本发明涉及一种 J亚群禽白血病病毒的肽核酸及其应用。

背景技术

禽白血病是由禽白血病病毒 （avian lekosis virus, ALV) 引起的以造血细 胞恶性增生为主的一类传染病， 包括淋巴细胞性白血病， 成红细胞性白血病， 成 髓细胞白血病和髓细胞样白血病， 对养禽业危害最大的是禽淋巴细胞性白血病 ( lymphoid leukosis, LL) 。 根据病毒囊膜特性、 病毒中和实验、 宿主范围和 基因组的分子生物学特性， 现己将该病毒分类成 10个亚群： A〜J亚群， 其包 括了除网状内皮组织增殖病病毒以外引起禽类 肿瘤性疾病的所有逆转录病毒。其 中 A、 B、 C、 D 为外源性病毒， E、 F、 G、 H、 I 为内源性病毒。 A、 B 亚群是商 业蛋鸡（来航鸡） 最为常见的外源性病毒亚群， 而 (、 D亚群感染率极低， 几乎 很难检测到； E 亚群包括普遍存在的低致病性和无致病性的内 源性病毒。 J亚群 于 1988年， 由 Payne等同事首次从商品代肉用鸡中分离得到， J亚群是一外源 性白血病病毒，其与内源性 E亚群的重组体，可以通过水平和垂直传播在� �群中 广泛散播，所有肉用型品系的鸡对 ALV-J都易感，但感染鸡的肿瘤发病率却有显 著差异， 蛋鸡虽可感染 ALV- J， 但自然感染时很少引起肿瘤； 随着养鸡生产规模 的不断增大， 疑似淋巴性白血病 J 亚群 ( ALV— J) 的发生更为广泛， 使发病鸡 群死淘率高， 给养鸡生产场带来严重的经济损失。

该病 1998年在世界范围内暴发， 给世界养禽业造成了沉重打击。 1999年， 杜岩等在国内首次从商品代肉鸡中分离并检测 到 ALV-J病毒。 2000 年以后， J 亚群白血病在我国鸡群中全面暴发， 并呈现出宿主范围扩展，其垂直和水平传播 引起临床和亚临床感染而造成较大的经济损失 。

禽白血病导致的经济损失主要有两个方面。 一是引起肿瘤， 导致鸡的死亡。 二是产生非肿瘤性疾病，造成免疫抑制造成的 亚临床感染，表现为鸡的消瘦和贫 血， 耐受性病毒血症， 免疫抑制等， 由此严重影响养鸡生产。 ALV- J感染可造成 鸡多重感染，在个体病鸡中可同时检出几种不 同的病毒， 如网状内皮增生症病毒 ( REV) 、 传染性法氏囊病毒、 鸡传染性贫血病毒等。 在实际生产过程中， 人们 通常只关注肿瘤形成对生产的影响，往往忽略 其亚临床感染。免疫抑制可包括淋 巴器官萎缩或发育不全、高血症丙球蛋白增多 、促有丝分裂剂诱导的胚细胞形成 减少以及抗体应答降低。 因此， ALV对养禽业造成的损失主要是由于其前期非肿 瘤性疾病（免疫抑制）引发的， 而后期由于肿瘤造成的死亡只是免疫抑制从量 变 到质变的一个表面现象。

病鸡临床症状主要表现为食欲不振， 进行性消痩； 羽毛异常， 患病鸡精神状 态差； 部分鸡的腹部胀大， 可触摸到肿大的肝脏； 鸡冠及肉髯苍白， 有些鸡冠萎 缩； 有的头部、 背部、 胸部、 腿部及翅膀可见 1〜3 cm大小的血疱， 呈褐紫色， 质地柔软， 有一定的弹性， 与周围皮肤界限清楚， 血疱破裂后流血不止， 血疱周 边的羽毛被大片血迹污染。

免疫抑制是指由于受到各种因素（如营养、 疾病、 应激等） 的影响， 使得机 体对抗原应答能力低下甚至缺失的现象。其中 由病毒引起的免疫抑制尤为严重从 而形成免疫抑制。 ALV- J引起成年肉鸡骨髓细胞瘤， 导致很高的死亡率， 还能使 繁殖力下降（由于影响种公鸡的发育）。 由于种母鸡的死亡和繁殖力下降， 使得 孵化用蛋减少，造成肉鸡饲养业的严重损失。 ALV 除了可引起原发感染引起鸡的 死亡， 更重要的是损害免疫器官， 如对鸡胸腺、法氏囊等主要免疫器官可造成严 重损伤， 使免疫器官功能降低， 使得机体的抗病力下降， 最终导致并发症和继发 感染。 另外， ALV- J 造成免疫抑制的解除很困难， 使鸡群对疫苗免疫不产生应答 或应答能力下降， 造成免疫失败， 引起烈性传染病暴发。

