TITRE : CONJUGUÉS PEPTIDIQUES ET LEUR UTILISATION POUR PROMOUVOIR L’IMMUNOTOLÉRANCE AUX NUCLEASES CAS DANS UNE THÉRAPIE GÉNIQUE PAR INGENIERIE DU GENOME

DOMAINE DE L’INVENTION

La présente invention concerne généralement le domaine de la médecine. Plus particulièrement, elle concerne les conjugués polypeptidiques, les compositions et les méthodes pour promouvoir l’immunotolérance au système CRISPR-Cas (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromie Repeats-CRISPR associated protein), pour une thérapie génique par ingénierie du génome.

ART ANTÉRIEUR

L’immunotolérance est un état de non-réponse du système immunitaire à des substances ou des tissus qui ont la capacité de provoquer un rejet immunitaire dans un organisme sain. Elle est induite par une exposition préalable à un antigène spécifique et contraste avec l’élimination conventionnelle des corps étrangers par les mécanismes de l’immunité (innée). La tolérance immunitaire est importante pour la physiologie normale. La tolérance centrale est le principal moyen par lequel le système immunitaire apprend à distinguer le soi du non-soi. La tolérance périphérique est essentielle pour prévenir la réactivité excessive du système immunitaire à diverses entités environnementales (p. ex. allergènes, microbes intestinaux, etc.) ainsi qu’aux antigènes produits par la phagocytose des cellules mortes de l’organisme. Les déficits de tolérance centrale ou périphérique sont également à l’origine de maladies auto-immunes, entraînant des syndromes tels que le lupus érythémateux systémique, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type 1 ou la sclérose en plaques. Cependant, des découvertes récentes établissent qu’il est possible d’induire l’immunotolérance périphérique, par exemple en ciblant l’entrée d’un antigène dans les cellules présentatrices d’antigènes (APC) par un récepteur présent sur les macrophages et les cellules dendritiques (DC) à savoir, le récepteur des asialogly coprotéines des cellules dendritiques (DC-ASGPR) (Li D et aL, J Exp Med. 2012;209(l): 109-121).

Le système CRISPR-Cas de bactéries, d’archées et de grands bactériophages est un système de défense adaptatif permettant la destruction d’éléments génétiques mobiles (Makarova, KS. et al. 2020. Nat Rev Microbiol 18(2):67-83), ainsi que le développement d’outils de biotechnologie pour l’ingénierie des génomes de tous types cellulaires (Knott, GJ and Doudna, J. 2018 Science 361(6405):866-869). À cette fin, l’utilisation de différentes familles de nucléases guidées par un ARN guide, telle que les protéines Cas9 et Cas 12, permettent la reconnaissance d’une séquence ADN double brin et sa coupure à un endroit spécifique. Ainsi, les nucléases programmées par un CRISPR-RNA ou ARN guide pour la reconnaissance d’une séquence cible d’acides nucléiques sont en passe de devenir un composé moléculaire biotechnologique des plus efficaces pour le génie génétique et la thérapie génique pour l’édition de gènes ou le contrôle de l’expression des gènes (F. A. Ran étal., Nature 520, 186-191 (2015) ; (Knott, GJ and Doudna, J. 2018 Science 361(6405):866-869). Les nucléases Cas coupent l’ADN sur une séquence cible précise, guidée par la reconnaissance d’homologie entre l’ARN guide et un site chromatinien. Le mécanisme de réparation de l’ADN permet alors de modifier une séquence de gènes, dans un but thérapeutique (F. A. Ran et al., Nature 520, 186-191 (2015)). En outre, certains mutants de nucléases Cas peuvent agir comme une nickase, ou perdre entièrement leur activité de nucléase et assumer d’autres fonctions comme pour la modification chimique de l’ADN ou la transcription de gènes (Knott, GJ and Doudna, J. 2018 Science 361(6405):866-869). Comme les systèmes CRISPR-Cas permettent une édition génétique précise dans les cellules eucaryotes, il ouvre de réelles perspectives de réparation et d’expression génique in vivo et permet d’envisager la guérison de maladies génétiques ou acquises aujourd’hui incurables. Ainsi, un premier essai de phase Eli a été lancé, utilisant le transfert du gène Cas9 dans des cellules photoréceptrices de la rétine avec un vecteur viral AAV, pour réparer un gène RPE65 mutant causant l’amaurose congénitale de Leber (A. Mullard, Nat. Rev. Drug Discov. 18, 656-656 (2019)). Par ailleurs, d’autres protocoles cliniques de réparation génique par édition de bases nucléotidiques in vivo se profilent pour introduire un changement de base par une protéine Cas mutante à activité nickase pour le traitement d’une hyperlipidémie ou de la drépanocytose par modification des gènes Pcsk9 ou de l’hémoglobine, respectivement (Ledford, H. Nature 2022). Enfin, d’autres applications cliniques deviennent également possibles avec l’utilisation de protéines Cas sans activité protéase, mais fusionnées à un domaine capable de moduler directement la transcription de gènes cibles (Jensen, TI. 2021 Genome Res. 31(11):2120-2130), ou à un domaine enzymatique pouvant modifier la méthylation de T ADN d’un locus et abolir ou activer durablement son expression (Pulecio, J. 2017. Cell Stem Cell 21(4):431-447).

Néanmoins, l’utilisation de nucléases Cas en médecine, pour la modification génétique d’organes in situ, est entravée par la perspective d’une mutagenèse à la suite d’une activité hors cible de Cas, ou au rejet immunitaire des cellules exprimant cette protéine bactérienne (C. T. Charlesworth, et al., Nat. Med. 25, 249-254 (2019)). Pour réduire la mutagenèse hors cible par Cas, des variantes de haute-fidélité, de Cas9 et de Casl2 ont été développées (B. P. Kleinstiver, et al., Nature 529, 490-495 (2016) — I. M. Slaymaker, étal, Science 351, 84-8 (2016) ; Xiaoshu Xu, Augustine Chemparathy, et al. 2021. Mol Cell 81(20):4333-4345.e4 ; Pausch, P. Soczek, KM. 2021 Nat Struct & mol biol 28(8):652-661 ; Tsuchida, CA. Zhang, S. 2022 Mol Cell 82(6): 1199-1209. e6). Toutefois, l’usage des protéines Cas en médecine pose un problème majeur d’immunogénicité, car environ 80% de la population présente une immunité humorale et cellulaire contre les orthologues Cas9 de S. pyogènes et S. aureus, qui sont des commensaux humains communs (C. T. Charlesworth, et al, Nat. Med. 25, 249-254 (2019)). Le risque de rejet immunitaire n’est donc pas négligeable et avec lui l’échec de la thérapie génique basée sur le système CRISPR-Cas. Cela soulève des inquiétudes légitimes quant à l’utilisation de Cas en thérapie génique, puisque les immunisations précédentes compromettent fortement l’efficacité de l’édition du génome in vivo chez les patients immunocompétents. Quand bien même cet inconvénient pourrait être réduit via l’usage ponctuel et éphémère de protéines Cas rarement en contact avec les humains, en cas de seconde administration ou d’une expression durable de celles-ci, le problème ci-dessus ne serait pas résolu pour autant.

BREF APERÇU DE L’INVENTION

Face à ce défi majeur de pouvoir promettre une thérapie génique in vivo sûre et efficace, l’inventeur a créé de nouveaux conjugués polypeptidiques, des compositions et des méthodes capables d’induire une tolérance immunitaire à la protéine Cas, en particulier Cas9, dans l’organisme des mammifères. Grâce à ces outils, il est désormais possible de prévenir le rejet immunitaire des cellules de l’organisme exprimant une protéine Cas et de l’associer à une expression génétique transitoire, inductible ou durable de la protéine Cas. Par conséquent, l’augmentation de la tolérance immunitaire à la protéine Cas devrait jeter les bases de protocoles sûrs et efficaces de réparation génique ou de contrôle de l’expression génique par le système CRISPR-Cas chez l’Homme.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

CONJUGUÉS POLYPEPTIDIQUES

Selon un premier aspect de l’invention, celle-ci a de manière générale pour objet un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines présents sur les APC (anti-APC- ASGPR), ou un fragment de celui-ci, liés de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas, en particulier une protéine Cas9, notamment celle de Staphylococcus aureus (saCas9). Le conjugué polypeptidique de l’invention ayant la capacité d’induire une tolérance immunitaire à la protéine Cas, dans l’organisme des primates, un mode de réalisation de l’invention concerne un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti -cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines des APC (anti-APC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l’épitope reconnu par l’anticorps complet, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant capable d’induire une tolérance immunitaire à la protéine Cas dans l’organisme des mammifères, et en particulier dans l’organisme des primates et de l’Homme.

Au vu de ce qui précède, on comprend également que selon un mode de réalisation particulier l’invention concerne un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines des APC (anti-APC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l’épitope reconnu par l’anticorps complet, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas9, ledit conjugué polypeptidique étant capable d’induire une tolérance immunitaire à la protéine Cas9 dans l’organisme des mammifères, et en particulier dans l’organisme des primates et de l’Homme. Par « protéine Cas », on entend de manière générale la CRISPR associated protein (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated protein) et par « protéine Cas9 », on entend la CRISPR associated protein 9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats associated protein 9). Ces dernières correspondent aux nucléases du système CRISPR- Cas qui constitue un mécanisme de défense adaptatif procaryote pour détruire l’ADN étranger envahissant. Une grande diversité de systèmes CRISPR-Cas existe parmi les bactéries et les archées, voire au sein d’une même espèce. Cela implique une divergence dans l’homologie des séquences, l’organisation et la taille des gènes et des protéines constituant le système CRISPR- Cas et leur capacité à cliver de l’ADN, de l’ARN, simple brin ou double brin. Néanmoins, les différents éléments des systèmes CRISPR-Cas et leur logique fonctionnelle sont similaires dans tout le règne Procaryota.

