本発明においては各種アミノ酸残基を次� ��略号で記述する。

 Ala :L-アラニン残基
 Arg :L-アルギニン残基
 Asn :L-アスパラギン残基
 Asp :L-アスパラギン酸残基
 Cys :L-システイン残基
 Gln :L-グルタミン残基
 Glu :L-グルタミン酸残基
 Gly :グリシン残基
 His :L-ヒスチジン残基
 Ile :L-イソロイシン残基
 Leu :L-ロイシン残基
 Lys :L-リジン残基
 Met :L-メチオニン残基
 Phe :L-フェニルアラニン残基
 Pro :L-プロリン残基
 Ser :L-セリン残基
 Thr :L-トレオニン残基
 Trp :L-トリプトファン残基
 Tyr :L-チロシン残基
 Val :L-バリン残基
 また、本明細書においては、常法に従って� ��プチドのアミノ酸配列を、そのN末端のアミ ノ酸残基が左側に位置し、C末端のアミノ酸� �基が右側に位置するように記述する。

  1.Wntシグナル伝達系活性を有する� ��プチド及びその塩
 本発明のペプチドとしては、下記の(1)又は( 2)に示すペプチドが挙げられる。
(1) Leu Cys Cys Gly Arg Gly His Arg Thr Arg Thr  Gln Arg Val Thr Glu Arg Cys Asn Cys (配列番号1) で表されるアミノ酸配列からなるペプチド
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列におい� �1又は数個のアミノ酸が置換、欠失、若しく� ��付加されたアミノ酸配列からなり、且つ、P C12細胞の接着誘導活性、神経幹細胞の分化促 進活性、及び細胞内βカテニン蓄積促進活性� ��りなる群から選択される少なくとも1種のWnt シグナル伝達系活性を有するペプチド。

 上記(2)のペプチドにおいて、置換、欠失� ��しくは付加されるアミノ酸の数については� ��改変されたペプチドが上記Wntシグナル伝達� ��活性を有していることを限度として特に制� ��されない。例えば、アミノ酸の付加の場合� ��あれば、当該付加されるアミノ酸の数とし� ��は、1~3個、好ましくは1~2個、更に好ましく� ��1個が挙げられる。また、例えば、アミノ酸 の欠失の場合であれば、当該欠失されるアミ ノ酸の数としては、1~3個、好ましくは1~2個、 更に好ましくは1個が挙げられる。更に、例� �ばアミノ酸の置換の場合であれば、当該置� �されるアミノ酸の数としては、1~3個、好ま� �くは1~2個、更に好ましくは1個が挙げられる� ��

 また、上記(2)のペプチドにおいて、置換� ��欠失若しくは付加されるアミノ酸の位置に� ��いては、改変されたペプチドが上記Wntシグ� ��ル伝達系活性を有している限り特に制限さ� ��るものではない。

 更に、上記(2)のペプチドにおいて、置換� ��しくは付加されるアミノ酸の種類について� ��、改変されたペプチドが上記Wntシグナル伝� ��系活性を有することを限度として、特に制� ��されない。但し、置換については、各アミ� ��酸残基は側鎖官能基の性質に基づく相同性� ��換であることが望ましい。アミノ酸の置換� ��場合であれば、例えば、CysはSerに、LeuはIle� ��はValに、ThrはSerに、GluはAspに、GlnはAsnに、A rgはLysにそれぞれ置換可能であり、その逆の� ��換も可能である。

 また、上記(2)のペプチドにおいて、「Wnt� ��グナル伝達系活性化作用」とは、PC12細胞の 接着誘導活性、神経幹細胞の分化促進活性、 及び細胞内βカテニン蓄積促進活性の中の少� ��くとも1種の活性を示す作用、好ましくはこ れらの中の2種以上の活性を示す作用、更に� �ましくはこれらの全ての活性を示す作用を� �えていることを意味する。上記(2)のペプチ� �における「Wntシグナル伝達系活性化作用」� �、次のようにして確認することができる。

