技术领域

本发明涉及一类五甲川菁荧光染料， 尤其是甲川链的中位发生共轭取代的 新型荧光染料与制备方法， 以及将该荧光染料用作粘度敏感的荧光探针检 测活 细胞内微环境粘度的方法。 说

背景技术

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的 主要因素， 同时是流体扩散 速率的主要参考指标。 针对宏观大体积的粘稠流体， 测定流体粘度的方法和仪 器已经发展的比较成熟了， 比如转子粘度计、 落球粘度计等， 然而这一类粘度 计只能用于宏观大体积流体粘度测定， 需要流体体书积在不小于 lmL; 对微观环 境， 比如组织、 细胞水平的粘度测定， 这些测试方法和仪器往往不能达到测试 的目的的。 而准确测定细胞水平内微环境的粘度又具有非 常重要的意义： 活细 胞内不同位置的粘度不同， 这对细胞内生物分子及胞内信号的扩散与传递 起着 决定性作用。根据 K. Suhling小组的工作可知， 正常活细胞内膜系统微环境的粘 度最高可以达到 140厘泊 （cp)， 而细胞质中的粘度仅 l~2cp， 相当于纯水中的 粘度； 当出现病变细胞逐渐死亡的时候， 细胞内的粘度会显著提高， 最高可以 达到 300cp， 细胞内粘度的显著变化会导致机体出现疾病或 机能失调等。 因此， 需要开发出能测试这些微环境粘度的方法。

近年来， 有一些文献报道了利用基于分子荧光转子的粘 度探针来检测细胞 内微环境粘度的方法。 设计这种粘度探针主要有两种方法： 一种是基于荧光寿 命成像的方法， 另一种是基于比例荧光系成像的方法。 对于荧光寿命成像的方 法， 前人已经做了很优秀的工作。 由于荧光寿命成像的发射波长只有单一的发 射峰；根据 A. Theodorakis小组的工作报道的要设计双波长的粘� ��分子转子有两 种方法， 一是基于光诱导分子内电荷转移 （ICT) 的方法， 但是基于这种机理设 计的探针容易受到溶剂的极性的影响， 另一种方法就是设计基于荧光共振能量 转的分子转子， 这种方法存在的问题就是需要作为能量供体的 发射光谱与能量 受体的吸收光谱有较好的重叠交盖， 这些要求限制了这类探针的设计与应用。

细胞内成像的精确可靠性十分重要， 虽然 Suhling等和 Theodorakis等小组 的工作分别是采用荧光寿命成像和比例的方法 来达到检测粘度变化的目的， 但 是现有技术中还没有荧光探针具备上述两种性 能。

经典的五甲川菁类荧光染料的合成是采用季铵 盐与中间共轭链的缩合剂在 醋酸酐做溶剂、 无水醋酸钠作为催化剂、 氩气保护条件下反应生成。 一般的五 甲川菁类荧光染料由于具有摩尔消光吸收大 （达到 10 ⁵ 数量级）等优点， 在蛋白 标记， DNA测序， 离子中性小分子识别， 细胞以及活体组织成像方面得到了很 广泛的应用。 而到目前为止还没有文献报道， 五甲川菁染料用来设计成对环境 粘度敏感的分子转子来检测溶液或者细胞内环 境的粘度。 发明内容

在现有技术的基础上， 本发明旨在提供一类新的五甲川菁荧光染料， 该染 料应当对环境粘度的变化具有很灵敏的响应， 荧光性能受溶剂极性的影响很小， 并且具有双重性能以保证其既适用于荧光寿命 成像法， 也适用于荧光比例法来 检测环境粘度。 发明人在研究中发现， 在传统五甲川菁类荧光染料化合物的甲 川链中间共轭连接取代基后， 染料的光谱上出现两个峰。 由于取代基的转动容 易形成 TICT激发态，消耗掉了激发能，使得染料主要� �非辐射的形式回到基态。 该类化合物排除了溶剂极性的影响， 对环境粘度变化具有很灵敏的响应， 当染 料所处环境的粘度增加时， 取代基的转动受到抑制， 两个发射峰处的荧光强度 呈现不同幅度增加， 表现出比例变化， 荧光寿命也增长， 并且这两种变化与粘 度的变化相关。 据此， 可以使用该类化合物在活细胞内成像来显示不 同区域的 粘度， 或显示细胞内粘度的变化， 具有很好的生物应用前景。

因此， 本发明首先提供一类五甲川菁荧光染料， 该化合物具有如下结构通 式 I：

I X为 CHO或 CHCR ₃ R ₄ ;

R^PR ₂ 各自独立选自 (CH ₂ ) _n R ₇ 、 （CH ₂ ) _m OR ₈ 、 （CHR ₉ CH ₂ 0) _p R ₈ 或 CH ₂ C ₆ H ₄ R _7; R ₃ 和 R ₄ 各自独立选自 CN、 COOH或 COOR ₁₆ ;

R ₅ 、 R ₆ 和 R ₇ 各自独立选自 H、 SO ₃ R ₁₀ i¾COOR _{li ;}

R ₈ 为 H或 d. ₁₈ 垸基；

R ₉ 为 H或 CH ₃ ;

Ru为 C 院基；

R ₁₂ 、 R ₁₃ 、 R ₁₄ 、 R ₁₅ 和 R ₁₆ 各自独立选自 H、 C _1-18 垸基、 （CH ₂ ) _m OR ₈ 或 (CHR ₉ CH ₂ 0) _p R ₈ ;