Le système CRISPR-Cas est composé d’une famille de séquences présentes dans le génome des bactéries, des archées et des grands bactériophages qui correspondent à des gènes assurant les fonctions d’adaptation, de maturation de l’ARNrc et d’interférence. Pour interférer avec l’expression et la réplication de l’ADN ou l’ARN étranger, l’hôte exprime un gène de nucléase Cas, le motif de séquence de l’ADN ou de l’ARN exogène, acquis au cours de rencontres précédentes entre les bactéries et des phages, des plasmides ou des éléments génétiques mobiles, qui code l’ARNrc non codant, et une séquence exprimant l’ARNrc transactivant (ARNrctra). L’ARNrc et l’ARNrctra transformés forment un ARN guide duplex (ARNg) qui guide la nucléase Cas vers une séquence d’ADN cible pour le clivage double brin. La coupure de l’ADN est limitée par un motif d’ADN adjacent, appelé protospacer adjacent motif (P AM), qui est spécifique à chaque système CRISPR-Cas.

Ce cadre fonctionnel a été depuis détourné de sa fonction initiale d’immunité procaryote et est aujourd’hui appliqué en biotechnologie pour le ciblage, le traitement, la modification, la destruction et la réparation programmée de gènes. A ce jour, plusieurs protéines Cas (Cas9, Casl2a, Casl2b, CasX ou Casl2e, Casl2f ou Casl4, Casl2j ou Cas®) provenant de différents hôtes ont été identifiées et caractérisées, voire modifiées (p. ex. amélioration de leur fonction), lesquelles peuvent être mises en œuvre par l’invention, pour l’ingénierie des génomes de mammifères. De manière générale, les protéines Cas mentionnées ci-dessus ont des tailles décroissantes de 1 500 acides aminés (AA) pour Cas9, 1 000 AA pour Casl2a et inférieur à 1 000 AA pour CasX, Casl2f et Casl2j. On comprend donc que selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi :

- les nucléases Cas9, Cas 12a, Cas 12b, CasX ou Cas 12e, CRISPR de type V, Cas 12j ou Cas® ;

- les orthologues Cas9, Cas 12a, Cas 12b, CasX ou Cas 12e, CRISPR de type V, Cas 12j ou Cas® ; et

- les mutants ou les variants fonctionnels Cas9, Casl2a, Casl2b, CasX ou Casl2e, CRISPR de type V, Cas 12j ou Cas®.

Par « nucléases Cas9 », on entend en particulier celles de S. pyogènes, S. aureus, C. diphtheriae, N meningitidis, S. canis, S. macacae, F. tularensis, Acidaminococcus, C. jejuni, S. pneumoniae et S. thermophilus. Plus particulièrement encore, il est question des Cas9 de séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et les mutants de celles-ci. Au vu de ce qui précède, on comprend que selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est une portéine Cas9 choisie parmi :

- les nucléases Cas9 de S. pyogenes, S. aureus, C. diphtheriae, N meningitidis, S. canis, S. macacae, F. tularensis, Acidaminococcus, C. jejuni, S. pneumoniae et S. thermophilus ; et

- les orthologues Cas9 et les mutants ou les variants fonctionnels Cas9 dérivés de ces organismes, et en particulier ladite protéine Cas9 est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et les mutants de celles-ci.

Par « nucléases Cas 12a (Cpfl) », on entend en particulier celles de Lachnospiraceae bacterium ou Acidaminococcus sp, sauvage ou améliorée portant les mutations E174R/S542R ou E174R/S542R/K548R. Plus particulièrement encore, il est question des Casl2a de séquences SEQ ID NOs : 105 et 106, et les mutants de celles-ci.

Par « nucléases Casl2b », on entend en particulier celles dérivées de Alicyclobacillus kakegawensis (AkCasl2b) ou de Bacillus hisashii (BhCasl2b), et une version mutante améliorée pour l’édition génique de BhCasl2b (K846R/ S893R/E837G). Plus particulièrement encore, il est question de la Cas 12b de séquence SEQ ID NO : 107 et les mutants de celle-ci. Par « nucléases CasX ou Casl2e », on entend en particulier celles dérivées de Deltaproteobacteria (DpbCasX) ou de Planctomycetes (PlmCasX), sauvage ou désactivée par les mutations N672A, E769A et N935A, ou améliorées pour l’édition génique en cellules de mammifères telles que les versions DpbCasX_R3 V2 ou PlmCasX Rl V2. Plus particulièrement encore, il est question des Casl2e de séquences SEQ ID NOs : 112 et 113, et les mutants de celles-ci.

Par « nucléases CRISPR de type V », sont désignées des nucléases ayant une taille réduite (400 à 700 AA) par rapport aux nucléases Cas9, Casl2a et CasX. Il s’agit notamment des protéines Casl2f (ou Cas 14) d’archées non cultivées (UnlCasl2fl), de Syntrophomonas palmitatica (SpCasl2fl) ou d’ Acidibacillus sulfuroxidans (AsCasl2fl), soit sauvages ou portant une ou plusieurs mutations abolissant l’activité catalytique (D225A et E324A) ou partiellement conduisant à l’obtention d’une nickase (R383A et D401 A). Plus particulièrement encore, il est question des Casl2f ou Cas 14 de séquences SEQ ID NOs : 108 à 111 et les mutants de celles- ci.

Par « nucléases Cas 12j ou CasP », on entend en particulier celles du clade de Biggiephage qui est aussi une CRIPR-Cas de type V.

Au vu de ce qui précède, on comprend également que selon un autre mode de réalisation l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi :

- les nucléases Cas9, Cas 12a, Cas 12b, CasX ou Cas 12e, CRISPR de type V (Casl2f ou Cas 14), Cas 12j ou Cas® ;

- les orthologues Cas9, Cas 12a, Cas 12b, CasX ou Cas 12e, CRISPR de type V (Casl2f ou Cas 14), Cas 12j ou Cas® ; et

- les mutants ou les variants fonctionnels Cas9, Casl2a, Casl2b, CasX ou Casl2e, CRISPR de type V (Casl2f ou Cas 14), Cas 12j ou Cas®, et en particulier ladite protéine Cas est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et 105 à 113, et les mutants de celles-ci.

Par « orthologues », on entend des protéines Cas similaires présentes chez deux ou plusieurs espèces différentes. Par « mutants », on entend une protéine Cas dans laquelle ont été introduites une ou plusieurs mutations parmi lesquelles on retrouve la délétion, la substitution et/ou l’ajout d’un ou plusieurs acides aminés. Ces dernières peuvent soit accroître ou abolir l’activité nucléase, soit augmenter ou diminuer la fidélité de reconnaissance de l’ADN cible.

Par « mutants fonctionnels », on entend des protéines Cas modifiées par la main de l’Homme (p. ex. par génie génétique), afin, /?, ex., d’accroître l’activité de la Cas.

Par « variants fonctionnels », on entend des protéines Cas modifiées naturellement par le biais de l’évolution, lesquelles présentent, /?, ex., une activité accrue (ou diminuée).

En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi :

- les nucléases Cas9 de S. pyogènes, S. aureus, C. diphtheriae, N. meningitidis, S. canis, S. macacae, F. tularensis, Acidaminococcus, C. jejuni, S. pneumoniae et S. thermophilus , ' les nucléases Caslla de Lachnospiraceae bacterium et Acidaminococcus sp , ' les nucléases Casllb de Alicyclobacillus kakegawensis et de Bacillus hisashii , ' les nucléases CasX ou Cas 12e de Deltaproteobacteria et de Planctomycetes , ' les nucléases CRISPR de type V de Syntrophomonas palmitatica et d’ Acidibacillus sulfuroxidans , ' les nucléases Cas 12j ou Cas® du clade de Biggiephage , -

- les orthologues Cas9, Cas 12a, Cas 12b, CasX ou Cas 12e, CRISPR de type V, Cas 12j ou Cas® dérivés de ces organismes ; et

- les mutants ou les variants fonctionnels Cas9, Casl2a, Casl2b, CasX ou Casl2e, CRISPR de type V, Cas 12j ou Cas® dérivés de ces organismes, et en particulier ladite protéine Cas est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et 105 à 113, et les mutants de celles-ci.

En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et 105 à 113, et les mutants de celles-ci. En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas9 est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et les mutants de celles-ci. Plus particulièrement encore, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 et 113.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ladite protéine Cas est choisie parmi :

- les nucléases Cas9 de S. pyogènes, S. aureus, C. diphtheriae, N meningitidis, S. canis, S. macacae, F. tularensis, Acidaminococcus, C. jejuni, S. pneumoniae et S. thermophilus ;

- les nucléases Casl2a de Lachnospiraceae bacterium, Casl2b de Bacillus hisashii, Casl2f (Cas 14) d’ Archée non cultivée et Cas 12j (Cas®) du clade de Baggiephage ; et

- les orthologues Cas9, Cas 12a, Cas 12b Casl2f et Casl2j, et les mutants ou les variants fonctionnels Cas9, Casl2a, Casl2b, Casl2f et Casl2j dérivés de ces organismes, et en particulier ladite protéine Cas est choisie parmi les séquences SEQ ID NOs : 87 à 95 et 105 à 113, et les mutants de celles-ci.