 <PC12細胞の接着誘導活性>
 5容量%のウマ血清及び5容量%のウシ胎児血清 を含むダルベッコのMEM培地(DMEM)に、PC12細胞� �100cells/μLとなるように懸濁し、当該細胞懸� �液を24穴プレートの各ウェルに500μL添加する 。各ウェルに確認対象となるペプチドを最終 濃度が100μg/mLとなるように添加し、その後、 37℃及び5%CO ₂ の条件下で5日間培養し、形態観察を行う。� �た、確認対象となるペプチドの代わりに、� �列番号1で表されるアミノ酸配列からなるペ� ��チドを用いて、上記と同様の方法で、試験� ��行い、5日間培養した後の形態観察を行う。 配列番号1で表されるアミノ酸配列からなる� �プチドを添加したウェルにおいて底部に接� �して扁平化したPC12細胞の数を100%として、確 認対象となるペプチドを添加したウェルにお いて底部に接着して扁平化したPC12細胞の数� �50%以上、好ましくは75%以上、特に好ましく� �85%以上である場合に、そのペプチドは「PC12� ��胞の接着誘導活性」を有するものとする。
参考文献:Neuron, 11, 865-875, 1993
 <神経幹細胞の分化促進活性>
 スフェアを形成して増殖している神経幹細� ��を集めて、1Vol%のN2-supplement、20ng/mLの塩基性 線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むDMEM/F12に、適� ��な濃度となるように懸濁し、24穴プレート� �各ウエルに500μLずつ添加する。各ウェルに� �認対象となるペプチドを最終濃度が100μg/mL� �なるように添加し、その後、37℃及び5%CO ₂ の条件下で5日間培養し、形態観察と免疫染� �を行う。また、確認対象となるペプチドの� �わりに、配列番号1で表されるアミノ酸配列� ��らなるペプチドを用いて、上記と同様の方� ��で、試験を行い、5日間培養した後の形態観 察を行う。配列番号1で表されるアミノ酸配� �からなるペプチドを添加したウェルにおい� �底部に接着して軸索様神経突起を伸長して� �る細胞の数を100%として、確認対象となるペ� ��チドを添加したウェルにおいて底部に接着� ��て軸索様神経突起を伸長しているスフェア� ��数が50%以上、好ましくは75%以上、特に好ま� ��くは85%以上である場合に、そのペプチドは� ��神経幹細胞の分化促進活性」を有するもの� ��する。
参考文献:Nat. Med. 6:271-277; 2000
 <細胞内βカテニン蓄積促進活性>
 5容量%のウマ血清及び5容量%のウシ胎児血清 を含むDMEM培地に、PC12細胞を懸濁し、20万cells /dishとなるように当該細胞懸濁液をディッシ� ��(内径3.5 cm)に添加し、37℃及び5%CO ₂ 条件下で一日培養する。斯くしてPC12細胞が� �養されたディッシュに、確認対象となるペ� �チドを最終濃度が100μg/mLとなるように添加� �、37℃及び5%CO ₂ 条件下で24時間培養する。その後、細胞を回� ��し、細胞ペレットをSDS-ポリアクリルアミド 電気泳動(SDS-PAGE)のサンプル緩衝液に溶解す� �。SDS-PAGEに供した後、親水化処理PVDF膜に転� �し、抗βカテニン抗体を用いて免疫染色する ことによりβカテニンを検出する。βカテニ� �は、分子量92 kダルトンの部分のバンドとし て検出され、当該バンドの濃淡をデンシトメ ーターにより測定することによりβカテニン� ��定量化される。また、確認対象となるペプ� ��ドの代わりに、配列番号1で表されるアミノ 酸配列からなるペプチドを用いて、上記と同 様の方法で、試験を行い、5日間培養した後� �細胞内に蓄積したβカテニン量をデンシトメ ーターにより測定する。配列番号1で表され� �アミノ酸配列からなるペプチドを添加した� �合の細胞において測定されたβカテニン量を 100%として、確認対象となるペプチドを添加� �た細胞において検出されたβカテニン量が50% 以上、好ましくは75%以上、特に好ましくは90% 以上である場合に、そのペプチドは「細胞内 βカテニン蓄積促進活性」を有するものとす� ��。
参考文献:J Biol Chem, 277, 17901-17905, 2002
 本発明の上記(1)又は(2)に示すペプチドは、� ��ミノ末端(N末端)がアセチル基、メトキシカ� ��ボニル基、ブトキシカルボニル基、又は1~3� ��基のペプチド等で置換されたものであって� ��良い。また、本発明の上記(1)又は(2)に示す� ��プチドは、カルボキシ末端(C末端)がアミド� ��、メチルエステル基、ブチルエステル基、� ��は1~3残基のペプチド等で置換されたもので� ��良い。

