本发明属于生物技术及制药领域， 特别是涉及一种重组集成干扰素变异体的聚乙 二醇偶联物及其制备 方法和应用。 本发明是发明名称为 "抗病毒活性的人 a干扰素衍生物 "(专利号为 ZL01102915.3)发明专利的 延伸。

背景技术

早在 1957年， lssacs等人发现病毒感染的细胞产生一种因子， 可抵抗病毒的感染， 干扰病毒的复制， 因而命名为干扰素（interferon，IFN)。 干扰素是由灭活的或活的病毒作用于易感细胞 后， 由易感细胞基因组 编码而产生的一组糖蛋白。 其活性及抗原性皆取决于分子中的蛋白质， 而与其糖基无关。 根据其来源和结 构， 可将 IFN分为 IFN-c IFN-β, IFN-γ, 它们分别由白细胞、 纤维母细胞和活化 T细胞产生。 IFN-α为多 基因产物， 有十佘种不同亚型， 但它们的生物活性基本相同。 IFN除有抗病毒作用外， 还有抗肿瘤、 免疫 调节、 控制细胞增殖及引起发热等作用。 目前临床上使用的干扰素大多是通过基因重组 技术得到的。

IFN是慢性病毒性肝炎经临床验证有效的一线治 疗药物。 临床使用较多的是天然结构的 IFNa-2a和 IFNa-2b。 二者均属于短效干扰素， 半衰期短 (4〜16 h)， 血清浓度在注射 24 h后已经很低。 其在体内的药 代动力学过程影响了其抗病毒治疗的远期疗效 。 按照目前 3~6MU/kg， 每周 3次的用药方法， 在体内干扰 素水平呈现出典型的 "峰 -谷曲线"。 干扰素血清水平大幅度波动容易使病毒水平反 跳， 产生耐药性， 降低治 疗效果。 同时， 短效干扰素存在毒副反应大， 人长期使用耐受性差， 免疫原性强等不足。 因此， 对短效干 扰素进行修饰， 延长其在体内的半衰期， 维持体内血药浓度的稳定， 将有助于提高其治疗病毒性肝炎的有 效性， 并减轻毒副作用。

聚乙二醇 (polyetnylene glycol, PEG)是一种安全无毒、 无活性的聚合物， 常用于蛋白质药物修饰。 修 饰后的蛋白抗酶解、 水溶性增加、 半衰期延长、 免疫原性和毒性降低 （Inada，et al.，J.Bioact .And Compatible Polymers,5： 343( 1990). Delgalo'et al., Critical Reviews in Therapeutic Drag Carrier systems, 9:249 (1992) katre, Advanced Drug Delivery Systems, 10:91(1993))。 霍夫曼一拉罗齐公司的中国专利： ZL93116479.6和 ZL97105433.9公开了聚乙二醇一干扰素结合物的制 备， 先灵公司的中国专利 200580032850.2公开了稳定 的聚乙二醇化干扰素的制剂的制备。目前，己 有两种 PEG修饰的人 α干扰素（霍夫曼一拉罗齐的 PEGASYS 和先灵公司的 PEGINTRON) 用于慢性丙型和乙型肝炎的治疗。 两者聚乙二醇化后肾脏清除率明显降低， 半衰期延长（30〜16 h)、 免疫原性降低， 每周仅需给药 1次。 在清除 HCV/HBV病毒方面明显优于短效干 扰素。 治疗丙型肝炎 HCV-RNA近期反应率可达 69% , 持续反应率达 39%， 而常规干扰素仅为 7<¾。 治疗 乙型肝炎 HBeAg 转阴率可达 37 %，综合应答率 (即 HBeAg 转阴、 HBV DNA抑制和 ALT正常化)为 35¾>， 61%的病人伴随 HBVDNA转阴 (<400copies/mL)， 7%出现了 HBsAg转阴。 而常规干扰素治疗乙肝后三项 指标仅为（15%、 25%、 12 ¾ 。无 HBsAg转阴的病人（Reddy KR, et al . Hepatology, 2001 , 33 : 433-438. Jessner W ， et al . J Viral Hepat. 2003， 10： 37-42. Shiffman ML, et al. Hepatology, 2004;40(4, suppl 1):314A. Davis GL, et al. Hepatology,2003 ;38: 645-52. Janssen HL, et al. Lancet,2005; 365: 123-129. Cooksley WG et al.. J Viral Hepat, 2003; 10:298-305. )。

PEG修饰的重组人 α干扰素 2a ( PEGASYS ) 修饰位点为赖氨酸， PEG修饰的重组人 a干扰素 2b (PEG-Intron)修饰位点为组氨酸。文献报道 ( Miller DL,et al.Science,1982,215:689-690. Radhakrishnan R, et al.Structure,1996;4(12): 1453-1463. Karpusas M, et al.Proc.Natl.Acad.sci.USA 1997,94: 11813-11818 )， IFN-α的 受体结合区主要包括 AB loop(Arg22,Leu26,Phe27, Leu30,Lys31, Arg33,His34),helixB (Ser68), helixC (Thr79,Lys83,Tyr85, Tyr89), helix D(Argl20,Lysl21,Glnl24,Lysl31,Glul32)和 helixE (Argl44,Glul46)。 PEGASYS修饰的赖氨酸以及 PEG-Intron修饰的组氨酸均在上述受体结合区， 不利于干扰素与其受体的结 合。 此外， 按二者 PEG修饰后终产物均非特异性单一定点修饰， 如 PEGASYS以修饰 Lysl31为主的混合 物 （共有 7个修饰位点）， PEG-Intron是以修饰 His34为主的混合物 （共有 4个修饰位点）。