Par exemple, il existe des mutants (variants) de la Cas9 de S. pyogènes (spCas9), dont une séquence représentative est la séquence SEQ ID NO : 87, dans lesquels sont modifiés des acides aminés à des positions particulières, abolissant l’activité des nucléases et augmentant la fidélité de la reconnaissance de la séquence d’ADN cible. Ces mutations peuvent être les suivantes : substitution des acides aminés D10, E762, D839, H840, H863, H983 et/ou D986 par un acide aminé différent tel que l’alanine ou par tout autre acide aminé autre que l’acide aminé natif, ce qui réduit, élimine sensiblement ou supprime l’activité des nucléases. D’autres substitutions d’acides aminés peuvent augmenter la spécificité de la reconnaissance de la séquence d’ADN cible, diminuant ainsi la liaison hors cible à d’autres séquences d’ADN présentant une certaine homologie avec celle qui est ciblée. S’agissant des spCas9, ces mutations peuvent être présentes à une, deux, trois, quatre, cinq, six et/ou aux sept positions suivantes : L169, Y450, N497, R661, Q695, Q926 et/ou DI 135, lesquelles donnent naissance à ce que l’on appelle une Cas9 de haute- fidélité (hifi spCas9) (Kleinstiver, BP et al., Nature. 2016;529(7587):490-495). Il a également été démontré que d’autres mutations différentes augmentent la spécificité des spCas9, il s’agit des substitutions des acides aminés K855, K810/K1003/R1060 ou K848/K1003/R1060 par l’alanine (I. M. Slaymaker, étal, Science 351, 84-8 (2016)). Enfin, une autre série de mutations de spCas9 augmentent également de manière significative la précision de la liaison de spCas9 à la séquence d’ADN cible ; celles-ci associent les substitutions N692A, M694A, Q695A et H698A, et constituent l’HyppaCas9 hyperprécise (Chen, JS étal., Nature. 2017;550(7676):407- 410). De plus, toutes les mutations qui abolissent l’activité catalytique de la spCas9 peuvent être associées à cette spécificité croissante de la reconnaissance des séquences d’ADN.

De même, il existe des mutants (variants) de la Cas9 de S. aureus (saCas9), dont une séquence représentative est la séquence SEQ ID NO : 88, dans lesquels des changements d’acides aminés, D10A ou N580A, désactivent respectivement les domaines de nucléase RuvC et HNH, et convertissent la saCas9 en une nickase (Friedland, AE et al., Genome Biol. 2015;16:257). La saCas9 de haute-fidélité quant à elle peut être obtenue par mutagenèse et les mutations Y211 A, Y212A, W229A, Y230, R245A, T392A, N413A, N419A, Y651A, R654A, seules ou combinées, favorisant des ratios on/off-target plus élevées que le saCas9 de type sauvage (Tan, Y et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2019; 116(42):20969-20976). De plus, les triples mutants E782K/N968K/R1015H et E782K/K929R/R1015H de la saCas9, présentent une reconnaissance de site plus large, car ils peuvent couper une séquence suivie d’un PAM plus simple "NNNRRT", au lieu du motif "NNGRRT". Enfin, les combinaisons des mutations susmentionnées peuvent permettre d’obtenir des améliorations fonctionnelles mixtes comme une nucléase ou une nickase saCas9 haute-fidélité avec une reconnaissance PAM plus large.

Par ailleurs, il existe dans la nature des organismes codant des nucléases Cas plus petites que les Cas9, Casl2a (Cpfl) ou Casl2b (1 000-1 500 AA). C’est le cas des nucléases CasX ou Casl2e (inférieure à 1 000 AA), des Casl2f ou Casl4 (400-700 AA) et des Casl2j ou Cas(|) (700-800 AA), offrant un réservoir naturel de Cas compactes permettant l’ingénierie efficace de cellules de mammifères (Tsuchida, CA, et al. 2022 Mol. Cell. 82(6): 1199-1209. e6 ; Do Yon Kim, et al. 2022, Nature Biotechnology. 40(l):94-102 ; Wu Zhaowei, et al. 2021 Nat. Chem. Biol. 17(11): 1132-1138 ; Xu X, Chemparathy A, et al. Mol Cell. 2021 Oct 21;81(20):4333- 4345. e4. ; Pausch P, et al Science. 2020 Jul 17;369(6501):333-337.). Les nucléases CasX telles que celles dérivées de Deltaproteobacteria (DpbCasX) ou de Planctomycetes (PlmCasX), dans leur version sauvage, ou améliorées pour l’édition génique telles que les versions DpbCasX-R3 (DpbCasX chimérique contenant la boucle R3 de PlmCasX), ou PlmCasX-Rl (PlmCasX chimérique contenant la boucle RI de DpbCasX), ou encore les versions désactivées de CasX par les mutations N672A, E769A and N935A seules ou combinées, permettent une ingénierie programmée des cellules de mammifères de façon efficace, soit pour induire des cassures de l’ADN ou pour moduler l’expression de gènes cibles ((Tsuchida, CA, et al. 2022 Mol. Cell. 82(6): 1199-1209. e6 ; Do Yon Kim, et al. 2022, Nature Biotechnology. 40(l):94-102 ; Liu, Jun- Jie, et al. 2019 Nature. 566(7743):218-223). Les nucléases Casl2f Les nucléases CRISPR de type V ont une taille réduite (400 à 700 AA) par rapport aux nucléases Cas9, Casl2a et CasX ; il s’agit par exemple des protéines Casl2f (ou Cas 14) d’archées non cultivées (UnlCasl2fl), de Syntrophomonas palmitatica (SpCasl2fl) ou d’Acidibacillus sulfuroxidans (AsCasl2fl), soit sauvages ou portant une ou plusieurs mutations abolissant complètement l’activité catalytique de la nucléase Casl2f (D225A et E324A pour Uni Cas 12fl, ou D326A et/ou D510A pour UnlCasl2fl), ou abolissant partiellement l’activité nucléase conduisant à l’obtention d’une nickase (R383A et D401A pour AsCasl2fl) (Do Yon Kim, et al. 2022, Nature Biotechnology. 40(l):94-102 ; Wu Zhaowei, et al. 2021 Nat. Chem. Biol. 17(11): 1132-1138 ; Xiaoshu Xu et al. 2021 Mol Cell. 81(20):4333-4345.e4). Ainsi, les mutants catalytiques de Casl2f peuvent être fusionnés à des domaines activateurs ou inhibiteurs de la transcription afin de programmer la protéine Casl2f pour l’expression ciblée de certains gènes cellulaires, mais aussi à un domaine enzymatique d’un éditeur de base ou de la deoxyadénosine déaminase permettant la transformation de bases A ou T en G ou C de façon ciblée, pour la réparation ou l’introduction de mutations ponctuelles dans le génome d’une cellule de mammifère (Do Yon Kim, et al. 2022, Nature Biotechnology. 40(l):94-102 ; Xiaoshu Xu et al. 2021 Mol Cell. 81(20):4333-4345.e4). La nucléase Casl2j ou Cas® de bactériophage est capables d’introduire une coupure double brin sur une séquence ADN reconnue par un ARN guide. La vitesse de cette coupure peut être accélérée environ 20 fois par des mutations introduites dans l’hélice a 7 (E159A, S160A, S 164 A, D167A, El 68 A) ou la substitution d’un fragment chargé négativement par une courte succession de glycines-sérines (Pausch, P. et al. 2021, Nature Structural & molecular biology. 28(8):652-661).

De manière générale, l’invention peut donc avoir pour objet un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines (anti-APC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées.

Par « cellule présentatrice d’antigène », abrégée APC (antigen-presenting cell), on entend une cellule du système immunitaire qui présente des parties d'éléments cellulaires à des lymphocytes T. Il peut s’agir de monocytes, de macrophages, de lymphocytes B ou de cellules dendritiques. En particulier, il s’agit de cellules dendritiques (DC). Aussi et selon un mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule dendritique qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines (anti-DC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas.

Par « récepteur des asialoglycoprotéines », abrégé ASGPR et également appelé CLEC10A, on entend un récepteur de lectine de type C (CLR) exprimé sur les cellules présentatrices d’antigène (p. ex. cellules dendritiques humaines (DC)). Les CLR permettent aux APC de capturer et d’internaliser des antigènes, en particulier des antigènes glycosylés, ce qui permet leur traitement ultérieur et leur présentation sur des molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH). En outre, plusieurs CLR, y compris l’ ASGPR, peuvent initier des cascades de signalisation et moduler la fonction des cellules dendritiques, avec des conséquences sur la réponse immunitaire induite. Contrairement aux autres CLR associées à Syk, l’ASGPR activé n’induit pas d’activation de NF-KB, mais conduit plutôt à la phosphorylation de CREB (Gu C étal., J Immunol. 2019;203(2):389-399).

Ainsi, la cascade de signalisation de l’ASGPR activé entraîne l’activation de Syk, PLCy2, PKCô puis MAPK ERK 1/2 et JNK, ce qui conduit, lorsque la stimulation est prolongée, à la phosphorylation de p90RSK et de CREB, induisant la transcription de la cytokine antiinflammatoire IL-10, qui est un résultat terminal particulier de l’endocytose d’un antigène par le DC-ASGPR.

