб- ного синдрома, артралгии, депрессивных состояний, диареи, депрессивных состояний, галлюцинаций, кожных высыпаний, аллергии, заболеваний крове- творной системы, выпадения волос, что также снижает комплаентность лече- нию [24, 25];

- образование антител, нейтрализующих антивирусную активность препарата, у 30 % больных, что сопровождается развитием резистентности к рекомбинантным интерферонам [26].

Таким образом, сохраняется острая потребность в новых терапевтиче- ских и профилактических препаратах против вирусных гепатитов, в том чис- ле гепатита С, обладающих высокой эффективностью и минимальными по- бочными эффектами. Одним из вариантов высокоэффективной терапии данного заболевания является применение лекарственных препаратов на основе интерферона лям- бда, поскольку IFN λ обладают более ограниченными паттернами экспрессии и экспрессируются преимущественно в гепатоцитах. IFN λ обладают проти-

95 вовирусным действием в печени, сравнимыми с IFN а, но с меньшими по- бочными эффектами, что создает предпосылки для терапевтических преиму- ществ IFN λ при лечении вирусных инфекций или состояний печени, в том числе вирусного гепатита С и вирусного гепатита В [27].

Наиболее близким к заявляемому средству по технической сущности loo является препарат пегилированного интерферона лямбда для лечения и про- филактики гепатита С, описанный в патенте [28]. Сегодня это единственный в мире препарат пегилированного интерферона лямбда, доведенный до кли- нических исследований и известный как препарат BMS-914143 компании «Bristol-Myers Squibb». Основным недостатком данного препарата является

105 необходимость еженедельного парентерального введения, что при рекомен- дованном курсе лечения продолжительностью от 12 недель может вызывать реакции в месте введения в виде болезненности, покраснения, отека, ин- фильтратов и даже некрозов, что не может удовлетворять требованиям комп- лаентности терапии. Помимо этого, системное введение сопряжено с харак-

110 терными для него осложнениями - повышением температуры тела, аллерги- ческими и анафилактическими реакциями.

Наиболее близким к заявляемому способу получения является способ, описанный в патенте [29], включающий растворение биологически активного вещества, например интерферона, в растворе водорастворимого фармаколо-

115 гически приемлемого полимера в концентрации выше 10 % до концентрации насыщенного раствора и облучение реакционной смеси ионизирующим из- лучением. Недостатком данного способа является неконтролируемое образо- вание ковалентной связи между биологически активным веществом и поли- мером под влиянием ионизирующего излучения, что может снижать специ- 120 фическую активность интерферона за счет блокирования активных центров, а также за счет необратимого изменения структуры белковой молекулы.

Технический результат, достигаемый данной группой изобретений, заключается в расширении арсенала средств для лечения инфекционных заболеваний, вызываемых гепатотропными вирусами, при применении

125 которых могут использоваться пути введения препарата, отличные от парентерального и повышающие комплаентность пациентов к проводимой терапии, а также способов их получения.

Сущность изобретения

Заявленный технический результат достигается в средстве,

130 представляющем пегилированный интерферон лямбда (далее - ПЭГ-IFN λ), обладающий противовирусным действием в отношении гепатотропных вирусов, отличающийся тем, что его биодоступность при пероральном применении составляет не менее 10 %, а получают его путем облучения раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до

135 примерно 5 000 Да ионизирующим излучением в дозе от 1 до 5 Мрад, смешением полученного раствора с раствором интерферона лямбда, замораживания и охлаждения полученной смеси до температуры -10 °С и ниже и облучения замороженной и охлажденной смеси ионизирующим излучением в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад.

140 Противовирусная активность ПЭГ-IFN λ

Противовирусные свойства заявляемого средства выявлены благодаря экспериментальным исследованиям, проведенным в системе «культуральный ВГС (HCVcc) клон JFH1 - клетки гепатомы человека Huh7.5». Эта система является на сегодняшний день наиболее адекватной и принята FDA в США и

145 Европейским сообществом для специфической оценки анти-ВГС активности фармацевтических препаратов на доклинической стадии.

Оценку антивирусной активности ПЭГ-IFN λ проводили с использова- нием культурального штамма ВГС, выделенного в 1999 году в Японии из сы- воротки больного фулминантным гепатитом. На основе этого штамма полу- 150 чен и проклонирован в плазмиде полноразмерный репликон ВГС, который демонстрирует необычно высокую скорость репликации геномной РНК при трансфекции клеток гепатомы человека Huh-7 и продукцию инфекционных вирионов в культуральную среду [30, 31]. Полученный инфекционный куль- туральный вирус HCVcc был обозначен как клон JFH1 (генотип 2а). Далее

155 был получен дериват Huh-7 клеток, обозначенный Huh-7.5, обладающий бо- лее высоким инфекционным потенциалом и способностью к поддержанию длительной инфекции JFH-1 клона HCV [32]. Высокая пермиссивность Huh-7,5 клеток обусловлена наличием в ней мутации гена RIG-1. Продукт этого гена ак- тивируется вирусной dsRNA и участвует в индукции интерферон опосредован-

160 ной противовирусной защиты клетки [33].

Оценку антивирусной активности проводили методами полимеразной цепной реакции (далее - ПНР) в реальном времени и методом иммуногисто- химии. Для индикации ВГС использовали моноклональные антитела мыши 6G7 к вирусному белку Core (FDA, USA). Диапазон тестируемых концентр а-

165 ций ПЭГ-IFN λ составил от 0,0085 до 8500 нг/мл культуральной среды. Схе- ма экспериментов включала 3 последовательных этапа:

1) прединкубация монослоя клеток Huh7.5 ПЭГ-IFN λ;

2) инфицирование клеток Huh7.5 вирусом JFH1 в отсутствии ПЭГ- IFN λ;

170 3) инкубация с 10-кратными разведениями ПЭГ-IFN λ, соответствую- щими дозам прединкубации.