单一位点的 PEG修饰可同时实现分子量和结构的均一性，提 高修饰后的生物活性和体内安全性。已 有多种方法可实现 PEG对干扰素的单一位点特异性修饰。 （1 ) WO2006/004959公开了一种利用 IFNa-lb 氨基酸序列中第 86位自由半胱氨酸 （Cys86 ) 特异性偶联马来酰胺 PEG ( PEG maleimide ) 的方法及其产 物； （2 ) WO2008/074230中公开了将 IFNa中第 85或 86为氨基酸突变为 Cys， 再利用马来酰胺 PEG进行 特异性定点修饰。 （3 ) 还可选择含与 N端氨基特异性结合活性基团的 PEG对干扰素进行 N末端修饰 （如 中国专利 CN1229388C, CN100478359C和 CN101381409A)。

N末端的修饰 PEG远离干扰素受体结合区， 从结构分析应是理想的修饰位点。 但天然 a干扰素 N 端的第 1位为半胱氨酸， 其与 99位半胱氨酸形成一对二硫键 （此二硫键对生物活性十分关键）。 采用对 α 干扰素 Ν末端的专一位点 PEG修饰， 修饰率很低且对生物活性影响大。

为提高天然干扰素的活性， 美国 Amgen 公司首次合成了一种非天然的干扰素 （Consensus interferon, 集成干扰素， 商品名为干复津）。 干复津是一种经计算机优化组合的非天然的重 组 α-干扰素， 其序列由 20 种天然 α-干扰素亚型序列优化组合而成， 其抗病毒活性比天然干扰素提高了 5〜10倍。 1997年， FDA批 准干复津应用于丙型肝炎的治疗， 研究结果显示疗效明显优于普通干扰素。 美国专利 US4695623、 US489747K US5372808公开了复合干扰素具有广谱的干扰素活 性，有较强的抗病毒和抗肿瘤以及激活 NK 细胞的活性。 但是干复津和天然 α干扰素相同， 具有稳定性差、 体内半衰期短、 免疫原性强等缺点。 同时 Ν端第一位的半胱氨酸需与 99位半胱氨酸形成二硫键， 不能有效的进行 Ν末端修饰。 虽然 Amgen公司的 美国专利 US005985265 A公开了干复津蛋白的 N端修饰的方法， 但无论在修饰率和修饰后保留的生物活 性均明显低于其它蛋白的 N末端修饰 （重组人粒细胞集落刺激因子 G-CSF和重组人生长激素 GH等）。 为实现干扰素的 N端修饰， 同时根据同源序列最高原则， 本发明人设计了全新的集成干扰素序列， 命 名为集成干扰素变异体（super antiviral interferon,简称 IFN-SA), 现根据干扰素的命名原则改为重组集成干 扰素变异体。 由 171氨基酸组成， 在 N末端专门设计引入 GlySerGlyGlyGly五个氨基酸序列， 可实现 N 末端的专一位点 PEG修饰。 该结构与干复津结构不同， 同时体外抗病毒活性提高了 50%。 本新型结构及 其重组制备和在抗病毒性疾病中的应用， 已获中国发明专利授权， 专利号： ZL01102915.3。

本发明提供了一种重组集成干扰素变异体 （IFN-SA) 聚乙二醇偶联物 （简称 PEG-IFN-SA) 的制备方 法和应用。 本发明优选能与 N端氨基特异性结合的丙醛基团的 20KD聚乙二醇 （PEG-ALD) 为修饰剂， 选择 pH4.5~6条件修饰， 成功获得了聚乙二醇化重组集成干扰素变异体 偶联物（PEG-IFN-SA)。 本制备方 法 N端单一位点化学修饰物，有效提高了该蛋白� �的稳定性、延长了半衰期、降低了免疫原性� �毒副反应。 可望成为新型的长效干扰素预防和治疗病毒性 感染性疾病、 增生性疾病、 增强免疫功能等疾病的药物。 发明内容

本发明的目的在于提供了一种用于 N端定点化学修饰的重组集成干扰素变异体 （IFN-SA) 聚乙二醇 偶联物的制备方法。 该偶联物具有稳定性好、 半衰期长、 免疫原性和毒副反应低等特征， 可用于制备治疗 预防和治疗病毒性感染性疾病、 增生性疾病、 增强免疫功能以及其他疾病的药物。

本发明涉及的一种化学修饰的 IFN-SA的聚乙二醇偶联物。

IFN-SA表示重组集成干扰素变异体， 其特征在于， 所述 IFN-SA的氨基酸序列为 SEQ ID No: 1所示：

Gly Ser Gly Gly Gly Cys Asp L-eu Pro Gin Thr His Ser L-eu Gly Asn

1 5 10 15

Arg Arg Ala L-eu lie L-eu L-eu Ala. G-Ln Ivlet Arg Arg lie Ser Pro Phe

20 25 30

Sear Cys L-eu Lys Asp Arg His Asp Phe Gly Phe Pro GLn Glu Glu Phe

35 40 45

Asp Gly Asn GLn Phe Oln Lys Ala OLn Ala. lie Ser Val L-eu. His Olu

50 55 60

Ivlet lie GLn G-ln Thr Phe Asn L-eu Phe Sear Thr Lys Asp Ser Sear Ala

65 70 75 SO

Ala. Trp As Glu Sear L-eu L-eu Glu Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gin

