Уровень техники

Вирусные заболевания ответственны как за глобальные пандемии, так и за ежегодные сезонные эпидемии, такие как грипп. Вспышки заболеваний могут характеризоваться усиленной вирулентностью и могут происходить внезапно, приводя к высокой смертности. Важным является то, что вирусные заболевания не ограничиваются заболеваниями у людей. Например, грипп также поражает скот и птиц.

В настоящее время в терапии заболеваний, вызванных вирусом гриппа, используют лекарственные препараты, действие которых направлено на подавление репликации вируса гриппа. Главным образом мишенью для лекарственного вмешательства является вирусная нейраминидаза - фермент, необходимый для нормального почкования вирусных частиц и проявления инфекционных свойств вируса гриппа.

Занамивир является первым производным гуанидино-нейраминовой кислоты, действующим на нейраминидазу вируса гриппа, которое стало использоваться как лекарство против вируса гриппа. Последующие разработки [11] были направлены на получение аналогов, с увеличенной активностью и биодоступностью, а также пролонгированным действием. Димеризация молекулы занамивира путем соединения двух мономеров по гидроксилу 07 привела к получению аналога примерно такой же активности, как мономер, но с пролонгированным действием. Однако для эффективного лечения гриппа этого недостаточно, поскольку занамивир и аналогичные ингибиторы нейраминидазы всего лишь сокращают длительность заболевания на 1 - 2 дня, но не приводят к радикальному быстрому излечению, а также неспособны действовать превентивно.

Ранее были синтезировали молекулы антенных пептидов - [H-Gly _n -NH] ₂ -4X, представляющие собой от 2 до 4 олигоглициновых цепей (антенн), связанных с разветвляющим центром (X), в качестве которого использовали α,ω-диаминоалканы, олигоэтиленгликоли с концевыми аминогруппами, а также ди,- три- и тетрааминопроизводные пентаэритрита. При достижении антеннами критического размера, 4 - 7 остатков Gly, молекулы пептидов оказываются способными к спонтанной самосборке супрамеров. Согласно данным Раман-спектроскопии, супрамеры представляют собой структуры полиглицин-И, где олигоглициновые цепи располагаются в узлах гексагональной решетки, спирализуются и между ними возникают множественные водородные связи. Методами просвечивающей электронной и сканирующей зондовой микроскопии было показано, что морфологически супрамеры представляют собой протяженные плоские образования (20-кристаллы); их высота приблизительно соответствует длине пептидной молекулы (40-70 А), а планарные размеры варьируются в диапазоне от 50 до 5000 нм.

К концам антенн разветвленных молекул могут быть ковалентно присоединены (непосредственно, либо через спейсерную/линкерную вставку, sp) заместители различной природы (R); модифицированные молекулы [R-sp-Gly _n -NH]2- ₄ X также оказываются способными к самосборке по типу полиглицин-ll. В случае гликопептидов, поверхность образующихся супрамеров оказывается покрытой группами R, которые обеспечивают растворимость супрамеров в воде, их устойчивость к седиментации, а также биологическую активность. В частности, самоассоциирующие гликопептиды [Neu5Aca-sp- Gly _n -NHCH ₂ ]4C (n=7 - 10), в отличие от неассоциирующих аналогов (п<7), демонстрируют повышенное сродство к вирусам гриппа. Указанный эффект обуславливается специфическим распознаванием остатков нейраминовой кислоты (Neu5Aca) вирусным лектином гемагглютинином (НА); это взаимодействие является слабым (K _D ~ 1 мкмоль) на моновалентном уровне, однако его аффинность на 2 - 3 порядка возрастает при многоточечном связывании вируса с гликопептидными супрамерами. Это дает возможность применения самоассоциирующих гликопептидов в качестве конкурентных ингибиторов клеточной адгезии вируса. В свою очередь, гликопептидные супрамеры, адсорбированные на вирусных частицах, стерически препятствуют взаимодействию последних с клетками-мишенями. Описанный выше принцип подавления инфекционности было предложено использовать для конструирования антивирусных препаратов нового поколения [1 , 3-6].

Можно было бы ожидать, что конъюгаты сиалогликанов с самоассоциирующими пептидами окажутся мощными блокаторами вируса гриппа, но на примере двухантенных молекул было показано, что объемные трисахаридные заместители препятствуют самосборке. Так, производное б'-сиалиллактозамина [6'SLN-nHHKep-Gly ₆ -NH(CH ₂ ) ₂ ] ₂ , не образует супрамеры в индивидуальной форме. Однако оказалось возможным получить супрамеры смешанного состава (со-ассоциаты), состоящие из молекул гликопептида и пептида-разбавителя [Suc-Gly ₆ -NH(CH ₂ )2]2, антенны которого терминированы небольшими гидрофильными группами (например НООС(СН ₂ ) ₂ С(0)-), которые не оказывают существенного влияния на процесс самосборки супрамеров (Рис. 1). Смешанные супрамеры подавляют взаимодействие фетуина с вирусом гриппа уже в микромолярных концентрациях (1С ₅₀ ~0.1 - 10 мкмоль), являясь на 2-3 порядка более мощными блокаторами, чем мономерный 6'SLN. Следует обратить внимание на наличие зависимости антивирусной активности смешанных супрамерных форм от их состава, а именно на увеличение активности при формальном снижении содержания гликопептида в данной конкретной форме. Этот эффект связан с тем, что при больших "разбавлениях" гликопептида сукцинильным производным, уменьшаются стерические препятствия для включения молекул в состав супрамера. С другой стороны, при больших "разбавлениях" могут достигаться оптимальные плотность и распределение 6'SLN групп на поверхности супрамера с точки зрения взаимодействия с вирусом [10].