 本発明において、上記(1)又は(2)に示すペ� ��チドは、塩の形態であっても良い。このよ� ��な塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸� ��乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマール酸、� ��ュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸� ��パルミチン酸等の酸との塩;ナトリウム、カ リウム等のアルカリ金属との塩;カルシウム� �のアルカリ土類金属との塩;アルミニウムの� ��酸化物又は炭酸塩との塩;トリエチルアミン 、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、t-� ��チルアミン、ジシクロヘキシルアミン、ア� ��ギニン等との塩等が挙げられる。

 本発明のペプチドは、通常のペプチド合� ��方法により行われる。例えば固相合成法ま� ��は液相合成法によって調製されるが、固相� ��成法が操作上簡便である〔例えば、日本生� ��学会編「続生化学実験講座2 タンパク質の� ��学(下)」(昭和62年5月20日 株式会社東京化学 同人発行)、第641-694頁参照〕。

 本発明のペプチドの固相合成法による調� ��は、例えば、(1)スチレン-ジビニルベンゼン 共重合体などの反応溶媒に不溶性である重合 体に目的とするペプチドのC末端に対応する� �ミノ酸をそれが有するα-COOH基を介して結合� ��せる、(2)次いで該アミノ酸に目的とするペ� ��チドのN末端の方向に向かって、対応するア ミノ酸またはペプチド断片を該アミノ酸また はペプチド断片が有するα-COOH基以外のα-ア� �ノ基などの官能基を保護したうえで縮合さ� �て結合させる操作と、該結合したアミノ酸� �たはペプチド断片におけるα-アミノ基など� �ペプチド結合を形成するアミノ基が有する� �護基を除去する操作とを順次繰り返すこと� �よってペプチド鎖を伸長させ、目的とする� �プチドに対応するペプチド鎖を形成する、(3 )次いで該ペプチド鎖を重合体から脱離させ� �かつ保護されている官能基から保護基を除� �することにより目的とするペプチドを得る� �(4)次いでこれを精製する、ことによって実� �される。ここで、ペプチド鎖の重合体から� �脱離および保護基の除去は、トリフルオロ� �酸を用いて同時に行うのが副反応を抑制す� �観点から好ましい。また、得られたペプチ� �の精製は逆相液体クロマトグラフィ-やゲル� ��ーミエイションクロマトグラフィーで行う� ��が効果的である。

 また、本発明のペプチドの塩は、通常の� ��生成反応を利用することにより調製される� ��

  2.医薬製剤
 本発明のペプチド又はその塩は、上記Wntシ� ��ナル伝達系活性を有しており、医薬分野に� ��ける有用効果を奏することができる。即ち� ��本発明のペプチド又はその塩は、Wntシグナ� ��伝達系の活性化によって改善乃至治療効果� ��期待される疾患に対する医薬として有用で� ��る。それ故、本発明のペプチド又はその塩� ��、薬学的に許容される基材又は担体と共に� ��剤化され、医薬製剤として使用することが� ��きる。

