技术领域

本发明涉及一种新的小肽物质，具体来说涉及 一种鱿鱼内脏提取的小肽及其 制备方法，还涉及这种物质的组合物以及该组 合物作为海洋水产养殖中的伺料蛋 白源的用途。

背景技术

随着我国远洋渔业的迅速发展， 鱿鱼的捕获量逐年增加， 2009年鱿鱼捕获量 已超过 30万吨，成为我国主要的水产品加工原料。但� ��我国的鱿鱼加工技术含量 低， 在加工处理获得鱼花、鱼干、咸鱿鱼、罐头及 调味品等产品后， 一般有 20%〜 30%的废弃物（内脏、 头、 足、 表皮和皮墨汁等）， 这些废弃物含有丰富的蛋白质、 脂肪、 多糖等营养物质， 据珠海市出入境检验检疫局吴莉敏 （《农产品加工》， 2007 (8)： 94-96 ) 研究表明，每 100 g鱿鱼内脏中含脂肪 21. 15 g， 蛋白质 21. 24 _g ， 钙 51. 46 mg， 铁 609. 07 μ g和磷 95. 88 μ g等。 但这些物质极易腐烂变质并且含 有对人体有害的重金属镉。通常对这些废物的 处理方法是就地掩埋， 这样不但对 渔业资源是巨大浪费， 而且还存在着环境污染的隐患。 因此， 如何有效地处理鱿 鱼废弃物并进行高值化综合利用越来越受到国 民与社会的重视。

中国水产科学院黄海水产研究所的王彩理等 （《水产养殖》， 2003， 24 ( 5 ) : 40-41 ) 研究鱿鱼内脏液化蛋白对南美白对虾的诱食性 ， 发现鱿鱼内脏浆 的诱食效果最佳， 强于甜菜碱、 牛磺酸和大蒜素。 上海水产品加工技术开发中心 的王建中等 （《中国海洋药物》， 1999， 1 : 55-58 )在对鱿鱼内脏的综合利用研究 中， 利用鱿鱼内脏及其它废弃物进行自生酶水解， 开发了鱿鱼油、 内脏水解液， 并解决了从水解液中去除镉的难题。中国海洋 大学水生生物制品安全性实验室的 刘春娥等 （《食品工业科技》， 2004, 9 ( 25 )： 83-86 ) 在鱿鱼内脏蛋白质酶解工 艺的研究中， 以氨基酸得率为主要指标， 采用不同蛋白酶对鱿鱼内脏蛋白质进行 了水解工艺研究。研究表明， 中性蛋白酶， 碱性蛋白酶， 胰蛋白酶和木瓜蛋白酶 具有较好的分解效果，氨基酸转化率可达到 50%以上。浙江工商大学的励建荣等人 的专利： 一种秘鲁鱿鱼内脏综合利用技术 （申请号： 200610053372. 6)， 将鱿鱼 内脏蒸煮， 酶液化， 加热， 离心等步骤， 得到的下层鱿鱼多肽制成用于水产动物 伺料蛋白源的鱿鱼膏，对对虾的伺喂试验表明 ， 添加鱿鱼膏能明显增加饵料的摄 取量，提高幼虾的存活率和体重。福建融鑫海 生物技术有限公司的苏祖凤的专利： 一种用鱿鱼内脏制备水产伺料诱食剂的生产方 法 （申请号： 200810071073. 4)， 通过将鱿鱼内脏蒸煮、静置、 自然酶解发酵， 油料分离后的沉淀进行 80〜90°C和 60〜65 °C两次低温真空浓縮。

由于现有的伺料蛋白源的制作工艺中主要采取 酶解后高温蒸煮、浓縮的方式 获得， 这些工艺过程容易使蛋白质变性， 产生胶原蛋白， 不仅降低了营养成分， 而且大大损害了产品对水产动物的诱食性。 即使采用苏祖凤等人的方法， 利用 SJN2-2000二效蒸发器对酶解液进行二次浓縮， 使蒸发温度控制在 90°C以下， 大 大降低了浓縮温度， 但是依然无法从根本上解决这一难题。

发明内容

本发明的目的在于摒弃高温蒸煮方法，利用超 滤膜从鱿鱼内脏提取出一种新 的小肽， 另一目的是开发出该小肽的制备方法， 又一目的是开发出含有该小肽的 组合物及其用途。