Проведенные исследования показали, что 50 % ингибирующая доза ПЭГ-IFN λ лежит в диапазоне концентраций 0,0085-0,085 нг/мл, а при кон- центрации 0,085 нг/мл ПЭГ-IFN λ уже приводит почти к 80 %-ному ингиби-

175 рованию репродукции ВГС в клетках гепатомы человека (табл. 1).

Таблица 1. Уровень ингибирования ПЭГ-IFN λ репродукции вируса гепати- та С по результатам ПЦР в реальном времени

Концентрация ПЭГ-IFN λ (в пересчете на Уровень ингибирования репродукции ви- IFN λ), нг/мл руса, %

8500,000 96,52

850,000 96,56 85,000 95,65

8,500 93,84

0,850 91,30

0,085 78,62

При этом анализ цитотоксической активности ПЭГ-IFN λ на культуре 180 клеток гепатомы человека Huh7.5 показал, что даже доза ПЭГ-IFN λ в 8500 нг/мл, что в миллион раз больше эффективной противовирусной дозы, не оказывает никакого цитотоксического действия на клетки Huh7.5 (фиг.1). Использованный для исследования метод определения цитотоксичности ос- нован на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать во- 185 дорастворимый 2,3-бис-(2-метокси-4-нитро-5-сульфо-ф� �нил)-2Н-тетразолий- 5-карбоксанилида (реагент ХТТ, Sigma- Aldrich, США) в формазан, который кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помощью феназинметасульфата (PMS) и последующая фотометрия позволяют точно соотнести изменение оптической плотности раствора с изменением количе- 190 ства жизнеспособных клеток.

Биодоступность ПЭГ-IFN λ

Изучение биодоступности ПЭГ-IFN λ проводили согласно «Руково- дству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» [34] на аутбредных лабораторных крысах, весом не менее 180 г в возрасте 12-

195 14 недель, содержание и манипуляции с животными осуществляли в соответствии с СОП «Содержание лабораторных животных» и действующими международными стандартами.

ПЭГ-IFN λ вводили животным однократно в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ внутрижелудочно или болюсно внутривенно. Концентрацию IFN λ в

200 сыворотке крови определяли при внутривенном и внутрижелудочном введе- нии в интервале 0-24 часа после введения, а концентрацию IFN λ в тканях сердца, сальника, печени, почек, поперечно-полосатых мышц и головного мозга крыс - в том же временном интервале при внутрижелудочном введе- нии. Количественное определение IFN λ в биологических объектах (сыворот-

205 ка крови, органы и ткани животных) проводили с помощью иммунофермент- ного метода (ИФА). Проведенные эксперименты показали, что концентрация IFN λ в сыворотке крови при внутривенном введении достигает максимума через 2 мин. после введения и составляет 30947,83+1968,67 пг/мл. При внут- рижелудочном введении концентрация IFN λ в сыворотке крови достигает

210 максимума через 4 ч после введения и составляет 1167,61+115,76 пг/мл. Мак- симальная концентрация IFN λ в тканях крыс при внутрижелудочном введе- нии составляет: в печени - 1239,04+125,11 пг/г (через 2 ч после введения), почках - 975,29+109,23 пг/г (через 4 ч после введения), сердце - 488, 11+81,53 пг/г (через 2 ч после введения), поперечно-полосатых мышцах -

215 392,92+37,78 пг/г (через 8 ч после введения). В мозге и сальнике концентра- ция IFN λ находится ниже порога определения используемого метода (2 пг/мг).

Расчет фармакокинетических параметров, проведенный с использова- нием внемодельного метода статистических моментов [35] и метода трапе- 220 ций [36, 37], показал, что при внутрижелудочном введении максимальное время полувыведения, максимальная концентрация и минимальная степень элиминации IFN λ наблюдаются в печени крыс и составляют 10, 11 ч, 1,24 нг/г и 0,07 ч ^"1 соответственно (таблица 2).

225 Таблица 2 - Фармакокинетические параметры ПЭГ-IFN λ после однократно- го внутривенного и внутрижелудочного введения крысам в дозе 2,6 мкг/кг (в пересчете на IFN λ) в сыворотке крови и органах и тканях крыс

AUC, (нгхчас)/мл

Суммарная пло- щадь под кривой

52,33 51,40 166,68 62,54 32,30 47,90 момента, AUMC,

(нгхчас )/ мл

Максимальная

концентрация, 3,09 1Д7 1,24 0,98 0,49 0,39

Константа элими-

0,68 0,23 0,07 0,15 0,14 0,16 нации, k _e i, час-1

Время полувыве-

1,02 3,02 10,11 4,71 5,01 4,26 дения, Ti/2, час

Абсолютную био доступность (F) ПЭГ-IFN λ рассчитывали по формуле:

_^ AUCelc y. Del в

F =

230 AUCe/e x De/c ^

где:

AUC _B/C - площадь под фармакокинетической кривой после внесосуди- стого введения;

AUC _B/B - площадь под фармакокинетической кривой после внутривен- 235 ного введения;

D _{b b} - величина дозы для внутривенного введения;

D _{b c} - величина дозы для внесосудистого введения.

Доза ПЭГ-IFN λ, вводимая крысам внутривенно и внутрижелудочно, одинакова, значение площади под фармакокинетической кривой для внутри- 240 венного введения составило 37,96 нгхч/мл, значение площади под фармако- кинетической кривой для внесосудистого пути введения - 7,96 нгхч/мл, та- ким образом, абсолютная биодоступность для ПЭГ-IFN λ при пероральном введении составила 20,97%.

Тканевую биодоступность ПЭГ-IFN λ рассчитывали по формуле:

245 fi=AUC/AUC _p ,

где:

AU - площадь под фармакокинетической кривой вещества в ткани; AUC _p - площадь под фармакокинетической кривой в сыворотке. Благодаря тому, что при внутрижелудочном введении происходит пря- 250 мое всасывание лечебного препарата в портальную вену, максимальная тка- невая биодоступность наблюдалась в печени и составила 0,31 ; тканевая био- доступность в почках составила 0,20; в поперечно-полосатой мускулатуре - 0,13; в сердце - 0,10. При этом ПЭГ-IFN λ практически не проникает в голов- ной мозг и не накапливается в жировой ткани.