85 90 95

Gin L-eu Asn Asp L-eu Glu Ala Cys \¾1 lie GLn Glu \¾1 Gly Val Glu

100 105 110

Glu Thr Pro Leu Ivlet Asn \¾1 Asp Sear lie L-eu Ala ¾1 Arg Lys Tyr

115 120 125

Phe Gin Arg lie Thr L-eu Tyr L-eu Thr Glu Lys L s Tyr Sear Pro Cys

130 135 140

Ala Trp Glu ¾1 Val Arg Ala Glu lie Ivlet Arg Ser Phe SerL-eu Ser

145 150 155 160

Thr Asn Leu Gin Glu. Arg L-eu Arg Arg L s Asp

165 170

IFN-SA聚乙二醇偶联物， 其特征在于聚乙二醇衍生物修饰剂是以酰胺键 与重组集成干扰素变异体 N 末端甘氨酸的 α-氨基共价连接。

所述聚乙二醇衍生物修饰剂为一端为醛基活化 聚乙二醇衍生物修饰剂。 所述聚乙二醇衍生物的另一端 为单甲氧基。

醛基活化的单甲氧基聚乙二醇分子，其特征在 于，包括但不限于单甲氧基聚乙二醇丙醛（mPE G-ALD)、 单甲氧基聚乙二醇丁醛、 单甲氧基聚乙二醇乙醛、 单甲氧基聚乙二醇戊醛。 优选单甲氧基聚乙二醇丙醛。 聚乙二醇分子根据偶联度不同， 可以是分子量为 10KD _a 〜40KDa的任一分子， 其中优选分子量为 20KD的 聚乙二醇分子。 聚乙二醇分子可以是直链型或分支型， 可以是单链、 双链或多链。 优选直链型单链聚乙二 醇分子。

本发明还提供了 IFN-SA聚乙二醇偶联物的制备方法。 所属领域技术人员根据常识可以选择聚乙二醇 的结构类型、 分子量和反应所需的用量。 通过本申请所提供的制备方法， 根据修饰后蛋白分子的结构和性 质， 选择修饰条件： 修饰酸碱度、 反应体系， 蛋白和聚乙二醇的摩尔比等。

以本发明优选的 20KDa的 mPEG定点 N末端修饰 IFN-SA为例， 说明偶联物的制备方法。

IFN-SA的制备， 具体见专利 ZL01102915.3。

本领域熟知的， 在氰基硼氢化钠存在条件下， 带醛基的 PEG会和伯胺发生还原氨化反应。醛基和其他 的亲电活性基团不同， 它只和胺基反应。 虽然醛基的反应活性比 NHS活性低， 但它具有反应条件温和， 易于使 PEG和蛋白质或其它材料的表面连接。 因此， 在低的 pH下， mPEG-醛会对蛋白质的 N端进行选择 性反应。 该反应条件在 pH值 4.0〜7.0， 10〜100mmol/L盐浓度的缓冲体系下， 温度在 4〜25°C， 反应时间 为 1〜72小时， 反应摩尔比 PEG:蛋白在 1 : 2〜1： 10。 一般情况下， 选择低温、 低 pH、 反应时间适宜条 件下得到的 N-末端修饰产物均一性强， 且反应转换率较高。

本发明专利所述偶联物的制备步骤： 将 IFN-SA的磷酸盐缓冲液与 20KD的 mPEG-ButyrALD在加入 20mM氰基硼氢化钠条件下反应， 然后采用常规方法进行分离纯化， 过滤除菌， 获得本发明的 IFN-SA的 偶联物。 所用磷酸盐缓冲液优选 pH4.0-6.0， 浓度为 50-lOOmmol/L, 温度优选 4-10°C， 反应时间优选 24〜 48小时， 反应摩尔比 PEG:IFN-SA为 1 : 2〜1： 5， 修饰率达到 50%以上。 修饰条件的选择和修饰方法在 实例中详细说明。

本发明偶联物的纯化方法为： IFN-SA 与聚乙二醇聚合物经反应后的样品， 用 5xDDW透析后上 SP Sepharose F.F. , 经 10 mM乙酸-乙酸钠 （pH5.5 )， 平衡液平衡后， 用 1M NaCl的盐离子逆度洗脱， 穿透 和洗脱样品分别用电泳、 RP-HPLC检测纯度。含聚乙二醇偶联物组份再经 Superd _eX 75 分子筛（或 Sephacryl S-200), lOmM PB, (pH7.4) 条件下分离除去高分子聚合物。 结构和质量分析方法包括质谱、 质量肽图、 RP-HPLC, Gel-HPLC和 SDS-PAGE。

采用 20KD分子量的丙醛活化的聚乙二醇分子（ALD-mPEG 20K)作为修饰物， 经过至少 10批的中试 工艺试验， 每批可获得 1克以上纯度大于 95%的 IFN-SA聚乙二醇偶联物 （代号： PEG20-IFN-SA), 修饰 率约 50%， 非 N端修饰物低于 3%， 抗病毒比活性≥1.2xl0 ⁷ IU/mg。 药代动力学表明在食蟹猴体内半衰期为 34.5小时， 明显长于 IFN-SA 3小时的半衰期。 食蟹猴 6月长毒表明， 免疫原性显著低于 IFN-SA。 在水溶 液状态 4°C条件下可稳定 24个月。 因此， 本发明所述 IFN-SA聚乙二醇偶联物具备长效、 稳定、 低免疫原 性的特征。

