SECTOR DE LA TÉCNICA Biotecnología. Ingeniería genética de microorganismos.

Síntesis de antibióticos. Penicilina ESTADO DE LA TECNICA Tanto Penicillium chrysogenum como el hongo filogenéticamente relacionado Aspergillus nidulans sintetizan benzilpenicilina (penicilina G) a partir de los mismos precursores aminoacídicos y de fenilacetato. Hasta el presente, se ha conseguido mejorar la producción de penicilina por ingeniería genética en estos hongos mediante, por ejemplo : (i) un incremento en la expresión de uno o más de los tres genes estructurales responsables de convertir los precursores aminoacídicos y fenilacetil-CoA en penicilina G [Peñalva, M. A et al. (1998) The optimization of penicillin biosynthesis in fungi. Trends in Biotechnology 16 : 483-489], (ii) la interrupción (en A. nidulans) de la ruta de catabolismo de fenilacetato y su consiguiente canalización hacia la biosíntesis de penicilina [Mingot, J. M. et al. (1999) Disruption of phacA, an Aspergillus nidulans gene encoding a novel cytochrome P450 monooxygenase catalyzing phenylacetate 2- hydroxylation, results in penicillin overproduction. J Biol Chem 274 : 14545- 14550; también Patente española P97700833], (iii) la sobreexpresión (en P. chrysogenum) de una fenilacetil-CoA ligasa de origen bacteriano [Minambres, B. et al. (1996). Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenylacetyl-CoA ligase-Use of this gene to improve the rate of benzylpenicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. J Biol Chem 271 : 33531-33538; también Patente P9600664], y

(iv) la canalización del precursor ácido a-aminoadípico hacia la biosíntesis de penicilina por interrupción de la biosíntesis de lisina a partir de dicho precursor [Casqueiro, J. et al. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum : disruption of the lys2 gene leads to penicillin overproduction. J Bacteriol. 181 : 1181-1188].

Todas estas estrategias se basan en la ganancia de función (mediante sobreexpresión) o en la inactivación de genes estructurales implicados en la biosíntesis de precursores de penicilina considerados individualmente. Esta invención cubre una posibilidad alternativa que no había sido previamente explorada, que es la manipulación por ingeniería genética de un gen regulador para incrementar simultáneamente la función de varios genes estructurales bajo su control. La ventaja es que es de aplicación general a otros metabolitos secundarios y no requiere la identificación previa de los genes estructurales cuya expresión se modifica en el organismo receptor.

En A. nidulans [Espeso, E. A. et al. (1993) pH regulation is a major determinant in expression of a fungal penicillin biosynthetic gene. EM80 J.

12 : 3947-3956] y P. chrysogenum [Suárez T. y Peñalva M. A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol. Microbiol. 20 : 529-540], la ruta de biosíntesis de penicilina está regulada positivamente por la proteína con dedos de zinc PacC (Tilburn, J. et al (1995) The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid-and alkaline-expressed genes by ambient pH. EM80 J. 14 : 779-790]. En A. nidulans, PacC se sintetiza en forma inactiva (674 residuos aminoacídicos) y es activada mediante eliminación proteolitica de unos 400 aminoácidos en su región carboxilo- terminal. La proteína resultante (aproximadamente 250 residuos) es un activador transcripcionai de los genes de biosíntesis de penicilina [Tilburn, J. et al. (1995) The Aspergillus PacC zinc finger transcription factor mediates regulation of both acid-and alkaline-expressed genes by ambient pH. EMBO J.

14 : 779-790; Orejas, M. et al. (1995) Activation of the Aspergillus PacC transcription factor in response to alkaline ambient pH requires proteolysis of

the carboxy-terminal moiety. Gene Develop. 9 : 1622-1632]. Este procesamiento proteolitico se produce en respuesta a una señal que se transmite cuando el medio ambiente es alcalin.

En A. nidulans mutaciones (denominadas pacC) en el gen pacC que producen un truncamiento en la región carboxilo terminal de la proteina entre los aminoácidos 263 y 574 (considerando el codon ATG en posición 5 de la ORF como punto principal de iniciación de traducción) causan la activación proteolitica independiente de pH ambiental de la proteina, mimetizan condiciones ambientales alcalinas y resultan en ganancia de función génica pacC, con lo que, cualquiera que sea el pH del medio, se produce una expresión elevada de los genes que deben funcionar a pH alcalino y una expresión reducida de aquellos que deben funcionar a pH ácido. Los genes "alcalinos", cuya expresión se ve incrementada en este fondo genético, incluyen genes de la ruta de biosíntesis de penicilina.

En A. nidulans, las mutaciones paccc se comportan como codominantes en diploides heterozigóticos con un alelo silvestre pacC+. Se desconoce el comportamiento de estas mutaciones en estirpes merodiploides con dos copias del gen pacC (una de ellas pacCC y la segunda pacC+) y el resto del genoma en su condición normal haploide.