Y—为卤素负离子或者 OTV;

n、 m、 p为 0〜18的整数。

本文中使用的术语 "垸基"包括直链垸基和支链垸基； 术语 "卤素"包括 氟、 氯、 溴和碘； OT 是指对甲苯磺酸根离子。

上述本发明的化合物中， 优选 和1 ₄ 为 CN的化合物， 即取代基 X为醛基和 丙二腈乙烯基的化合物。

本发明所述化合物的母体结构上取代基的作用 是调节染料在有机溶剂或者 水溶液中的溶解性， 或者细胞跨膜的能力。 其中优选的技术方案是1^和 各自 独立选自 (CH ₂ ) _n R ₇ 和 /或 R ₅ 和 为11。

最为优选地， R^PR ₄ 为 CN， R^PR ₂ 为 CH ₃ ， R ₅ 和 R ₆ 为 H， 即下述式 4和式 7 的

4 7 本发明的另一目的是提供上述化合物的制备方 法， 包括如下步骤：

( 1 )连有取代基 的2， 3， 3-三甲基 -3H-吲哚啉与 (^¾2反应制得季铵盐 II， 其中 Z是卤素或者 OTs, Z -是卤素负离子或者 OTV; 反应温度 80~148°C， 反 应时间 6~12小时， 反应溶剂选自甲苯、 邻二氯苯、 乙醇或乙腈， 吲哚化合 (3Η ₂ Ζ的投料摩尔比 1:1~1:4；

该反应步骤中， 如果 z是氯或者溴， 在反应的过程中可以加入少量 KI作为 催化剂， 有利于提高反应的速率， 缩短反应时间。

(2) 溴乙酸与三氯氧膦和 DMF反应生成带多个醛基的中间体 III， 溴乙酸 与三氯氧膦的投料摩尔比 1: 4-1： 6， 反应的温度 70±2°C _;

CHO

Br^ COOH

OHC人 CHO

III

该反应步骤中， 由于 DMF是溶剂， 因此其与溴乙酸的投料比例无需进行限

(3) 将步骤 （1) 制得的季铵盐 II和步骤 （2) 制得的中间体 III在乙醇溶 剂中， 吡啶催化下回流 2~6小时， 制得式 IV的中位醛基取代的五甲川菁荧光染 料； 当中间体 III与季铵盐 II的投料摩尔比是 1:3时， 产物是对称的中位醛基取 代的五甲川菁荧光染料； 当使用两种不同的季铵盐， 并且中间体 III、 第一季铵 盐及第二季铵盐的投料摩尔比是 1:0.8~1:1~3时，产物是非对称的中位醛基取代 的五甲川菁荧光染料；

(4) 以甲醇为溶剂， 使步骤 （3) 中制得的化合物 IV与硼氢化钠反应得化 合 V 该步反应中， 加入硼氢化钠的量要尽可能的少， 最好是刚好将染料的正电 荷还原， 避免中位的醛基被还原。 可通过反应溶液的颜色变化来灵敏地控制， 化合物溶液颜色呈深蓝色， 向里面缓慢的加入硼氢化钠， 边加边搅拌直到溶液 中蓝色刚好消失， 变为黄色， 即停止加入硼氢化钠。

(5) 步骤 （4) 制得的化合物 ¥与 (^¾ ₄ 在碱性试剂存在条件下反应制备 化合物 VI； 反应溶剂是无水甲醇， 反应温度 25~40°C， 化合物 ¥与 (^¾ ₄ 的投 料摩尔比 1:2 ~1 :4; 其

VI

(6) 步骤 （5) 制得的化合物 VI常温下氧化脱氢制备化合物 VII， 溶剂是 二氯甲垸或氯仿， 氧化脱氢试剂是 2， 3， 5， 6-四氯 -1， 4-对苯二醌或 2， 3-二氯 -5， 6-二氰基 -1， 4-对苯二醌，化合物 V与氧化脱氢试剂的投料摩尔比 1 :0.5~1 :1；

W

(7) 将化合物 IV和化合物 VII与含 Y—阴离子的钠盐或钾盐进行负离子置换， 得到式 I的化合物。

本发明的再一目的是提供利用上述五甲川菁荧 光染料检测流体粘度的方 法， 尤其是用于检测组织、 细胞水平流体粘度的方法。

本发明所公开的中位取代五甲川菁染料具有双 吸收和发射峰； 该类化合物 的荧光性能对溶液粘度非常敏感， 随着溶剂粘度的增加， 染料的发射强度迅速 增加， 而且符合 FSrster-Hoffmann关系式， 在各发射峰处的强度的比例值， 荧 光寿命与粘度的对数值呈线性变化， 也符合 FSrster- Hoffmann关系式， 能同时 使用两种方法测试化合物所处溶液环境或者生 物环境的粘度。 利用此类染料， 可同时用比例成像和荧光寿命成像两种方法来 对细胞进行研究， 并可以借此采 用比例成像法来检测细胞内粘度的变化。 附图说明

本发明附图 11幅， 其中：

图 1是化合物 4在不同溶剂中的吸收和发射光谱 a _ex = 600nm和 400 nm,

ΙμΜ) 以及荧光增强倍数；

图 1A是： 化合物 4在不同溶剂中的吸收光谱， 其中 （1 ) 二氯甲垸； （2 ) 乙腈； （3)二甲基亚砜； （4) 乙醇； （5 ) 甲醇； （6) 水。