255

Отличия заявляемого средства от прототипа и технические результаты заключаются в следующем:

- заявляемое средство обладает противовирусной активностью в отношении гепатотропных вирусов. Исследования по ингибированию

260 репродукции ВГС в клетках гепатомы человека показали, что 50 %-ная ингибирующая доза ПЭГ-IFN λ лежит в диапазоне концентраций 0,0085- 0,085 нг/мл, а при концентрации 0,085 нг/мл ПЭГ-IFN λ приводит почти к 80 %-ному ингибированию репродукции ВГС;

- заявляемое средство не обладает цитотоксической активностью: даже 265 доза ПЭГ-IFN λ в 8500 нг/мл, что в миллион раз больше эффективной противовирусной дозы, не оказывает цитотоксического действия на культуру клеток гепатомы человека Huh7.5;

- абсолютная биодоступность заявляемого средства при пероральном применении составляет не менее 10 %: при однократном внутрижелудочном

270 введении крысам в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λ абсолютная био доступность ПЭГ-IFN λ составляет 20,97 %. Это делает возможным использование перорального пути введения препарата ПЭГ-IFN λ, исключающим побочные эффекты, характерные для парентерального пути введения и повышающим комплаентность пациентов к проводимой терапии;

275 - максимальная тканевая биодоступность ПЭГ-IFN λ, максимальная концентрация IFN λ и максимальное время полувыведения IFN λ при однократном внутрижелудочном введении крысам в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на ΙΚΝ λ наблюдаются в печени и составляют 0,31 ; 1239,04+125,11 пг/г и 10,11 ч соответственно. Это происходит благодаря 280 прямому всасыванию ПЭГ-IFN λ в портальную вену, и подтверждает «целевое» воздействие заявляемого средства на печень, уменьшая тем самым системное побочное действие, характерное для парентерального пути введения;

- в отличие от прототипа, полученного путем химического пегилиро- 285 вания IFN λ, заявляемое средство получено путем пегилирования IFN λ при облучении исходных компонентов ионизирующим излучением, что значи- тельно упрощает технологическую схему получения и тем самым снижает себестоимость конечного продукта, поскольку исключает многостадийный органический синтез, сопряженный с существенной потерей целевой белко- 290 вой субстанции на промежуточных технологических стадиях, и последую- щую очистку активных целевых молекул как от компонентов, не вступивших в реакцию, так и от избыточно модифицированных продуктов реакции.

Заявленный технический результат достигается также в способе полу- 295 чения пегилированного интерферона лямбда, обладающего противовирус- ным действием в отношении гепатотропных вирусов и биодоступностью при пероральном применении не менее 10 %, который включает приготовление раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5 000 Да и интерферона лямбда, заморозку и охлаждение приго- зоо товленного раствора до температуры -10 °С и ниже и последующее облуче- ние замороженного и охлажденного раствора ионизирующим излучением в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад, отличающийся тем, что приготовление раствора по- лиэтиленгликоля и интерферона лямбда осуществляют путем смешения рас- твора интерферона лямбда и раствора полиэтиленгликоля, причем раствор 305 полиэтиленгликоля перед смешением подвергают облучению ионизирующим излучением в дозе от 1 до 5 Мрад.

В качестве полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5 000 Да используют полиэтиленгликоль, полученный любым известным способом, например полиэтиленгликоль производства ООО «За-

310 вод синтанолов», Россия. В качестве растворителя для приготовления рас- твора полиэтиленгликоля используют очищенную воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в пределах, необходимых в дальнейшем для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9, напри- мер фосфатно-солевой буфер (NaH ₂ P0 ₄ 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л,

315 рН=7,4), а концентрация ПЭГ в полученном растворе составляет от 0,20 до 0,50 г/мл. Раствор ПЭГ переносят в полиэтиленовые пакеты или пробирки таким образом, чтобы толщина слоя жидкости не превышала 5-8 мм, и герме- тично запаивают. В качестве тары возможно использование любой другой упаковки, проницаемой для ионизирующего излучения и в то же время ус-

320 тойчивой к его воздействию. В качестве ионизирующего излучения исполь- зуют поток ускоренных электронов в дозе от 1 до 5 Мрад.

Молекулярная масса ПЭГ и доза ионизирующего излучения определе- ны в предварительных экспериментах по обработке водных растворов ПЭГ с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 20 000 Да ионизирую-

325 щим излучением в дозе от 0,25 до 10 Мрад с дальнейшим анализом образцов облученных ПЭГ методом гель-проникающей высокоэффективной жидкост- ной хроматографии с использованием испарительного детектора светорас- сеяния и методом хроматомасс-спектрометрии. В настоящее время известно, что облучение водного раствора ПЭГ высокими дозами ионизирующего из- ззо лучения приводит к межмолекулярному кросслинкингу и формированию гидрогелей вне зависимости от его молекулярной массы. В частности, для 4 % водного раствора ПЭГ с молекулярной массой 1 500 Да выявлена спо- собность образовывать гидрогель при достижении поглощенной дозы излу- чения в 12-14 Мрад. В то же время ПЭГ с низкой молекулярной массой при

335 облучении в водных растворах при низких дозах и малых концентрациях по- лимера обладает способностью к внутримолекулярным сшивкам, приводя- щим к синтезу полимерных клубков, так называемых наногелей [38]. В ходе проведенных экспериментов установлено, что при воздействии ионизирую- щего излучения молекулы ПЭГ претерпевают структурные изменения, ха-

340 растеризующиеся различной степенью сшивки в зависимости как от их мо- лекулярной массы, так и от дозы облучения. При облучении раствора ПЭГ с молекулярной массой 10 000 Да и выше даже при минимальной поглощенной дозе 0,25 Мрад наблюдается значительная агрегация молекул ПЭГ с образо- ванием надмолекулярных структур сверхбольших масс Ю О' Да. При об-

345 лучении растворов ПЭГ с молекулярной массой от примерно 400 до пример- но 5 000 Да в дозе от 1 до 5 Мрад имеют место характерные внутримолеку- лярные взаимодействия, не приводящие к явно выраженному предгелирова- нию и образованию надмолекулярных ассоциатов, что определяет выбор данного типа полимеров, поскольку в этих условиях ПЭГ демонстрирует вы-

350 раженную способность к внутримолекулярному кросслинкингу при низких энергетических затратах и в то же время формирует полимерную матрицу, необходимую в дальнейшем для встраивания белка.