En el organismo industrial Penicillium chrysogenum existe un homólogo del gen pacC de A. nidulans [Suárez T. y Peñalva M. A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol. Microbiol. 20 : 529-540]. Dicho gen (que denominaremos Pc-pacC) posiblemente regula de manera positiva la ruta biosintética de penicilina G, con lo que un incremento en la función pudiera resultar en un incremento en los niveles de producción de este antibiótico. Pc- pacC (GenBank ID U44726) codifica para un factor de transcripción (Pc-PacC) que tiene aproximadamente un 64% de identidad de secuencia de aminoácidos con su homólogo de A. nidulans. La secuencia de 641 aminoácidos deducida para Pc-PacC se muestra en SEQ. ID NO 1.

La tecnología de ingeniería genética esta muy poco desarrollada en el organismo industrial Penicillium chrysogenum en relación con el organismo modelo A. nidulans. Por ejemplo, se ha demostrado que la inactivación génica por recombinación homóloga con alelos nulos de un gen es muy ineficiente [Peñalva, M. A. et al. (1998) The optimization of penicillin biosynthesis in fungi.

Trends in Biotechnology 16 : 483-489].

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCION Breve descripción El objeto de la presente invención es el diseño por ingeniería genética de una cepa merodiploide transgénica de Penicillium chrysogenum en la que se ha alterado de manera dirigida la actividad de un gen regulador que controla la biosíntesis de penicilina. Esta invención representa el primer caso en el que la biosíntesis de penicilina ha sido mejorada por manipulación de un gen regulador, y por lo tanto presenta una notable novedad sobre las tecnologías previamente utilizadas.

Para evitar las dificultades tecnológicas antes mencionadas, en la presente invención se propone la generación de estirpes merodiploides que contienen, además de la copia silvestre del gen pacC, una o más copias adicionales de una versión mutante del gen pacC que codifica para una proteína truncada en el aminoácido 477. Todas estas cepas merodiploides son notablemente superproductoras de penicilina con relación a la estirpe materna y muestran niveles elevados de transcripción de al menos dos genes de la biosíntesis del antibiótico, demostrando así la validez del abordaje seguido.

Descripción detallada de la invención Se han construido una serie de cepas merodiploides derivadas de P. chrysogenum NRRL1951. EI gen pacC silvestre de esta estirpe codifica una proteína de 641 aminoácidos cuya secuencia se muestra en SEQ ID NO 1.

Además del gen pacC silvestre, estas cepas transgénicas contienen una o varias copias de pacC33, una variante alélica de pacC de 481 residuos que

codifica para una proteína PacC normal hasta su residuo 477 tras el que se añaden, debido a un cambio de pauta de lectura resultante del truncamiento, cuatro aminoácidos anormales, con los que termina en su extremo carboxilo terminal (ver SEQ ID NO 3). La secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica esta proteína truncada se presenta en la SEQ ID NO 2). El gen pacC de P. chrysogenum tiene un intrón a partir del nucleótido 223 de 56 pb [no se incluye en SEQ ID NO 2; Suárez T. y Peñalva M. A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol. Microbiol. 20 : 529-540]. Esta proteína truncada esta diseñada para que proporcione ganancia de función PacC, por analogia a la situación en A. nidulans, independientemente de la presencia o ausencia de la señal transducida por la ruta de genes pal.

Selección de una cepa receptora de P. chrysogenum y de marcadores de transformación El marcador de transformación utilizado para la construcción de varias de las estirpes transgénicas fue el gen sC, que codifica para el enzima ATP- sulfurilasa, que convierte el sulfato en adenosina 5'-fosfosulfato. Esta conversión es un paso esencial para la utilización de sulfato inorgánico como única fuente de azufre por P. chrysogenum y otros hongos, por lo que los mutantes sC-son incapaces de crecer en medio con sulfato como fuente de azufre, aunque lo hacen normalmente en medio suplementado con fuentes de azufre orgánico, como L-o D-metionina. La selección de los transformantes en un fondo genético sC'se realiza por su capacidad de crecer en medio con sulfato, que les diferencia de la estirpe parental sC-.

EI selenato (Se04 2-) que penetra en las células a través de la permeasa del sulfato, es un compuesto tóxico para los hongos. Por ejemplo, inhibe el crecimiento de P. chrysogenum NRRL1951 a concentración 10 mM, permitiendo el aislamiento de mutantes resistentes, que pueden tener mutaciones de pérdida de función en el gen sB (que codifica para la permeasa de sulfato y selenato) o en el gen sC. Estas dos clases mutantes se distinguen,

por ejemplo, porque los mutantes s6'pueden crecer utilizando sulfato de colina como única fuente de azufre, mientras que los mutantes sC no lo hacen. Por ello, en la cepa receptora se seleccionaron mutantes resistentes espontáneamente al selenato. Una vez aislados y purificados los clones mutantes, se analizó su capacidad de crecimiento en diferentes compuestos como fuente de azufre para diagnosticar el gen inactivado en cada caso por la mutación que confería resistencia a selenato [H. N. Arst, Jr. (1968) Genetic analysis of the final steps of sulphate metabolism in Aspergillus nidulans.