 当該医薬製剤は、Wntシグナル伝達系の活� ��化によって改善乃至治療効果が期待される� ��薬用途、即ち、神経幹細胞及び造血幹細胞� ��の幹細胞の増殖又は分化制御;或いは癌、神 経疾患、糖尿病等の疾病の治療に有用である 。中でも特に、本発明のペプチド又はその塩 は、神経幹細胞を、軸索様神経突起を伸長し ている神経細胞に分化促進させる作用に優れ ているので、当該医薬製剤は、神経幹細胞の 分化促進用の製剤として好適である。

 当該医薬製剤に使用される基材又は担体� ��ついては、薬学的に許容されることを限度� ��して特に制限されず、医薬の製剤化のため� ��配合されている成分を広く使用することが� ��きる。具体的には、当該基材としては、水� ��生理食塩水、乳糖、デンプン、白糖、デキ� ��トリン、ブドウ糖、カオリン、結晶セルロ� ��ス、ケイ酸塩等の賦形剤が挙げられる。

 また、当該医薬製剤には、上記成分の他� ��、添加剤や薬理活性成分を含んでいても良� ��。当該医薬製剤に配合可能な添加剤として� ��、例えば、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、湿潤� ��剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、界面活性� ��、保存剤等が例示される。これらの添加剤� ��配合割合は、医薬組成物の用途や製剤形態� ��応じて適宜設定することができる。

 当該医薬製剤の剤型としては、適用形態� ��応じて適宜設定されるが、一例として、錠� ��、散剤、粉末剤、顆粒剤、カプセル剤等の� ��形製剤;及び液剤、乳剤、懸濁剤等の液状製 剤が挙げられる。また、当該医薬製剤は、本 発明のペプチド又はその塩をリポソ-ム化し� �製剤化したものであってもよい。

 更に、当該医薬製剤は、本発明のペプチ� ��又はその塩を、アルギン酸ゲルや人工コラ� ��ゲンゲル等の生分解性基材に担持(固定化)� �せたものであってもよい。本発明のペプチ� �又はその塩を上記生分解性基材に担持(固定� ��)させるには、例えば、アルギン酸ゲルやカ ルボキシル基を導入した人工コラーゲンゲル に活性エステル化法又は直接法で結合するこ とができる。カルボキシル基を導入した人工 コラーゲンゲルは、例えば人工コラーゲンゲ ルを無水コハク酸と反応させること、或いは 人工コラーゲンゲルにグルタミン酸残基を導 入することによって作製できる。ゲルの活性 エステル化は、例えば、上記ゲルをジメチル ホルムアミド等の溶媒に懸濁し、N-ヒドロキ� ��コハク酸イミドと1-エチル-3-(3-ジメチルア� �ノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(WSCD・HCl) を添加し、室温で一晩振盪することにより実 施できる。活性エステル化法において、本発 明のペプチド又はその塩を上記生分解性基材 に担持(固定化)させるには、ジメチルホルム� ��ミド等の溶媒中で、上記の活性エステル化� ��れたゲル100重量部に対して、本発明のペプ� ��ド又はその塩を0.1~200重量部、好ましくは1~1 00重量部を混合して、ジイソプロピルエチル� ��ミンの存在下10~30℃で3~48時間程度、必要に� ��じて振盪しながらインキュベートすればよ� ��。一方、直接法で、本発明のペプチド又は� ��の塩を上記生分解性基材に担持(固定化)さ� �るには、例えば、以下の(i)~(iii)の工程を順� �実施すればよい:(i)上記ゲルをジメチルホル� ��アミド等の溶媒に懸濁する、(ii)得られた懸 濁液にN-ヒドロキシコハク酸イミドと1-エチ� �-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミ ド塩酸塩(WSCD・HCl)を添加する、(iii)次いで、� ��イソプロピルエチルアミンの存在下同時に� ��記ゲル100重量部に対して、本発明のペプチ� ��又はその塩を0.1~200重量部、好ましくは1~100� ��量部を添加して、10~30℃で3~48時間程度、必� ��に応じて振盪しながらインキュベートする� ��

 また、当該医薬製剤を幹細胞の増殖又は� ��化制御の用途に使用する場合であれば、当� ��医薬製剤は、本発明のペプチド又はその塩� ��上記生分解性基材に担持(固定化)されてな� �ものが好適である。更に、かかる用途の場� �、当該医薬製剤は、上記生分解性基材に担� �された本発明のペプチド又はその塩と、更� �神経幹細胞や造血幹細胞等の幹細胞と混合� �たものであってもよい。このように幹細胞� �含まれる医薬製剤は、直接又は試験管内で� �養後に体内に投与することができる。

 当該医薬製剤の投与形態については、例� ��ば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、� ��皮投与、経口投与等の全身的投与;関節内投 与等の局所投与等が挙げられ、用途や剤型等 に応じて適宜設定することができる。

 また、当該医薬製剤の投与量は、疾患の� ��類や程度、患者の性別や年齢、該製剤の投� ��形態、期待される効果等に基づいて、適宜� ��定することができる。当該医薬製剤の1日当 たりの投与量の一例として、本発明のペプチ ド又はその塩の投与量に換算して、通常0.01μ g/kg~2g/kg(成人)、好ましくは0.01μg/kg~200mg/kg (� �人)が挙げられる。

  3.Wntシグナル伝達の活性化方法
 前述するように、本発明のペプチド又はそ� ��塩は、ヒトを含むほ乳類動物においてWntシ� ��ナル伝達系を活性化できるので、Wntシグナ� ��伝達系の活性化方法に使用することができ� ��。

 当該活性化方法は、Wntシグナル伝達系活� ��化が必要とされる患者に対して、本発明の� ��プチド又はその塩を投与することによって� ��施される。Wntシグナル伝達系活性化が必要� ��される患者としては、Wntシグナル伝達系の� ��性化によって改善乃至治療効果が期待され� ��症状又は疾患を罹患している者であり、そ� ��具体例については上記「2.医薬製剤」の欄� �記載の通りである。

 また、当該活性化方法において、本発明� ��ペプチド又はその塩の投与は、上記医薬製� ��を使用すればよく、投与形態、投与量等に� ��いても、上記「2.医薬製剤」の欄に記載の� �りである。

  4.神経幹細胞の分化誘導方法
 本発明のペプチド又はその塩は、上記Wntシ� ��ナル伝達系活性化効果に基づいて、特に、� ��経幹細胞を効率的に神経細胞に分化誘導さ� ��ることができる。即ち、本発明のペプチド� ��はその塩は、神経幹細胞の分化誘導方法に� ��適に使用される。

 当該分化誘導方法は、本発明のペプチド� ��はその塩を含有する培地中で神経幹細胞を� ��養することにより実施される。

 当該化誘導方法で使用される培地として� ��、例えば、1Vol%N2-supplement、及び20ng/mLの塩基 性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含むDMEM/F12培地� ��、神経幹細胞を培養可能である培地が挙げ� ��れる。

 また、上記培地中の本発明のペプチド又� ��その塩の含有量としては、例えば、10~500μg/ mL、好ましくは50~200μg/mLが挙げられる。

 また、当該分化誘導方法は、本発明のペ� ��チド又はその塩、そのまま上記培地に配合� ��れてもよいが、アルギン酸ゲルや人工コラ� ��ゲンゲル等の生分解性基材に担持された状� ��で配合されていてもよい。後者の場合、神� ��幹細胞をより効率的に、神経細胞に分化誘� ��させることが可能になる。本発明のペプチ� ��又はその塩を生分解性基材に担持させる方� ��については、上記「2.医薬製剤」の欄に記� �の通りである。

 当該分化誘導方法は、上記培地に、神経幹� ��胞を1×10 ⁴ ~1×10 ⁶ cells/mLとなるように添加して、37℃、5%CO ₂ 条件下で、12~240時間、好ましくは24~120時間培 養することにより実施される。斯くして、神 経幹細胞を効率的に、軸索様神経突起を伸長 している神経細胞に分化誘導することができ る。