В качестве IFN λ используют природный или рекомбинантный интер- ферон лямбда, полученный любым известным способом. Для приготовления

355 раствора IFN λ в качестве растворителя используют очищенную воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в преде- лах, необходимых для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9, на- пример, фосфатно-солевой буфер (NaH ₂ P0 ₄ 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л, рН=7,4). Концентрация интерферона лямбда в полученном растворе состав-

360 ляет 0,25 мг/мл и выше, предпочтительно 0,9 мг/мл, но она должна быть дос- таточной для того, чтобы при смешении с раствором ПЭГ концентрация IFN λ в итоговой смеси составила от 0,2 до 0,8 мг/мл. Возможно также ис- пользование растворов IFN λ, выпускаемых производителями, например рас- твора интерферона лямбда 1 производства ЗАО «СЦФБ», Россия.

365 Далее готовят смесь облученного раствора ПЭГ и раствора IFN λ. Ис- пользование IFN λ в виде раствора необходимо для обеспечения равномерно- сти перемешивания, поскольку при растворении сухого IFN λ необходимо интенсивное перемешивание, которое изменяет вязкость и структуру раство- pa ПЭГ. Для приготовления смеси растворов IFN λ и ПЭГ количества раство-

370 pa IFN λ и предварительно облученного раствора ПЭГ подбирают таким об- разом, что после смешения растворов концентрация IFN λ в полученной сме- си составляет от 0,2 до 0,8 мг/мл, а концентрация полиэтиленгликоля - от 8 до 12 мг/мл, при этом в качестве растворителя используют воду или водный солевой буфер, обеспечивающий поддержание рН раствора в пределах, необ-

375 ходимых для сохранности белка, предпочтительно от 6,0 до 7,9. Оптималь- ные концентрации IFN λ и ПЭГ были выявлены экспериментально для дос- тижения наибольшей сохранности и стабильности белка и сохранения необ- ходимого избытка по массе полимера относительно содержания белковой субстанции, поскольку в процессе радиационного воздействия именно избы-

380 ток молекул ПЭГ в первую очередь принимает на себя основную атаку сво- бодных радикалов, способствуя тем самым повышению сохранности белко- вой молекулы. Полученную смесь переносят в полиэтиленовые пакеты или пробирки таким образом, чтобы толщина слоя жидкости не превышала 5- 8 мм, и герметично запаивают. В качестве тары возможно использование лю-

385 бой другой упаковки, проницаемой для ионизирующего излучения и в то же время устойчивой к его воздействию.

Расфасованную смесь замораживают и охлаждают до температуры -10 °С, при этом перед замораживанием смесь может быть подвергнута дега- зации любым доступным способом. После этого проводят облучение замо-

390 роженной и охлажденной смеси ионизирующим излучением в замороженном виде, при этом в качестве ионизирующего излучения используют поток ус- коренных электронов в дозе от 0,1 до 0,5 Мрад. Облучение смеси в заморо- женном виде необходимо для снижения негативного эффекта от действия свободных радикалов: при таком облучении смеси сохранность IFN λ по дан-

395 ным обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии и SDS-электрофореза в полиакриламидном геле достигает 69 %, в то время как при облучении той же смеси без заморозки даже при минимальной дозе 0,25 Мрад используемые методы выявляют лишь остаточные количества IFN λ. Проведение дегазации смеси растворов перед расфасовкой и замора-

400 живанием также позволяет увеличить сохранность IFN λ до 73 - 76 %. Это объясняется тем, что процессы образования свободных радикалов в растворе полимера под действием ионизирующих излучений протекают с участием растворенного кислорода воздуха, а при дегазации содержание кислорода в растворе уменьшается. При этом значения степени связывания белка в поли-

405 мер-белковые коньюгаты в дегазированной смеси и смеси без обработки раз- личаются между собой незначительно (Ν = 1 ,14 и Ν = 1 ,22, соответственно), что означает, что доля ПЭГ, химически связанного с интерфероном лямбда, составляет около 0,4 % от его общего количества. Преобладающая часть ПЭГ в исследуемом образце вступает в нековалентные обратимые взаимодействия

410 с молекулами белка, формируя надмолекулярные комплексы.

После облучения целевой продукт хранят в замороженном виде или подвергают разморозке и при необходимости - дополнительной очистке ме- тодом стерилизационной фильтрации, после чего для удобства хранения под- вергают стерильному розливу в стерильную упаковку, например стеклянные

415 флаконы.

Отличие заявляемого способа от прототипа и технические результаты заключаются в том, что в заявляемом способе:

- используют раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой от примерно 400 до примерно 5 000 Да, который перед смешением с раствором

420 интерферона лямбда подвергают облучению ионизирующим излучением.

При этом происходят структурные изменения молекул полиэтиленгликоля, которые не связаны с увеличением молекулярной массы, но приводят к формированию полимерной матрицы, необходимой для встраивания белка;

- приготовление раствора полиэтиленгликоля и интерферона лямбда 425 осуществляют путем смешения раствора интерферона лямбда и раствора полиэтиленгликоля. Это позволяет избежать интенсивного перемешивания раствора ПЭГ, необходимого при растворении сухого интерферона лямбда, и в то же время сохранив вязкость и структуру раствора ПЭГ, необходимую для эффективного пегилирования интерферона лямбда;

430 - происходит модификация свойств интерферона лямбда таким образом, что его биодоступность при пероральном применении составляет не менее 10 %. При этом не происходит образования ковалентных связей между интерфероном лямбда и полиэтиленгликолем, что позволяет избежать неконтролируемого изменения свойств интерферона лямбда и использовать в

435 качестве интерферона лямбда любой доступный интерферон.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения:

Пример 1. Получение ПЭГ-IFN λ

440 К 20,00 г ПЭГ-1500 (производство ООО «Завод синтанолов», Россия) добавляют 15,00 мл очищенной воды. Смесь перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения полиэтиленгликоля, после чего доводят объем смеси до 50,00 мл. Полученный раствор с концентрацией ПЭГ-1500 0,40 г/мл переносится в полиэтиленовый пакет таким образом, чтобы толщи-

445 на слоя жидкости не превышала 5-8 мм, и герметично запаивается. Упако- ванный раствор ПЭГ-1500 подвергается воздействию ионизирующим облу- чением в дозе 2,0 Мрад на ускорителе электронов ИЛУ-10 (ЭУ-75).