Таким образом, поиск и разработка более активных и эффективных аналогов занамивира в качестве ингибиторов вируса гриппа является актуальной задачей.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание новых эффективных ингибиторов вирусов гриппа человека и животных на основе занамивира, перспективных для применения в клинической практике.

Техническим результатом изобретения является разработка и получение новых эффективных ингибиторов вирусов гриппа человека и животных на основе занамивира, а также разработка и получение новых мультимерных производных (со-ассоциатов), которые обладают не только пролонгированным действием, но и повышенной ингибирующей активностью по отношению к нейраминидазе, а вследствие этого и характеризуются повышенной способностью подавлять размножение вируса гриппа.

Указанный технический результат достигается путем получения производных занамивира по 7 -положению общей формулы (I).

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

X представляет собой спейсерную группу,

п - целое число от 6 до 10.

В частных вариантах воплощения изобретения спейсерная группа X представляет собой -OC(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHCO(CH ₂ ) ₄ CO-.

В частных вариантах воплощения изобретения п равно 9.

Технический результат достигается также путем получения со-ассоциатов двух типов соединений, а именно, соединений общей формулы (I):

или его фармацевтически приемлемой соли, где:

X представляет собой спейсерную группу,

п - целое число от 6 до 10;

и соединений общей формулы (II):

[R-Gly _m -NHCH ₂ ] ₄ C

или его фармацевтически приемлемой соли, где

m - целое число от 6 до 10;

R представляет собой Η-, НООССН ₂ СН ₂ СО- или НОСН ₂ СО-;

причем молярное соотношение соединений (I) и (II) в со-ассоциате составляет от 1 :10 до

1 :100.

В частных вариантах воплощения изобретения спейсерная группа X представляет собой -OC(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHCO(CH ₂ ) ₄ CO-.

В частных вариантах воплощения изобретения п равно 9.

В частных вариантах воплощения изобретения m равно 9.

Технический результат достигается также осуществлением способа получения соединения общей формулы (I) путем конденсации соединения общей формулы занамивир-X-Y-COOW с соединениями общей формулы [Gly _n NHCH ₂ ] ₄ C,

где X представляет собой спейсерную группу,

Y представляет собой линкер для связывания активированной карбоксильной группы -COOW со спейсерной;

W представляет собой активирующий остаток;

причем спейсерная группа присоединена к занамивиру по его 7-О-положению. В частных вариантах воплощения изобретения W представляет собой 4-пара- нитрофенильный остаток.

Настоящее изобретение также относится к применению соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению в качестве ингибиторов вирусов гриппа человека. В частности, типы вируса, в отношении которых могут использоваться со-ассоциаты по изобретению, представляют собой А или В. Причем, в некоторых вариантах изобретения, подтип вируса гриппа человека типа А представляет собой Н1 или НЗ. Кроме того, изобретение относится к применению соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусом гриппа человека.

Изобретение также включает фармацевтические композиции для лечения и/или профилактики заболеваний, ассоциированных с вирусами гриппа человека, содержащие терапевтически эффективное количество соединений общей формулы (I) или со- ассоциатов по изобретению.

Изобретение также включает получение соединений общей формулы (I), а также со-ассоциатов по изобретению.

Подробное описание изобретения Определения (термины)

Хаотропный агент - вещество, способное разрушать водородные связи, например роданид-анион или мочевина.

Ассоциат (со-ассоциат) - физически устойчивый (то есть тот, который можно надежно обнаруживать физическими методами) при рассматриваемой температуре комплекс одинаковых (ассоциат) или разных (со-ассоциат) малых молекул, не соединенных между собой ковалентными связями.

Супрамер - общий термин, включающий как гомогенные ассоциаты, (см. выше), так и со-ассоциаты.

Вирус гриппа - в настоящем документе означает любой штамм вирусов гриппа человека. То есть любой тип вирусов гриппа человека, выбранного из типов А или В. В частности, любой тип вируса гриппа человека типа А, который имеет подтип Н1 или НЗ, определяющийся антигенностью поверхностного белка гемагглютинина; при этом подтип вируса, определяющийся поверхностным белком нейраминидазой, может быть любым. Вирусы человеческого гриппа С и вирусы птичьего гриппа не имеются в виду в настоящем документе.

Линкер - молекулярный фрагмент, соединяющий два функциональных фрагмента биоконъюгата, в данном случае фрагмента, ответственного за связывание с вирусом, и фрагмента, ответственного за ассоциацию. Линкер существенно не влияет на свойства биоконъюгата, поэтому его стремятся сделать максимально простым. Так как свойства линкера может выполнять бесконечное разнообразие молекулярных фрагментов, его сложно дефинировать в виде химической формулы, и поэтому целесообразно использовать термин "линкер" как заменитель химической формулы.