我们将日本鱿鱼 Todarodes pacificus 内脏经有机溶剂脱脂后， 用爱尔 卡酶和胰蛋白酶酶解，然后用超滤膜过滤脱脂 后的酶解液， 再用凝胶色谱分离纯 化， 得到含有氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-的小肽物质， 加入山梨酸钾搅匀、 干燥。 将本发明小肽、 豆粕粉、 玉米粉、 淀粉、 鱼粉等按配比制粒， 得到的组合 物可用作海洋水产养殖伺料蛋白源，对鱼虾贝 类等有非常好的诱食作用， 从而实 现了本发明的目的。

本发明的鱿鱼内脏提取的小肽， 其特征是含有氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-, 相对分子质量范围为 1400〜5800， 并通过下述方法制备得到： ( 1 ) 将日本鱿鱼内脏搅碎， 加水搅匀， 用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷的 混合溶剂脱脂， 去除有机溶剂层， 水层在室温下晾 1〜3小时， 50〜60°C下烘 1〜3 小时， 加入温度为 50〜60°C的水， 调节 pH值至 8. 0〜8. 5， 然后在 50〜60°C保温状 态下， 按每克原料 2000〜3000单位的比例用爱尔卡酶酶解 1〜3小时后， 再按每克 原料 2000〜3000单位的比例用胰蛋白酶酶解 1〜3小时， 去除不溶物质， 得到酶解 液； （2 )将步骤（1 )得到的酶解液用截留分子质量 18000Da超滤膜过滤， 再用凝 胶色谱分离纯化， 得到含有氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。

本发明的鱿鱼内脏提取的小肽还可以加入防腐 剂，例如山梨酸钾， 最好在步 骤 （2) 得到的小肽物质每 lOOOg中加入 0. 025〜0. 050g山梨酸钾， 搅匀， 干燥。 在中试制备中， 小肽物质的纯度值为 51%〜63%时有利于成本控制。

本发明的鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法， 其特征是包括以下的步骤：

(1) 将日本鱿鱼内脏搅碎，加水搅匀， 用石油醚或正己烷或石油醚和正己烷 的混合溶剂脱脂，去除有机溶剂层，水层在室 温下晾 1〜3小时， 50〜60°C下烘 1〜 3小时， 加入温度为 50〜60°C的水， 调节 pH值至 8. 0〜8. 5， 然后在 50°C〜60°C保 温状态下， 按每克原料 2000〜3000单位的比例用爱尔卡酶酶解 1〜3小时后， 再按 每克原料 2000〜3000单位的比例用胰蛋白酶酶解 1〜3小时， 去除不溶物质， 得到 酶解液；

(2) 将步骤（1 )得到的酶解液用截留分子质量 ISOOODa超滤膜过滤， 再用凝 胶色谱分离纯化， 得到含有氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-的小肽物质。

本发明的鱿鱼内脏提取的小肽的制备方法， 还可以在步骤 （2) 得到的小肽 物质中加入防腐剂， 例如山梨酸钾， 最好在每 lOOOg小肽物质中加入 0. 025〜 0. 050g山梨酸钾， 搅匀， 干燥。

鱿鱼内脏提取的小肽的分子质量计算方法：

logMw = -b Kav + c; 有效分配系数 Kav是表示被排阻的程度， Mw表示物质 的分子质量， b， c为常数与凝胶柱本身性质相关，可通过标准� �白质样品计算 b， c 值。

凝胶色谱分离纯化和分子质量测定的操作包括 ：

( 1 ) 采用中大型凝胶色谱柱进行分离纯化。 将日本鱿鱼内脏按上述本发明 方法脱脂处理后进行酶解， 截留分子质量 18000Da超滤膜过滤鱿鱼内脏酶解液。 采用中大型凝胶色谱进行分离， 凝胶色谱型号： Sephadex G-25, 柱型号：200 X 10 cm, 缓冲液为 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液（含 0. 16 mol/L NaCl)， pH= 7. 0， 溶剂流 速 10 mL/min, 柱床体积约 12000 mL, 将样品配成浓度为 50〜100 mg/mL的溶液， 用 0. 45 m微孔滤膜过滤， 取 500〜1000 mL进样分离纯化， 采用下述步骤方法分 析检测。

( 2 ) 采用小型凝胶色谱进行分子质量测定。 分析条件选择： 凝胶色谱型 号： Sephadex G-25；柱型号： 100 X 1 cm, 缓冲液为 0. 05 mol/L磷酸盐缓冲液（含 0. 16 mol/L NaCl) ， pH= 7. 0， 溶剂流速 0. 20 mL/min, 检测波长 280 歷， 柱床体 积约 60mL。