80,00 мл раствора интерферона лямбда 1 (ЗАО «СЦФБ», Россия) с кон- центрацией интерферона лямбда 1 0,86 мг/мл смешивают с 3,45 мл облучен-

450 ного раствора ПЭГ-1500, доводят объем полученной смеси до 138,00 мл с помощью фосфатно-солевого буфера (NaH ₂ P0 ₄ 10 ммоль/л, NaCl 150 ммоль/л, рН=7,4), и тщательно перемешивают. Далее проводят дегаза- цию полученного раствора с помощью вакуумного насоса и колбы Бунзена. Откачка воздуха из колбы производится до давления 10-50 мм.рт. ст. в тече-

455 ние 30-40 минут. Затем дегазированный раствор помещается в полиэтилено- вый пакет таким образом, чтобы толщина раствора в горизонтальном поло- жении не превышала 5-8 мм, пакет герметично запаивается и замораживается до -20 °C в морозильной камере в течение 12 часов, после чего проводится облучение ионизирующим излучением на ускорителе электронов ИЛУ- 10 460 (ЭУ-75) в дозе 0,25 Мрад. После облучения пакет с ПЭГ-IFN λΐ разморажи- вают, проводят стерилизующую фильтрацию посредством вакуумной стери- лизационной системы «Stericup» (Merck Millipore), розлив и укупорку в сте- рильные стеклянные флаконы.

465 Пример 2. Изучение цитото сичес ой активности ПЭГ-IFN λ

Цитотоксическую активность ПЭГ-IFN λΐ полученного в Примере 1, определяли на культуре клеток гепатомы человека Huh7.5 в диапазоне кон- центраций ПЭГ-IFN λΐ от 0,85 до 8500 нг/мл (в пересчете на IFN λΐ) микро- методом на 96-луночных планшетах ("Greiner") с использованием 2,3-бис-(2-

470 метокси-4-нитро-5-сульфо-фенил)-2Н-� �етразолий-5-карбоксанилида (реагент ХТТ, Sigma- Aldrich, США). Метод основан на способности митохондриаль- ных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый ХТТ в формазан, кото- рый кристаллизуется внутри клетки. Перевод формазана в раствор с помо- щью феназинметасульфата (PMS) и последующая фотометрия позволяют

475 точно соотнести изменение оптической плотности раствора с изменением ко- личества жизнеспособных клеток. Специфическая гибель клеток Huh7.5, об- работанных разными концентрациями белков клеток по отношению к необ- работанным (контроль, 100 % жизнеспособности), оценивалась в двух повто- рах. Результаты представлены на фиг. 1.

480

Пример 3. Изучение антивирусной активности ПЭГ-IFN λ

Оценку антивирусной активности ПЭГ-IFN λΐ, полученного в Приме- ре 1, проводили с использованием модели JFH1 клон/Нип-7.5 клетки, которая в настоящее время является общепризнанной системой для оценки антиви- 485 русной активности препаратов, включая интерфероны.

Линеаризованная ДНК плазмиды pffHl pUC была использована в ка- честве матрицы для транскрипции полноразмерной инфекционной РНК ВГС с помощью набора реагентов TranscriptAid™ для высокоэффективной транс- крипции с Т7 РНК-полимеразой (Fermentas, Латвия).

Культуральный вирус гепатита С (JFH1) был получен в результате трансфекции синтезированной РНК в клетки гепатомы человека Huh7.5 с ис- пользованием набора для трансфекции РНК Minis Bio MIR 2250 (Miras, США). Максимальный выход вируса в культуральную среду через 8 пассажей трансфецированных клеток достиг 1 ,37x 10 ⁶ копий РНК/мл по ре- зультатам ПЦР в реальном времени (тест-система «АмплиСенс ^® HCV- Монитор-FL», ИЛС, Москва). Далее вируссодержащую культуральную жид- кость концентрировали центрифугированием в ячейке с отсекающим фильт- ром Amicon Ultra- 15 centrifugal filter unit (100 к Да) (Millipore, США) и прово- дили еще 4 субпассажа на клетках Huh7.5 для получения вирусного стока JFH1. Сток титровали на монослое клеток Huh7.5 методом иммуногистохи- мического определения фокусов инфекционности (далее - фи). Для этого мо- нослой клеток Huh7.5, выращенный в 96-луночных планшетах, инфицирова- ли 10-кратными разведениями стока JFH1, инкубировали 72 часа, отмывали 1ХФСБ, фиксировали изопропанолом, обрабатывали моноклональными ан- тителами 6G7 к белку Core 6G7 и вторичными антителами, конъюгирован- ными с пероксидазой хрена. Фокусы инфицированных клеток окрашивали хромогеном АБС (3-Amino-9-ethylcarbazole, Sigma), который окисляется пе- роксидазой с образованием нерастворимого осадка красного цвета. Сканиро- вание фокусов проводили с помощью микроскопа "Axiovert" 40 CFL ZEISS. Титр ВГС составил ~ 2>< 10 ⁴ фи/мл. Полученный сток фасовали по аликвотам 1,5 мкл и хранили при -80 °С до использования при определении антивирус- ной активности ПЭГ-IFN λΐ .

