MéTODO DE CONSERVACIóN DE PEPTIDOS O PROTEíNAS

SECTOR DE LA TéCNICA

El sector de la técnica en el que se encuadra la presente invención es el biotecnológico, y su ámbito de aplicación es la conservación y el transporte de péptidos o proteínas de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico o industrial. También es de interés en el campo de la investigación en ciencias de la vida.

ESTADO DE LA TéCNICA

Los péptidos o proteínas generalmente son inestables cuando son conservados a temperatura ambiente (aproximadamente 25 ⁰ C) en medios líquidos o soluciones acuosas, así en pocas horas comienzan a aparecer fenómenos de degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes microbianos (Jaenicke, R., (2000). J Biotechnol, 79, 193-203; Meyer, J.D., et al (2002). Pharm Biotechnol, 13, 85-107). Con objeto de evitar dichos fenómenos se utilizan diversos métodos de conservación de péptidos y proteínas, los más habituales pueden ser resumidos en: (i) conservación a temperatura refrigerada; (ii) adición de agentes estabilizantes; y, (iii) deshidratación o liofilización.

Tradicionalmente los péptidos o proteínas han sido conservados en solución acuosa a temperatura refrigerada, bien de forma líquida a 4 ⁰ C ó bien de forma congelada a -20 ⁰ C. De esta forma se reduce la velocidad de las reacciones de degradación. No obstante, los procesos de congelación-descongelación repetida provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de los péptidos y proteínas (Tang, X.C., et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175). Asimismo, los péptidos y proteínas conservados de esta forma no evitan la aparición de los fenómenos de degradación, desnaturalización y/o contaminación microbiana.

Los agentes estabilizantes son sustancias inertes que modifican las características físico-químicas de las soluciones acuosas empleadas para conservar péptidos o proteínas, reduciendo así el riesgo de degradación. Ejemplos de tales agentes son: glicerol, azúcares (glucosa, galactosa, sacarosa, trealosa), polietilenglicoles, amino-ácidos (metionina, histidina), detergentes (Tritón X-100, Tween-20), y otras proteínas (albúmina) (Arakawa, T., (1991). Pharm Res, 8, 285-291; Crowe, J.H., et al (1987). Biochem J, 242, 1-10; Levine, R.L.

(1983). JBiol Chem, 258, 11828-11833). El glicerol es un agente estabilizante tradicional que reduce el punto de congelación de la solución acuosa con los péptidos o proteínas, permitiendo conservarlos en estado líquido sin congelar a baja temperatura (-2O ⁰ C) (Scharnagl, C, et al (2005). Biochim Biophys Acta, 1749, 187-213). Los agentes estabilizantes suelen utilizarse conjuntamente a otros métodos de conservación de péptidos o proteínas (Carpenter, J.F. et al (1987). Biochim Biophys Acta, 923, 109-115). Sin embargo a menudo los agentes estabilizantes pueden interferir en la actividad o aplicación posterior del péptido o proteína de interés, y deben ser eliminados utilizando sistemas de diálisis u otros procedimientos más agresivos (precipitación salina o acida) que alteran dicho péptido o proteína (Prive, G.G. (2007) Methods, 41, 388-397).

La liofilización es un proceso de deshidratación en el cual las moléculas de agua son eliminadas de una muestra congelada en el interior de un sistema de vacío. Este método de conservación requiere que el péptido o proteína, disuelto en un medio o solución acuosa, sea congelado preferentemente de forma rápida. Un procedimiento utilizado para congelar rápidamente la solución con el péptido o proteína consiste en su inmersión en nitrógeno líquido. Entonces se aplica a la muestra congelada un sistema de vació, que provoca la sublimación o vaporización de la fase helada a temperaturas bajo cero (deshidratación primaria). La humedad residual puede ser posteriormente eliminada permitiendo la elevación gradual de la temperatura (deshidratación secundaria). El resultado del proceso de liofilización es un polvo o sustancia seca y cristalina que contiene el péptido o proteína a conservar (Randolph, T. W., (1997). J Pharm Sci, 86, 1198-1203; Wang, W. (2000). Int J Pharm, 203, 1-60). En la liofilización, durante las fases de deshidratación primaria y secundaria los péptidos o proteínas sufren cambios físicos y químicos, como incremento de la concentración salina, agregación/precipitación, estrés físico, pH extremos, que producen alteraciones en su estructura y/o actividad. Adicionalmente, los péptidos o proteínas liofilizados usualmente son muy higroscópicos, y tienen tendencia a absorber la humedad ambiental, lo que también ocasiona fenómenos de degradación y descenso de la actividad de dichos péptidos o proteínas (Webb, S.D., et al (2003). J Pharm Sci, 92, 715-729).