( 3 )将标准蛋白质样品配成浓度为 5mg/mL的溶液， 用 0. 30 m微孔滤膜过滤， 取 0. 5mL进样， 获得 （Kav， logMw) 的对应点三个（28. 5, 4. 16)、 （53. 7, 3. 13)、

(74. 9, 2. 26)， 通过计算获得公式： logMw = -0. 041 Kav + 5. 33 ( R ² = 0. 9998)。

( 4)将步骤（1 )分离纯化的日本鱿鱼内脏酶解液经 0. 30 m微孔滤膜过滤后， 调整浓度至 10mg/mL。采用小型凝胶色谱， 取 0. 5mL进样， 得出鱿鱼内脏提取的小 肽在直线上的 ( Kav, logMw) 点分别为 （53. 3， 3. 15)、 （38. 2， 3. 76)， 计算其 对应分子质量为 1400和 5800。

本发明含有鱿鱼内脏提取的小肽的组合物， 其特征是按总质量分数 100%计， 由鱿鱼内脏提取的小肽 6%〜8%， 豆粕粉 50%〜60%， 鱼粉 3%〜6%， 玉米粉 27%〜33% 和制粒用淀粉 2%〜5%组成。所用的豆粕粉， 鱼粉， 玉米粉和制粒用淀粉为水产伺 料用， 从市场购买。

本发明的组合物的制备方法，是按上述比例将 鱿鱼内脏提取的小肽、豆粕粉、 鱼粉和玉米粉搅匀， 以配料：水 =1 : 4 (质量比）的比例加入适量的水， 搅匀， 喷雾 干燥， 得干膏粉； 按配方比例向干膏粉中加入制粒用淀粉， 制粒， 晾干得到。

本发明的组合物可用作海洋水产养殖中的伺料 蛋白源， 包括海洋鱼、虾、 贝 类等的伺料蛋白源， 特别适合海洋水产鱼类的伺料蛋白源。

本发明中鱿鱼内脏提取的小肽的制作过程中温 度不超过 60°C，干燥时采用喷 雾干燥器进行干燥， 时间短、 效果好， 保证了该物质不水解、 不变性。 本发明的 组合物具有强的鱼类诱食性， 其主要成分鱿鱼内脏提取的小肽具有浓郁的腥 香 味， 是水产养殖伺料蛋白源的佳品。利用本发明提 供的组合物养殖海洋鱼类， 可 大幅度的提高鱼类的摄食量， 增加鱼类个体的单位重量。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明， 不是对本发明的限制。实施例中主要 原材料、 主要仪器设备、 主要生物和化学试剂等如下：

主要原材料：

从广州市黄沙海产品市场收集日本鱿鱼 （Todarodes pacificus ) 内脏， 储 存于 -15°C下备用， 使用前 12小时在室温下解冻。 "大江牌"常规鱼用配合伺料， 上海大江（集团）股份有限公司。 所用豆粕粉， 玉米粉购自济宁双华工贸有限公 司， 所用鱼粉购自荣成新希望鱼粉有限公司。

主要仪器设备：

发酵罐： LABF0RS 实验室台式小型发酵罐，产地瑞士； 匀浆机： 予华 A8G型， 产地：河南巩义；落地式离心机： Bechman J2-Hs高速冷冻离心机，产地美国； 中 大型凝胶色谱型号： S印 hadex G-25, 柱型号：200 X 10 cm, 缓冲液为 0. 05 mol/L 磷酸盐缓冲液（含 0. 16 mol/L NaCl)， pH= 7. 0， 溶剂流速 50 mL/min, 柱床体积 约 12000 mL; 835-50氨基酸自动分析仪（日本 Hitachi公司）；色谱仪 Waters 2690， 质谱仪 Waters Platform ZMD 4000。

主要生物和化学试剂：

胰蛋白酶： 100万活力单位 /g， 大连保税区联合博泰生物技术有限公司， 产 品编号： RM00102。 爱尔卡 （Alcalase) 蛋白酶： 50万活力单位 /g， 诺维信公司。 有机试剂:有机试剂购自广州试剂公司 （分析纯）。 无机试剂:无机试剂购自广州 试剂公司 （分析纯）。 纯水： 实施例中用水均为纯水， 使用 MiniQ纯水制备系统制 备。

实施例 1 :