病毒粒子直径 80〜100 nm, 由外部的囊膜和内部的电子致密的核衣壳构成 ， 核心结构由二倍体 RNA和核衣壳、 反转录酶、 整合酶、 蛋白酶组成， 呈正二十面 体。 病毒囊膜上有放射状突起， 直径约为 8 ran。 ALV基因组全长约 7. 2 kb, 可 直接作为 mRNA。 ALV 结构基因从 5 ' 端至 3' 端顺序为 gag-pol- env， 分别编码 病毒结构蛋白、 RNA依赖的 DNA聚合酶 (反转录酶） 和囊膜糖蛋白。 gag基因编 码病毒内部非糖基化结构蛋白， 包括基质蛋白、 蛋白酶、 衣壳和核衣壳。 在 ALV 亚群间， 这些病毒蛋白十分保守， 具有高度的同源性， 即所谓的群特异性抗原或 GSAc pol 基因编码病毒的反转录酶和整合酶， 以完成作为细胞基因信息表达前 的病毒至前病毒以及前病毒 DNA整合进细胞染色体的过程。 erw基因编码病毒囊 膜糖基化蛋白。 包括膜表面糖蛋白亚单位 （SU) gp85和跨膜糖蛋白亚单位（TM) gp37。 SU是由 gp85基因编码的， 它含有病毒一受体决定簇， 决定禽白血病的亚 群特异性； TM负责将病毒转入细胞。结构基因两侧的长末� ��序列（ long terminal repeats, LTR ) , 与病毒 RNA的复制和翻译有关。 急性转化型 ALV还带有病毒 性肿瘤基因（v2 _0nC0gene )。 该病毒含有 5 种结构蛋白即病毒群特异性抗原衣壳 蛋白 P27， 病毒基膜蛋白 P19， 参与 RNA 加工与包装的核衣壳蛋白 P12， 参与蛋 白前体剪切的天冬氨酸酶 P15,功能不详的 P10。内源性病毒 RAV-0株中存在 P27 的变异体即 P270。

反义核酸（antisense nucleic acid)是一段与靶基因 （mRNA或 DNA) 的某段 序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列 ，反义核酸通过碱基配对方式特异 性的与病毒靶基因结合形成杂交分子，从而在 复制、转录和翻译水平调节靶基因 的表达， 或诱导 RNase H识别并切割 mRNA, 进而使其功能丧失。

反义核酸包括反义 RNA (antisense RNA)和反义 DNA (antisense DNA) , 具有 合成方便、 序列设计简单、 容易修饰、 选择性高、 亲和力强等特点。 反义核酸作 为一种新的抗病毒、抗肿瘤药物， 掀起了一场药理学领域的革命， 即新的药物受 体 mRNA通过新受体结合方式（Watson- Crick杂交） 、 引发新的药物受体结合后 反应： （1 ) RNase H介导的靶 RNA的降解； （2) 抑制 DNA的复制和转录及转录 后的加工和翻译等。 可以说反义寡核苷酸（ODNs )疗法比传统的药物治疗手段有 更高的特异性。 从二十世纪 70年代末到现在， 在这三十年的时间中， 反义核酸 药物已走出实验室， 进入了实际临床应用。 特别是第一个反义核酸药物 Foraivirsen通过 FDA批准上市后， 人们对反义疗法尤为关注。

反义核酸作用原理基于碱基配对原则，可通过 与靶 RNA进行碱基配对结合的 方式参与对相关基因表达的调控。 其作用方式可能有： ①反义 RNA与病毒 mRNA 结合形成互补双链阻断核糖体与病毒 mRNA的结合，从而抑制了病毒 mRNA翻译成 蛋白质的过程。②反义 DNA能与靶基因形成一种三链核酸 (triple helix nucleic acid) , 它通过作用于控制基因转录的转录子、 增强子和启动子区， 对基因的转 录进行调控。③反义核酸与病毒 mRNA的结合可阻挡 mRNA向细胞质的运输。④反 义核酸与病毒 mRNA结合后使得 mRNA更加易被核酸酶识别降解， 从而大大缩短 mRNA 的半衰期。 上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达 的抑制或调控， 且这种调控是高度特异性的。