Nature 219 : 268-270].

De esta manera se identificaron varios mutantes presumiblemente afectados en el gen sC. Se calcul6 la frecuencia de reversión de cinco de estos mutantes y se seleccionaron dos de ellos que revertían con una frecuencia menor a 2x10-7. El gen funcional sC de P. chrysogenum presente en el plásmido pINES1 (Figura 1A) complementó las respectivas mutaciones presentes en estas estirpes, lo que sirvió para verificar que ambas eran mutantes sC. De ellas se seleccionó aquélla que presentó una frecuencia de transformación más alta (45 transformantes por ug de pINES1). El allelo sC mutante de esta estirpe se denominó sC14. Esta estirpe (sC14), que se usó como receptora de transformación, ha sido depositada en la CECT con el número 20327.

También se utilizó como marcador en la transformación un gen quimérico en el que el gen bacteriano ble de resistencia a fleomicina (antibiótico al que P. chrysogenum es sensible) se expresa bajo el control de secuencias promotoras de la transcripción procedentes del promotor gpdA de A. nidulans y del terminador del gen CYC1 de Saccharomyces cerevisiae. La utilización de este gen quimérico, que se comporta como un marcador dominante para la selección de transformantes en P. chrysogenum ha sido descrita por Kolar [Kolar, M. et al. (1988) Transformation of Penicillium chrysogenum, using dominant selection markers and expression of an Escherichia coli lacZ fusion gene. Gene 62 : 127-134]. Experimentos previos (ver Ejemplos) permitieron establecer que una concentración de 1 pg/ml de

fleomicina era la óptima para la selección de transformantes en la cepa silvestre NRRL1951.

Preparación de los plásmidos transformantes, transformación y selección de las cepas transgénicas Un gen Pc-pacC mutante (SEQ ID NO 2) que codifica para una proteína truncada de 481 aminoácidos (SEQ ID NO 3) se introdujo en los vectores pPhleo y pPcsC para dar lugar a los plásmidos recombinantes pPacC33 (Phleo) y pPacC33 (sC), respectivamente (Fig. 1 B y C). Este alelo Pc-pacC mutante se denominó pacC33 y lleva corriente arriba del ATG iniciador de traducción, 1550 pb de la región promotora del gen Pc-pacC. EI promotor del gen Pc-pacC es un promotor débit [Suárez T. y Peñalva M. A. (1996) Characterization of a Penicillium chrysogenum gene encoding a PacC transcription factor and its binding sites in the divergent pcbAB-pcbC promoter of the penicillin biosynthetic cluster. Mol. Microbiol. 20 : 529-540]. Como control se construyó el plásmido pPacC (sC), que se diferencia de pPacC33 (sC) en que Ileva el un alelo Pc- pacC+ en lugar de pacC33 (ver Figura 1 D, mapa de los plásmidos).

Los plásmidos se introdujeron por transformación en P. chrysogenum NRRL1951 (pPacC33 (Phleo)) o en su estirpe derivada mutante sC14 (pPacC33 (sC) y pPacC (sC)). Tras la selección y purificación de los transformantes y el análisis de la situación y número de copias del plásmido integradas en el genoma mediante la técnica de Southern, se seleccionaron los siguientes transformantes que se han depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) : TX5 (CECT 20328) es una estirpe de P. chrysogenum con 3 copias de pPacC33 (Phleo) integradas en tándem en una posición indeterminada del genoma. TSC4 (CECT 20329) es una estirpe de P. chrysogenum con una única copia de pPacC33 (sC) integrada en el locus sC.

TSC7 (CECT 20330) es una estirpe de P. chrysogenum con una sola copia de pPacC33 (sC) integrada en el locus pacC. TSC03 (CECT 20331) es una estirpe de P. chrysogenum con una sola copia de pPacC (sC) integrada en el locus pacC. Todas estas estirpes son morfológicamente indistinguibles de la cepa silvestre NRRL1951.

Resultados de la aplicación de esta tecnologia Las estirpes merodiploides TX5, TSC4 y TSC7 son hiperproductoras de penicilina G, en comparación con la estirpe NRRL1951 y con su cepa mutante NRRL1951 sC14 receptora de los transgenes, con las que no mostraron diferencias de crecimiento o de variación del pH del medio de cultivo. La producción de penicilina y tasa de crecimiento de las cepas sC14 y su parental NRRL1951 fue muy similar, mostrando que la mutación sC14 no afecta la producción del antibiótico (Figura 2). Utilizando sacarosa como fuente de carbono (que normalmente reprime la producción de penicilina G) las estirpes merodiploides alcanzaron, por ejemplo, niveles al menos 5 veces superiores a los obtenidos de la cepa sC14 (ver descripción detallada y Figura 3). La estirpe TSC03 (con dos copias del gen pacC silvestre), también es hiperproductora de penicilina con respecto a la cepa sC14, aunque en mucha menor medida que, por ejemplo, la cepa TSC7 con una copia del gen silvestre y una segunda copia del alelo pacC33 (Figura 4). Estos resultados validan los principios utilizados en esta invención de (i) diseñar estirpes transgénicas con función pacC incrementada con objeto de sobreproducir penicilina y (ii) diseñar mutaciones de pacC que proporcionen ganancia de función y que se comporten como co- dominantes en merodiploides con una copia del gen pacC silvestre.