Спейсер (X)- молекулярный фрагмент, соединяющий два функциональных фрагмента биоконъюгата; его роль заключается в обеспечении оптимального расстояния между соединяемыми им фрагментами биоконъюгата. В отличие от простого линкера (см. выше), спейсер бывает значительно длиннее. Вообще говоря, спейсер включает в себя линкер, но иногда формально удобнее выделить в молекуле биоконъюгата линкерныи, так и спеисерныи фрагменты. Неограничивающими примерами спейсера изобретению могут быть X = -C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ )4C(0)-, а также

Активирующий остаток - молекулярная группа, используемая для повышения реакционной способности карбоксильной группы в реакциях амидирования. В рамках изобретения могут быть использованы любые активирующие остатки, в том числе, например, такие как 4-нитрофенильный, пентахлорфенильный, Ν-оксисукцинимидный и другие.

Сукцинат, сукцинатная группа (Sue) - остаток янтарной кислоты НООССН ₂ СН ₂ СО-.

Занамивир (Zanamivir, Zn) - (2R,3R,4S)- 4-[(диаминомелилиден)амино]- 3- ацетамидо- 2-[(1 R,2R)- 1 ,2,3-тригидроксипропил]- 3,4-дигидро- 2Н-пиран- 6-карбоксиловая кислота.

Структурная формула занамивира (Zn) представляет собой:

Производные занамивира по 7-0- положению (отмечено звездочкой) представляют собой:

Примеры структурных формул производных занамивира по 7-О-положению согласно изобретению приведены на рисунках 3 и 7.

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Фармацевтически приемлемые соли - такие, которые, в рамках проведенного медицинского заключения, пригодны для использования в контакте с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции и т.д., и отвечают разумному соотношению пользы и риска. Примерами фармацевтически приемлемых нетоксичных солей могут служить соли, образованные неорганическими кислотами, такими как соляная, бромоводородная, фосфорная, серная и хлорная кислоты, или органическими кислотами, такими как уксусная, щавелевая, малеиновая, винная, янтарная, лимонная или малоновая кислоты. Описание рисунков

Рисунок 1. Схема взаимодействия супрамеров с поверхностью вирусной частицы

(НА - гемагглютинин, NA - нейраминидаза):

(А) Супрамер, образованный в результате сборки только одного типа гликопептида - производного занамивира [Занамивир-Х-С1у ₉ -МНСН ₂ ] ₄ С (ассоциат);

(Б) Супрамер смешанного состава, с "разбавителем", благодаря отсутствию пространственных затруднений взаимодействует с вирусом лучше (со-ассоциат) - со- ассоциат двух типов молекул [3aHaMHBHp-X-Gly _n -NHCH ₂ ]4C и [R-Gly _m -NHCH ₂ ]4C.

Рисунок 2. Схема синтеза производного занамивира с активированной карбоксильной группой в спейсере общей формулы - занамивир-X-Y-COOW. Реагенты и условия: i. MeONa, МеОН, 4 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; ii. р- N0 ₂ C ₆ H ₄ OCOCI, ДМАП, Ру, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; iii. BocNH(CH ₂ )NH ₂ , ДМАП, Ру, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; iv. Ph ₃ P, ТГФ, 12 ч, комн. т-ра; v. Et ₃ N, Н ₂ 0, 12 ч, комн. т-ра, хроматография на силикагеле; vi. bis(Boc)PCH, МеОН; vii. CF ₃ COOH, 2 ч, комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20; viii. динитрофениловый эфир адипиновой кислоты, ДМФА/ДМСО, 5:1 ,. 12 ч, комн. т- ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20.

Рисунок 3. Строение некоторых молекул общей формулы (I) и общей формулы (II), входящих в со-ассоциаты по изобретению.

Рисунок 4. Схема синтеза молекул общей формулы (I) и общей формулы (II), входящих в со-ассоцитаты по изобретению. Реагенты и условия: i. Boc-Gly-OSu, NEt ₃ , ДМФА, 24 ч, 70оС, хроматография на силикагеле; ii. CF ₃ COOH, 2 ч, комн. т-ра; iii. Boc-Gly ₂ - OSu, NEt ₃ , ДМСО, 24 ч, 70оС, хроматография на силикагеле; iv. Boc-Gly ₂ -OSu, Li ₂ C0 ₃ , 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, высаживание при разбавлении водой; v. янтарный ангидрид, Li ₂ C0 ₃ , 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20; vi. Zn-7-0-C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ ) ₄ C(0)ONp (3), Li ₂ C0 ₃ , 12 М LiCI (водн)., 72 ч комн. т-ра, эксклюзионная хроматография на геле LH-20.

Рисунок 5. ¹ Н-ЯМР спектр [Zn-X-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C,

где X - C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ ) ₄ C(0)-. Рисунок 6. ¹ Н-ЯМР спектр [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ]4C.

Рисунок 7. Структурная формула [Zn-X-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C,

где X -

Подробное раскрытие изобретения

Существует два подхода к получению мультимерных (то есть, содержащих много копий лиганда) производных каких-либо активных лигандов. Первый - иммобилизация лигандов на полимере; этот путь как правило приводит к увеличенной активности, но имеет два серьезных недостатка: 1 ) повышенная токсичность из-за метаболитов полимера-матрицы [6]; 2) неопределенность структуры ("inconsistency") полимера чрезвычайно затрудняет регистрацию таких препаратов для массового лечения, их разрешают к применению как правило для лечения при непосредственной угрозе жизни, как например при онкологии.