Las etiquetas de afinidad (tags) se han convertido en un sistema habitual de purificar proteínas y complejos proteicos nativos por evidentes razones: permiten purificar o enriquecer de cientos a miles de veces dichos péptidos o proteínas desde extractos crudos en un solo paso, sin la necesidad de eliminar previamente ácidos nucleicos u otros materiales celulares;

y, sobre todo, permiten utilizar protocolos generales de purificación con una gran diversidad proteínas, en contraste con el diseño y puesta a punto de protocolos específicos para cada material peptídico que necesita la cromatografía convencional (Waugh, D. S., (2005). Trenas Biotechnol, 23, 316-320; Esposito, D. et al (2006). Curr Opin Biotechnol, 17, 353-358). Gracias a estas ventajas, la purificación usando etiquetas de afinidad ha facilitado a los investigadores la producción de multitud de proteínas recombinantes de interés en investigación y en diagnóstico, siendo el procedimiento típicamente usado en los proyectos de alto rendimiento (Braun, P., et al. (2002) PNAS; 99, 2654-2659). .

Actualmente, las colaboraciones científicas o los servicios especializados cliente- proveedor requieren el intercambio o envío de péptidos o proteínas, de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en el campo de la investigación en ciencias de la vida, entre laboratorios de centros públicos o empresas privadas localizados en el mismo país o países diferentes. Uno de los problemas del envío de estos materiales, consiste en evitar los fenómenos de degradación, desnaturalización y/o crecimiento de contaminantes microbianos referidos anteriormente. El sistema de transporte más habitual consiste en usar cajas voluminosas que contienen hielo, nieve carbónica o acumuladores de frío para garantizar que los péptidos o proteínas se conservan una temperatura refrigerada durante el tiempo establecido para el transporte (de 24 horas a 4-5 días para este tipo de envíos). Estos sistemas son engorrosos y suponen un elevado coste económico. Además, cualquier retraso en el tiempo de transporte (retención en aduanas, retrasos por la empresa de mensajería, etc) provoca que el material llegue a su destino a temperatura ambiente, motivando su devolución o la comprobación de la integridad del material enviado por parte del receptor. Por ello son necesarios nuevos métodos que permitan resolver el problema de conservación y transporte de péptidos o proteínas a temperatura ambiente. La presente invención describe un método sencillo, económico y versátil orientado a resolver este problema, así como los útiles necesarios para realizarlo.

DESCRIPCIóN DETALLADA DE LA INVENCIóN

El objeto de la invención se refiere un método para conservar péptidos o proteínas etiquetados durante varios días, e incluso meses, que evita el uso de refrigeración, y su aplicación en el almacenamiento y el transporte de péptidos o proteínas de interés para los sectores sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico o industrial. La presente invención describe un método alternativo más cómodo y seguro que los ya existentes, tales como la

conservación y/o transporte de péptidos o proteínas en solución acuosa a temperatura refrigerada o la liofílización. (Tang, X.C., et al (2005). Pharm Res, 22, 1167-1175; Webb, S.D., et al (2003). J Pharm Sci, 92, 715-729). Así, el objeto de la invención comprende el uso de matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas con compuestos que tienen afinidad por secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en los péptidos o proteínas a conservar.

El método para conservar péptidos o proteínas objeto de la invención incluye las siguientes etapas:

(a) paso de un fluido o solución que contenga el péptido o proteína etiquetado a través de una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada, en condiciones tales que la etiqueta (tag) del péptido o proteína se une por afinidad a los grupos funcionales presentes en dicha matriz.

(b) paso de una solución de lavado a través de la matriz para eliminar el material biológico, péptidos o proteínas, u otras sustancias del fluido o solución no unidos a la matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada. (c) secado parcial o total de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado a temperatura moderada (a partir de 15°y no superior a temperaturas desnaturalizantes, preferentemente de 18 a 42 ⁰ C), preferentemente a temperatura ambiente.