Las cepas TX5, TSC4 y TSC7 son también sobreproductoras de penicilina en medio con lactosa, donde los niveles de producción son aproximadamente el doble de los obtenidos con sC14 o NRRL 1951 (Figura 5).

El RNA de los distintos transformantes en diferentes días de los cultivos de producción de penicilina G se analizó por la técnica de northern con sondas específicas para los genes estructurales pcbAB, que codifica para la ACV sintetasa, y pcbC, que codifica para la IPNS sintetasa, de la ruta de biosíntesis de penicilina. La cuantificación con Phosphorimager de las señales de hibridación de las membranas, permitió determinar los perfiles de transcripción de estos genes en la cepa receptora sC14 cultivada en condiciones de inóculo y agitación controtadas. En esta cepa, los transcritos de estos genes se detectaron a partir del dia 3, con un nivel máximo en los días 5-6 tras la siembra. Como ejemplo, la cepa transgénica TSC7 mostró reproduciblemente,

un aumento de aproximadamente dos veces en el nivel máximo de transcripción de estos dos genes con respecto a la cepa sC14 (Fig. 6).

En conclusion, la presente invención describe un nuevo procedimiento que permite incrementar la sintesis de penicilina mediante la manipulación genética de un gen regulador, pacC. Se presenta por primera vez una forma mutada de este gen en P. chrysogenum, denominada pacC33, que codifica una proteína con ganancia de función y cuya secuencia (SEQ ID NO 2) forma parte de la presente invención.

Esta información permite desarrollar otras formas mutadas, completas o parciales, tanto por síntesis de nuevas secuencias de ADN como por aislamiento e identificación de formas naturals, de genes homólogos en otros ascomicetos, que codifiquen nuevas proteins con ganancia de función respecto a la proteína salvaje PacC, y forman parte de la presente invención.

El uso de promotores, para la expresión de estas formas mutadas, diferentes del propio promotor del gen pacC, bien sean promotores condicionales o constitutivos, es una variante evidente de esta invención y forma parte de ella.

Estos resultados demuestran que cepas transgénicas merodiploides para el gen pacC de P. chrysogenum que tienen un alelo silvestre y otro mutante de pacC, modificado de manera dirigida, son cepas sobreproductoras de penicilina y tienen niveles elevados de los transcritos de al menos dos genes implicados en la biosíntesis de penicilina.

EI gen regulador pacC controla la síntesis de otros metabolitos secundarios y de numerosas enzimas extracelulares. EI uso de esta tecnología para la construcción de estirpes transgénicas de P. chrysogenum utilizando la estrategia aquí descrita (o variantes de ella) para modificar en sentido positivo o negativo la función pacC con el objeto de incrementar la síntesis de metabolitos y enzimas extracelulares de utilidad o de prevenir la de metabolitos indeseables, como las aflatoxinas, queda cubierta por esta solicitud.

La transferencia de la tecnología descrita en esta solicitud a otros hongos de interés industrial como, por ejemplo, Aspergillus niger o Thricoderma ressei es evidente y queda cubierta por esta solicitud.

La transferencia de esta tecnologia a otros genes reguladores de ascomicetos con objeto de incrementar la sintesis de metabolitos y enzimas extracelulares de utilidad o de prevenir la de metabolitos indeseables queda asimismo cubierta por esta solicitud.

EJEMPLOS Ejemplo 1.-Obtención de cepas mutantes en el gen que codifica la ATP- sulfurilasa.

La cepa silvestre de P. chrysogenum NRRL1951 se obtuvo del CBS (Holanda). Con el objeto de seleccionar mutantes resistentes al selenato, se plaquearon 1,5 x 108 esporas de esta cepa en 30 placas de medio mínimo [Cove, D. J. (1966) The induction and repression of nitrate reductase in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim. Biophys. Acta 113 : 51-56] con 10 mM de selenato sódico y 10, ug/ml de D-metionina y 1% de glucosa y 10 mM de tartrato amónico, como fuente de carbono y nitrógeno, respectivamente. Los mutantes resistentes al selenato aparecieron con una frecuencia de 1,5 x 10-7 esporas. Una vez purificados, el fenotipo de los mutantes se comprobó mediante tests de crecimiento.

Los mutantes resistentes al selenato pueden mapear, al menos, en dos genes estructurales, sC (ATP-sulfurilasa) y sB (permeasa de sulfato). Los mutantes en el gen sC no crecen en un medio con sulfato de colina como fuente de S, compuesto que si es capaz de suplementar la deficiencia en la permeasa, ya que entra en la célula por una permeasa alternativa a la del sulfato/selenato. De esta manera se identificaron 7 mutantes sC-putativos. Con el objeto de verificar cuáles de ellos eran definitivamente mutantes sa, se procedió a probar mediante transformación con el plásmido pINES1 (Fig. 1A) si las mutaciones eran complementables por el gen sC funcional de P. chrysogenum, mediante selección de los transformantes en medio con sulfato como única fuente de S. Tras estos experimentos se seleccionó el mutante, sC14, ya que presentó la más alta frecuencia de transformación con pINES1 (45 transformantes capaces de utilizar sulfato/pg de plásmido).