Второй путь к получению мультимеров - это создание star-like молекул и аналогичных им, когда ограниченное число лигандов (3 - 8) присоединено как правило к симметричной матрице, которые в отличие от полимеров имеют определенную структуру; их основным недостатком является относительно короткая дистанция между лигандами, не позволяющая связываться с мишенью истинно мультиточечно. Например, расстояние между сиало-связывающими белками вируса гриппа превышает дистанцию 10 нм [6], что трудно достижимо в рамках концепции этого типа мультимерных молекул.

В данном изобретении, основанном на получении мультимерных производных второго типа, первую проблему (связанную с полимерами) решают применением супрамеров вместо истинных полимеров [10], а вторую проблему - оптимального (как правило значительного, как в приведенном выше примере сиалосвязывающих белков вируса гриппа) расстояния между лигандами - разработкой и применением со-ассоциата, в котором используются молекулы «разбавителя» [10].

Ранее для блокирования вируса гриппа были использованы со-ассоциаты, в которых использовались молекулы «разбавителя» [10], когда активным вирус- связывающим лигандом является трисахарид 6'SLN, взаимодействующий с гемагглютинином вириона; это приводило к противовирусному эффекту, но недостаточно мощному из-за низкой аффинности трисахарида 6'SLN по отношению к белку (гемагглютинину). Препарат занамивир (Zn) представляет собой 4-гуанидино- производное гликаля нейраминовой кислоты, являющегося аналогом переходного состояния сиалового субстрата в каталитическом сайте нейраминидазы (NA) [1 1 , 12], он действует на нейраминидазу, а не на гемагглютинин вируса гриппа. Количество копий нейраминидазы (мишень действия занамивира) на вирионе примерно втрое ниже, чем

8

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гемагглютинина, поэтому было совершенно неожиданно обнаружено, что соединения общей формулы (I), а также со-ассоциаты по изобретению обладают высокой противовирусной активностью. Получение производных занамивира общей формулы (I) и со-ассоцитов на их основе по изобретению

Возможность объективного проявления технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными данными, приведенными в примерах, содержащих сведения экспериментального характера, полученных в процессе проведения исследований по методикам, принятым в данной области. Сущность изобретения поясняется рисунками. Следует понимать, что эти и все приведенные в материалах заявки примеры не являются ограничивающими и приведены только для иллюстрации настоящего изобретения.

Ранее было осуществлено получение разветвленных ассоциирующих пептидов, в том числе молекул с четырьмя олигоглициновыми антеннами, с помощью метода активированных эфиров в классическом растворном варианте его реализации [1]. Схема синтеза самоассоциирующих тетрантенных олигоглицинов (рис. 4) включает несколько циклов удлинения пептидных антенн; антенны последовательно наращиваются на один или два глициновых остатка, начиная с тетрааминометилметана [NH ₂ CH ₂ ]4C, служащего разветвляющим центром. Первой стадией внутри каждого цикла является ацилирование тетраамина с помощью Л/-оксисукцинимидного эфира трет- бутилоксикарбонилглицина/глици� �гпицина (Boc-Gly-OSu/Boc-Gly ₂ -OSu); исчерпывающее протекание реакции достигается за счет использования избытка активированного эфира (10 - 20 мольн. % в расчете на NH ₂ -rpynny). Синтез пептидов с короткими антеннами [Вос- Gly _n -NHCH ₂ ] _4i η=1 , 3, 5, проводят в диметилформамиде (DMF); при получении [Boc-Gly ₇ - NHCH ₂ ] ₄ C в качестве растворителя используют диметилсульфоксид (DMSO); наконец, пептид с антеннами, построенными из девяти глициновых остатков, [Boc-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C приходится синтезировать в концентрированном водном растворе хлористого лития, являющегося хаотропным агентом, подавляющим ассоциацию пептида и обеспечивающим его растворимость в процессе ацилирования. Образующийся в результате присоединения глициновых остатков к аминокомпоненту защищенный пептид, [Boc-Gly _n -NHCH ₂ ] ₄ C деблокируется с помощью трифторуксусной кислоты. Затем, аналогично методам, описанным ранее [1 , 2, 5], к тетраантенным пептидам исчерпывающе (4 эквивалента) присоединяли остаток занамивира (Zn).

По тем же принципам синтезировали четырехантенные производные с карбоксильными группам на концах антенн (соединения общей формулы (II), рис. 3), которые использовали в качестве "разбавителей". Двухкомпонентные со-ассоциаты получали из олигоглициновых пептидов путем смешения и выдерживания компонентов при температуре 60-80 °С, с последующим медленным охлаждением.

Реагенты и методы

Реактивы и растворители были получены из коммерческих источников (Sigma-

Aldrich, Merck, Acros) и использовались без дополнительной очистки.

Разветвленные олигоглицины [HCIxH-Gly _n -NHCH ₂ ] ₄ C, п=1 - 9, синтезировали как описано ранее в работе [1].

Производные гликаля 1 и 2 (Рис.2) получены в соответствии с методами, описанными в работе [13].