另根据上述制备方法， 选择 10KD 的单甲氧基聚乙二醇丁醛与 IFN-SA 的 N端氨基进行偶联获得 PEG10-IFN-SA。 选择 40KD 的 PEG-NHS 与 IFN-SA 的 N 端氨基进行偶联获得 PEG40-IFN-S A。 PEG10-IFN-SA的体外抗病毒活性为≥7.0xl0 ⁷ U/mg， 半衰期为 15.3小时。 PEG40-IFN-S A的体外抗病毒活 性为≥4.0xl0 ⁶ U/mg， 半衰期为 42.29小时。 表明随着偶联 PEG分子量的增加， 半衰期延长， 但外抗病毒活 性显著下降。 本发明发现， 直链型 PEG修饰对 IFN-SA体外活性的影响明显小于支链型 PEG的修饰。 因 此， 本发明优选 20KD直链型单链 PEG偶联修饰 IFN-SA。

由上述方法制备的 PEG-IFN-SA, 通过相应的制剂技术制备成注射液或冻干粉针 、 外用型的膏剂或乳 剂或喷雾剂以及口服型的含化片或胶囊、 片剂。

IFN-SA 的聚乙二醇偶联物的另一特征在于， 该偶联物可制成临床治疗的药物组合， 含有有效剂量的 任一偶联物， 和药用稀释剂、 佐剂或载体。

本发明所涉及的 PEG-IFN-SA分子为临床药用制剂的有效成分， 该制剂包括但不限于： 稀释剂、 稳定 剂、 防腐剂、 溶解剂、 乳化剂、 佐剂和载体等。 1 )稀释液： 磷酸盐、 醋酸盐、 柠檬酸盐等缓冲液； 2) pH 值和离子强度； 3 )去污剂和促溶剂： 山梨醇、 T _Ween -20、 Tween-80; 4)充填剂： 山梨醇、 葡萄糖、 蔗糖、 甘露醇、 甘油。 PEG-IFN-SA制剂优选 lOmM PB (pH7.2)、 山梨醇、 Tween-80。 有效成分的有效剂量是指 考虑到表观分子量和病人体重、 年龄等因素的有效治疗或预防剂量。 本发明涉及的 PEG-IFN-SA其有效剂 量为 0.5ug~9ug/kg/次。

PEG-IFN-SA临床药用制剂给药方式肠道外给药， 包括但不限于皮下、 肌肉、 静脉、 腹腔注射、 吸入、 舌下或透皮给药。 给药周期为 3〜14天 /次。

本发明同时还公开了 IFN-SA与聚乙二醇偶联物用于预防和治疗病毒性 感染性疾病、 增生性疾病、 增 强免疫功能以及其他疾病的方法。

在一实施方式中， 所述病毒感染特征在于包括而不限于肝炎病毒 感染， 人乳头状病毒感染， 单纯性疱 疹病毒感染、 人免疫缺陷病毒感染、 EB病毒感染、 SARS感染和流感病毒感染。 所述的肝炎病毒感染特征 在于包括而不限于丙型肝炎病毒、 乙型肝炎病毒感染、 甲型肝炎病毒、 丁型肝炎病毒、 戊型肝炎病毒。 优 选丙型肝炎、 乙型肝炎病毒感染。 优选丙型肝炎、 乙型肝炎病毒感染。

在另一实施方式中， 所述的增生性疾病特征在于包括而不限于良性 肿瘤和恶性肿瘤， 恶性肿瘤特征在 于包括而不限于慢性髓原性白血病、 黑色素瘤、 肾癌、 肝癌。

还提供了药物组合联合用药方式包括而不限于 利巴韦林、 拉米夫定。 抗丙型肝炎病毒与能抑制病毒 DNA和 RNA合成的广谱抗病毒类药物如利巴韦林组合运 用； 抗乙型肝炎病毒与核苷类抗病毒类药物如拉 米夫定组合运用； 治疗恶性肿瘤与其他化疗药物组合运用。

至此已对本发明进行了详细的描述， 通过参考下列实例， 能够对本发明有更清楚地理解， 所述实例仅 为说明目的而并不旨在对本发明进行限制。

附图说明

附图 1 : IFN-SA与 PEG的摩尔比对修饰反应的影响 SDS-PAGE电泳图， 其中 1 : 为 1 : 2比例， 2： 为 1 :3 附图 2: IFN-SA修饰前后的 SDS-PAGE电泳图。 其中 1 : 为修饰前 IFN-SA, 2： 为修饰后产物， 3 : 为纯 化后的 PEG20-IFN-SA, M: 蛋白分子量标准。

比例， 3 : 为 1 :4比例， 4: 为 1 :5比例， 5： 为 1 :6比例， M为蛋白分子量标准。

附图 3 : 不同分子量 PEG修饰的 IFN-SA的 SDS-PAGE电泳图。其中 M为 marker, 1为 PEG10K-IFN-SA, 2为 PEG20K-IFN-SA, 3为 PEG40K-IFN-SA。 图中三种 PEG化的 IFN-SA蛋白因迁移率变慢而比理论值 偏大。