反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所 打靶的基因， 从理论来分析， 研究人员以动物细胞为例，其染色体大约有几 十亿对碱基，如果 4个碱基（A、 G、 C和 T ) 的数目大致相同， 并在整个基因中随机分布， 那么按照统计学原理， 大 于 17个碱基的反义核酸与非靶基因杂交的可能性� ��大，所以长度超过 17个碱基 的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯一 的，从而使反义核酸具有高度的特 异性。

研究表明，在细胞内部一个拷贝的基因会产生 200-300条 mRNA， 翻译出 10 万个具有生物活性的蛋白质分子。传统药物主 要作用于有生物功能的蛋白分子的 某结构域上的几个作用位点， 事实上蛋白的结构是非常复杂的， 且在生物体内， 活性蛋白的空间结构又是千变万化的，以传统 药物有限的几种作用位点来控制靶 分子的动态的和整体的功能很难达到理想的效 果，因而不难看出传统药物的局限 性。 由 mRNA可翻译出几十到几百个蛋白， 反义核酸在 mRNA水平对靶基因直接进 行调控，这个步骤相当于将传统药物作用放大 了数十到数百倍， 可见反义核酸的 调控是极其经济合理的。

毒理学研究表明， 反义核酸在体内具有很低的毒性， 尽管其在生物体内的存 留时间有长有短，但最终都将被降解消除，这 避免了如转基因疗法中外源基因整 合到宿主染色体上的危险性。 与传统药物相比， 反义核酸药物具有特异性强， 效 率髙和毒副作用低等优点，在抑制肿瘤生长和 抗病毒复制等方面显现出了良好的 应用价值。 目前己有多个药物进入美国和欧洲市场， 另还有 30多种反义核酸药 物正在进行临床前期的研究或开发后进入了 I、 II和 III期实验。

由于动物体内存在大量的核酸外切酶， 反义核酸若不经过化学修饰，很快就 被降解， 失去活性。 目前对反义核酸的化学修饰有很多方法， 常见的有硫代修饰 反义核酸及 2 ' -甲氧基修饰反义核酸等。且目前硫代修饰药� �的研究最为全面， 它可有效抵抗核酸酶的降解， 同时可促进核酸酶 Rase H的活性， 目前这种修饰 方法已成功用于临床的反义核酸药物。 但这些还只是第一代反义核酸的修饰方 法， 随着技术的发展与进步， 新的修饰途径与方法被幵发出来， 使得反义核酸的 研究进入了第二、 三代， 其中肽核酸的修饰最为引人关注。

肽核酸 （peptidenucleic acids, PNAs ) ， 是一种以中性酰胺键为骨架的全 新的 DNA类似物，可序列特异的靶向作用于 DNA的大沟槽， 其骨架的结构单元为 N (2-氨基乙基) -甘氨酸，碱基部分通过亚甲基羰基连接于主� �架的氨基 N上。为 反义核酸的第二代产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种