Для тонкослойной хроматографии использовали стеклянные пластинки, покрытые силикагелем Sg-60 (Merck, Германия). Проявление пластинок проводили:

- путем их выдерживания в парах аммиака (для нитрофениловых эфиров);

- выдерживанием в парах соляной кислоты, опрыскиванием нингидриновым реагентом (2.5 г нингидрина в смеси Ме ₂ СО/Н ₂ 0/АсОН, 96:4:1) и нагреванием в течение 5-

10 мин при 120-150 °С или опрыскиванием 10% Н ₃ Р0 ₄ и нагреванием в течении 10 мин при 150 °С.

Спектры ядерного магнитного резонанса ( ¹ Н-ЯМР) записывали на спектрометре WM-500 (Bruker, США). Рабочая частота прибора 500 МГц; температура проведения экспериментов 303 К; химические сдвиги протонов определяли по отношению к сигналу CF ₃ COOD (δ _Η 11.50) или D ₂ 0 (δ _Η 4.75).

Масс-спектры получали на время-пролетном спектрометре Vision-2000 (Thermo Bioanalysis Corp., Великобритания) с лазерной ионизацией образца с поверхности матрицы (MALDI), в качестве которой использовали дигидроксибензойную кислоту.

Пример 1.

Синтез (4S,5R,6R)-5-a4eTaMHflo-4-ryaHMflMHO-6- 2R,3-flMrHflpoKCH-1R-[6-(4- нитрофенил-6-оксагексаноат)-амин� �гексил-карбомаилокси]-пропил}-5,6- дигидро-4Н- пиран-2-оновой кислоты (3)

К раствору 250 мг (0.53 ммоль) 2 (рис.2) в DMSO (1 мл) прибавлено 875 мг (2.65 ммоль) динитрофенилового эфира адипиновой кислоты в ДМФА (5 мл). Реакционную смесь перемешивали 12 ч при комнатной температуре, после чего прибавили к ней 60 мл 5% АсОН, выпавший осадок отфильтровали, фильтрат упарили до объема ~7 мл. Выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - МеОН/Н ₂ 0, 3:1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 285 мг (75%); ТСХ: R, 0.48, /-РгОН-ЕЮАс-Н ₂ 0, 4:3:2; Н ЯМР (700 МГц, D ₂ 0): 8.36, 7.39 (2м, 2х2Н, 2*2> СН Аг), 5.89 (д, 1 Н, J ₃₄ 2.3 Гц, Н-3), 4.95 (дд, 1 Н, J ₇ , ₈ 9.2 Гц, J ₆ 1.9 Гц, H-7), 4.55 (дд, 1 Н, J _5,6 10.3 Гц, Н-6), 4.44 (дд, 1 Н, J ₄ ,5 9.2 Гц, Н-4), 4.14 (т, 1 Н, Н-5), 4.05 (ддд, 1 Н, Н-8), 3.67 (дд, 1 Н, J _5,6a 2.7 Гц, J _6a,6b 12.0 Гц, Н-9а), 3.50 (дд, 1 Н, J ₅ , _6a 6.7 Гц, Н9Ь), 3.23-3.18 (м, 5Н, ОС(0)СН ₂ , OC(0)NHCH, NH ₂ CH ₂ ), 3.09-2.97 (м, 1 Н, OC(O)NHCH), 2.31 (т, 2Н, NHC(0)CH ₂ ), 1.97 (с, ЗН, NC(0)CH ₃ ), 1.78-1.70 (м, 4Н, 2xJC(0)CH ₂ CH ₂ ), 1.55-1.40 (м, 4Н, 2хСН ₂ ), 1.35-1.25 (м, 8Н, 4хСН ₂ ); MALDI-MS: 724 [М] ⁺ , 747 [M+Na] ⁺ , 763 [М+К] ⁺ ; Найдено (%): С 51.40; Н 6.45; N 13.46. Рассчитано для C ₃ iH ₄₅ N ₇ 0 ₁₃ (%): С 51.45; Н 6.27; N 13.55.

Пример 2.

Синтез [3aHaMMBMp-X-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C, X = -C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ ) ₄ C(0)-

К нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF ₃ COOHxH-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C и 143 мг (1.94 ммоль) Li ₂ C0 ₃ вЮ мл 12 М LiCI водн. прибавили 420 мг (0.58 ммоль) активированного производного Zn 3 (рис.2). Реакционную смесь оставили интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - 0.05 М NH ₃ в MeCN/H ₂ 0, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 477 мг (87%); ¹ Н ЯМР (700 МГц, CF ₃ COOD): 6.33 (д, Н, J _3,4 2.6 Гц, Н-3 Zn), 4.75-4.52 (м, 2Н, Н-4,6 Zn), 4.47-4.20 (м, 23Н, 9хСН ₂ Gly, Н-5,7,8,9 Zn), 3.65-3.55, 3.35-3.25 (2м, 2х2Н, 2xCH ₂ NH sp), 3.19 (уш. с, 2Н, NHCH ₂ C), 2.79, 2.66 (2т, 2х2Н, J 6.5 Гц, 2хСН ₂ СО sp), 2.30-2.20 (m, ЗН, NC(0)CH ₃ ), 1.96-1.86 (м, 4Н, 2хСН ₂ СН ₂ СО sp), 1.80-1.73, 1.68-1.58 (2м, 2х2Н, 2хСН ₂ sp), 1.52-1.40 (м, 4Н, 2хСН ₂ sp); MALDI-MS: 4525 [М] ⁺ , 4548 [M+Na] ⁺ , 4563 [М+К] ⁺ ; Найдено (%): С 46.90; Н 6.42; N 19.66. Рассчитано для C ₁₇₇ H ₂₈₄ N ₆₄ 0 ₇₆ (%): С 46.99; Н 6.33; N 19.81.