Par « anticorps », on entend une immunoglobuline, protéine multimérique constituée de 4 chaînes participant à la réponse immunitaire acquise. Les immunoglobulines sont bien connues de l’homme de métier et sont constituées d’un assemblage de deux dimères constitués chacun d’une chaîne lourde et d’une chaîne légère. Le complexe multimérique assemblé par la liaison d’une chaîne légère et d’une chaîne lourde par un pont disulfure entre deux cystéines, les deux chaînes lourdes étant également reliées entre elles par deux ponts disulfures.

Chacune des chaînes lourdes et des chaînes légères est constituée d’une région constante et d’une région variable. L’assemblage des chaînes qui composent un anticorps permet de définir une structure tridimensionnelle caractéristique en Y, où,

- la base du Y correspond à la région constante Fc qui est reconnue par le complément et les récepteurs Fc, et - l’extrémité des bras du Y correspondent à l’assemblage respectif des régions variables, de la chaîne légère et de la chaîne lourde.

Plus précisément, chaque chaîne légère est constituée d’une région variable (VL) et d’une région constante (CL). Chaque chaîne lourde est constituée d’une région variable (Vu) et d’une région constante constituée de trois domaines constants CHI, CH2 et CH3. Les domaines CH2 et CH3 composent le domaine Fc.

La région variable de la chaîne légère est constituée, de trois régions déterminant la reconnaissance de l’antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes. La région variable de la chaîne lourde est également constituée de trois régions déterminant la reconnaissance de l’antigène (CDR) entourées de quatre domaines charpentes. Le repliement tridimensionnel de ces régions variables est tel que les 6 CDR sont exposés du même côté de la protéine et permettent la formation d’une structure spécifique reconnaissant un antigène déterminé.

Les anticorps décrits dans l’invention sont isolés et purifiés, peuvent appartenir à n’importe quel isotype/classe (e.g. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA et IgY) ou à une sous-classe (p. ex. IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl et IgA2) et sont différents des anticorps naturels. Ces anticorps sont matures, c’est-à-dire qu’ils possèdent une structure tridimensionnelle ad hoc leur permettant de reconnaître l’antigène, et possèdent toutes les modifications /wV-traductionnelles essentielles à leur reconnaissance antigènique, notamment la glycosylation et la formation de ponts disulfures intra et intermoléculaires.

Il s’agit plus particulièrement d’« anticorps monoclonaux », c’est-à-dire qu’ils ne reconnaissent qu’un seul déterminant antigènique du DC-ASGPR, contrairement aux anticorps polyclonaux qui correspondent à un mélange d’anticorps, et donc peuvent reconnaître plusieurs déterminants antigèniques d’une même protéine.

Par «fragment de celui-ci », on désigne toute partie de l’anticorps selon l’invention qui conserve la capacité de se lier à l’épitope reconnu par l’anticorps complet. Des exemples de tels fragments incluent, sans s’y limiter, Fab, Fab’ et F(ab’)2, Fd, les Fv à chaîne unique (scFv), les anticorps à chaîne unique, les Fv liés par un pont disulfure (dsFv) et des fragments comprenant la région VL OU VH. Les fragments se liant à l’épitope, y compris les anticorps à chaîne unique, peuvent comprendre la ou les régions variables seules ou en combinaison avec l’intégralité ou une partie des éléments suivants : région charnière, domaines CHI, CH2 et CH3. De tels fragments peuvent contenir un ou les deux fragments Fab ou le fragment F(ab’)2. En outre, les fragments peuvent être ou peuvent combiner des membres de l’une quelconque des classes d’immunoglobulines suivantes : IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE et leurs sous-classes.

Les fragments Fab et F(ab’)2 peuvent être produits par clivage protéolytique, en utilisant des enzymes telles que la papaïne (fragment Fab) ou la pepsine (fragment F(ab’)2). Les fragments « Fv à chaîne unique » (« scFv ») sont des fragments se liant à un épitope qui contiennent au moins un fragment d’une région variable (VH) d’anticorps liée à au moins un fragment d’une région variable (VL) d’anticorps à chaîne légère. Le linker peut être un peptide court et flexible choisi pour assurer que le repliement correct en trois dimensions des régions VL et VH se produise une fois qu’elles sont liées, de manière à maintenir la spécificité de liaison à la molécule cible de l’anticorps entier à partir duquel le fragment d’anticorps à chaîne unique est dérivé. L’extrémité carboxyle de la séquence VL OU VH peut être liée de manière covalente par un agent de liaison à l’extrémité aminoacide d’une séquence VL OU VH complémentaire.

Aussi, par « anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines des APC (anti-DC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci », on entend des protéines capables de reconnaître spécifiquement le DC-ASGPR. Parmi eux, sept anticorps monoclonaux reconnaissant le DC-ASGPR humain peuvent être cités : le 49C11, le 49C1 I bis, le lHl l, le 5F10, le 4G2.2, le 6.3H9.1Dl l et le 5H8.1D4.

Par anticorps « 49C11 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 10, laquelle est une construction synthétique comprenant : o la région variable murine ciblant le DC-ASGPR humain de séquence SEQ ID NO : 4 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une protéine de fusion avec la région constante de la chaîne lourde de l’IgG4 humaine ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 25, laquelle est une construction synthétique comprenant : o la région variable murine ciblant le DC-ASGPR humain de séquence SEQ ID NO : 19 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ; et o une protéine de fusion avec la région constante de la chaîne Kappa de l’IgG4 humaine.

À partir de l’anticorps 49C11 ci-dessus 5 variants ont également été développés à savoir :

- le 49Cl l_varl comprenant : o une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 11 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 5 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 26 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 20 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ;

- le 49C1 l_var2 comprenant : o une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 12 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 6 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 27 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 21 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ;

- le 49Cl l_var3 comprenant : o une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 13 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 7 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 28 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 22 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ;

- le 49C1 l_var4 comprenant : o une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 14 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 8 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 29 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 23 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ; et

- le 49C1 l_var5 comprenant : o une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 15 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 9 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 30 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 24 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18.

Par anticorps « 49C11 bis », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 32 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 31 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 34 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 33 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18.

Par anticorps « 1H11 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 39 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 38 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 35, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 36 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 37 ; et - une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 44 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 43 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 40, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 41 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 42.

Par anticorps « 5F 10 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 49 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 48 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 45, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 46 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 47 ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 54 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 53 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 50, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 51 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 52.

Par anticorps « 4G2.2 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 59 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 58 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 55, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 56 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 57 ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 64 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 63 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 60, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 61 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 62.

Par anticorps « 6.3H9.1D11 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 69 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 68 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 65, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 66 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 67 ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 74 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 73 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 70, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 71 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 72. Par anticorps « 5H8.1D4 », on entend un anticorps comprenant :

- une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 79 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 78 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 75, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 76 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 77 ; et

- une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 84 comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 83 comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 80, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 81 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 82. En résumé de ce qui précède, ledit anti-DC-ASGPR selon un mode de réalisation particulier de l’invention possède les séquences suivantes :

Tableau 1. Anti-DC-ASGPR & séquences correspondantes

On comprend donc que selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialogly coprotéines des cellules présentatrices d’antigènes (anti-DC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci capable de se lier à l’épitope reconnu par l’anticorps complet, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant capable d’induire une tolérance immunitaire à la protéine Cas dans l’organisme des mammifères en particulier dans l’organisme des primates et de l’ Homme, et ledit anti-DC-ASGPR étant choisi parmi :

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 1, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 2 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 3 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 16, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 17 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 18 ;

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 35, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 36 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 37 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 40, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 41 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 42 ;

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 45, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 46 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 47 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 50, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 51 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 52 ;

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 55, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 56 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 57 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 60, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 61 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 62 ;

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 65, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 66 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 67 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 70, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 71 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 72 ; et

- un anticorps comprenant : o une chaîne lourde comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 75, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 76 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 77 ; et o une chaîne légère comprenant de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C- terminale le CDR1 de séquence SEQ ID NO : 80, le CDR2 de séquence SEQ ID NO : 81 et le CDR3 de séquence SEQ ID NO : 82.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-DC-ASGPR est choisi parmi :

- un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 31 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 33 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 38 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 43 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 48 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 53 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 58 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 63 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 68 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 73 ; et un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 78 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 83.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-DC-ASGPR est choisi parmi :

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 32 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 34 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 39 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 44 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 49 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 54 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 59 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 64 ;

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 69 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 74 ; et

- un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 79 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 84.

Sur ce point et s’agissant des séquences en lien avec les anticorps 49C11, 49Cl l_varl, 49Cl l_var2, 49Cl l_var3, 49Cl l_var4, 49Cl l_var5 et 49Cl l_bis, les chaînes lourdes et légères partageant respectivement les mêmes CDR (cf Tableau 1), il est possible de les interchanger pour développer de nouveau anticorps. Aussi et par l’expression « un anticorps comprenant une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 31 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 33 », on entend aussi bien l’anticorps comprenant :

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 4 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 19 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 5 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 20 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 6 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 21 ; - une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 7 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 22 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 8 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 23 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 9 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 24 ; et

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 31 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 33 ; que l’anticorps, par exemple, comprenant :

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 4 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 20 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 7 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 19 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 6 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 24 ;

- une chaîne lourde comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 6 et une chaîne légère comprenant la région variable de séquence SEQ ID NO : 33 ;

- etc.