附图 4: PEG20-IFN-SA的 RP-HPLC色谱图。 图中 PEG20-IFN-SA呈单一吸收峰， 纯度为 98.7%。

附图 5 : PEG20-IFN-SA和 IFN-SA的胰蛋白酶酶切后还原质量肽图分析色谱 图。其中图 A为 IFN-SA的肽 图， 图 B为 PEG20-IFN-SA肽图。 二者间仅有二个肽段峰的差异， 差异分析说明见实例 3。

图 6 ： PEG20-IFN-SA在食蟹中皮下注射不同剂量（10ug/kg� � 30ug/kg和 90ug/kg)后体内抗病毒生物活性 随时间变化曲线图。 其中參为 10ug/kg， 〇为 30ug/kg， 为901¾/1 _¾ 。 横坐标为时间 （小时）， 纵坐标为每 毫升血液中抗病毒活性单位 （IU/ml)。

具体实施方式

实例 1、 重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物 (PEG20-IFN-SA) 的修饰条件

IFN-SA溶液 （浓度为 10 mg/mL， 缓冲为 100 mM PB， pH7.0) 由重庆富进生物医药有限公司制备， mPEG-ButyrALD-20KD (纯度 >95%， 相对分子质量为 20xl0 ³ ) 购自北京键凯科技有限公司， 氰基硼氢化 钠 （NaBH3(CN)， 括号内的东西跟括号外的名称不是一致的）溶 液购自 Sigma公司， SDS-PAGE相关试剂 及溶液和各种分析纯均为上海生工产品。 恒温磁力搅拌仪（江苏中大仪器厂）、 电泳仪、 SP S _e phar _OSe RF.、 Superdex75 分子筛、 AKTA explore层析系统 、 SDS-PAGE 电泳系统均为 Pharmacia公司产品。

1 、 反应 pH值对修饰产物的影响

IFN-SA溶液分别用 100 mmol/L PB(pH4.0、pH5.0和 pH5.5 )缓冲液配成 2 mg/mL,各取一份加入 1 mol/L NaBH3(CN)母液至终浓度为 20 mmol/L。 按摩尔比 1： 4 ( IFN-SA:mPEG-ButyrALD-20KD ) 称取 mPEG-ButyrALD-20KD 加入 IFN-SA 反应溶液中， 4°C条件下 lOOr/min 搅拌反应 24 h。 分别取样进行 SDS-PAGE电泳， 确定 PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明： pH值在 4.0、 5.0、 5.5的条件下， PEG1-IFN-SA所占比例分别为 18%, 31%, 40%。 说明 pH4.0的修饰率最低， pH5.5的条件下修饰率最高。

2 、 IFN-SA与 PEG的修饰比例对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用 100 mmol/LPB pH5.5缓冲液配成 2 mg/mL, 补入 1 mol/L NaBH3(CN)母液至终浓度为 20 mmol/L„ 按 IFN-SA与 mPEG-ButyrALD-20KD摩尔比为 A (1:2)、 B (1:3)、 C (1:4)、 D (1:5)、 E (1:6) 分别称取 mPEG- ButyrALD- 20KD加入 IFN- SA反应溶液中， 4°C条件下 100 r/min搅拌反应 24 hr, 分别取 样进行 SDS-PAGE电泳， 确定 PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明 (图 1): 在 IFN-SA与 mPEG-ButyrALD-20KD摩尔比为 A (1:2)、 B (1:3)、 C (1:4)、 D (1:5)、 E (1:6) 时， PEG1-IFN-SA所占比例分别为 18%, 27%, 39%, 40%, 41<¾。 当 PEG修饰物的摩 尔比达到 1: 4后， 不能进一步提高修饰率， 反应会造成 PEG修饰的多聚体增加。

3 、 反应温度和时间对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用 100 mmol/L PB pH5.5缓冲液配成 2 mg/mL, 补入 1 mol/L NaBH3(CN)至终浓度为 20 mmol/L。 取 IFN-SA与 mPEG-ButyrALD-20KD质量比 1:4， 分别在 4°C反应 48hr， 25°C反应 24hr不同时 间点， 分别取样进行 SDS-PAGE电泳， 确定 PEG20-IFN-SA的修饰率。 实验结果表明： 4°C条件下通过延 长反应时间， 同样达到反应 25°C反应的修饰率。 但 4°C条件修饰更利于 IFN-SA的活性和结构稳定。

4、 IFN-SA浓度对修饰产物的影响

IFN-SA溶液用 100 mmol/L PB pH5.5缓冲液配成为 1.0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 4.0 mg/mL, 共 4份，按 IFN-SA与 mPEG-ButyrALD-20KD质量比 1:4的比例加入 mPEG-ButyrALD-20KD, 4°C， 100 r/min 搅拌反应 24hr， 分别取样进行 SDS-PAGE电泳分析， 确定 PEG20-IFN-SA的修饰率。

实验结果表明， IFN-SA浓度在 1.0 mg/mL， 2.0 mg/mL, 3.0 mg/mL, 4.0 mg/mL时， PEG20-IFN-SA 所占比例分别为 28%， 40%, 45%, 48% 但随着蛋白浓度提高时， PEG20-IFN-SA的修饰有所增加， 达到 3.0-4.0 mg/mL时为合适浓度。

实例 2、 重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物 (PEG20-IFN-SA) 的分离纯化