收集 20 kg日本鱿鱼内脏， 予华 A8G型匀浆机搅拌破碎，加入 2L水，再加入 20L 沸程为 60〜90°C的石油醚搅拌脱脂，去除石油醚层，� �水层在室温下晾 3小时， 50 烘箱中烘 3小时； 加入温度为 50°C的水 8L， 搅匀， 用饱和 NaOH溶液调节 pH值至 接近 8. 5， 再用 5 mol/L浓度的 NaOH溶液调节 pH值至 8. 5， 50°C保温状态下， 将鱿 鱼内脏放入发酵罐中， 按 3000单位 /g原料加入 6 X 10 ⁷ 单位爱尔卡酶酶解 3小时后， 再按 3000单位 /g原料加入 6 X 10 ⁷ 单位胰蛋白酶酶解 3小时； 用 Bechman J2_Hs高速 冷冻离心机以 5000转 /分钟离心分离， 去除不溶物质； 利用截留分子质量 18000Da 超滤膜过滤脱脂后的酶解液， 获得富含小肽的成分， 再用中大型 Sephadex G-25 凝胶色谱分离纯化， 获得含有氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-的小肽物质， 按每 1000g小肽中加入 0. 025g山梨酸钾的配比加入 0. 0059g山梨酸钾；干燥后得鱿鱼内 脏提取的小肽。

称取鱿鱼内脏提取的小肽 80g， 豆粕粉 600g， 鱼粉 30g， 玉米粉 270g， 加入 4L水， 搅拌均匀后喷雾干燥， 得到干膏粉； 再称取制粒用淀粉 20g， 制粒， 晾干， 得到组合物。

实施例 2 :

收集 20 Kg日本鱿鱼内脏， 予华 A8G型匀浆机搅拌破碎， 加入 12 L水， 再加入 20L石油醚和正己烷混合溶剂（1 : 1 )搅拌脱脂， 去除石油醚层， 将水层在室温下 晾 1小时， 60°C烘箱中烘 1小时； 加入温度为 60°C的水 8L， 搅匀， 用饱和 NaOH溶 液调节 pH值至接近 8. 0，再用稀浓度的 NaOH溶液调节 pH值至 8. 0； 60 °C保温状态下， 将鱿鱼内脏放入发酵罐中，加入 4 X 10 ⁷ 单位爱尔卡酶酶解 1小时后， 再加入 4 X 10 ⁷ 单位胰蛋白酶酶解 1小时； 用 Bechman J2_Hs高速冷冻离心机以 5000转 /分钟离心 分离， 去除不溶物质； 利用截留分子质量 ISOOODa超滤膜过滤脱脂后的酶解液， 获得富含小肽的成分， 再用中大型 Sephadex G_25凝胶色谱分离纯化， 获得含有 氨基酸结构片段 -ILGGSDPKHYTG-的小肽物质， 按每 1000 _g 小肽中加入 0. 050g山梨 酸钾的配比加入 0. 0078g山梨酸钾， 干燥后得鱿鱼内脏提取的小肽。

称取鱿鱼内脏提取的小肽 60g， 豆粕粉 500g， 鱼粉 60g， 玉米粉 330g， 加入 4L 水， 搅拌均匀后喷雾干燥， 得干膏粉； 再称取制粒用淀粉 50g， 制粒， 晾干， 得 到组合物。 实施例 3 :

称取实施例 1的鱿鱼内脏提取的小肽 65g，豆粕粉 535g，鱼粉 30g，玉米粉 330g， 加入 4L水， 搅拌均匀后喷雾干燥， 得干膏粉； 再称取制粒用淀粉 40g， 制粒， 晾 干， 得到组合物。 实施例 4:

称取实施例 2的鱿鱼内脏提取的小肽 75g，豆粕粉 575g，鱼粉 50g，玉米粉 280g， 加入 4L水， 搅拌均匀后喷雾干燥， 得干膏粉； 再称取制粒用淀粉 20g， 制粒， 晾 干， 得到组合物。 实施例 5:

氨基酸组成分析： 将实施例 1和 2获得的鱿鱼内脏提取的小肽分别置于水解管� �， 加入 6 mol/L 的盐酸溶液， 真空封口。 在 11CTC下水解 24h， 冷却后定容、 过滤和蒸干， 再加入

0.02 mol/L的盐酸溶液在空气中放置 30 min, 采用 835-50氨基酸自动分析仪（日 本 Hitachi公司）， 测除色氨酸以外的氨基酸含量， 结果得到：