图 1B是： 化合物 4在不同溶剂中的发射光谱， 其中 （1 ) 二氯甲垸； （2 ) 乙腈；（3)二甲基亚砜； （4) 乙醇； （5 ) 甲醇； （6) 水。

图 2Α是化合物 4 ( 1 μΜ)在不同粘度溶液中的吸收光谱的变化 a _ex = 410 nm 和 600 nm)以及在各发射峰处的荧光增加倍数；

图 2B是化合物 4 ( ΙμΜ)在不同粘度溶液中发射光谱的变化 a _ex = 600 nm:) 图 2C是化合物 4 ( ΙμΜ)在不同粘度溶液中发射光谱的变化 a _ex = 410 nm:> 图 2D是化合物 4 ( ΙμΜ) 在 410 nm处激发的时候在 460 nm和 650 nm发 射峰处的荧光增加倍数。

图 3A是化合物 4的荧光强度的对数与溶剂粘度的对数的线性� �系； 图 3B是化合物 4在两发射峰强度处比值的对数与粘度对数之� �的线性关 系；

图 4是化合物 7在不同粘度溶液中紫外吸收和荧光发射光谱� �变化以及荧 光强度比值的对数与溶液粘度对数之间的线性 关系， 其中，

图 4A是化合物 7 ( 1 μΜ) 在不同粘度溶液中的吸收光谱的变化；

图 4Β是化合物 7 ( ΙμΜ)在不同粘度溶液中发射光谱的变化 a _ex = 510 nm); 图 4C是化合物 7 ( ΙμΜ) 的在 665 nm和 565 nm处荧光强度比值的对数与 溶液粘度对数之间的线性关系；

图 5是化合物 7在不同粘度溶液中的荧光寿命变化， 其中：

图 5A是染料 7 ( ΙμΜ)在不同体积比例 （粘度） 的甘油 -乙醇混合溶剂中的 荧光寿命曲线， 激发波长 460 nm， 检测波长 665 nm _;

图 5B是化合物 7荧光寿命的对数与粘度对数之间的线性关系� �所采用荧光 寿命仪的型号： Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4p。

图 6是化合物 4 ( 5μΜ)在 MCF-7细胞中的荧光成像， Leica激光共聚焦荧 光显微镜 x l 00 objective lens, 激发波长 800 nm， 其中：

图 6A是蓝色通道荧光图片；

图 6B是红色通道荧光图片；

图 6C是蓝色与红色通道的叠加图片；

图 6D是图 4B与图 4A的荧光比例图片。

图 7是化合物 4在不同粘度的甘油 -乙醇混合溶液中的荧光寿命谱图以及荧 光寿命的对数与粘度对数之间的线性关系， 所采用荧光寿命仪的型号： Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4p; 激发波长 376nm, 其中：

图 7A是化合物 4 ( Ι μΜ) 在不同比例甘油-乙醇混合溶剂中的荧光寿命� � 图， 激发波长 376 nm， 检测波长 650 nm;

图 7B是化合物 4的荧光寿命的对数与溶液粘度对数之间的线� �关系； 图 8是化合物 4 ( 5μΜ) 在 MCF-7细胞中的荧光强度以及荧光寿命成像， 其中：

图 8Α是化合物 4在 MCF-7细胞中的荧光强度成像；

图 8Β是化合物 4在 MCF-7细胞中的荧光寿命成像， 激发波长 800 nm; 图 9是化合物 7在 MCF-7细胞中的荧光图。 λεχ = 514 nm， Leica TCS-SP2 激 光共聚焦显微镜。 放大倍数 ΙΟΟχ物镜； 其中：

图 9A: 化合物 7 ( 5uM) 与 MCF-7细胞一起孵育 30分钟；

图 9B : MCF-7细胞先用 ¾0 ₂ ( ImM) 处理 30分钟促使细胞凋亡， 然后用 磷酸缓冲夜清洗后再与化合物 7 ( 5uM) 一起孵育 30分钟；

图 9C: MCF-7细胞先用乙醇固定 30分钟后用磷酸缓冲夜清洗， 再与化合 物 7 ( 5uM) —起孵育 30分钟；

图 9D: 化合物 7 ( 5uM) 与 MCF-7细胞一起孵育 30分钟后， 再在室温下 放置 4小时后的荧光相片。

图 10是化合物 7在 MCF-7细胞中的比例荧光成像。 λεχ = 514 nm， Leica TCS-SP2 激光共聚焦显微镜。 放大倍数 lOOx物镜； 其中：

图 10A: 化合物 7 (5uM) 与 MCF-7细胞一起孵育 30分钟 （分别是绿色 通道荧光相片， 红色通道荧光相片， 白光细胞图以及前三者的叠加图）；

图 10B: MCF-7细胞先用 ¾0 ₂ ( ImM)处理 30分钟促使细胞凋亡， 然后用 磷酸缓冲夜清洗后再与化合物 7 (5uM) 一起孵育 30分钟 （分别是绿色通道荧 光相片， 红色通道荧光相片， 白光细胞图以及前三者的叠加图）；

图 10C: MCF-7细胞先用乙醇固定 30分钟后用磷酸缓冲夜清洗， 再与化合 物 7 (5uM)一起孵育 30分钟（分别是绿色通道荧光相片， 红色通道荧光相片， 白光细胞图以及前三者的叠加图）；

图 10D: 化合物 7 (5uM) 与 MCF-7细胞一起孵育 30分钟后， 再在室温 下放置 4小时后的荧光成像 （分别是绿色通道荧光相片， 红色通道荧光相片， 白光细胞图以及前三者的叠加图）。