修饰后样品 PEG-IFN-SA, 用 5xDDW透析过夜，透析后样品上 SP Sepharose F.F层析柱。 SP Sepharose F.F层析柱用 BufferA (10mM乙酸-乙酸钠 pH5.5 平衡） 平衡后上样， 分别用洗脱 1 (10mM乙酸 -乙酸 钠 0.15MNaCl pH5.5)、 洗脱 2 (10mM乙酸-乙酸钠 0.2M NaCl pH5.5)、 洗脱 3 (10mM乙酸-乙酸钠 0.25M NaCl pH5.5 )、洗脱 4( 10 mM乙酸-乙酸钠 0.35MNaCl pH5.5)、洗脱 5( 10 mM乙酸-乙酸钠 0.45M NaCl pH5.5 )进行洗脱， 分别收集穿透峰及各个洗脱峰， 并取样分别进行 SDS-PAGE电泳分析。 收集 SP Sepharose F.F层析纯化后的 PEG-IFN-S A样品，上 Superdex 75 分子筛。 Superdex 75凝胶分子筛用 10mmol/L PB， pH7.4平衡， 平衡好后上样， 再用 10mmol/L PB， pH7.4等梯度分离， 随后收集含 PEG20-IFN-SA主 峰。 分别取样进行 SDS-PAGE电泳分析 （见图 2)。

实验结果表明， 经 SP Sepharose和 SuperdexG75柱能有效将修饰 1个 PEG和修饰 2个 PEG的 IFN-SA 和游离 IFN-SA分离。

实例 3、 10KD和 40聚乙二醇修饰重组集成干扰素变异体

分别选择 10KD的单甲氧基聚乙二醇丁醛和 40KD的分枝链单甲氧基聚乙二醇丙醛 (均为北京健凯生物 公司产品） 按照实例 1 和实例 2 的方法对 IFN-SA进行 N端单一位点特异性修饰， 经分离和纯化获得 PEG10-IFN-SA和 PEG40-IFN-SA (见图 3 )。

实例 4、 重组集成干扰素变异体聚乙二醇化偶联物 (PEG20-IFN-SA) 的理化性质

1、 纯度

分析型 RP-HPLC 的分析柱为 C18 (Waters Symmestry), 流动相 A液（0.1%三氟乙酸、 5%乙腈）， 流 动相 B 液 （0.1%三氟乙酸、 95%乙腈）。 上样量 20 μ1， 流速为 1 mL/min， 梯度洗脱 70 min (A液从 100% 至 30%， B 液从 0至 70%)， 检测波长为 214 nm。 实验结果表明（图 4)， PEG20-IFN-SA纯度达 95%以上。

2、 PEG20-IFN-SA修饰位点确定

经中国科学院上海生命科学研究院蛋白质组分 析中心用氨基酸序列分析仪测定 PEG20-IFN-SA的 N端 氨基酸序列为 SGG GCD LPQ THS LGN。 未修饰前的 N末端第一位 Gly未能测出， 证明该位点被 PEG修 饰。

3、 PEG20-IFN-SA修饰位点均一度分析

本品 mPEG-ALD修饰为专一 N末端氨基修饰，但在氰基硼氢化钠的存在下� � 可能因修饰条件的不 同产生部分 mPEG-ALD修饰在赖氨酸的 ε -ΝΗ ₂ 残基上。为证明 PEG20-IFN-SA中 PEG仅修饰在 N末端， 通过选用专一性强的胰蛋白酶（Sigma公司， 蛋白组学级）特异性酶解赖氨酸和精氨酸的 C端肽键， 由于 空间位阻作用的影响， 经 PEG修饰后的赖氨酸位点不能被胰蛋白酶识别和 酶切。 比较修饰前后的 IFN-SA 质量肽图， 可获得本样品中的 N末端 PEG修饰均一度。

将 IFN-SA和 PEG20-IFN-SA二种样品冻干除盐后用 1 <¾NH ₄ HC0 ₃ 溶解成 2mg/ml， 每个样品取 0.9ml， 补入 50uL牛胰蛋白酶（质量比 1 : 50)，37°C反应 24小时后，再补入 0.1ml的 O.lMoL/L DTT还原处理（37°C， lhr ) 经 RP-HPLC和质谱分析二者的质量肽图。

由图 5A和图 5B比较可见：未修饰 IFN-SA样品肽图中 13.5min肽段峰在 PEG20-IFN-SA中消失，而 在 PEG20-IFN-S A肽图中出现 37.9min新的肽段峰，其余肽段峰形和峰面积两� �完全一致。在 PEG20-IFN-S A 消失的 13.5mm 肽段经过质谱测定分子量为 1655， 即 IFN-SA 的第一肽段 （序列为 GSGGGCDLPQTHSLGNR ) , 而出现的 37.9min肽段为 PEG化的该肽段。 比较两者质量肽图， 未见其余被 PEG修饰的片段。 证明， IFN-S A经本专利方法的 PEG修饰仅位于 N末端。