De manière équivalente, par l’expression « un anticorps comprenant une chaîne lourde de séquence SEQ ID NO : 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 32 et une chaîne légère de séquence SEQ ID NO : 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou 34 », on entend aussi bien un anticorps comprenant les chaînes lourde et légère de séquences respectives SEQ ID NOs : 10 et 25, 11 et 26, 12 et 27, 13 et 28, 14 et 29, 15 et 30 ou 32 et 34, qu’un anticorps comprenant les chaînes lourde et légère de séquences respectives SEQ ID NOs : 10 et 30, 10 et 29, 13 et 25, 14 et 26, etc.

De manière générale, l’invention peut donc également avoir pour objet un conjugué polypeptidique comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialogly coprotéines (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci- dessus, ou un fragment de celui-ci tel que décrit ci-dessus, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées. Par « lié de manière covalente », on entend que le conjugué polypeptidique de l’invention peut être lié par covalence, c’est-à-dire que les premier et deuxième composants sont liés par une liaison covalente (avec ou sans linker), également appelée liaison moléculaire, qui est une liaison chimique forte qui implique le partage de paires d’électrons entre les atomes desdits premiers et deuxièmes composants. L’invention a donc pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-DC-ASGPR est lié de manière covalente à ladite protéine Cas. En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel l’anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci-dessus est lié de manière covalente par l’intermédiaire de sa chaîne lourde à un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées. A titre d’exemple et sur la base de l’anticorps 49Cl l_bis, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus comprenant les séquences SEQ ID NO : 102 (chaîne lourde du 49C1 I bis de séquence SEQ ID NO : 32 liée de manière covalente à son extrémité C-terminale à la saCas9 de séquence SEQ ID NO : 89) et 34 (chaîne légère du 49C1 I bis). Au regard de cet exemple non limitatif, il convient de noter que l’ensemble des constructions possible à partir des anticorps décrits ci-dessus et des Cas décrites ci-dessus, que l’homme du métier est en capacité de développer, fait partie de l’invention.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-APC-ASGPR est lié de manière covalente à ladite protéine Cas, et en particulier ledit conjugué polypeptidique comprend les séquences SEQ ID NOs : 102 et 34.

Avantageusement, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-DC-ASGPR est lié de manière covalente à ladite protéine Cas grâce à un linker, notamment un linker peptidique.

Parmi les linkers qu’il soit possible d’utiliser, c.-à-d. des petites molécules ou des petits peptides utilisés pour lier l’ anti-DC-ASGPR et la protéine Cas, lesquels peuvent incorporer des sites de glycosylation ou introduire une structure secondaire particulière, il convient de noter que certains augmentent l’efficacité de l’expression ou la stabilité de la protéine de fusion et, par conséquent, l’efficacité de celle-ci. Aux fins de l’invention, il convient de noter que les linkers peptidiques suivant sont utilisés sans toutefois s’y limiter :

- QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO : 96) ; - SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO : 97) ;

- PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO : 98) ;

- TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO : 99) ; et

- TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO : 100).

Aussi et selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit linker peptidique est choisi parmi :

- QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO : 96) ;

- SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO : 97) ;

- PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO : 98) ;

- TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO : 99) ; et

- TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO : 100).

En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel l’anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines des APC (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci-dessus est lié de manière covalente par l’intermédiaire de sa chaîne lourde à un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées via un linker peptidique. A titre d’exemple et sur la base de l’anticorps 49Cl l_bis, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci- dessus comprenant les séquences SEQ ID NOs : 101 (chaîne lourde du 49Cl l_bis de séquence SEQ ID NO : 32 liée de manière covalente à son extrémité C-terminale au linker de séquence SEQ ID NO : 96 lié de manière covalente à la Cas9 de séquence SEQ ID NO : 89) et 34 (chaîne légère du 49Cl l_bis). Au regard de cet exemple non limitatif, il convient de noter que l’ensemble des constructions possible à partir des anticorps décrits ci-dessus et des Cas décrites ci-dessus, que l’homme du métier est en capacité de développer, fait partie de l’invention.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit linker peptidique est choisi parmi :

- QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNPAS (SEQ ID NO : 96) ;

- SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP (SEQ ID NO : 97) ;

- PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG (SEQ ID NO : 98) ;

- TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP (SEQ ID NO : 99) ; et

- TNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA (SEQ ID NO : 100), et en particulier ledit conjugué polypeptidique comprend les séquences SEQ ID NOs : 101 et 34. Par « lié de manière non covalente », on entend que le conjugué polypeptidique de l’invention peut également être lié de manière non covalente, c’est-à-dire que les premier et deuxième composant sont liés par des liaisons faibles, également appelées interactions non covalentes, qui n’impliquent pas le partage des électrons desdits premier et deuxième composants. En particulier, on comprend que selon un deuxième mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-APC- ASGPR est lié de manière non covalente à ladite protéine Cas.

Pour cela, il est possible de profiter d’interactions non covalentes de haute affinité connues de l’Homme du métier qui existent entre deux partenaires, telles que, sans s’y limiter, l’interaction anticorps/antigène, l’interaction récepteur/ligand, l’interaction avidine/biotine, l’interaction cohésine/dockérine et l’interaction barnase/barstar. Aussi et selon un autre mode de réalisation particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel ledit anti-DC-ASGPR est lié de manière non covalente à ladite protéine Cas grâce à des interactions à haute affinité choisies parmi :

- les interactions anticorps/antigène ;

- les interactions récepteur/ligand ;

- les interactions avidine/biotine ;

- les interactions cohésine/dockérine ; et

- les interactions barnase/barstar.

En particulier, l’invention a également pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci- dessus, dans lequel lesdites interactions à haute affinité sont des interactions cohésine/dockérine.

En particulier, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel l’anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci-dessus est lié de manière non covalente par l’intermédiaire de sa chaîne lourde à un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées. A titre d’exemple et sur la base de l’anticorps 49Cl l_bis, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus comprenant les séquences SEQ ID NOs : 103 ou 86 (chaîne lourde du 49Cl l_bis de séquence SEQ ID NO : 32 liée de manière covalente à son extrémité C-terminale à la dockérine), 34 (chaîne légère du 49C1 I bis) et 104 (Cas9 de séquence SEQ ID NO : 89 liée de manière covalente à son extrémité N-terminale à la cohésine). Au regard de cet exemple non limitatif, il convient de noter que l’ensemble des constructions possibles à partir des anticorps décrits ci-dessus, des protéines Cas décrites ci- dessus et des moyens d’interactions non covalentes de haute affinité décrits ci-dessus, que l’homme du métier est en capacité de développer, fait partie de l’invention. De la même manière, si la construction ci-dessus fait apparaître la dockérine en lien avec la composante anticorps et la cohésine en lien avec la composante Cas, il est possible de réaliser l’inverse à savoir, mettre la cohésine sur la composante anticorps et la dockérine sur la composante Cas du conjugué polypeptidique de l’invention et ce, quel que soit le moyen d’interactions non covalentes de haute affinité utilisé.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique tel que décrit ci-dessus, dans lequel lesdites interactions à haute affinité sont des interactions cohésine/dockérine, et en en particulier ledit conjugué polypeptidique comprend les séquences SEQ ID NOs : 103, 34 et 104 ou les séquences SEQ ID NOs : 85, 25 et 104.

VECTEURS

Selon un deuxième aspect de l’invention, celle-ci a pour objet un vecteur codant pour un conjugué polypeptidique de l’invention. Autrement dit, l’invention comprend dans son ensemble au moins un acide nucléique comprenant ou constitué d’une séquence codant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines des APC (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci-dessus, ou un fragment de celui-ci tel que décrit ci-dessus, et/ou un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées. Par « au moins un acide nucléique », on entend que l’invention peut comprendre deux ou trois acides nucléiques. Par exemple, l’un codant l’ anti-DC-ASGPR tel que décrit ci-dessus, ou un fragment de celui-ci tel que décrit ci-dessus, et l’autre l’une des protéines Cas susmentionnées ; ou deux codant l’ anti-DC-ASGPR tel que décrit ci-dessus (p. ex. un premier pour la chaîne légère et un second pour la chaîne lourde) et le troisième l’une des protéines Cas susmentionnées. A noter toutefois que dans sa configuration covalente, l’invention préférentiellement ne met en œuvre qu’un acide nucléique, lequel comprend ou est constitué d’une séquence codant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines (anti-DC-ASGPR) tel que décrit ci-dessus, ou un fragment de celui-ci tel que décrit ci-dessus, et un second composant qui est l’une des protéines Cas susmentionnées.

Selon ce deuxième aspect, l’invention a donc pour objet un vecteur d’expression comprenant au moins un acide nucléique tel que défini précédemment, ledit au moins acide nucléique étant sous contrôle d’éléments permettant son expression (promoteur).

Par « vecteur d’expression », on entend une molécule d’ADN (acide désoxyribonucléique) qui possède des éléments permettant sa réplication (duplication) dans au moins un organisme vivant. Ces éléments permettant la réplication sont notamment des origines de réplication de levure ou de bactéries, ou encore des éléments de contrôle de la réplication d’un virus. Les vecteurs selon l’invention sont notamment des plasmides, des phages, des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels de bactéries (BAC), les génomes modifiés de virus réplicatifs ou de virus intégratifs, etc. Certains vecteurs véhiculent un génome viral (réplicatif) ou dérivé de virus, mais dépourvu de gènes viraux (non réplicatif), ADN (acide désoxyribonucléique), ou ARN (acide ribonucléique). Les génomes ARN peuvent être rétrotranscrits en ADN par une transcriptase inverse rétrovirale ou directement traduits par la machinerie cellulaire. Les génomes viraux ou dérivés de virus, ADN ou ARN, peuvent être encapsidés dans une structure protectrice de protéines virales et de membranes cellulaires. Ces particules recombinantes de virus ou dérivées de virus permettent la transduction de cellules cible pour l’expression d’une protéine Cas ou de l’anti-CD-ASGPR. Cette expression du transgène peut être stable, cyclique ou transitoire, selon le procédé ou le promoteur utilisé.