Для оценки антивирусной активности ПЭГ-IFN λΐ методом ПЦР в ре- альном времени монослой клеток Huh7.5, выращенный на 24-х луночных планшетах, инкубировали с 10-кратными разведениями ПЭГ-IFN λΐ в диапа- зоне 0,085 - 8500нг/мл в культуральной среде в течение 12 часов при 37 °С. Затем среду с ПЭГ-IFN λΐ удаляли и клетки инфицировали одинаковой дозой вируса JFH1 (из расфасованного замороженного стока) 4,37* 10 ⁶ копий РНК/лунку (кроме контроля клеток) по 3 лунки на одну дозу ПЭГ-IFN λΐ. 520 Адсорбцию вируса проводили 2 часа при 37 °С без ПЭГ-IFN λΐ, затем вирус удаляли и в лунки вновь добавляли среду с соответствующими разведениями ПЭГ-IFN λΐ . Планшеты инкубировали 2 суток при 37 °С в С0 ₂ инкубаторе, затем готовили лизаты инфицированных и контрольных клеток следующим образом:

525 - монослой клеток трижды промывали TBS-буфером (150 мМ NaCl,

50 тМ Трис, рН 7.6);

- обрабатывали смесью лизирующего буфера 100 мкл/лунка (150 мМ

NaCl, 50 mM Трис, р 7.6, 1 % Тритон Х- 100) и коктейля из ингибиторов протеаз (AEBSF, aprotinin, bestatin, Е-64, EDTA, leupeptin) (Sigma, США), 530 переносили в центрифужные микропробирки, выдерживали во льду

10 минут, замораживали;

- лизаты трижды подвергали заморозке-разморозке;

- полученную смесь центрифугировали 30 минут при скорости центрифугирования 14 000 об./мин, при температуре 4 °С;

535 - супернатант расфасовывали по 100 мкл и проводили ПЦР в реальном времени с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV-MOHHTOP-FL».

Результаты ПЦР представлены в таблице 3.

Таблица 3. Уровень ингибирования ПЭГ-IFN λΐ репродукции вируса гепати- та С по результатам ПЦР в реальном времени

* - лизат не инфицированных клеток Huh7.5, отрицательный контроль (бланк);

** - лизат клеток Huh7.5, инфицированных вирусом, но не обработанных IFN λΐ, положительный контроль, 100 % инфекции.

545 Оценку антивирусного действия ПЭГ-IFN λΐ проводили также иммуно- гистохимическим методом подсчета фокусов инфекционности, описанным ранее, на монослое клеток Huh 7.5 в диапазоне концентраций ПЭГ-IFN λΐ от 0,0085 до 8,5000 нг/мл. Результаты этого анализа представлены на фиг. 2, где видно, что доза ПЭГ-IFN λΐ 0,0085 нг/мл ингибирует репродукцию вируса на

550 25 %, а следующая 10-кратная доза 0,085 нг/мл - уже на 75 %, таким образом, 50 %-ная ингибирующая доза лежит в диапазоне концентраций ПЭГ-IFN λΐ 0,0085-0,085 нг/мл.

Пример 4. Изучение биодоступности ПЭГ-IFN λ

555 Исследование биодоступности ПЭГ-IFN λΐ, полученного в Примере 1, проводили согласно «Руководству по проведению доклинических исследова- ний лекарственных средств», [34]. В качестве тест-систем были использованы аутбредные лабораторные крысы весом не менее 180 г в возрасте 12-14 недель, полученные из отдела экспериментальных биологиче-

560 ских моделей НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Федерального государственно- го бюджетного научного учреждения «Томский национальный исследова- тельский медицинский центр Российской академии наук» (Ветеринарные удостоверения имеются), содержание и манипуляции с животными проводили в соответствии с СОП «Содержание лабораторных животных» и

565 международными стандартами, действующими в настоящий момент (Animal Welfare Act, Guide for Care and Use of Laboratory Animals).

ПЭГ-IFN λΐ вводили животным однократно в дозе 2,6 мкг/кг в пересчете на IFN λΐ внутрижелудочно или внутривенно. Концентрацию IFN λΐ при однократном внутрижелуд очном введении ПЭГ-IFN λΐ 570 определяли в сыворотке крови, а также тканях сердца, сальника, печени, почек, поперечно-полосатых мышц и головного мозга крыс до введения препарата и через 0,25, 0,5, 1 , 2, 4, 8, 16 и 24 часа после введения, при однократном внутривенном введеним - в сыворотке крови до введения препарата и через 0,03, 0,17, 0,33, 0,5, 0,75, 1 и 2 часа после введения. На 575 каждую точку использовали 6 животных.

Предварительную пробоподготовку проводили следующим образом: Сыворотка крови. Кровь забирали после умерщвления животного из полости сердца. Для отделения сыворотки от сгустка клеточных элементов обводили собранную кровь по стенкам пробирки стеклянной палочкой. Далее 580 инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. Выдерживали в холодильнике 1 час, центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Выделенную сыворотку собирали в пластиковые пробирки и замораживали при темпера- туре от -18 до -20 °С. В качестве нулевой точки (до введения) использовали пробы сыворотки крови 6 интактных животных, которые получали 585 аналогичным способом.

Ткань печени, мозга, сердца, скелетной (поперечено-полосатой) мыш- цы, почек, сальника и тонкого кишечника. Для определения IFN λΐ в органах и тканях навеску ткани (около 1 г) дважды замораживали и размораживали, тщательно растирали в ступке и готовили 20 %-ные гомогенаты на дистилли- рованной воде. Полученную суспензию встряхивали на шейкере в течение 10 мин. После этого пробирки центрифугировали при 3 000 об/мин в течение 10 мин. Супернатант переносили в чистые пробирки и использовали для ана- лиза. В качестве нулевой точки (до введения) использовали пробы ткани пе- чени, мозга, сердца, скелетной мышцы, почек и сальника 6 интактных жи- вотных, которые получали аналогичным способом.