本发明所提供的肽核酸， 选自如下任一种或任几种肽核酸：

a) 其核酸序列为序列表中的序列 1

5， - AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3 ' ；

b ) 其核酸序列为序列表中的序列 2

5 ' - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3 ' ；

c ) 其核酸序列为序列表中的序列 3

5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3 ' ；

d) 其核酸序列为序列表中的序列 4

5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3 ' 。

其中， 所述肽核酸可以为经壳聚糖修饰的肽核酸。

本发明的肽核酸用于制备抗 J亚群禽白血病病毒的药物。

本发明的肽核酸制剂， 其活性成分为所述的肽核酸。

其中，所述制剂为结肠溶控释微囊制剂、注射 用冻干制剂或口服用水溶性颗 粒剂。

本发明的肽核酸制剂还含有可药用载体或赋形 剂。

本发明的肽核酸制剂的稳定性分析

高温： 流通蒸汽高温 105°C， 20分钟灭菌不影响其生物活性。

极端温度： 50'C存放 6个月不影响其生物活性。

室温： 存放 24个月不影响其生物活性。

低温： -2CTC存放 48个月不影响其生物活性。

本发明的肽核酸无毒副作用， 无耐药性， 能特异性直接抑制 ALV-J复制， 抗 病毒效果好， 无药残等食品安全问题。 具体实施方式

J 亚群禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒（aivan leukosi s subgroup J， ALV-J ) 引起的一种主要发生于鸡的传染病， 其主要引起鸡的造血细胞恶性增 生， 该病近年来在我国鸡群中病毒阳性率呈快速上 升趋势， 并呈现出宿主范围扩 展，其垂直和水平传播引起临床和亚临床感染 而造成较大的经济损失。到目前为 止，对该病尚无有效的防控措施， 开发预防和治疗 ALV-J感染的新技术显得尤为 迫切，另 ALV-J侵害鸡的免疫系统，使感染后鸡群的免疫� ��低下，引发免疫抑制， 一旦感染容易继发其它传染病。到目前为止， 尚未成功开发出可以预防该病的有 效疫苗， 本发明率先将肽核酸技术与反义核酸技术结合 起来， 并应用于预防和治 疗 ALV-J病毒感染引发的相关疾病。

为此， 本发明采用了以下技术方案：

ALV-J毒株： NS- XI I株， 来自楠森兽医诊断技术研究中心实验室。

CEF细胞： 常规方法制备的鸡胚成纤维细胞 （CEF)。

DF-1细胞： 来自楠森兽医诊断技术研究中心实验室。

针对抗 ALV- J的肽核酸体外抗病毒效果分析

从 GenBank数据库检索出 ALV- J的基因组，用生物学软件进行序列分析，综� � 考虑序列的保守性， G+C%含量， 碱基分布特点， 然后从中挑选出合适的区域设计 反义核酸， 最后所确定的针对病毒的 gp85和 P27基因的反义核酸序列如下。

gp85

gp85-l : 5， - AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3 ' ；

gp85-2: 5， - UAAAUCGGUGUUGUUAUCGCA-3 ' ；

gp85-3 : 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3 ' ；

P27

P27-1 : 5， - AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3 ' ；

P 27-2： 5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3 ' ；

P27-3 -. 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3 ' 。

人工合成如下肽核酸， 肽核酸的序列如下：

gp85

g _P 85-l : 5， - AGACUAAGGCAAAAAUCUGUU-3 ' ； gp85-2: 5， ― UAAAUCGGUGU翻画 CGCA- 3， ；

gp85-3: 5， - ACGACUUAUUGAAAAACUCUC-3 ' ；

P27

P27-1 : 5， - AUAACUCUCAUUAGAUUCGUA-3 ' ；

P 27-2： 5， - UAUAACCGUCUGUAGUUGGAC-3 ' ；

P27-3: 5， - ACAUAUUUGAUUAUCUCUCCU-3 ' 。

壳聚糖 -肽核酸：以壳聚糖修饰肽核酸,修饰方法为本� ��域中已知的多种方法 具体如下述文献：

Luessen H L, de leeuw B J, Lang emeyer M, et al . Mucoadhesive polymers in peroral peptide drug delivery. 0 . carbomer and chitosan impro ve t he abso rptio n of the pept ide drug buser elin in vivo [ J] . Pharm Res,

1996, 13 ( 11) ： 1 668- 1 172.

Kotze A F, Luessen H L, de Leeuw B J, et al . Compar ison o f the effect of differ ent chitosan salts and N- tr-I methyl chitosan chlo ride o n the permeability of intestinal epithelial cells [ J] . J Control Release, 1998, 51 ( 1) :35- 46.

T hanoo B C, Sunny M C, Jayakrishnan A. Cr osslinked chit osan micro spheres : prepa ratio n and ev aluatio n as a matr ix fo r the co ntr oiled release of pharmaceuticals [ J] . J PharmPharmacol, 1992, 44 ( 4) ： 283-286.

Por tero A, ReraunanLo pez C, Cr iado M T, et al . Reacety lated chito san micr ospher es fo r contro lied deliver y of ant-i micro bial agents t o t he gastr ic mucosa [ J] . J Microencapsul, 2002, 19 ( 6) ： 797- 809. 采用 ALV-J病毒特异性定量 RT- PCR检测肽核酸对病毒靶基因的抑制程度， 同时运用病毒毒价测定实验检测抗病毒的滴度 。

Day 1 :

铺板： 消化前期准备的 DF- 1 细胞， 离心收集， 细胞计数， 用完全培养基 (DMEM+5%胎牛血清 +青链霉素）将细胞浓度调到 3〜6 X 105 个 /ml , 铺 24孔板， 于 37°C二氧化碳培养箱中进行培养 18-24小时。

Day 2 :