图 11是化合物 4和化合物 7的合成流程简图。 具体实施方式

下面的实施例可以使本领域的普通技术人员更 全面地理解本发明， 但不以 任何方式限制本发明。 实施例 1

化合物 4和化合物 7的合成

化合物 4和化合物 7的合成流程简图如附图 11所示。

( 1 ) 2,3,3-三甲基 -3H-吲哚啉（化合物 1 )的合成按照 fisher吲哚合成方法： 称量苯肼 54g (0.5mol)加入到 250mL两口瓶中，搅拌下缓慢滴加 3-甲基 -2- 丁酮 43g (0.5mol)加热到 70~80°C， 反应 4小时， 分去水层， 水层用乙醚萃取， 与乙醚层合并后用无水硫酸镁干燥过滤， 减压蒸出溶剂， 即得到粗制的腙 70g， 收率 80%。

将上步粗制的腙 70g (0.4mol) 与 150mL冰醋酸混合， 在 90°C油浴中反应

3小时，冷却至室温，用饱和碳酸钠水溶液� �和水层至中性，分离水相和有机相， 水相用乙醚萃取， 萃取液与有机相合并， 无水硫酸钠干燥过滤后蒸出乙醚， 再 减压蒸馏， 收集 130~140°C (0.08~0.09Mp) 沸程的馏分。 产品为单换色油状液 体 52g (收率 82%)。

(2) 碘化 N-乙基 -2， 3， 3-三甲基 -3H-吲哚啉季铵盐 （化合物 2) 的合成 将 3.2g (20mmol)的 2， 3， 3-三甲基 -3H-吲哚啉和 4.7g碘乙垸混合于 lOOmL 圆底烧瓶中， 加入约 30mL甲苯， 于氮气保护下加热回流 7小时， 停止加热冷却 至室温，过滤生成的固体，用乙醚洗涤得到粉 红色固体季铵盐 5.4g (收率 86%)。

(3 ) 2-甲酰基 -1， 3-丙二醛 （化合物 3 ) 的合成

冰浴条件下， 将三氯氧磷 （13.8mL， 147mmol ) 逐滴滴入 DMF (40mL， 518mmol)， 1小时内滴完， 控制滴加速度保证在滴加过程中温度不要超过 5°C， 刚开始溶液呈绿色滴加完毕颜色变成橙色， 移去冰浴， 粘稠的混合物在室温下 继续搅拌 1小时。 将溴乙酸（7.15g， 51mmol)分批加入， 混合物在 70°C下反应 24小时， 棕色反应液用约 200mL水分解， 小心用 Na ₂ C0 ₃ 中和至 pH为 8左右， 加 入 2L无水乙醇， 过滤掉无机盐， 残余有机相溶液用空气流缓慢蒸干得到黄白色 残余物， 用硫酸（50%, lOmL) 中和， 然后用氯仿萃取（3x200mL)无水 MgS0 ₄ 干燥得到的残余物进一步升华得到纯的黄色晶 体 1.9g， 产率 37%。

(4)氯化 1， 5-二（1-N-乙基 -3， 3-二甲基 -2-3氢-吲哚啉基） -3-甲酰基 -1,3,5- 戊三烯季铵盐菁染料 （化合物 4) 的合成

取碘化 1-乙基 -2,3,3-三甲基 -3/ ^引哚啉盐（1.3g， 4mmol)，丁三醛（3 ) (0.2g， 2mmol)于 50ml圆底烧瓶中， 依次向其中加入无水乙醇 20mL和几滴吡啶， 氮气 保护下加热回流 1 小时， 溶液变成深蓝色， 冷却至室温， 减压蒸干溶剂， 先用 水洗涤产物， 二氯甲垸萃取 （3x20mL)， 无水 Na ₂ S0 ₄ 干燥， 旋转蒸发除去溶剂， 硅胶色谱层析分离纯化， 用无水甲醇 /二氯甲垸（1/400， v/v)展开剂冲洗， 收集 蓝色组分，得到产物 0.45g，产率约 51%。产物结构鉴定的核磁和质谱数据如下：

¹ H-NMR(400MHz, CDCl ₃ ):1.56(t, 6H, CH ₃ , J = 7.2Hz), 1.86(s, 6H, CH ₃ ), 4.51(q, 4H, CH ₂ , /= 7.2Hz), 7.22(bp, 2H, CH), 7.33(d, 2H, ArH, /= 8.4Hz), 7.38(t, 2H, ArH, J = 7.6Hz), 7.46(d, 2H, ArH, J = 7.6Hz), 7.49(t, 2H, ArH, J = 8.0Hz), 8.26(d, 2H, CH, J= 14.4Hz), 9.76(s, 1H, CH,)

¹³ C-NMR (100MHz, CDC1 ₃ ): 12.86, 28.39, 41.83, 50.93, 102.38, 112.14, 120.32, 122.83, 127.09, 129.18, 141.33, 142.25, 177.85, 189.74 HRMS-ESI: m/z calcd M+ for C ₃ oH ₃₅ N ₂ 0 ⁺ , 439.2749; found, 439.2764

(5 ) 还原的氯化 1， 5-二 （1-N-乙基 -3， 3-二甲基 -2-3氢 -吲哚啉基） -3-甲 酰基 -1,3,5-戊三烯季铵盐菁染料 （化合物 5 ) 的合成