Ces vecteurs sont dits « d’expression », car ils disposent de séquences nucléotidiques qui permettent l’expression, c’est-à-dire la transcription en ARN (acide ribonucléique), des séquences nucléotidiques qu’elles contrôlent, ou la traduction de l’ARN qu’ils véhiculent.

Dans l’invention, ledit au moins un acide nucléique contenu dans ledit vecteur est placé « sous contrôle des éléments permettant son expression ». Cela signifie que ledit vecteur d’expression possède au moins une séquence d’initiation de la transcription tel qu’un promoteur d’un virus comme le promoteur précoce du virus simien SV40, ou du Cytomégalovirus (CMV) ou encore les séquences promotrices du virus du sarcome de Rous (RSV), et notamment une séquence ou promoteur comprenant une boite TATAA. Il peut également s’agir d’un promoteur humain d’un gène de ménage comme celui du gène de la phosphoglycerate kinase (PGK) ou encore d’un promoteur humain dit tissus spécifiques actif seulement dans certaine sous populations de cellules de l’organisme. Il peut également s’agir d’un promoteur synthétique contenant un ou plusieurs éléments de réponse, liant un ou plusieurs facteurs de transcription ; ces promoteurs peuvent être inductible par un stimulus exogène comme une molécule pharmacologique, une hormone, une carence ou un stress. De plus, ledit vecteur possède également au moins une séquence de terminaison de la transcription et en particulier une séquence de polyadénylation issue d’un gène de mammifère, notamment humain.

À ces séquences indispensables pour l’expression de la séquence nucléotidique contenue dans ledit vecteur peuvent s’ajouter d’autres séquences permettant de réguler ou de moduler l’expression de ladite séquence. Une liste non exhaustive comprend : des introns de gènes de mammifères, et notamment humains, des séquences de régulation de transcription de type amplificateur (« enhancers ») ou encore des séquences transcrites, mais non traduites de gènes de mammifères, et notamment humains.

CELLULES HÔTES

Selon un troisième aspect de l’invention, celle-ci a pour objet une cellule hôte ou lignée cellulaire transformée par un acide nucléique tel que décrit précédemment et/ou un vecteur d’expression tel que décrit précédemment. Autrement dit, l’invention a pour objet une cellule hôte ou lignée cellulaire capable d’exprimer (de produire) un conjugué polypeptidique comme décrit ci-dessus comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialogly coprotéines (anti-APC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas.

COMPOSITIONS

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant comme principe actif un conjugué polypeptidique comme décrit ci-dessus comprenant un premier composant qui est un anticorps anti-cellule présentatrice d’antigène qui cible le récepteur des asialoglycoprotéines de APC (anti-DC-ASGPR), ou un fragment de celui-ci, lié de manière covalente ou non covalente à un second composant qui est une protéine Cas, en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable. Par « composition pharmaceutique », on entend un conditionnement particulier de l’invention, lequel permet que la composition pharmaceutique de l’invention soit possiblement administrable aux animaux et aux êtres humains par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, transdermique, locale, inhalée ou rectale. Par ailleurs, ce conditionnement permet également l’administration du principe actif (ou substance active), seul ou en combinaison avec un autre principe actif, sous forme unitaire ou en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Les formes d’administration unitaires appropriées comprennent :

- les formes d’administration par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les suspensions ou solutions orales ;

- les formes d’administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants ;

- les formes d’administration sous-cutanée, transdermique, intradermique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, transdermique, intratrachéale et nasale ; et

- les formes d’administration rectale.

Par « véhicule pharmaceutique acceptable » (ou véhicule pharmaceutiquement acceptable), on entend un matériel non toxique qui est compatible avec un système biologique tel qu’une cellule, une culture cellulaire, un tissu ou un organisme animal ou humain. Il peut s’agir notamment :

- de solutés cristalloïdes, par exemple chlorure de sodium, bicarbonate, glucose ;

- de lipides cationiques ;

- de composés peptidiques ; ou

- de surfactants, par exemple polysorbates.

Dans tous les cas et ce, quel que soit la formulation choisie, celle-ci doit être stérile, stable dans les conditions de fabrication et de stockage, et doit impérativement être préservée de toute contamination par des micro-organismes, tels que les bactéries et les champignons.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus sous forme unitaire, dans laquelle le conjugué polypeptidique de l’invention est à une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 pg ou à une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 mg/kg (rapporté à un Homme de 70 kg). Par « comprise de 0,1 à 1 000 ug (ou mg/kg) », on entend que la dose peut être comprise de 10 à 1 000, de 100 à 900, de 200 à 800, de 300 à 700, de 400 à 600, de 0,1 à 500, de 500 à 1 000, de 10 à 100, de 100 à 200, de 200 à 300, de 300 à 400, de 400 à 500, de 500 à 600, de 600 à 700, de 700 à 800, de 800 à 900 ou de 900 à 1 000 pg (ou mg/kg). On entend également que la dose peut être de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 1 1,0, 1 1,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 21, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400,

410, 420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580,

590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770,

780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960,

970, 980, 990, ou de 1 000 pg (ou mg/kg).

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus, ladite composition pharmaceutique étant formulée pour être susceptible d’être administrée par l’une des voies suivantes : orale, parentérale, injectable, topique, par inhalation, sous-cutanée, nasale ou pulmonaire.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention concerne la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus, en combinaison avec un second principe actif. En particulier, l’invention a pour objet la composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus, comprenant en outre un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci. Par « anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci », on entend un anticorps ou un fragment de celui-ci capable de reconnaître spécifiquement le ligand de 1’0X40 (également appelé CD134 ou TNFRSF4), lequel est exprimé de manière stable sur de nombreuses cellules présentatrices d’antigènes telles que les DC2 (un sous-type de cellules dendritiques), les macrophages et les lymphocytes B activés.

UTILISATIONS & MÉTHODES

Selon un autre aspect, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas susmentionnée. L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas d’origine bactérienne, d’archée ou de phage.

Par « promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas », on entend que l’administration du conjugué polypeptidique selon l’invention et/ou une composition pharmaceutique selon l’invention à un mammifère induit (déclenche) une tolérance immunitaire à la protéine Cas, laquelle inhibe tout rejet immunitaire ultérieur vis-à-vis de la protéine Cas concernée. De cette manière, l’augmentation de la tolérance immunitaire à la Cas permet de mettre en place des protocoles sûrs et efficaces de réparation génique chez l’Homme grâce au système CRISPR- Cas.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant administré à un mammifère. L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à ladite protéine Cas, ladite composition pharmaceutique étant administrée à un mammifère. Par « mammifère », on entend un organisme animal tel que les primates ou l’Homme (homme, femme et enfant).

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant à une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 pg ou à une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 mg/kg (rapporté à un Homme de 70 kg). L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ladite composition pharmaceutique comprenant une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 pg du conjugué polypeptidique selon l’invention ou à une dose (unitaire) comprise de 0,1 à 1 000 mg/kg (rapporté à un Homme de 70 kg) du conjugué polypeptidique selon l’invention. Par « comprise de 0,1 à 1 000 pg (ou mg/kg) », on entend que la dose peut être comprise de 10 à 1 000, de 100 à 900, de 200 à 800, de 300 à 700, de 400 à 600, de 0,1 à 500, de 500 à 1 000, de 10 à 100, de 100 à 200, de 200 à 300, de 300 à 400, de 400 à 500, de 500 à 600, de 600 à 700, de 700 à 800, de 800 à 900 ou de 900 à 1 000 pg (ou mg/kg). On entend également que la dose peut être de 0,1 , 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 1 1,0, 1 1,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 21, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 ,

42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65, 66,

67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 ,

92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 1 10, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220,

230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410,

420, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590,

600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780,

790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970,

980, 990, ou de 1 000 pg (ou mg/kg).

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant administré par l’une des voies suivantes : orale, parentérale, injectable, topique, par inhalation, sous-cutanée, nasale ou pulmonaire. L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à ladite protéine Cas, ladite composition pharmaceutique étant administrée par l’une des voies suivantes : orale, parentérale, injectable, topique, par inhalation, sous-cutanée, nasale ou pulmonaire.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet un conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ledit conjugué polypeptidique étant administré en association avec un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci. L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à ladite protéine Cas, ladite composition pharmaceutique comprenant en outre un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci.

Selon un autre mode de réalisation, l’invention a pour objet le conjugué polypeptidique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, et en particulier ledit conjugué polypeptidique est administrée en association avec un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci.

L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique selon l’invention pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à ladite protéine Cas, et en particulier ladite composition pharmaceutique comprend en outre un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci.

De manière alternative, l’invention a pour objet une composition pharmaceutique pour son utilisation pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas, ladite composition comprenant comme principe actif le conjugué polypeptidique de l’invention en association avec un véhicule pharmaceutique acceptable, et en particulier ladite composition pharmaceutique comprenant en outre un anticorps anti-OX40L ou un fragment de celui-ci.