Количественное определение IFN λΐ в биологических объектах (сыво- ротка крови, органы и ткани животных) проводили с помощью иммунофер- ментного метода (ИФА) с использованием наборов Human IL-29 Platinum ELISA («Bender MedSystems GmbH», Австрия, кат. номер BMS2049), предна- 600 значенных для определения концентрации IFN λΐ человека в культуральных супернатантах, сыворотке, плазме и других биологических образцах в интер- вале концентраций от 2 до 1 000 пг/мл, в соответствии с инструкцией произ- водителя. Учет результатов проводили на анализаторе иммуноферментных реакций АИФР-01 «УНИПЛАН» (ЗАО «Пикон», Россия) при длине волны

605 450 нм.

Результаты определения концентраций IFN λΐ в сыворотке крови и ор- ганах и тканях крыс после однократного внутрижелудочного введения ПЭГ- IFN λΐ представлены в таблице 4. Данные по количественному определению концентрации IFN λΐ в мозге и сальнике не представлены, так как концен-

610 трация была ниже 2 пг/мл и не выявлялась ИФА с использованием наборов Human IL-29 Platinum ELISA.

Результаты определения концентраций IFN λΐ в сыворотке крови крыс после однократного внутривенного введения ПЭГ-IFN λΐ в дозе 2,6 мкг/кг представлены в таблице 5.

615 Расчет фармакокинетических параметров на основе полученных дан- ных проводился с использованием внемодельного метода статистических моментов [39] и метода трапеций [40, 41]. Результаты расчета представлены в таблице 2.

Таблица 4 - Концентрация IFN λΐ в сыворотке крови и органах и тканях крыс 620 после однократного внутрижелудочного введения ПЭГ-IFN 1в дозе

2,6 мкг/кг (в пересчете на IFN λΐ)

24 10,91+1,83 172,84+27,85 41,56+13,30 14,51+3,82 28,84+3,48

Таблица 5 - Концентрация IFN λΐ в сыворотке крови крыс после однократно- го внутривенного введения ПЭГ-IFN λΐ в дозе 2,6 мкг/кг (в пересчете на IFN l)

Концентрация IFN λΐ в сыворотке крови,

Время, час

пг/мл

0,00 0,00+0,00

0,03 30947,83+1968,67

0,17 24314,77+2362,67

0,33 21547,21+1828,17

0,50 18502,97+2143,13

0,75 14786,24+1323,60

1,00 11187,96+1057,21

2,00 6495,04+1062,71

630 Источники

1. Perez-Martin E, Weiss M, Diaz-San Segundo F, Pacheco JM, Arzt J, Grubman MJ, de los Santos T. Bovine type III interferon significantly delays and reduces the severity of foot-and-mouth disease in cattle. // J Virol. - 2012 - Vol. 86, J4O 8. - P. 4477-4487.

635 2. Prokunina-Olsson L, Muchmore B, Tang W, Pfeiffer RM, Park H,

Dickensheets H, Hergott D, Porter-Gill P, Mumy A, Kohaar I, Chen S, Brand N, Tarway M, Liu L, Sheikh F, Astemborski J, Bonkovsky HL, Edlin BR, Howell CD, Morgan TR, Thomas DL, Rehermann B, Donnelly RP, O'Brien TR. A variant upstream of IFNL3 (IL28B) creating a new interferon gene IFNL4 is

640 associated with impaired clearance of hepatitis С virus. // Nat Genet. - 2013. - Vol.45(2). - P. 164-71.

3. O'Brien TR, Prokunina-Olsson L, Donnelly RP. IFN- 4: The Paradoxical New Member of the Interferon Lambda Family. // J Interferon Cytokine Res. - 2014. - Vol. 34(11). - P. 829-838.

645 4. Григорян С. С. Интерфероны лямбда (3-й тип интерферонов) и вирусные инфекции. // Интерферон-2011 / Сборник научных статей. - Москва. - 2012. - 512 с. С. 63-72

5. Durbin, R.K., Kotenko, S.V., and Durbin, J.E. Interferon induction and function at the mucosal surface. // Immunol. Rev. - 2013. - Vol. 255. - P. 25-39.

650 6. Hermant, P., and Michiels, T. Interferon- λ in the context of viral infections: production, response and therapeutic implications. // J. Innate Immun. -

2014. - Vol. 6. - P. 563-574.

7. Mahlakoiv, Т., Hernandez, P., Gronke, K., Diefenbach, A., and Staeheli, P. Leukocyte-derived IFN-a/b and epithelial IFN-1 constitute a compartmentalized

655 mucosal defense system that restricts enteric virus infections. // PLoS Pathog. -

2015. - Vol. 11. - art. no. el004782.

8. Ank N, West H, Bartholdy C, Eriksson K, Thomsen AR, Paludan SR. Lambda interferon (IFN-lambda), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections in vivo. // J

660 Virol. - 2006. - Vol. 80(9). - P. 4501-4509.

9. Mordstein, M., Neugebauer, E., Ditt, V., Jessen, В., Rieger, Т., Falcone, V., Sorgeloos, F., Ehl, S., Mayer, D., Kochs, G., et al. Lambda interferon renders epithelial cells of the respiratory and gastrointestinal tracts resistant to viral infections. // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. - P. 5670-5677.

665 10. Pott J, Mahlakoiv T, Mordstein M, Duerr CU, Michiels T, Stockinger S,

Staeheli P, Hornef MW. IFN-lambda determines the intestinal epithelial antiviral host defense. // Proc Natl Acad Sci USA. - 2011. - Vol. 108(19). - P. 7944-7949.

11. Heinze B, Frey S, Mordstein M, Schmitt-Graff A, Ehl S, Buchholz Ш, Collins PL, Staeheli P, Krempl CD. Both nonstructural proteins NSl and NS2 of

670 pneumonia virus of mice are inhibitors of the interferon type I and type III responses in vivo. // J Virol. 2011 May;85(9):4071-84. doi: 10.1128/JVI.01365-10. Epub 2011 Feb 9.

12. Nice, T.J., Baldridge, M.T., McCune, B.T., Norman, J.M., Lazear, H.M., Artyomov, M., Diamond, M.S., Virgin, H.W. Interferon-λ cures persistent murine

675 norovirus infection in the absence of adaptive immunity. // Science. - 2015. - Vol. 347(6219). - P. 269-273.