取氯化 1， 5-二（1-N-乙基 -3， 3-二甲基 -2-3氢 -Π引哚啉基）—3-甲酰基 -1,3,5-戊 三烯季铵盐菁染料 （化合物 4) (0.566g， lmmol) 溶于 15mL的甲醇中得到深 蓝色溶液， 然后将硼氢化钠 （10mg， 0.25mmol) 加入上述溶液中， 磁力搅拌， 室温下搅拌溶液直到溶液变成黄色， 减压蒸馏除掉溶剂， 采用硅胶柱色谱简单 纯化产品， 用二氯甲垸作为洗脱剂， 得到浅黄色产品约 0.41g， 产率 93.2%。 产 物结构鉴定的核磁数据如下：

^ NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): 1.10 (t, 3H, CH ₃ , J= 6.4Hz), 1.14 (s, 3H, CH ₃ ), 1.27 (t, 3H, CH ₃ , / = 6.4 Hz), 1.34 (s, 3H, CH ₃ ), 1.68 (s, 6H, CH ₃ ), 3.17 (q, 1H, CH ₂ , / = 6.8Hz), 3.33 (q, 1H, CH ₂ , J= 6.8Hz), 3.75 (q, 2H, CH ₂ , J= 6.8 Hz), 5.99 (d, 1H, CH, J = 12.8Hz), 6.43 (d, 1H, ArH, J = 8.4 Hz), 6.49 (d, 1H, ArH, J = 7.6 Hz), 6.57 (d, 1H, CH, J = 16.0 Hz), 6.68 (t, 1H, ArH, J = 7.2 Hz), 6.78 (d, 1H, ArH, J = 7.6 Hz), 7.01 (t, 2H, ArH, J= 6.8 Hz), 7.08 (t, 1H, ArH, J= 7.2 Hz), 7.24 (t, 2H, ArH, J= 7.2 Hz), 7.49 (d, 1H, CH, J= 13.2 Hz), 9.41 (s, 1H, CHO)

( 6)还原的氯化 1， 5-二（1-N-乙基 -3， 3-二甲基 -2-3氢 -吲哚啉基) -3- (2， 2-二氰基乙烯基） -1,3,5-戊三烯季铵盐菁染料 （化合物 6) 的合成

取中间体（化合物 5 ) ( 1.33g， 3mmol)， 丙二腈 （0.66g， lOmmol)和无水 哌嗪 （0.86g， lOmmol) , —起溶于 30mL 的无水甲醇中， 氮气保护下室温搅拌 过夜， 反应液变成粉红色， 减压蒸馏除掉溶剂， 得到的残余物通过硅胶柱色谱 分离纯化， 二氯甲垸作为洗脱剂， 得到具有金属光泽粉末 1.3g， 产率 89%。 产 物结构鉴定的核磁数据如下：

¾ NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): 1.12 (t, 3H, CH ₃ , J= 8.0 Hz), 1.29 (t, 3H, CH ₃ , J= 8.0 Hz), 1.4 (s, 6H, CH ₃ ), 1.67 (s, 6H, CH ₃ ), 3.3 (q, 4H, CH ₂ , J = 8.0 Hz), 5.86 (bp, 1H, CH), 5.95 ( d, 1H, CH, J = 12.0 Hz), 6.52 (bp, 1H, CH), 6.70(bp, 2H, ArH), 6.89 (d, 1H, ArH, J = 8.0 Hz), 7.02 (t, 1H, ArH, / = 8.0 Hz), 7.11 (t, 2H, ArH, J = 8.0 Hz), 7.19 (s, 1H, CH), 7.30 (t, 2H, ArH, J= 8.0 Hz), 7.71 (d, 1H, CH, J= 12.0 Hz)

(7) 氯化 1， 5-二 （1-N-乙基 -3， 3-二甲基 -2-3氢 -吲哚啉基) -3- (2， 2-二氰 基乙烯基） -1,3,5-戊三烯季铵盐菁染料 （化合物 7) 的合成

0.98g化合物 6 (2mmol) 溶于 20mL的无水二氯甲垸中， 然后将 2， 3-二氯 -5， 6-二氰基 -1， 4-对苯二醌 （DDQ， 0.452g， 2mmol ) 加入上述溶液中， 室温 下搅拌， TLC 薄层色谱监测反应完成， 溶液从粉红色变成深蓝色， 然后减压蒸 馏除掉溶剂， 饱和食盐水洗涤， 然后二氯甲垸萃取， 无水硫酸钠干燥， 减压除 掉溶剂得到的残余物通过硅胶柱色谱分离 （采用 99/1 (v/v) 的二氯甲院 /甲醇作 为洗脱剂） 得到具有金属光泽粉末 0.56g， 产率 53.6%。 产物结构鉴定的核磁及 质谱数据如下：

¾ NMR (400 MHz, CDC1 ₃ ): 1.54 (t, 6 H, CH ₃ , / = 6 Hz), 1.83 (s, 12 H, CH ₃ ), 4.59 (q, 4 H, CH ₂ , / = 6.0 Hz), 6.66 (d, 2 H, CH, J= 14.8 Hz), 7.34 (d, 2 H, ArH, J= 8.0 Hz), 7.39 (d, 2 H, ArH, J= 7.2 Hz), 7.46 (t, 4 H, ArH, J= 7.2 Hz), 8.03 (s, 1 H, CH), 8.53 (d, 2 H, CR, J= 14.8 Hz);

¹³ C-NMR (100 MHz, CDC1 ₃ ): 12.95, 27.55, 41.26, 51.03, 102.92, 112.26, 115.45, 116.16, 116.96, 122.63, 127.34, 129.01, 140.96, 142.39, 148.81, 154.18, 177.37