De manière alternative, l’invention a également pour objet une méthode pour promouvoir l’immunotolérance à une protéine Cas chez un patient qui en a besoin, ladite méthode comprenant une étape d’administration d’un conjugué polypeptidique selon l’invention. L’invention a également pour objet une méthode pour promouvoir l’immunotolérance à ladite protéine Cas chez un patient qui en a besoin, ladite méthode comprenant une étape d’administration d’une composition pharmaceutique selon l’invention.

Finalement, on comprend que l’immunisation à la Cas du patient qui en besoin (z.e. celui qui souffre d’une pathologie dont le soin nécessite une thérapie génique basée sur le système CRISPR-Cas) grâce à l’invention lui offre la possibilité de bénéficier d’un protocole de thérapie génique sûr et efficace. Dans une certaine mesure, on comprend donc que l’invention met en œuvre une protéine recombinante (l’anti-DC-ASGPR-Cas) et un vecteur codant la protéine Cas. La protéine recombinante anti-DC-ASGPR-Cas est injectée, notamment en intradermique, pour immuniser le patient qui en besoin puis le vecteur est administré pour permettre l’expression de Cas dans un tissu préalablement génétiquement modifié donné.

Autrement dit, l’invention a également pour objet un kit comprenant :

- le conjugué polypeptidique selon l’invention, ou le vecteur codant pour le conjugué polypeptidique de l’invention, ou la composition pharmaceutique selon l’invention ; et

- un vecteur codant une protéine Cas, en particulier codant la même protéine Cas que celle présente dans le conjugué polypeptidique selon l’invention.

Sur ce point, il convient de noter que le « vecteur codant une protéine Cas » du kit ne correspondant au vecteur de l’invention tel que décrit ci-dessus, le but du vecteur du kit étant de permettre l’expression de la Cas dans le but d’une thérapie génique (et non de produire le conjugué polypeptidique de l’invention). À tout égard, il convient de noter que les différents aspects de l’invention, tout comme les différents modes de réalisation de celle-ci sont interdépendants. Ces derniers peuvent donc être combinés entre eux à foison autant que nécessaire pour obtenir des aspects et/ou des modes de réalisation préférés de l’invention non explicitement décrits. Ceci est également valable pour l’ensemble des définitions fourni dans la présente description, lequel s’applique à tous les aspects de l’invention et ses modes de réalisation.

En outre, la présente invention est illustrée, sans toutefois s’y limiter, par les figures et exemples suivants.

LISTE DES FIGURES

Figure 1. Protocole expérimental pour la vaccination d’un macaque cynomolgus avec l’anti- DC-ASGPR-Cas9. Le protocole s’est déroulé sur 42 jours. Un prélèvement de sang a été effectué tous les 7 jours. Le premier prélèvement à JO a fourni les niveaux de base de toutes les mesures ultérieures. L’animal a reçu trois injections intradermiques (ID) d’anti-DC-ASGPR- Cas9 à une semaine d’intervalle chacune, aux jours 14, 21 et 28. Enfin, l’animal a reçu une injection de protéine Cas9 à J35.

Figure 2. Optimisation de l’assemblage des portions Anti-DC-ASGPR-dockerin et saCas9- cohesin. L’assemblage de deux ratios molaires des protéines Anti-DC-ASGPR-dockerin et saCas9-cohesin a été analysé par CAPE blot électrophorèse (Chretien P, et al. J Autoimmun. 1994 Jun;7(3):379-88. PMID: 7916909). Ligne 1, dépôt de saCas9-cohesin seule (migration 20 mm). Ligne 2, dépôt de l’anti-DC-ASGPR-dockerin seul (migration 8 mm). Ligne 3, mix de saCas9-cohesin et de l’anti-DC-ASGPR-dockerin à un ratio molaire de 1 :0,5 (smear et migration 12 mm). Ligne 4 mix de saCas9-cohesin et de l’anti-DC-ASGPR-dockerin à un ratio molaire de 1 :2 (bande unique et migration 12 mm). Le ratio molaire 1 :2, des protéines Anti- DC-ASGPR-dockerin et saCas9-cohesin, est retenu pour la vaccination par anti-DC-ASGPR- saCas9. Figure 3. Stratégies d’analyse des sous-types cellulaires à partir de PBMC de macaque cynomolgus par cytométrie.

Figure 4. Stratégie d’analyse du phénotype régulateur des lymphocytes CD4 ⁺ de macaque cynomolgus, exprimant les marqueurs CD25, FOXP3 et CD39.

Figure 5. Analyse par cytométrie des lymphocytes CD4 ⁺ d’intérêt en condition non stimulées (NS), ou stimulées avec la protéine Cas9 (saCas9) à JO du protocole. Les chiffres de cadrans indiquent des proportions de cellules.

Figure 6. Analyse par cytométrie des lymphocytes CD4 ⁺ d’intérêt en condition non stimulées (NS), ou stimulées avec la protéine Cas9 (saCas9) à J21 du protocole. Les chiffres de cadrans indiquent des proportions de cellules.

Figure 7. Analyse par cytométrie des lymphocytes CD4 ⁺ d’intérêt en condition non stimulées (NS), ou stimulées avec la protéine Cas9 (saCas9) à J35 du protocole. Les chiffres de cadrans indiquent des proportions de cellules.

Figure 8. Nombre de lymphocytes régulateurs T CD4+ exprimant FOXP3 et CD39 dans la population de lymphocytes CD4+ CD25+ 0X40+ (A) Proportion de lymphocytes CD4+ CD25+ OX40+, sept jours après, une (J21) et trois (J35) vaccinations avec l’anti-DC-ASGPR- Cas9 (lignes pointillées verticales). (B) Nombre de lymphocytes Foxp3+ CD39- dans la population de lymphocytes CD4+ CD25+ 0X40+ (C) Nombre de lymphocytes Foxp3+ CD39+ dans la population de lymphocytes CD4+ CD25+ 0X40+

Figure 9. Mesure du TGFbl dans le sérum du macaque cynomolgus après trois vaccinations avec l’anti-DC-ASGPR-Cas9 (J35) et une semaine après immunisation avec la protéine recombinante Cas9. Une augmentation importante du niveau de TGFbl dans le sérum de l’animal une semaine après immunisation avec la protéine Cas9 est observée. Ligne pointillée fine : vaccination avec l’anti-DC-ASGPR-Cas9 ; ligne pointillée épaisse : immunisation avec la protéine Cas9.

Figure 10. Mesure de l ’IL 10 dans le surnageant de culture des PBMC du macaque cynomolgus prélevées à J21, J28, J35 et J42 après la première immunisation à la rhMOG. Une augmentation de la sécrétion d’ILlO dans les PBMC prélevées à J42 (une semaine après une seconde immunisation à la rhMOG) stimulées par saCas9 (Cas9) est observée mais pas dans le surnageant des PBMC non stimulées (NS).

EXEMPLES

ÉTUDE PRÉCLINIOUE : IMMUNOTOLÉRISATION À LA saCAS9 CHEZ UN MACAQUE CYNOMOLGUS VIA UNE IMMUNISATION AVEC L’ANTI-APC-ASGPR-saCAS9

DONNÉES PRÉLIMINAIRES

In vitro

L’anti-APC-ASGPR-saCas9 a été obtenu. Il a été construit sur la base de l’anticorps monoclonal 49C11 et de la Cas9 de S. aureus, et le conjugué obtenu comprend :

- la chaîne légère de l’anticorps monoclonal anti-DC-ASGPR 49C11 L (SEQ ID NO : 34) ; et

- la chaîne lourde de l’anticorps monoclonal anti-DC-ASGPR 49C11_H qui contient un domaine dockérine (SEQ ID NO : 103) permettant son association à la protéine saCas9 qui contient un domaine cohésine (SEQ ID NO : 89).

CONCEPTION EXPÉRIMENTALE GÉNÉRALE

Il a été établi un protocole pour induire une tolérance immunitaire chez un macaque Cynomolgus adulte immunocompétent à la protéine hétérologue saCas9 (Fig. 1). Pour cela, il a été utilisé une protéine recombinante anti-DC-ASGPR-saCas9 obtenue en combinant un anticorps anti-DC-ASGPR-dockerin et la protéine saCas9-cohesin (Fig. 2). Ensuite, il a été déterminé si cette procédure permet l’apparition d’une population de lymphocyte T CD4+ régulateur spécifique pour saCas9 et exprimant les marqueurs 0X40+ CD25+ FOXP3 et CD39+ (Fovet CM, étal. EBioMedicine. 2019 Sep;47:492-505. PMC6796575.). Pour cela, une stratégie de marquage des cellules mononuclées du sang a été établie (Fig. 3). Cela permet la détection des lymphocytes CD4+ circulants, où le phénotype régulateur a été déterminé par immunomarquage des antigènes CD25+ FOXP3 et CD39+ (Fig. 4). Les lymphocytes T CD4+ régulateurs saCas9-spécifiques (CD25+ FOXP3 et CD39- ou CD39+), ont été détectés par la présence du marqueur d’activation 0X40, 44h après priming avec la protéine saCas9 (Fig. 5). Au cours de ce protocole, 1 singe est immunisé par des injections intradermiques d’un anticorps anti-APC-ASGPR-saCas9.

Protocole vaccinal

L’animal a reçu une dose intradermique, dans le dos, de 250 pg de protéine recombinante anti- APC-ASGPR-saCas9 chaque semaine pendant 3 semaines (Fig. 1).