Ejemplo 2.-Determinación de la sensibilidad de P. chrysogenum NRRL 1951 a la fleomicina.

Con el objeto de determinar la sensibilidad a fleomicina de la cepa NRRL1951, se realizaron experimentos con protoplastos en placas de medio de regeneración, en las condiciones de selección de los transformantes. Los protoplastos se obtuvieron tras incubar micelio crecido durante 20 h a 25°C en medio mínimo (Cove, 1966), con 30 mg de Novozyma por gramo de micelio (peso escurrido) durante 2 h a 25° en una solución 0.9 M KCI, 10 mM tampón fosfato pH 5,8. Los protoplastos se agitaron brevemente en el vórtex, y se centrifugaron a 3000g, de tal modo que los protoplastos sedimentaron encima del micelio no digerido, del que se distinguen por su color blanquecino. 105 protoplastos viables de NRRL1951 se extendieron en placas de medio de regeneración de protoplastos (medio mínimo de Cove estabilizado osmóticamente con 1M sorbitol y 0,1 M sacarosa) que contenían 0,05; 0,1; 0,5; 1; 5; 10; 20; 40 y 50, ug/ml de fleomicina (Cayla, Francia). A concentraciones superiores a 0,5 pg/ml no se observó crecimiento de colonias después de 10 días de incubación a 25°. Por ello se ha utilizado rutinariamente la concentración de 1, ug/ml de fleomicina en los experimentos de transformación en los que se ha usado la selección basada en este antibiótico.

Ejemplo 3.-Plásmidos utilizados en la transformación de NRRL 1951 EI plásmido pINES1 (Figura 1A), de donde se obtuvo el gen sC de P. chrysogenum, es un derivado de pBR322 que incluye un fragmento EcoRl- EcoRV de 1,5 kb con el gen pyr4 de Neurospora crassa y un fragmento de 6,1 kb EcoRV-Sall de DNA genómico de P. chrysogenum que contiene el gen sC.

Se construyeron diferentes plásmidos que llevan un alelo silvestre o un alelo mutante pacC33 del gen pacC de P. chrysogenum. La presencia de un sitio de corte de Kpnl en una posición del gen de P. chrysogenum similar a aquella en la que se encuentra el triplete de terminación de traducción resultante de la mutación pacC°14 en A. nidulans permitió crear una proteína truncada en el residuo 477, con 4 residuos adicionales en su carboxilo terminal antes de llegar a un codon de terminación de traducción (SEQ ID NO 2 y 3).

EI plásmido pPacC33 (Phleo) (Figura 1B) se construyó utilizando como base pBluescript 11 SK+. Este vector se digirió con EcoRl y Kpnl y se le insertó mediante técnicas convencionales de ingeniería genética un fragmento EcoRl- Kpnl de DNA genómico de P. chrysogenum NRRL 1951 de 3037 pb que incluye 1553 bp del promotor de Pc-pacC y la región de codificante de Pc-pacC hasta el codon 477 inclusive, para dar lugar al plásmido pPacC33. El alelo mutante resultante (denominado pacC33, SEQ ID NO 2) codifica para la proteína PacC truncada descrita en SEQ ID NO 3. En este plásmido se introdujo un gen quimérico consistente en el gen ble de E. coli bajo el control de señales promotoras y terminadoras fúngicas, que se obtuvo del plásmido pHS103 descrito por Kolar [Kolar, M. et al (1988) Transformation of Penicillium chrysogenum using dominant selection markers and expression of an Escherichia coli/acZ fusion gene. Gene 62 : 127-134] como un fragmento EcoRl-Hindlll de 2,8 kb, cuyos extremos cohesivos se rellenaron con la DNA polimerasa de T4 para proceder a su inserción en el sitio único BamH/, convertido también en romo por el mismo método.

El plásmido pPacC33 (sC) (Figura 1C), se construyó de manera análoga a pPacC33 (Phleo), salvo que en este caso se insertó en el sitio BamHl, en lugar del gen de resistencia a fleomicina, un gen sC funcional, que se obtuvo de piNES como un fragmento Bglll de 4,3 kb (Figura 1A). E ! ptásmido pPacC (sC) (Figura 1D) es un derivado de pBS-SK+, en el que se introdujo en primer lugar un fragmento EcoRI-Sall de 7,5 kb, que contiene el alelo silvestre del gen pacC con el mismo fragmento del promotor presente en los plásmidos pPacC33 (Phleo) y pPacC33 (sC). Posteriormente, el fragmento de DNA que contiene el gen sC se introdujo de igual manera que en pPacC33 (sC).