HRMS-ESI: m/z calcd M+ for C ₃₃ H ₃₅ N ₄ +, 487.2862; found, 487.2866 实施例 2

化合物 4和化合物 Ί的光谱特征检测及分析

首先配制化合物 4和 7 的二甲基亚砜母液， 然后使用相应的色谱级溶剂进 行稀释得到的， 测试液的浓度是 1μΜ。 室温下测试在不同溶剂中的紫外吸收和 荧光发射光谱，其结果分别如图 1A和 IB,并检测化合物 4，化合物 7和乙基 -Cy5 的光谱性能， 其结果如表 1。

从检测结果可知： 与传统的五甲川菁染料相比（ethyl-Cy5 )， 作为荧光探针， 化合物 4和化合物 7都有两组吸收和发射峰， 它们分别位于 400nm， 610nm和 456nm, 650nm以及 510nm， 655nm和 565nm， 668nm。 在乙醇中， 化合物 4、 化合物 7和乙基 Cy5的荧光量子产率分别是 0.0108， 0.0048和 0.27， 前二者远 低于传统 Cy5的荧光量子产率 （如表 1 )， 所示并且这两种染料的荧光量子产率 随溶剂极性变化较小， 即染料受溶剂极性的影响很小， 对溶剂不敏感。 从结构 上，相当于两个荧光染料叠加在一起，两组长 波长的吸收和发射（610nm， 650nm 和 655nm， 668nm) 分别对应于菁染料正常的吸收和发射峰； 而两组短波长峰 (400nm， 460nm和 510nm， 565nm) 的产生是由于中位共轭基团 （醛基或者丙 二腈乙烯基） 的引入产生了一组新的电子跃迁态的， 即短共轭链荧光团的跃迁 产生， 两个荧光染料之间在激发态发生分子内电荷的 再分布， 就可以用短波长 的激发产生长波长的发射 （结果见附图 1和表 1 )， 这样可以得到大的假斯托克 斯位移（在乙醇中， 假斯托克斯位移分别是 254nm和 158nm)。探针对环境粘度 是非常敏感的， 随着溶剂粘度的增加， 染料的荧光强度迅速增加， 但是紫外吸 收光谱受到粘度影响不大。

表 1 化合物 4和化合物 7与传统乙基 Cy5的光谱性能比较 化合物 溶剂 人 A ₂ ^h A ₃ ^h o ₂ ^d 二氯甲烷 399 625 454 654 55 29 255 1.60 8.97 0.0060 0.0231 乙腈 397 607 451 626 54 19 229 1.12 9.35 0.0062 0.0071 二甲亚砜 400 613 451 630 51 17 230 1.5 10.85 0.0158 0.0224

4

乙醇 399 613 451 653 52 40 254 1.38 9.75 0.0050 0.0108 甲醇 400 608 451 650 51 42 250 1.45 9.93 0.0050 0.0079 水 413 600 460 643 47 43 230 1.68 6.21 0.0023 0.0032 二氯甲烷 512 656 568 672 56 16 160 4.97 11.35 0.0016 0.006 乙腈 513 635 561 661 48 25 148 5.94 11.20 0.0017 0.0019 二甲亚砜 522 639 569 670 47 31 148 4.50 11.82 0.0057 0.0113

7

乙醇 510 641 566 668 56 27 158 5.31 12.56 0.0022 0.0048 甲醇 509 636 568 665 59 25 156 4.90 12.20 0.0022 0.0031 水 520 627 570 655 50 28 135 3.10 5.24 0.0006 0.0028 二氯甲烷 661 671 6 30.6 0.29 四氢呋喃 653 662 9 22.7 0.37 乙基 二甲亚砜 655 668 13 27.2 0.33

-Cy5 乙醇 652 663 11 30.2 0.27

甲醇 649 659 10 25.9 0.22 水 648 656 8 22.7 0.13 表 1中， "是染料在不同溶剂中的最大吸收和发射波长 （nm) ；

是斯托克斯位禾多 (nm), Δλι =λ _6Πΐ1 - _absl , Δλ ₂ =λ _βΐίΐ2 - _abs2 , Δλ ₃ = _em2 - _absl ; £是摩尔消光系数 （ 10 ⁴ L/cm-mol);

是选用罗丹名 B在乙醇中的荧光量子产率为 0.97作为参比标准 ， 染料的吸收 波长选用第一个吸收波长作为激发波长。 实施例 3 化合物 4和化合物 7的粘度试验

分别配制浓度为 lxl(T ³ M的化合物 4和化合物 7的 DMSO溶液， 精确量取 lO L该溶液加入到 10mL甘油-乙醇溶液中， 超声 10分钟， 除掉气泡后静置 1小 时， 在紫外分光光度仪和荧光光度仪上测量其吸收 和发射光谱以及测试各粘度 溶液染料的荧光寿命。 所选用激发波长是 376nm。 所用仪器为紫外可见分光光 度计，型号： Hp8453 _; 荧光分光光度计，型号： FP-6500,荧光寿命测试仪： Horiba Jobin Yvon Fluoromax-4p。