Пример 3.

Синтез [ Занамивир-Х-01у ₉ -МНСН ₂ ] ₄ С*

К раствору 270 мг (0.53 ммоль) аналога соединения 2 с олигоэтиленгликолевым спейсером (рис. 7) в 1 мл DMSO прибавлено 875 мг (2.65 ммоль) динитрофенилового эфира адипиновой кислоты в ДМФА (5 мл). Реакционную смесь перемешивали 12 ч при комнатной температуре, после чего прибавили к ней 60 мл 5% АсОН, выпавший осадок отфильтровали, фильтрат упарили. Выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30x750 мм), элюция - МеОН/Н ₂ 0, 3:1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 280 мг (71%). Бесцветная пена, ¹ Н ЯМР (700 МГц, D ₂ 0): 5.74 (д, J ₃₄ 2.6 Гц, Н-3 Zn), 5.24 (с, 2Н, NCH ₂ CO sp1), 4.52 (дд, 1 Н, J _6,7 1.4 Hz, J _5,6 10.5 Hz, H-6 Zn), 4.46 (дд, 1 H, J ₃ , ₄ 2.6 Hz, J ₄₅ 9.0 Hz, H-4 Zn), 4.10-3.48 (м, 35H), 3.35-3.25 (м, 4H, 2xCH ₂ NH sp1), 2.75, 2.32 (2т, 2x2H, 2xCH ₂ CONH), 2.02 (с, ЗН, NC(0)CH ₃ ), 1.85-1.77 (м, 4Н, 2xCH ₂ CH ₂ NH), 1.75-1.70 (м, 4Н, 2хСН ₂ СН ₂ СО); MALDI-MS: 5210 [М] ⁺ , 5233 [M+Na] ⁺ , 5249 [М+К] ⁺ ; Найдено (%): С 48.07; Н 7.00; N 20.27. Рассчитано для C ₂₀₉ H ₃ 5 ₂ N ₇₆ O80 (%): С 48.19; Н 6.81 ; N 20.43. Полученное соединение (448 мг, 0.58 ммоль) прибавили к нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF ₃ COOHxH-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C и 143 мг (1.94 ммоль) Li ₂ CO ₃ Bl 0 мл 12 М LiCI. Реакционную смесь оставили при интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30*750 мм), элюция - 0.05 М NH ₃ в MeCN/H ₂ 0, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 481 мг (85%).

"где X представляет собой

Пример 4.

Синтез тетрааммноиевой соли

К нагретой до 70 °С смеси 320 мг (0.12 мкмоль) [CF ₃ COOHxH-Gly ₉ -NHCH ₂ ] C и 143 мг (1.94 ммоль) Li ₂ C0 ₃ в10 мл 12 М LiCI водн. прибавили 160 мг (1.6 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь оставили интенсивном перемешивании на 72 ч, выделение продукта проводили методом эксклюзионной хроматографии на колонке с гелем Sephadex LH-20 (30*750 мм), элюция - 0.05 М NH ₃ в MeCN/H ₂ 0, 1 :1. Продукт получен в виде бесцветной пены; выход - 231 мг (72%); ¹ Н ЯМР (700 МГц, CF ₃ COOD): 4.37-4.21 (м, 18Н, 9*СН ₂ Gly), 3.19 (уш. с, 2Н, NHCH ₂ C), 2.96-2.90, 2.87-2.82 (2м, 2*2Η, 2хСН ₂ Sue); MALDI-MS: 2586[М] ⁺ , 2609 [M+Na]\ 2625 [М+К] ⁺ ; Найдено (%): С 41.98; Н 6.62; N 23.16. Рассчитано для C ₉₃ H ₁₅₂ N440 ₄₈ (%): С 42.08; Н 5.77; N 23.22.

Пример 5.

Получение со-ассоциата [Занамивир-Х-С1у ₉ -МНСН ₂ ] ₄ С и [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ]4C, соотношение 1 :5, X = C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ ) ₄ C(0)

Раствор 100 мкмоль [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (натрий-фосфатный буфер) (рН около 7) в течение 1-2 мин нагревают до температуры 60 °С (результат был одинаковым в температурных пределах 60-80 °С). К полученному нагретому раствору добавляют раствор 20 мкмоль [Занамивир- X-Gly ₉ -NHCH ₂ ]4C в дистиллированной воде (1 мл) при температуре 60-80 °С, после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при 4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.

Пример 6.

Получение со-ассоциата [Занамивир-Х-С1у ₉ -МНСН ₂ ] ₄ С и [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C, соотношение 1 :10, X = C(0)NH(CH ₂ ) ₆ NHC(0)(CH ₂ ) ₄ C(0)

12

ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Раствор 100 мкмоль [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ]4C в 1 мл дистиллированной воды (рН около 6) или в буфере PBS (натрий-фосфатный буфер) (рН около 7) в течение 1-2 мин нагревают до температуры 60-80 °С. К полученному нагретому раствору добавляют раствор 10 мкмоль [Занамивир-Х-С1у ₉ -МНСН ₂ ] ₄ С в дистиллированной воде (0.5 мл) при температуре 60-80 °С, после чего полученный раствор охлаждают до комнатной температуры в течение 10-20 минут; полученный со-ассоциат хранят при 4 °С и используют без дальнейших манипуляций, кроме разбавления.