实例 5、 不同分子量聚乙二醇修饰的 IFN-SA体外生物活性测定

采用 Wish/VSV细胞病变抑制法测定体外抗病毒活性。 人 α-干扰素生物学活性测定的国家标准品 （中 检所） 复溶后， 用测定培养液稀释至 1000IU/mL。 在 96孔细胞培养板中， 做 4倍梯度系列稀释， 共 8个 稀释度， 每个稀释度做 2孔。 分别将 PEG10-IFN-SA, PEG20-IFN-SA和 PEG40-IFN-SA用测定培养液稀释 成 0.1 _g /mL， 用测定培养液稀释成将 IFN-SA稀释为 l.Ong/mL, 记录预稀释倍数。 在 96孔细胞培养板中， 再做 4倍梯度系列稀释， 共 8个稀释度， 每个稀释度做 2孔。 按活性标准品计算样品的抗病毒体外活性。

PEG10-IFN-SA 体外抗病毒活性保留了 IFN-SA约 8. 01%的活性， PEGG20-IFN-SA 保留了 1. 24%, PEG40-IFN-SA保留了 0. 43%。采用 NIBSC来源的国际重组人集成干扰素活性标准品� ��参照， 四者其体外抗 病毒活性均提高 50%左右。

体外抗病毒活性 （IU/mg)

IFN-SA 9.64 X 10 ⁸

PEG10-IFN-SA 7.72 X 10 ⁷ 8. 01

PEG20-IFN-SA 1. 29 X 10 ⁷ 1. 34

PEG40-IFN-SA 4.14 X 10 ⁶ 0. 43 实例 6、 IFN-SA与 PEG20-IFN-SA药代动力学比较研究

食蟹猴 12只，雌雄各半， 分为 2组， 分别单次给予 lO g kg 的 IFN-SA或 5(^g/kg 的 PEG20-IFN-SA, 采用本公司研制的 IFN-SA放射免疫（RIA)试剂盒测定皮下注射 IFW-SA或 PEG20-IFN-SA后的血药浓度， 实验数据用 3P97药动程序拟合并计算药动参数。实验动物� �前肢肘肝素抗凝静脉取血，每次 1.5ml。IFN-SA 的取血时间点为 0 h 30min, lhr、 2h、 4h、 8h、 12h、 16h和 24h。 PEG-IFN-SA的为 Oh lhr, 2hr, 4、 6、 12、 24、 48、 72、 96、 120、 144和 168h。 血液在室温放置 30min后于 4000rpm离心 10min， 分离出血清， -20 °C保存用于血药浓度的测定。

经拟合优度比较， 未修饰的 IFN-SA 的药代符合一房室消除模型， 平均达峰时间 T _pMk (实测值） 为 5.33+1.63h , 平均消除半衰期 (t _1/2e )为 3.06±1.19h ; PEG20-IFN-SA 平均达峰时间 T _peak (实测值） 为 13.33+2.07h _; 平均消除半衰期 (t _1/2e )为 34.43±4.77 h。 比 IFN-SA的半衰期延长 10倍以上。 平均消除半衰期

种类 平均达峰时间 T _pMk

(tl/ _2e )

IFN-SA 5.33+1.63h 3.06±1.19h

PEG20-IFN-SA 13.33+2.07h 34.43+4.77 h 实例 7、 PEG20-IFN-SA体内生物活性测定

食蟹猴 18 只， 随机分为 3 组， 每组 6只， 雌雄各半。 分别皮下一次注射 PEG20-IFN-SA 10 g/kg、 30 g/kg, 9(^g/kg后于 0， 3, 12, 24, 48, 72， 96, 120, 144hr共 9个时间点， 取血 1.0ml, 4°C3000rpm， lQmm离心后取不少于 0.4ml血清样品于 -70°C保存。 采用 Wish/VSV细胞病变抑制法测定体内抗病毒生物 活性， 各时相点血清样品从 1 : 45按三倍稀释， 共 6个稀释度。 测定结果用活性标准品计算相应时间点的 体内抗病毒活性 （IU/ml)。

结果如图 6所示， 10、 30和 90ug/kg三个剂量的相应时间点从 3〜144hr范围内， 体内干扰素抗病毒活 性呈剂量反应关系。 三者的体内活性均随时间延长而逐渐降低， 最高活性维持在 12〜24hr之间。 30ug/kg 剂量注射后在 12hr出现最高体内活性达 15000IU/ml以上， 24小时为 11000IU/ml， 48hr为 6500IU/ml， 72hr 为 4000IU/ml， 96hr为 2500IU/ml， 144小时为 500IU/ml。

实例 8、 PEG20-IFN-SA与 IFN-SA免疫原性比较研究

IFN-SA设 l.(Vg/kg/d组、 5 g kg/d组、 25 g/kg/d组皮下注射，连续 4周。 PEG20-IFN-SA设 lO.O g kg/ 周组、 30.(Vg/kg/周组、 90.(Vg/kg/周组皮下注射，连续 4周。每组 6只食蟹猴，不同时间点采血检测抗 IFN-SA 的抗体滴度， 并计算抗体滴度的几何均数 （为抗体滴度倒数的反对数的平均值）。 血清抗体滴度 （几何均数)