其中，甘油 -乙醇溶液包括甘油、乙醇以及 V甘油： V 分别是 1:9,2:8,3:7,4:6, 5:5,6:4,7:3,8:2,9:1的两相混合溶液。

当上述配制好的溶液在一定温度下静置一段时 间待气泡消除后， 在紫 外吸收光谱仪和荧光仪上测的各种体积比下化 合物的紫外吸收光谱 （如图 2A) 和荧光发射光谱 （如图 2B， 2C), 从图 1可以知道染料在不同种类的 低粘度溶剂中的吸收和发射变化不大， 说明染料对溶剂的极性不敏感。 而 当逐渐增加溶剂的粘度的时候， 染料的紫外吸收也变化不大， 但是荧光发 射却随着粘度的增加明显增加， 不管是在 600nm处激发， 还是 400nm处激 发， 染料在 650nm和 456nm发射处的荧光强度增加倍数分别达到 15倍和 4 倍 （如图 2D); 而且荧光强度的对数与溶液的对数之间保持较 好的线性 关系 （如图 3A), 符合 F0rster_ Hoffmann公式， 可以用来检测均匀溶剂中 的粘度；另一方面 650nm处的荧光强度与 456nm处的荧光强度的比值的对 数与溶剂粘度的对数之间也保持很好线性关系 （如图 3B), 可以用来检测 生物环境 （如细胞内） 的粘度。

相比化合物 4和乙基 -Cy5的光谱性能， 化合物 7的最大吸收和发射波长都 有红移， 而且也是两组吸收和发射峰， 其荧光量子产率在低粘度不同极性的溶 剂中都很低， 如表 1所示， 在小极性的二氯甲垸中， 化合物 7在不同发射峰处 的荧光量子产率只有 0.0016和 0.006，而在大极性的水中在两个发射峰处的荧� �� 量子产率分别是 0.0006和 0.0028， 极性变化很多大， 粘度变化不大， 染料的荧 光量子产率变化也不大,说明染料对溶剂的极� �也不敏感。

化合物 7在不同粘度的溶液中也得到与化合物 4类似的结果， 荧光增加很 多， 如图 4所示， 化合物 7的紫外吸收随着溶液粘度的变化， 在两吸收峰处的 吸光度变化较小 （图 4A), 而其在发射峰处荧光强度随着溶液粘度的增加 ， 很 显著的增强 （图 4B)， 而且在 665nm处的荧光强度比 565nm处的增加幅度大。 在两发射峰处的荧光强度之比的对数值与溶液 粘度对数值之间也很好的满足 FSrster-Hoffmann公式（图 4C) , 可以用来测试溶液中粘度值。 化合物 7在发射 峰 665nm处的荧光寿命也随着溶液的粘度很明显的� ��长 （图 5A) , 寿命与溶液 粘度的关系也较好的符合 FSrster-Hoffmann公式 （图 5B ) , 也就是说， 化合物 7 也能采用两种模式来检测溶液的粘度， 这与化合物 4得到的结论是一致的。

化合物 4和化合物 7的 荧光量子产率都很低， 在生物方面产生低的本底荧 光， 由表 1可知化合物 4和化合物 7对溶剂的极性不敏感。化合物 4和化合物 7 的荧光发射强度对溶剂的粘度比较敏感。 随着溶剂粘度的增加， 探针的荧光发 射强度迅速增加， 采用长波长激发， 探针的长波长处的发射强度随之增加， 在 短波长处激发， 其在短波长的发射强度和长波长处的发射强度 都随着增加， 增 加幅度分别是起始时的 15和 4倍。 而且荧光强度的对数与溶液粘度的对数之间 满足很好的线性关系符合 FSrster-Hoffmann公式 （式 1 ) :

Log If = C + log ^ (式 1 )

式 1 中. · 为染料的荧光强度； C为温度常数； X 为染料的常数； η 为溶 剂的粘度。

因为有两组发射峰， 而且随着粘度的增加， 在各发射峰处的荧光增加倍数 不相同， 所以对两组发射峰处的荧光强度作比。 发现两者的比值的对数与粘度 的对数也是很好的线性关系， 也很好的符合 F6rster-Hoffmann。 因此， 可以把化 合物 4和化合物 7 用作比例探针 （结果见附图 3和图 4)。

在溶液中， 如果染料的浓度不均匀， 那么荧光强度也会受到影响， 增加误 差， 影响到经测量的精确度。 因此为了尽量排除这些原因引起的误差， 采用比 例的方法是能满足的要求的。 荧光染料的荧光寿命的长短也是不受到染料浓 度 的影响的， 也能达到相同的效果。 根据 Suhling等人的工作可知， 根据染料在不 同粘度环境中的荧光寿命是不同的， 采用荧光寿命的方法可以对环境的粘度进 行测试。

根据附图 5和 7的结果可知， 在溶液中的粘度较低的情况下， 染料 4的荧 光寿命增加是不明显的， 一旦溶液的粘度达到较大后， 染料的荧光寿命会很明 显的增加， 从纯乙醇中不足 50ps增加到 99%的甘油中的 1450ps。 而且荧光寿命 的对数与溶液粘度的对数成线性关系， 满足 FSrster-Hoffmann关系式， 化合物 7 的荧光寿命与化合物 4的变化规律是一致的， 故化合物 4和 7都能用来检测染 料的荧光寿命来测量溶液或者生物环境的粘度 。 实施例 4

化合物 4和化合物 7的细胞实验

激光共聚焦扫描显微镜下观察化合物对活细胞 MCF-7的染色：

加配有化合物 4和 7浓度为 5μΜ的 PBS缓冲液 12 L于培养好 MCF-7细胞的 六孔板中， 在 37 °C ， 5% C0 ₂ 的细胞培养箱中孵育 30min。 然后， PBS震荡漂 洗 5 minx3 , 再加入细胞培养基， 激光共聚焦扫描显微镜 （Leica, TCS-SP2, Germany) 观察细胞形态。 选取代表性区域， 分别选用 Cy5 ( 633nm) 通道激 发传统 Cy5 和绿光 514nm激发化合物 7， 用油镜 （ΙΟΟΟχ ) 观察， 重复三次。