Способ терапевтического применения соединений общей формулы (I) и со- ассоциатов по изобретению

Предмет данного изобретения также включает введение субъекту, нуждающемуся в соответствующем лечении или профилактике, терапевтически эффективного количества ингибиторов на основе занамивира общей формулы (I) или со-ассоциата по изобретению. Под терапевтически эффективным количеством подразумевается такое количество ингибитора занамивира общей формулы (I) или со-ассоциата по изобретению, вводимого или доставляемого пациенту, при котором у пациента с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния пациента, тяжести заболевания, методики введения препарата, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Ингибитор общей формулы (I) или со-ассоциат по изобретению или фармацевтическая композиция, содержащая соединение общей формулы (I) или со- ассоциат, может быть введен в организм пациента в любом количестве и любым путем введения, эффективным для лечения или профилактики заболевания.

После смешения соединения общей формулы (I) или со-ассоциата с конкретным подходящим фармацевтически допустимым носителем в желаемой дозировке, композиции, составляющие суть изобретения, могут быть введены в организм человека или других животных перорально, парентерально, местно и т.п.

Введение может осуществляться как разово, так и несколько раз в день, неделю (или любой другой временной интервал), или время от времени. Кроме того, соединение общей формулы (I) или со-ассоциат может вводиться в организм пациента ежедневно в течение определенного периода дней (например, 2-10 дней), а затем следует период без приема соединения общей формулы (I) или со-ассоциата (например, 1-30 дней).

В том случае, когда соединение общей формулы (I) или со-ассоциат по изобретению используется как часть режима комбинированной терапии, доза каждого из компонентов комбинированной терапии вводится в течение требуемого периода лечения. Соединения, составляющие комбинированную терапию, могут вводиться в организм пациента как единовременно, в виде дозировки, содержащей все компоненты, так и в виде индивидуальных дозировок компонентов.

Фармацевтические композиции

Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, которые содержат соединения по изобретению (или пролекарственную форму или другое фармацевтически приемлемое производное) и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, адъювантов, растворителей и/или наполнителей, таких, которые могут быть введены в организм пациента совместно с со-ассоциатами, составляющими суть данного изобретения, и которые не разрушают фармакологической активности этого со-ассоциата, а также являются нетоксичными при введении в дозах, достаточных для доставки терапевтического количества соединения.

Фармацевтические композиции, заявляемые в данном изобретении, содержат соединение общей формулы (I) или со-ассоциаты совместно с фармацевтически приемлемыми носителями, которые могут включать в себя любые растворители, разбавители, дисперсии или суспензии, поверхностно-активные вещества, изотонические агенты, загустители и эмульгаторы, консерванты, вяжущие вещества, смазочные материалы и т.д., подходящие для конкретной формы дозирования. Материалы, которые могут служить фармацевтически приемлемыми носителями, включают, но не ограничиваются, моно- и олигосахариды, а также их производные; желатин; тальк; эксципиенты, такие как какао-масло и воск для суппозиториев; масла, такие как арахисовое, хлопковое, сафроловое, кунжутное, оливковое, кукурузное и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные вещества, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновая кислота; апирогенная вода; изотонический раствор, раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы. Также в составе композиции могут быть другие нетоксичные совместимые смазочные вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные жидкости, пленкообразователи, подсластители, вкусовые добавки и ароматизаторы, консерванты и антиоксиданты.

Предметом данного изобретения являются также лекарственные формы - класс фармацевтических композиций, состав которых оптимизирован для определённого пути введения в организм в терапевтически эффективной дозе, например, для введения в организм орально, местно, пульмональным, например, в виде ингаляционного спрея, или внутрисосудистым способом, интраназально, подкожно, внутримышечно, а также инфузионным способом, в рекомендованных дозировках.

Лекарственные формы данного изобретения могут содержать составы, полученные методами использования липосом, методами микрокапсулирования, методами приготовления наноформ препарата, или другими методами, известными в фармацевтике.

При получении композиции, например в форме таблетки, активное начало смешивают с одним или несколькими фармацевтическими эксципиентами, такими как желатин, крахмал, лактоза, стеарат магния, тальк, кремнезем, аравийская камедь, маннит, микрокристаллическая целлюлоза, гипромеллоза или аналогичные соединения.

Таблетки можно покрыть сахарозой, целлюлозным производным или другими веществами, подходящими для нанесения оболочки. Таблетки могут быть получены различными способами, такими как непосредственное сжатие, сухое или влажное гранулирование или горячее сплавление в горячем состоянии.

Фармацевтическую композицию в форме желатиновой капсулы можно получить, смешивая активное начало с растворителем и заполняя полученной смесью мягкие или твердые капсулы.

Для введения парентеральным путем используются водные суспензии, изотонические солевые растворы или стерильные растворы для инъекций, которые содержат фармакологически совместимые агенты, например пропиленгликоль или бутиленгликоль.

Характеристика биологической активности

Противовирусная активность соединений общей формулы (I), а также со- ассоциатов по изобретению была изучена в опытах по подавлению инфекционности вируса гриппа в клеточной культуре [метод проведения эксперимента описан в работе 14], Таблица 1.