Ejemplo 4.-Transformación de la cepa NRRL1951 de P. chrysogenum La transformación de Penicillium se Ilevo a cabo siguiendo el protocolo descrito para A. nidulans [Tilburn, J. et al. (1983) Transformation by integration in Aspergillus nidulans. Gene 26 : 205-211] con ligeras modificaciones. Los protoplastos se obtuvieron como se describe en el ejemplo 2. Los protoplastos se resuspendieron en STC (sorbitol 1 M, 10 mM Tris HCI pH 7,5,10 mM CaCl2), se lavaron dos veces en este tampón y se resuspendieron a una

concentración de 1-2 x 107 protoplastos en 200 pI de STC. A cada alícuota se le añadieron 5 pg de plásmido circular (en un volumen inferior a 20 pI) y 20 Vtl de PEG 6000 50% (v/v) en STC, y las mezclas se incubaron durante 20 min en hielo. Después se añadió 1 ml de PEG a cada tubo y se incubó durante 5 min a 25°, se añadió 1 ml de STC, se mezcló suavemente y se centrifugó 5 min a 12000 rpm. Los protoplastos se resuspendieron suavemente en 500 pI de STC y se sedimentaron por centrifugación. Finalmente se resuspendieron en 200 PI de STC, y se extendieron sobre placas de medio estabilizado osmóticamente (medio mínimo de Cove [Cove, D. J. (1966) The induction and repression of nitrate reductase in the fungus Aspergillus nidulans. Biochim. Biophys. Acta 113 : 51-56] con 0,1 M sacarosa y 1 M sorbitol), tras mezclarlos con 3 mi del mismo medio con un 0,25% (p/v) de agar. Para la selección basada en la resistencia a fleomicina, se incluyó el antibiótico en el medio de regeneración a una concentración de 1 pg/ml. Para la selección basada en sC, se utilizó medio mínimo normal, que contiene sulfato como única fuente de azufre. Las placas se incubaron a 25°C. Las colonias capaces de crecer en los medios selectivos aparecieron a los 6-7 días y se purificaron en medio selectivo sin estabilizador mediante el aislamiento de colonias individuales crecidas a partir de conidiosporas.

Ejemplo 5.-Caracterización molecular de los transformantes Los transformantes purificados se crecieron para obtener micelio, del que se extrajo el DNA siguiendo el método de Pérez-Esteban [Pérez Esteban, B. et al. (1993) Molecular characterization of a fungal secondary metabolism promoter : transcription of the Aspergillus nidulans isopenicillin N synthetase gene is modulated by upstream negative elements. Mol. Microbiol. 9 : 881-895].

Este DNA se digirió con las enzimas EcoRl o Xbal para determinar el número de copias del plásmido y su lugar de integración en el genoma. Los DNAs digeridos se cargaron en geles del 0,7% de agarosa para separar los fragmentos de restricción, que se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Esta membrana se incubó 2 h a 80° para fijar el DNA.

Posteriormente, se pre-hibridó durante 2 h a 42°, en 50% formamida, 5X solución de Denhart, 5X SSC y 0,1% de SDS con 50 pg/ml de DNA

monocatenario de esperma de salmón sonicado, tras lo cual se añadieron 50 ng de la sonda correspondiente : bien el fragmento EcoRl-Hindlil de 2,8 kb que contiene el gen ble, bien el fragmento Bglll de 4,3 kb que contiene el gen sC o bien un fragmento Hindlll-Kpnl de 1,3 kb de DNA genómico de P. chrysogenum perteneciente al gen pacC, en todos los casos marcados radiactivamente. La hibridación se llevó a cabo durante 18 h a 42°. El lavado final de los filtros se realizó durante 15 min a 65°C en 0,2X SSC, 0,1 % SDS. Los filtros se expusieron a pelicula autorradiográfica o en Phosphorimager para la detección de la radiactividad.

Para el análisis de los transformantes se emplearon digestiones con Xbal (Figuras 7 y 8). La sonda del gen pacC revel6 en la cepa silvestre sC14 una banda Xbal de 4 kb que se transforma en dos nuevas bandas de 6 y 8,3 kb en el transformante TSC7 (en el que el plásmido PacC33 (sC) está integrado en el locus pacC, Figuras 7A y 8A). La sonda del gen sC revel6 en la cepa silvestre sC14 una banda de 7 kb que se convierte en dos bandas de 6,5 y 10,8 kb en el transformante TSC4 (pPacC33 (sC) integrado en el locus sC, Figuras 7B y 8B). El transformante TX5, obtenido con el plásmido pPacC33 (Phleo), presenta, con la sonda del gen pacC, una banda de 4 kb, otra banda de 10-11 kb y otra banda de cerca de 9 kb (Figuras 7C y 8C). Esta última banda es 3 veces más intensa que la banda procedente del gen pacC residente y su movilidad se corresponde con el tamaño del plásmido, por lo que se consideró que el merodiploide TX5 es un transformante con 3 copias integradas en tándem en una posición no determinada del genoma (Figura 8C). En un análisis similar, el transformante TSC03 (Figuras 7D y 8D) presenta, con la sonda pacC, la misma banda Xbal de 4 kb que aparece en cepa sC14 y un nuevo fragmento de 8,3 kb (un fragmento interno del inserto pacC de 2 kb y las secuencias del vector no se detectan en esta hibridación, ver Figura 8D).