显微镜观察细胞的密度， 待细胞长满孔板面积的 70~80%时， 且细胞状态良 好。 吸去培养液， 每孔加入 30(M待筛选药物（即肽核酸） ， 每个药物 10个孔。 温育 1小时后， 加入 ΙΟΟμΙ ΑΙ Μ (感染比为 0. 01 ) ， 吸附 2小时后， 用营养液 洗去未吸附的病毒后， 再加入含 4%FBS的 DMEM培养基， 在 37Ό和 5%C02环境中 继续培养， 感染后定时观察细胞病变。 感染后 72h， 将感染细胞进行反复冻融以 释放病毒， 以此为样本进行病毒检测。实验过程中还设不 加病毒和肽核酸的正常 细胞对照组， 加病毒、 不加肽核酸阳性对照组和加肽核酸药物、 不加病毒的阴性 对照组。

Day 3-5 :

观察药物对细胞的保护效应， 并对结果进行评判。

Real-time PCR定量检测

收集上述各处理组中的上清液， 用病毒总 RNA提取试剂盒提取病毒 RNA。 对 获得的病毒 RNA首先进行反转录成 cDNA, 然后运用针对的引物分别检测 ALV-J 处理组中的病毒含量。定量扩增后的结果，运 用统计学软件计算出各处理组中病 毒滴度， 抑制效果以 PNA组与空白对照组差异的倍数。

本发明参考 Huang等提供的引物， 釆用 real- time PCR定量检测 ALV-J。

ALV-J特异性检测引物

引物 1 : 5， - TCAGGACCAAGGGCTTAC -3， ；

引物 2 : 5， - CTGCCGCTATAACCGTCTG -3' 。 β -actin 为内参

Actin-F: 5， - TCCCTGTATGCCTCTGGTC -3， ；

Actin-R: 5， - TCTCTCTCGGCTGTGGTGG -3， 。 反应体系 (25 μ ΐ )

试剂 用量 (ul )

2 X One-Step SYBR RT-PCR Buffer 12. 5

Ex Taq T M HS 0. 5

PrimeScript T M RT Enzyme Mix II 0. 5

PCR 正向引物 0. 5

PCR 反向引物 0. 5

总 讓 2 无 RNase dH20 8. 5

总里 25 反应条件

反转录 组

42 °C 5 min

95 °C 10 sec

PCR扩增

Cycle: 40

95 °C 5 sec

60 °C 30 sec

反应结束后确认 Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线， 以确 保结果的特异性与可靠性。

针对 ALV- J的肽核酸体外抗病毒结果 .

定量 PCR检测结果显示， 除 gp85-2效果不明显外， gp85- 1， gp85_3的抑制率 分别为： 78 %和83% (表 1) ； 除 P27- 1效果不明显外， P27- 2和 P27-3的抑制率分 别为： 73%和 77% (表 1) 。

表 1. 核酸对体外 MARC- 145细胞抗 PRRSV效果

病毒抑制率

组别

72h

gp85-l组

gp85-2组

gp85-3组

用

P27-1组

P27-2组

P27-3组

病毒对照组

阴性对照组

空白对照组 肽核酸 gp85- 1/3， P27-2/3为优选。

药物组合处理

针对前一步所筛选出的。然后， 在前面的这些实验基础上， 对筛选出的有效 抗病毒作用的药物进行组合使用，比较组合后 的抗病毒效果与单药抗病毒效果之 间的差异。 DF- 1细胞感染 ALV- J NS-X11株后， 分别加入针对 gp85或 P27的基 因药物组合， 同时设阳性对照和阴性对照及空白对照， 用 Real- time PCR方法进 行检测， 统计分析各用药组之间病毒抑制率， 方法同上， 如表 2。

表 2. 不同浓度的肽核酸对体外 DF-1细胞抗 ALV-J效果 病毒抑制率

72h

gp85-l/3组 79%

感染

P27-2/3组 81%

用药组

gp85-l/3组 + P27-2/3组 88%

病毒对照组 - 阴性对照组 - 空白对照组 - 细胞毒性实验

1)以 DF-1细胞作检测对象， 96孔板，每孔加 100微升 5000个细胞。 gp85_l、 gp85- 3、 P27- 2和 P27- 3肽核酸浓度 (0. 02， 0. 1， 0. 5， 1， 5， lO m) ， 每个 梯度设置 3个重复孔， 另设未处理细胞对照、 无细胞培养基对照。

2)处理结束后， 每孔每 100 μΐ培养基加入 Ιθμΐ MTT Stock, 37 °C培养箱 内继续孵育 4小时。 也可更换 100 μΐ新鲜无血清培养基后再加 MTT Stockc