Как следует из данных, приведенных в таблице 1 , противовирусная активность супрамерного занамивира (соединения общей формулы (I) как такового сопоставима с активностью неконъюгированного Zn. В то же время, "разбавленные" со-ассоциаты по изобретению, в частности при степени разбавления 1 :10, на порядок активнее неконъюгированного занамивира. Сами по себе соединения общей формулы (II), в частности супрамер [Suc-Gly ₉ -NHCH ₂ ] ₄ C, не обладают противовирусной активностью, а их добавление к мономерному занамивиру не увеличивает активность последнего (Таблица 1)- Таким образом, производные занамивира общей формулы (I), а также со- ассоциаты по изобретению способны ингибировать инфекцию клеток вирусами гриппа значительно эффективнее, чем мономерный занамивир. Кроме того, супрамерные молекулы по изобретению (со-ассоциаты) помимо высокой противовирусной активности характеризуются также низкой токсичностью. А также лишены недостатка, которым характеризуются полимерные производные занамивира - неопределенности их структуры.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. Библиографический список:

[1] Tuzikov, A., Chinarev, A., Gambaryan, A, Oleynikov, V., Klinov, D., Matsko, N., Kadykov, V., Ermishov, M., Demin, I., Demin, V., Rye, P., Bovin, N. Polyglycine II nanosheets: supramolecular antivirals? ChemBioChem., 2003, 4(2-3), 147-154. DOI: 10.1002/cbic.200390025.

[2] Tsygankova, S., Chinarev, A., Tuzikov, A., Zaitsev, I., Severin, N., Kalachev, A., Rabe, J., Bovin, N. Assembly of oligoglycine layers on mica surface. J. Biomat. Nanobiotech., 2011 , 2(1), 90-96. DOI : 10.4236/jbnb.201 1.21012. [4] Bovin, N., Tuzikov, A., Chinarev, A. Oligoglycines: Materials with unlimited potential for nanotechnologies. Nanotechnologies in Russia (Engl. Transl.), 2008, 3(5-6), 291-302. DOI: 10.1 134/S1995078008050042.

[5] Tsygankova, S., Chinarev, A. , Tuzikov, A., Severin, N., Kalachev, A., Rabe, J., Gambaryan, A., Bovin, N.Biantennary oligoglycines and glyco-oligoglycines self-associating in aqueous medium. Beilstein . J. Org. Chem., 2014, 10, 1372-1382. DOI: 10.3762/bjoc.10.140.

[6] Bovin, N., Tuzikov, A., Chinarev, A., Gambaryan, A. Multimeric glycotherapheutics: New paradigm. Glycoconjugate J., 2004, 21(8-9), 471-478. DOI: 10.1007/s10719-004-5537-3io

[7] Baum, L.G., Paulson, J. C. Sialyloligosaccharides of the respiratory epithelium in the selection of human influenza virus receptor specificity. Acta Histochem., 1990, Suppl. 40, 35- 38.

[8] Couceiro, J. N., Paulson, J. C, Baum L.G. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium; the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity. Virus Res., 1993, 29, 155-165.

[9] Gagneux, P., Cheriyan, M., Hurtado-Ziola, N., van der Linden, E. C, Anderson, D., McClure, H., Varki, A., Varki, N. M. Human-specific regulation of alpha 2-6-linked sialic acids. J. Biol. Chem., 2003, 278, 48245-48250.

[10] RU2612221.

[11] von Itzstein, M. The war against influenza: discovery and development of sialidase inhibitors. Nat. Rev. Drug Discov. 2007, 6(12), 967-974.

[12] Shtyria, J.A., Mochalova, L.V., Bovin, N.V. Influenza virus neuraminidase: structure and function. Acta Naturae 2009, 1(2), 26-32.

[13] Scheigetz, J., Zamboni, R., Bernstein, MA, Roy, B. A synthesis of 4-a-guanidino-2-deoxy- 2,3-dehydro-N- acetylneuraminuic acid. Org. Prep. Proc. Int. 1995, 27(6), 637-644; Chandler, M., Bamford, M., Conroy. R., Lamont, В., Patwl., В., Patel, V., Steeples, I., Stoper, R., Weir, N., Wright, M., Wiliamson, C. Synthesis of the potent influenza neuraminidase inhibitor 4- guanidino Neu5Ac2en. X-Ray molecular structure of 5-acetamido-

4-amino-2,6-anhydro-3,4,5-trideoxy-D-erythro-L-gluco-nono nic acid. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1, 1995, 1173-1180.

[14] Matrosovic^ M^N., Gambaryan _A A^S. Solid-phase assays of receptor-binding specificity.

Meth. Mol. Biol., 2012, 865, 71-94. DOI: 10.1007/978-1 -61779-621 -0_5

[15] Weight A.K., Haldar J., Alvarez de Cienfuegos L., Gubareva L.V., Tumpey T.M., Chen J.,

Klibanov A.M. Attaching zanamivir to a polymer markedly enhances its activity against drug- resistant strains of influenza a virus. J Pharm Sci. 2011 , 100(3):831-835. doi: 0.1002/jps.22338.

[16] N.V.Bovin, A.B.Tuzikov, A.A.Chinarev, A.S. Gambaryan. Multimeric glycotherapeutics: new paradigm. Glycoconjugate J., 2004, 21 , 471-478.