Immunisation avec saCas9

Au jour 35 du protocole, 7 jours après avoir reçu la dernière dose vaccinale, l’animal a été immunisé avec 250 pg de protéine saCas9.

Analyse immunitaire pré- et /> st-vaccination

A partir du premier jour, du plasma et des PBMC ont été collectés chaque semaine pour explorer la réponse CD4 à la saCas9 in vitro.

Des échantillons de sang (10 mL) ont été prélevés sur l’animal avant la première vaccination, puis à intervalles réguliers pour évaluer les fonctions hématologiques et biologiques.

Les PBMC de l’animal ont été mis en culture. Les cellules ont été marquées avec du CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester) au jour 0 et mises en culture puis stimulées avec de la saCas9 recombinante, ou rien. Des cellules marquées ont été collectées après 44h et traitées pour une analyse des cytokines intracellulaires et l’étude de leur phénotype par cytométrie en flux. Une partie de ces cellules a été utilisée pour évaluer l’expression des marqueurs CD4, CD8, CD25, 0X40, CD39 et Foxp3 après stimulation avec la saCas9.

L’animal a été examiné chaque jour et les signes cliniques ont été quantifiés à l’aide d’une grille d’évaluation.

Par ailleurs :

La protéine fusion anti-APC-ASGPR-saCas9 a été injectée par voie intradermique dans le dos de l’animal ;

La protéine saCas9 recombinante a été injectée par voie intradermique dans le dos de l’animal ;

Le Resiquimod a été appliqué sous forme de gel à la surface de la peau rasée et au site d’injection des protéines fusion. L’application du gel a été effectuée juste après l’injection de la protéine fusion et a été suivie d’un doux « massage de la peau » pendant 30 s ;

A chaque date de vaccination par l’anticorps, l’animal a reçu cinq injections de 50 pg de protéine fusion (250 pg au total) ; - À la date d’injection de la protéine recombinante saCas9, l’animal a reçu 5 injections de 50 pg de saCas9 (250 pg au total) ; et

- L’ immunosurveillance a inclus : a. Mesure des cellules T spécifiques anti-saCas9 (CD4 ⁺ et CD8 ⁺ ) dans le sang et du TGF01 dans le sérum. b. Suivi des marqueurs de l’activation des cellules T et B dans le sang, anti-CD45, anti- CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD95, anti-CD28, anti-CD69, anti-HLADR, anti- CD20, anti-CD27 et anti-IgD.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Animaux

Un singe cynomolgus adulte (Macaca fascicularis) importé de l’ile Maurice a été inclus dans cette étude. Le typage des CMH de classe I et de classe II a été déterminé.

Immunogènes

Les protéines recombinantes ont été préparées par le Baylor Institute for Immunology Research (BUR). L’anti-DC-ASGPR-dockerin (humain) a été associé à la saCas9-cohesin extemporanément au moment de l’injection intradermique par un mélange à un ratio molaire de 1 :2.

La saCas9 recombinante produite chez E.Coli a été obtenue par le BIIR.

Immunisations

L’animal a reçu des injections dans le dos avec une seringue pour l’inoculation intradermique (ID). Le site d’injection est rasé.

En outre, l’animal a reçu à chaque date de vaccination 5 injections de 100 pL de chaque vaccin anti-DC-ASGPR-saCas9 espacées de 0,5 cm.

Chaque injection contient 50 pg d’anticorps.

Observations en cours de vie

L’animal a été observé par le personnel du CEA 7 jours sur 7 via notamment un suivi par une webcam. La consommation de nourriture et d’eau a été enregistrée. A chaque saignement, un examen clinique a été effectué, et le poids et la température rectale ont été enregistrés.

Tableau 2. Observations en cours de vie

Hématologie complète

L’hématologie complète a été réalisée à l’aide d’un HMX A/L (Beckman Coulter®) selon la procédure SOP#EXAM0006_01. Les transaminases sériques ont été mesurées chaque semaine ainsi que le LDL et la protéine PCSK9.

Activation des cellules T spécifiques de la saCas9, phénotype et production de cytokines.

Le taux de lymphocytes CD4 ⁺ autoréactifs et régulateurs spécifiques de la saCas9 parmi les PBMC circulants n’a pas été étudié chez l’animal après le transfert de gène de la saCas9. Leur stimulation et leur culture à grande échelle modifient leur phénotype et leur fonction d’origine et empêchent leur étude précise. Pour évaluer et caractériser précisément ces cellules chez le macaque, il a été utilisé un test récent qui détecte les lymphocytes T CD4+ surexprimant CD 140 (0X40) et CD25 (IL2R), car ils permettent d’identifier les cellules qui répondent à une restimulation par l’antigène avec une sensibilité beaucoup plus grande que le marquage des cytokines intracellulaires (CSI) (J. J. Zaunders étal., J Immunol 183, 2827-36 (2009)).

Parmi les PBMC, la polarisation phénotypique des cellules T CD4 ⁺ spécifiques de la saCas9 a été évaluée par stimulation ex vivo des PBMC avec de la protéine recombinante saCas9 pendant 44 heures. Dans ces conditions, les lymphocytes CD4 ⁺ spécifiques de la saCas9 surexpriment 0X40 et CD25 avant que les cellules ne commencent à proliférer (N. Seddiki, et al., Eur J Immunol 44, 1644-61 (2014)). Ainsi, des PBMC cultivées stimulées avec des épitopes saCas9, ont été marquées avec des anticorps dirigés contre CD4, CD134, CD25, CD39 et FOXP3 pour distinguer les T _reg s et TRI (CD4+, CD25+, CD134+, CD39+) (N. Seddiki, ét al., Eur J Immunol 44, 1644-61 (2014)). Les différents sous-types de cellules ont été identifiés, quantifiés et triés par cytométrie. Cette expérience nécessitant de petites quantités de sang a fourni des informations quantitatives et qualitatives de base sur le taux et le phénotype des cellules CD4+ anti-saCas9 circulant à différents moments après la vaccination avec l’anticorps anti-DC-ASGPR-saCas9.

Cytokines sériques

Le TGFbl a été mesuré à différent temps avant et après vaccination ainsi qu’une semaine après immunisation par la saCas9.

Cytokines dans le surnageant de culture des PBMC

L’ILIO a été mesurée dans le surnageant de culture de PBMC prélevés à différents temps après immunisation avec la rhMOG et vaccination avec l’anti-ASGPR-saCas9. Les PBMC en culture ont été stimulées ou pas avec la scCas9.

Conservation du matériel

Les échantillons biologiques ont été conservés congelés à - 80°C (plasma, sérum, ARN) ou à - 135°C (PBMC) pendant toute la durée de l’étude et 2 ans après la fin de l’étude.

Analyse des données

Les données ont été enregistrées et analysées en utilisant des systèmes de gestion de données du type IDBS.

L’analyse statistique a été effectuée en utilisant le test non paramétrique Mann & Whitney ou Wilcoxon rank à l’aide de PRISM® 8 (GraphPad®).

Les analyses de cytométrie en flux ont été réalisées à l’aide des logiciels FlowJo® et SPICE®.

Éthique

L’animal a été hébergé dans les installations du CEA à Fontenay-aux -Roses conformément aux normes de soins des institutions et à la directive européenne D8906, et celles de V Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW) du National Institutes of Health (USA).

RÉSULTATS

Un macaque Cynomolgus adulte sain a été traité afin de le rendre immunotolérant à la protéine hétérologue saCas9 par le protocole de vaccination décrit à la Figure 1 et rappelé ci-après. Pour cela, il a été utilisé une protéine recombinante anti-DC-ASGPR-saCas9 obtenue en combinant deux protéines recombinantes : un anticorps anti-DC-ASGPR-dockerin et la protéine saCas9- cohesin (Fig. 2). Par la suite, l’animal a reçu des injections intradermiques de l’anti-DC- ASGPR-saCas9. Dans le même temps, il a été déterminé si cette procédure permet l’apparition d’une population de lymphocyte T CD4+ régulateur spécifique pour saCas9 et exprimant les marqueurs 0X40+ CD25+ FOXP3 et CD39+. Pour cela, une stratégie de marquage des cellules mononuclées du sang a été établie (Fig.3), laquelle a permis la détection d’une nouvelle population de lymphocytes T CD4+ régulateur exprimant les marqueurs CD25+ 0X40+ FOXP3+ et CD39+ (Fig. 4). Ces cellules (i.e. lymphocytes T CD4+ régulateurs saCas9- spécifiques (CD25+ FOXP3 et CD39- ou CD39+), inexistantes avant le protocole vaccinal, ont augmenté proportionnellement au fil de la complétion du schéma vaccinal avec l’anti-DC- ASGPR-saCas9 (Fig. 5 à 7). De plus, le comptage total de ces cellules indique que leur nombre absolu s’est accru par l’activation avec la protéine recombinante saCas9 (Fig. 8). Enfin, chez l’animal ayant reçu les trois injections d’anti-DC-ASGPR-saCas9, une immunisation par injection intradermique de saCas9, a induit l’expression des cytokines anti -inflammatoires TGFbl et IL10 telles que détectées respectivement dans le plasma ou dans le surnageant des PBMC en culture (Fig. 9 et 10).

Ces résultats ont donc démontré qu’un traitement vaccinal avec la protéine anti-DC- ASGPR-saCas9 permet l’apparition d’une population de lymphocyte T régulateurs et sont la marque d’une réponse immunomodulatrice anti-inflammatoire en présence de l’antigène saCas9.