图 6和图 9分别是化合物 4和化合物 7对活细胞 MCF-7染色的荧光显微照 片；如图可观察到传统 Cy5 和化合物 4对 MCF-7细胞质的特异性染色对比。所 用仪器为激光共聚焦扫描显微镜， 型号: TCS-SP2。 激发光通道： 分别选用 Cy5(633nm), 绿光 （543nm)， 青光 （488nm) 和蓝光 （388 nm)。 染料直接染色：

将可传代 MCF-7和 Hela细胞接种于 6孔板， 37°C， 5%C0 ₂ 条件下培养 24小 时， 加入染料， 终浓度为 5μΜ， 37°C孵育 30min， 吸掉培养基， PBS洗 2遍， 加 入 120(^L新鲜培养基， 照荧光。

H ₂ 0 ₂ 损伤：

将可传代 MCF-7和 Hela细胞接种于 6孔板， 37°C， 5%C0 ₂ 条件下培养 24小 时， 加入 133.3 L H ₂ 0 ₂ ， 终浓度为 lmM/L， 37°C孵育 2h， 吸掉原培养基， 用 PBS 洗 2遍， 加入 120(^L新鲜培养基， 加入染料， 终浓度为 5μΜ， 37°C孵育 30min， 吸掉培养基， PBS洗 2遍， 加入 120(^L新鲜培养基， 照荧光。 乙醇固定：

将可传代 MCF-7和 Hela细胞接种于 6孔板， 37°C， 5%C0 ₂ 条件下培养 24小 时， 吸掉培养基， 用 PBS洗 2遍， 加入适量 70%乙醇， 37°C孵育 30min， 吸掉固 定用乙醇， 用 PBS洗 2遍， 力口 120(^LPBS， 加入染料， 终浓度为 5μΜ， 37°C孵 育 30min， 照荧光。

本专利所涉及的染料具有细胞膜的通透性， 小分子染料具有活细胞膜渗透 性。 进入到细胞内后， 探针在细胞不同位置分布， 荧光强度不同程度的增强， 实验结果见附图 6， 是化合物 4在 MCF-7细胞内的成像结果， 由于染料有两组 发射波长分别位于 460nm和 650nm， 那么就采用双通道检测， 短波长通道取 (460±20)nm的蓝色通道 （如图 6A ); 长波长则是取 （650±20 ) nm的红色通道 (如图 6B ) , 两者的叠加图片呈粉红色 （如图 6C ) , 而对两通道的荧光强度做 比值后， 得到化合物 4在 MCF-7细胞内的比例成像图 （如图 6D ) , 根据图片能 很清楚的看出， 细胞内不同粘度位置的分布， 达到对细胞内粘度分布比例成像 的目的。

根据 Suhling等人的工作， 探针的荧光寿命对数与粘度对数是线性关系， 很 好的符合 FSrster-Hoffmann关系式， 化合物 4是可以用来对细胞内的粘度分布 进行荧光寿命成像的。 由附图 8的结果可以看出， 化合物 4在 MCF-7细胞内的 分布可以通过荧光强度的图看出， 整个细胞内都是有染料存在的， 由荧光寿命 成像的图 （如图 8 ) 可以看出， 化合物 4在不同环境中的荧光寿命的不同的， 也反映出细胞内不同位置的粘度不同， 进而通过化合物 4 的在细胞内的荧光寿 命成像清楚的表现出来。

通过上述结果可以看出， 比例成像的结果和荧光寿命成像的结果是一致 的， 细胞内比值比较大的位置对应的荧光寿命也比 较长， 这也互相证明比例成像和 荧光寿命成像的准确性。

以上主要针对化合物 4讲述其对细胞的比例成像检测和荧光寿命成� �检测， 化合物 7与化合物 4具有同样的效果， 也能采用双模式对细胞内的粘度分布进 行检测成像。

根据附图 9和附图 10的结果可以看出。 化合物 7有两组发射波长分别位于 565nm和 665nm，采用双通道检测，绿色通道 (565±20)nm和红色通道（665±20)nm. 分别做了四组细胞， 第一组是细胞与化合物 7在一起孵育好了后直接在激光共 聚焦显微镜下观察结果； 第二组是染料与细胞培养好了后再向其中加入 双氧水 ( ImM) 再孵育半小时诱导细胞凋亡； 第三组是直接使用无水乙醇将细胞杀死 固定； 第四组是将细胞与化合物 7—起培养好了后， 在室温下放置 4小时后观 察到的结果， 实验结果见附图 9。 用 Image Pro-plus软件将结果处理得到各组比 例成像图片， 如结果所示， 第一组结果表明正常活细胞中的粘度较低， 染料在 细胞中呈现蓝色较多， 比例值较小； 当细胞被双氧水处理过细胞逐渐凋亡后， 细胞内的颜色明显增加， 比例值增加， 细胞内的粘度也相应的增加了； 细胞被 固定后， 细胞确定是死亡了， 得到的化合物 7 的结果与第二组类似； 而第四组 结果是细胞处于凋亡过程中， 探针的比例值也位于第一组第二组之间， 是一种 中间状态。 故化合物 7可用来检测细胞内的粘度变化和研究细胞凋� �过程。