时间 IFN-SA组 PEG20-IFN-SA组

1.0ug kg/d 5.0ug/kg/d 25.0ug kg/d 10.0ug/kg 30.0ug kg 90.0ug/kg 给药 2周 10.0± 1.0 50.0 ± 1.0 111.8±3.8 2.1 ±0.2 5.6±0.3 8.7±0.6 给药 4周 74.8 ±4.7 1869.2±4.7 2137.5 ±5.3 5.1 ±0.9 10.0± 1.1 21.2±2.7 结果表明： PEG20-IFN-SA显著降低了 IFN-SA的体内免疫原性。 实例 9、 PEG20-IFN-SA对食蟹猴免疫功能的促进作用 设 PEG20-IFN-SA l( g/kg、 3( g/kg、 90μ§¾ 低、 中、 高三个剂量组， 皮下注射， 每周一次。 给药后 30、 58、 175、 180 天进行外周血淋巴细胞增殖试验和 ΝΚ细胞杀伤活性检测。 结果显示， 给药 2个月后， 三个剂量组与对照组相比， Con Α诱导外周血淋巴细胞增殖能力和 ΝΚ细 胞杀伤活性检测均显著增高 （P < 0.05 )。 提示， PEG-IFN-SA有增强免疫功能的作用-

淋巴细胞增殖 （OD) NK细胞杀伤活性 （<¾) 时间 溶媒对 ΙΟμ kg 30μ ₈ /1¾ 溶媒对 ΙΟμ kg 30μ ₈ /1¾

照组 组 组 组 照组 组 组 组

0.27土 0.49土 0.47土 0.50土 59.34土 75.88土 77.56土 78.25土 给药 58天

0.12 0.06 0.11 0.15 13.41 11.28 10.92 13.96

0.40土 0.62土 0.75土 0.83土 55.40土 76.58土 75.71土 79.33+ 给药 135天

0.06 0.08 0.13 0.10 15.73 12.63 9.33 13.10

0.41土 0.59土 0.71土 0.79土 58.41土 75.99土 78.22土 73.52土 给药 180天

0.09 0.06 0.16 0.07 12.09 13.57 11.11 14.03 实例 10、 PEG20-IFN-SA体外抗乙型肝炎病毒的活性 选用乙型肝炎病毒（HBV) DNA克隆转染人肝癌细胞（HepG2)的 2.2.15细胞系，观察 PEG20-IFN-SA 和集成干扰素（商品名干复津或 IFN (—） Co _ni )在体外对 HBsAg和 HBeAg分泌、 HBV DNA拷贝数的 影响。设无药细胞对照组和不同药物浓度的给 药组， PEG20-IFN-SA的终浓度为 l.OxlO ⁶ 到 0.0032xl0 ⁶ IU/ml 五倍梯度稀释， 每四天换一次液， 再重新加药。 样品与细胞总共作用 9天后， 取上清测定 HBsAg、 HBeAg 浓度和 HBV的 DNA拷贝数， 余下细胞加入 MTT检测细胞增殖。 通过获得细胞毒性 TC ₅ 。和抑制 HBsAg、 HBeAg的 IC ₅ 。， 计算相应的治疗指数（TI) 即 TC ₅ 。/IC ₅ 。。 如 TI越大， 表明抗 HBV的作用越显著。 采用荧 光定量 PCR测定 HBV-DNA的拷贝数，上清和胞内 HBV DNA拷贝数与对照组相比 PEG20-IFN-SA最大降 低率分别为 94%和 83%， 而干复津为 84%和 76%。

HBsAg的 TI HBeAg的 TI 对细胞毒性 TC50 (IU/ml)

PEG20-IFN-SA 5.2±0.8 1.9 ±0.6 1.02 X 10 ⁶

IFN-conl 4.4 ±0.4 < 1.0 6.2 X 10 ⁶ 结果表明： PEG20-IFN-SA具有较强的体外抗乙型肝炎病毒的活 性。 实例 11、 PEG20-IFN-SA体外对肿瘤细胞株的抑制作用 选择四株肿瘤细胞株： 肝细胞癌（HepG2 )， 乳腺癌 （MCF- 7 ), 急性早幼粒细胞性白血病 （HL60 ), 肾癌（ACHN )。设无药细胞对照组和不同药物浓度的给药� �， PEG20-IFN-SA终浓度为 4.0xl0 ⁵ 到 O.OOlxlO ⁵ IU/ml, 四倍梯度稀释， 共 8个浓度梯度， 作用 48小时后 MTT检测细胞增殖状况。 实验结果表明： PEG20-IFN-SA对四株肿瘤细胞均有明显抑制作用， 提示 PEG20-IFN-SA对肝细胞癌、 乳腺癌、 急性早幼粒细胞性白血病、 肾癌有潜在的治疗作用。

HepG2 MCF- 7 H L60 ACHN

IC50

ΡΡ °Π ΤΓ7Μ Λ 5253IU/ml 4875IU/ml 2394IU/ml 3157IU/ml r U 丄 Γ1Ν o i

最大抑制率 52% 65% 78% 75% 实例 12、 PEG20-IFN-SA体内抗肿瘤作用

选择肾癌 （ACHN) 细胞株， 传代生长至 80%融合时， 消化成单细胞悬液， 以 6.0xl0 ⁵ 个 /200ul， 皮下 注射在雌性裸鼠的背部皮下， 观察 4〜5天待皮下长出瘤块后， 用数字测径仪检测肿瘤大小， 随机分为模 型组和 PEG-IFN-SA治疗组， 每组 10只。 PEG20-IFN-SA按 10 ⁶ IU/kg， 皮下注射， 每周 2次， 模型组注射 相同体积的生理盐水。 第 5次给药后 24小时， 处死裸鼠， 手术剥离肿块， 数字测径仪检测肿瘤大小。 结 果表明， PEG20-IFN-SA给药后肿瘤大小比模型组减小 33%左右， 具有一定的体内抗肿瘤生长的作用。