Ejemplo 6.-Producción de penicilina en sacarosa como fuente de carbono Los transformantes seleccionados, junto con las cepas control NRRL 1951 o su derivado sC14 se crecieron a 25°C con fuerte agitación en medio de producción de penicilina (medio de Cove suplementado con 2,5% (p/v) de sólidos de corn steep y 0,12% (p/v) de fenilacetato sódico, y 3% de sacarosa o

3% lactosa (ambas p/v) como principal fuente de carbono). En todos los casos se inoculó a partir de una suspensión de conidiosporas, a una concentración inicial de 1-2 x 106 esporas/ml, utilizándose matraces de 500 mi con 100 ml de medio. Se tomaron muestras de medio a diferentes tiempos después del inóculo, en las que se midió la cantidad de penicilina producida utilizando un bioensayo con Serratia marcescens. Para ello, se excavaron pocillos de 1 cm de diámetro en Medio Antibiótico-1 (DIFCO) sólido que incluia una suspensión diluída de la bacteria (a una D. O600 de 0,0075). En estos pocillos se colocaron 100, ul de una dilución apropiada de los sobrenadantes. Las placas se incubaron durante 20 h a 37°, tras lo cual se midió el halo de inhibición de crecimiento bacteriano y se calcul6 la cantidad de penicilina mediante comparación con los halos producidos por distintas diluciones de una solución estandard de penicilina G sódica.

La Figura 2 muestra que el nivel de producción de penicilina de la cepa sC14 es muy similar al de la cepa NRRL 1951 de la que procede, indicando que la mutación no afecta la producción de antibiótico. En medio con sacarosa o lactosa como fuente principal de carbono, el crecimiento de las distintas estirpes fue muy similar en cuanto a medida de biomasa y evolución del pH extracelular. Sin embargo, las estirpes transgénicas TX5, TSC4 y TSC7 reproduciblemente produjeron niveles sensiblemente más altos de penicilina que la estirpe parental sC14, tanto con sacarosa (Figura 3), como con lactosa (Figura 5). En el primer caso, el incremento de producción fue de 4-5 veces aproximadamente, mientras que, en lactosa, los niveles de producción fueron aproximadamente dos veces los obtenidos con sC14 o NRRL 1951 (Figura 5).

La estirpe merodiploide TSC03 (con dos copias del gen pacC silvestre) tiene un crecimiento similar a sC14 (ver la evolución del pH extracelular en la figura 4A) y también es hiperproductora de penicilina con respecto a la cepa sC14 (Figura 4B), aunque en mucha menor medida que las cepas TX5, TSC4 y TSC7, que tienen, además de una copia del gen silvestre, una o más copias del alelo pacC33 (ver Figura 4B para la comparación de los niveles de producción de penicilina de TSC03 con los de TSC7 en sacarosa).

Ejemplo 7.-Análisis transcripcional de los merodiploides De cultivos de producción de penicilina, se cosecharon muestras de micelio a lo largo del tiempo (desde el dia 2 al dia 10). De estos micelios, se extrajo el RNA mediante el método de Lockington [Lockington, R. A. et al (1985) Cloning and characterisation of the ethanol utilisation regulon in Aspergillus nidulans. Gene 33 : 137-149] y se cargaron 10 pg de cada muestra en geles de agarosa del 1,2% con un 18% de formaldehido en tampon MOPS (40 mM MOPS pH 7,2; 10 mM acetato sódico ; 0,5 mM EDTA). Los RNAs se transfirieron a membranas de nitrocelulosa, que se secaron a 80°C para fijar el RNA. Estas membranas fueron hibridadas con sondas que permitían detectar los siguientes genes : pacC (fragmento interno Hindlll-Kpnl de 1,3 kb); pcbC (fragmento interno Ncol-BamHl de 0,9 kb); pcbAB (fragmento EcoRl de 2,4 kb) y el fragmento de 955 bp Ncol-Kpnl del gen acnA de A. nidulans, que codifica para la actina, y que se empleó como control de homogeneidad de carga entre las distintas muestras. Las condiciones de hibridación fueron idénticas a las descritas en el ejemplo 5, salvo que la cantidad de sonda añadida fue de 100 ng. EI lavado final se realizó en el mismo tampón, pero a 42°C. En todos los experimentos de northern se incluyó en el gel un carril con 10 g de mRNA obtenido a partir de un micelio de la cepa sC14 crecida durante 39 h en medio de producción de penicilina con 3% de lactosa. Todas las membranas de nitrocelulosa, después de los lavados, se expusieron durante 15-18 h a una pantalla de Phosphorimager, sensible a la emisión ß del p32. Dichas pantallas se leyeron posteriormente en un Phosphorlmager (Molecular Dynamics) y se cuantificaron las señales de hibridación empleando el software ImageQuant de la misma casa comercial. Además de hibridar las membranas con sondas que permiten revelar los transcritos problema, todas las membranas se hibridaron con una sonda que revela el mRNA de la actina. Las cuantificaciones de las bandas reveladas con las sondas pcbC, pcbAB y pacC, se normalizaron frente a la intensidad obtenida en la banda de la actina en cada carril. Todos estos cocientes para un gen dado de una misma membrana se normalizaron al valor del carrii común (muestra de RNA de micelio de la estirpe sC14 crecida en lactosa durante 39 h), con el objeto de poder comparar medidas de intensidad