I:L:G:S:D:P:K:H:Y:T=1.05:1.02:3.01:0.96:0.98:1.00:0.97:0.98: 0.95:

1.00。

采用液质联用（LC-MS)仪测分子质量：

液相色谱条件：色谱仪 Waters 2690,检测器： Waters 996，分析柱 Lichrospher C-18 (2.6 X 250mm), 流动相： 甲醇-水 _0.5%乙酸梯度洗脱， 检测波长 220nm， 柱温 30°C， 进样量， lO L,流速 0.3mL/min; 质谱条件： 质谱仪 Waters Platform ZMD4000, 离子方式 ESI ⁺ ， 毛细管电压 4.80kV， 锥孔电压 32 V， Gas Flow: 4.2L/h, 离子源温度 120°C， 脱溶剂气温度 250°C， 质量范围： 1000〜8000m/z， 光电倍增 器电压 670V， Analyser Vacuum2.6e〜5mBar。

采用液质联用仪测定小肽分子质量时没有发现 其分子离子峰，只得到其脱去 部分基团后的碎片峰。

氨基酸序列测定： 采用 Edman降解法测鱿鱼小肽的氨基酸序列。 序列分析表 明小肽具有 -ILGGSDPKHYTG-顺序结构链接。

通过对鱿鱼内脏提取的小肽的氨基酸进行氨基 酸组成分析、 凝胶色谱分析、 小肽分子质量测定和氨基酸序列测定，结果得 到其中含有 -ILGGSDPKHYTG-小肽结 构片段， 相对分子质量在 1400至 5800之间。 实施例 6:

鲻鱼的伺喂实验， 2009年 4月，取 1龄鲻鱼 50尾， 分成不添加本发明伺料蛋白 源的对照组（10尾）、按 10%添加实施例 1〜3的组合物的实验组（各 10尾）和按 10% 添加鱿鱼内脏鲜液的实验组（10尾）， 而且都喂养相同的普通伺料（"大江牌"常 规鱼用配合伺料）。 把鱼放入 5个 1.5立方米左右的池中， 前一个月每天换水 1/5， 后半个月每天换水 1/3， 记录其 7天、 15天、 30天和 45天后的总体重和相应时间间 隔内伺料消耗总量， 分析他们的重量变化情况和伺料消耗情况。其 中第 17天对照 组鲻鱼死亡 1尾，数据是按 10尾换算后的数据。 结果见表 1， 鱿鱼内脏鲜液为鱿鱼 内脏经过自生酶解 3小时后获得的末经加工的物质。从表 1可以清楚看到： 与不添 加本发明伺料蛋白源的对照组和添加一般鱿鱼 内脏酶解鲜液的实验组相比，含鱿 鱼内脏提取的小肽的本发明组合物作为伺料蛋 白源可大幅度的提高鲻鱼的摄食 量， 增加鲻鱼个体的单位重量。 实施例 1〜3的组合物， 鱿鱼内脏鲜液和对照组对鲻鱼生长的影响

实施例 7:

鲈鱼的伺喂实验， 2009年 8月， 取出生 45天的大口黑鲈鱼 50尾， 分成不添加 本发明伺料蛋白源的对照组（10尾）、按 10%添加实施例 1-3的组合物的实验组（各 10尾）和按 10%添加鱿鱼内脏鲜液的实验组（10尾）， 而且都喂养相同的普通伺料 ("大江牌"常规鱼用配合伺料）。把各组鱼放入 5个 1. 5立方米左右的池中， 前一 个月每天换水 15%， 后一个月每天换水 20%， 记录其 7天、 15天、 30天和 60天后的 总体重和相应时间间隔内伺料消耗总量，分析 他们的重量变化情况和伺料消耗情 况。 其中第 5天对照组鲈鱼死亡 1尾， 数据是按 10尾换算后的数据。 结果见表 2。 鱿鱼内脏鲜液为鱿鱼内脏经过自生酶解 3小时后获得的末经加工的物质。 从表 2 可以清楚看到：与不添加本发明伺料蛋白源的 对照组和添加一般鱿鱼内脏酶解鲜 液的实验组相比，含鱿鱼内脏提取的小肽的本 发明组合物作为伺料蛋白源可大幅 度的提高鲈鱼的摄食量， 增加鲈鱼个体的单位重量。 实施例 1-3的组合物， 鱿鱼内脏鲜液和对照组对鲈鱼生长的影响