3)吸去培养基， 每孔加入 Ιθθμΐ MTT溶解剂， 保持各孔内液体体积一致。

4)在 570nm测定 0D吸光度并进行比较计算。注意： 为准确考虑可在 699 nm 处测定未还原的 MTT本身的吸光度 0D值， 然后用 0D570减去 0D699。

5)结果判断： 细胞增殖或毒性 = 100% X (0D实验一 0D本底） I (0D对照 一 0D本底）。

0D实验是接受处理细胞的 0D值， 0D对照是未处理细胞对照管 0D值， 0D 本底是无细胞培养基对照 0D值。 处理后细胞增殖或毒性变化表示为未处理对照 的百分数。

检测结果表明， 针对 ALV-J的肽核酸 gp85- 1、 gp85- 3、 P27-2和 P27- 3无毒 性。

实验动物感染及饲养

健康 1日龄 AA系商品代肉鸡共 200只（楠森兽医诊断中心实验动物养殖场司提 供， 经检测 ALV- J阴性）随机分为 5组。 其中 ALV- J感染组 (试验组) 40只， 于 1日龄 颈部皮下接种 ALV- J感染细胞培养液 0. 2mL/只； 空白对照组 (对照组)共 40只， 不 作任何处理。 gp85- 1/3 + P27-2/3肽核酸的等质量比混合物剂量组（25ppm， 50ppm， lOOppm) ， 采用饮水给药方式， 严格隔离饲养， 各组的饲料与饮水均单独准备， 不交叉。

ALV- J感染后， 于不同的时间点采集鸡血， 取血清， 用 ELISA检测血清中病毒 阳性率， 如表 3。

表 3. 试验各组 ALV- J存在于血清中的阳性情况 时间 （天） 1 3 5 7 9

25 (ppm) + + + ― ―

感 染

50 (ppm) + + - - - 给药组

100 (ppm) + - - - 一 感染不给药组 + + + + + 空白对照组 - 一 ― - - 最终优选的给药剂量为 50〜100ppm。

病毒感染后肉鸡生长情况

对照组未出现死亡现象

病毒感染后第 1 周混感组就出现死亡

各药物处理组在病毒感染后第 3 周对 ALV- J 感染引起的死亡率表现出差 异， 如表 4。

同时检测肉鸡的临床表现、 增重、 免疫器官指数及死亡率测定： ①临床表 现、体重、免疫器官指数。每天观察鸡群发病 及生长情况， 各组在 7 、 14 、 21 、 28 、 35 、 49d 称量体重。 每周随机剖杀各病毒感染组鸡 5只， 对照组 3只， 分 别于 7 、 21 、 35 、 49d 时取胸腺、 脾脏和法氏囊称重， 并按如下方法计算免 疫器官指数:免疫器官指数 =免疫器官重量 (g)/鸡活体重 (kg) 。 ②死亡率统计。 记录每天自然死亡鸡只，统计各组死亡率,并� �检、 观察病变。 ③数据统计分析。 表 4. ALV- J感染后对肉鸡不同日龄体重的影响 日龄 ALV-J感染组 空白对照组

25 50 100

7 149±32 136±32 129±32 128 ±23

14 362 ±49 375±51 392±38 350 ±38

21 502 ±55 542 ±54 532 ±55 560 ±54

28 650±75 700±85 670±65 708 ±65

35 998 ±89 1088 ±89 996 ±92 1260±59

49 1590±120 1688±140 1650±130 2020±45 病毒感染后对鸡免疫器官指数的影响， ALV - J感染组， 5周后中枢免疫器 官 (法氏囊和胸腺） 指数显著和极显著低于对照组， 表 5。

表 5. ALV-J感染后对肉鸡免疫器官指数之间关系 日龄 ALV-J感染组 +药物混合组 空白对照组

胸腺 2.9±0.32 2.86±0.35

7 法氏囊 1.29±0.22 1.65±0.4 脾 0.9±19 1.15±0.2 胸腺 3.5±0.36 3.66 ±0.34

21 法氏囊 2.33 ±0.23 2.65 ±0.42 脾 1.1±0.17 2.55 ±0.29 胸腺 2.9±0.33 4.86±0.55

35 法氏囊 1.33±0.31 1.65±0.4 脾 1.5±0.27 1.23±0.32 胸腺 3.1±0.46 5.26±0.17

49 法氏囊 0.93土 0.18 1.35±0.4 脾 1.21±0.23 1.25±0.3