de diferentes membranas. Estas medidas, con su desviación estándar, son las que aparecen en la figura 6, para los RNA mensajeros de pcbAB y pcbC.

FIGURAS Figura 1.-Mapas esquemáticos de restricción de los plásmidos empleados en la construcción de las cepas merodiploides de P. chrysogenum. A) plásmido pINES ; B) plásmido pPacC33 (Phleo) ; C) piásmido pPacC33 (sC); y D) plásmido pPacC (sC). Los diferentes genes están indicados con las siguientes tramas : negro, gen pyr4 de N. crassa; caja vacía, región del gen sC de P. chrysogenum (la flecha indica la posición aproximada del gen y la dirección de transcripción) ; caja rayada, gen de resistencia a fleomicina, con el gen ble de E. coli rayado vertical y el promotor y terminador de transcripción indicados con rayado inclinado ; finalmente, la caja gris indica la región del gen pacC de P. chrysogenum, con la posición, tanto del alelo silvestre como del mutante, indicada con una flecha.

Figura 2.-Crecimiento y producción de penicilina de las cepas de P. chrysogenum NRRL1951 y sC14. Se representan las medidas de producción de penicilina, pH y peso seco en cultivos de las cepas NRRL1951 y sC14 realizados en medio de producción de penicilina con 3% de sacarosa (A) o lactosa (B), como principal fuente de carbono.

Figura 3.-Crecimiento y producción de penicilina de las cepas transgénicas pacC+/pacC33. Medidas de la producción de penicilina y la tasa de crecimiento (pH y peso seco) en cultivos de las estirpes transgénicas TX5, TSC4 y TSC7, merodiploides pacC+/pacC33, en comparación con la estirpe parental sC14. Los cultivos se realizaron en medio de producción de penicilina con sacarosa como principal fuente de carbono.

Figura 4.-Crecimiento y producción de penicilina de la cepa transgénica pacC+/pacC+. Medida de la tasa de crecimiento (pH extracelular, A) y de la producción de penicilina (B) de la estirpe transgénica TSC03, merodiploide pacC+/pacC+, en comparación con la estirpe parental sC14. Los cultivos se realizaron en medio de producción de penicilina con sacarosa como principal fuente de carbono. En el panel B, se observa también la diferencia en la

producción de penicilina entre el merodiploide pacC+/pacC+ (TSC03) y un merodiploide pacC+/pacC33 (TSC7).

Figura 5.-Producción de penicilina en medio con lactosa. Medida de la producción de penicilina en lactosa de las cepas merodiploides pacC+/pacC33, TSC4, TSC7 y TX5, en comparación con la estirpe parental sC14.

Figura 6.-Cuantificación de los niveles de mRNA de pcbC y pcbAB en las cepas sc14 y TSC7. Las medidas están expresadas en unidades arbitrarias (UA). En abcisas se indica el tiempo de cultivo. Los datos son media de tres experimentos y las barras de error indican la desviación estándar.

Figura 7.-Análisis por el método de Southern de las cepas merodiploides de P. chrysogenum. Las muestras de DNA de las distintas estirpes fueron digeridas con Xbal. La sonda utilizada fue un fragmento del gen pacC (A, C y D) o del gen sC (B). Las flechas señalan las bandas de hibridación obtenidas con los merodiploides y la estirpe receptora, según se indica en el texto.

Figura 8.-Esquema gráfico de los sucesos de recombinación de los plásmidos. La interpretación gráfica de las bandas reveladas en el southern de la figura 7, se representa aquí para las cepas sc14 (tipo silvestre), TSC7 (A), TSC4 (B), TX5 (C) y TSC03 (D). EI genoma del hongo está indicado por la linea fina continua. La caja con rayas gruesas representa el gen sC (versiones silvestre o mutante, sc14) y la flecha blanca indica la dirección de transcripción. Los genes pacC+ o pacCC33 están representados por una caja blanca con una flecha interna (que indica la dirección de transcripción). EI gen de resistencia a fleomicina está indicado por una caja con rayas finas y las secuencias plasmidicas, por una linea continua gruesa. En el transformante TX5 no es posible determinar el lugar del suceso de integración, y se indica la repetición de tres copias del plásmido transformante. Las lineas de cotas muestran los tamaños (en kb) de los fragmentos señalados en la hibridación de la Figura 7.