13. Lazear, H.M., Daniels, B.P., Pinto, A.K., Huang, A.C., Vick, S.C., Doyle, S.E., Gale, M., Jr., Klein, R.S., and Diamond, M.S. Interferon-1 restricts West Nile virus neuroinvasion by tightening the blood-brain barrier. // Sci. Transl.

680 Med. - 2015. - Vol. 7. - P. 284ra59.

14. Thatte A, DeWitte-Orr SJ, Lichty B, Mossman KL, Ashkar AA. A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection. // Immunol Cell Biol. - 2011. - Vol. 89(6). - P. 663-669.

15. Bartlett NW, Buttigieg K, Kotenko SV, Smith GL. Murine interferon 685 lambdas (type III interferons) exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model. // J Gen Virol. - 2005. - Vol. 86(Pt 6). - P. 1589-1596.

16. Pagliaccetti N.E., Chu E.N., Bolen Ch.R., Kleinstein S.H., Robek M.D. Lambda and alpha interferons inhibit hepatitis В virus replication through a common molecular mechanism but with different in vivo activities. // Virology. - 690 2010. - Vol. 401(2). - P. 197-206.

17. Donnelly, R.P., Dickensheets, H., and O'Brien, T.R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis С virus infection. // Trends Immunol. - 2011. - Vol. 32. - P. 443-450.

18. Hayes, C.N., Imamura, M., Aikata, H., and Chayama, K. Genetics of 695 IL28B and HCV-response to infection and treatment. // Nat. Rev. Gastroenterol.

Hepatol. - 2012. - Vol. 9. - P. 406-417.

19. Глобальная стратегия сектора здравоохранения по вирусному гепатиту 2016-2021. На пути к ликвидации вирусного гепатита. - ВОЗ, Женева, Швейцария, 2016. - 56 с.

700 20. Новые рекомендации в обновленном Руководстве воз по скринингу, оказанию медицинской помощи и лечению лиц с хронической инфекцией гепатита С. Аналитическая справка. - ВОЗ, Женева, Швейцария, 2016. - 12 с.

21. Патент US 5951974, МПК А61Р43/00, А61Р35/02, А61К47/34, А61Р1/16, С07К1/08, С07К14/56, А61Р35/00, А61К38/21, С07К1/113,

705 А61Р31/12, А61К47/48, А61К38/00, опубл. 14.09.1999.

22. Патент ЕР 0 809 996, МПК С07К1/10, С07К14/56, А61Р35/00, А61Р37/02, А61К31/00, А61Р31/00, А61Р31/12, А61К31/745, С07К14/52, С07К14/555, С07К1/113, А61К47/48, А61К38/21, А61Р37/00, С07К17/08, А61Р31/04, опубл. 03.12.1997.

710 23. Патент RU 2 447 083, МПК С07К 14/56, А61К 38/21, А61К 47/48,

А61Р 37/00, А61Р 35/00, А61Р 31/12, опубл. 10.04.2012.

24. Patten S.B. What is the best approach to treating interferon-induced depression in people with multiple sclerosis? // J. Neurosci. - 2001 - V. 26. - P. 66.

715 25. Wills RJ. Clinical pharmacokinetics of interferons // Clin.

Pharmacokinet. - 1990. - Vol.19. - JSfe 5.— P. 390-399. 26. Prammer О., Streichan U., Porzsolt F. Treatment-induced interferon (IFN)-a antibodies: Differential neutralisation of the antiviral and antiproliferative IFN-α activity in vitro // J. Interferon Res. - 1991. - N° 11. - P. 265.

720 27. Muir, A.J., Arora, S., Everson, G., Flisiak, R., George, J., Ghalib, R.,

Gordon, S.C., Gray, Т., Greenbloom, S., Hassanein, Т., et al.; EMERGE study group A randomized phase 2b study of peginterferon lambda- la for the treatment of chronic HCV infection. // J. Hepatol. - 2014. - Vol. 61. - P. 1238-1246.

28. Патент RU 2496514, МПК A61K 38/21, A61K 38/20, A61P 31/20, 725 опубл. 27.10.2013.

29. Патент RU 2409669, МПК C12N 11/08, C12N 11/10, A61K 38/00, A61K 38/43, опубл. 27.05.2012.

30. Kato Т., Date Т., Murayama A. et al. Cell culture and infection system for hepatitis С virus. // Nature protocols - 2006. - Vol. 1(5). - P.2334-2339.

730 31. Kato N., Mori K., Abe K. et al. Efficient replication systems for hepatitis

С virus using a new human hepatoma cell line. // Virus Research. - 2009. - Vol. 146. - P.41-50.

32. Blight K.J., McKeating J.A., Rice CM. Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis С virus RNA replication. // J. Virol. - 2002. -

735 Vol. 76(24). - P.13001-13014.

33. Bartenschlager R. and Pietschmann T. Efficient hepatitis С virus cell culture system: What a difference the host cell makes. // PNAS. - 2005. - Vol. 102(28). - P.9739-9740.

34. Руководство по проведению доклинических исследований 740 лекарственных средств. Часть первая.— М.: Гриф и К, 2013.— 944 с.

35. Пиотровский В. . Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики // Фармакология и токсикология. - 1986.— J b 5.— С. 118-125.

36. Каркищенко Н.Н., Хоронько В.В., Сергеева С.А., Каркищенко В.Н. 745 Фармакокинетика. - Ростов-на- Дону, 2001. - 383 с. 37. Мирошниченко И.И. Основы фармакокинетики. - М.: Издательский дом «ГЭОТАР-МЕД», 2002. - 188 с.

38. Rosiak J. М., Janik I., Kadlubowski S., Kozicki M.,Kujawa P., Stasica P., Ulanski P. Radiation formation of hydrogels for biomedical application // Radiation synthesis and modification of polymers for biomedical applications Final results of a coordinated research project 1996-2000. - 2002. - P. 5-48.