(d) conservación de la matriz con el péptido o proteína inmovilizado en un envoltorio limpio y aséptico durante el tiempo necesario hasta su uso.

(e) recuperación del péptido o proteína inmovilizado mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada.

La presente invención describe concretamente el uso de matrices sólidas o semi- sólidas compuestas por cualquier material poroso, fibroso o reticular que permita el paso de líquidos, preferentemente alguno de los siguientes materiales o sus derivados: celulosas, agarosas, poliacrilatos, polimetacrilatos, polivinilos, chitosanos, poliestirenos y cualquier polímero natural o de síntesis derivatizable con estructura porosa o fibrosa. En general, puede usarse cualquier polímero caracterizado por tener una alta relación superficie/volumen y que suelen ser utilizados como soportes de purificación sólidos o semi-sólidos en cromatografía de afinidad para purificación de péptidos o proteínas. Asimismo se describe que dichas

matrices estarían derivatizadas con compuestos que tienen afinidad por secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en los péptidos o proteínas a conservar. Concretamente, la unión a la matriz se produce por medio de una zona del péptido o proteína que no afectaría a su actividad o funcionalidad, ya que las etiquetas o tags suelen fusionarse al extremo amino o carboxilo terminal del péptido o proteína, manteniendo una distancia con los sitios activos suficiente para que ambos dominios o regiones no interaccionen.

Preferentemente se utilizarían matrices derivatizadas con alguno de los siguientes compuestos: ácido iminodiacético (IDA) o ácido nitrilotriacético (NTA) unidos a metales dicatiónicos como el níquel (Ni), el cobalto (Co) o el cobre (Cu); aminas terciarias o cuaternarias como el dietilaminoetanol (DEAE) o el trimetilamonio (QAE); glutation; anulosa; avidina o estreptavidina; calmodulina; proteína A; proteína G; o cualquier otro compuesto que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidos por los expertos en dicha materia. Las etiquetas o tags que permiten la unión por afinidad a los grupos funcionales presentes en las matrices pueden ser preferentemente colas de histidinas (Histag), dominios de unión a colina (Lytag), glutation S-transferasa (GST-tag), maltose binding protein (MBP-tag), biotina o Streptag, calmodulin binding domain (CBD-tag) o calmodulin binding protein (CBP-tag) o calmodulin regulated proteins, secuencias totales o parciales de cadenas pesadas de inmunoglobulinas, o cualquier otro tipo de etiqueta que permita la purificación por cromatografía de afinidad de péptidos o proteínas conocidas por los expertos en dicha materia.

También se describe en la presente invención que los péptidos o proteínas conservados en las matrices, pueden ser recuperados a solución acuosa mediante el paso a través de la matriz de una solución con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de dicha matriz sólida o semi-sólida derivatizada. Preferentemente se utilizarían alguno de los siguientes compuestos: imidazol; colina; glutation; maltosa; biotina; agentes quelantes del calcio; soluciones acidas; o cualquier otro compuesto que permita la elución de péptidos o proteínas unidas por afinidad a soportes cromatográficos conocidos por los expertos en la materia.

A partir del método para conservar péptidos o proteínas y de la variedad de compuestos descritos anteriormente, puede utilizarse alguna de las configuraciones descritas en la siguiente tabla:

^* secuencias específicas o etiquetas (tags) presentes en el péptido o proteína.

** compuestos utilizados para derivatizar Ia matriz.

*** compuestos que interrumpen Ia unión del péptido o proteína y Ia matriz.

Las características más novedosas y ventajosas del objeto de la presente invención se pueden resumir en los siguientes puntos:

1. La inmovilización de péptidos o proteínas en matrices sólidas o semi-sólidas que son deshidratadas parcial o totalmente permite conservar dichos péptidos o proteínas por periodos de tiempo desde varias horas a varios meses a temperatura ambiente (aproximadamente 18-25°C) sin necesidad de refrigeración. De la misma forma se podrían conservar una gran proporción de péptidos o proteínas por periodos de tiempo superiores a menor temperatura.

2. El uso de matrices sólidas o semi-sólidas derivatizadas permite conservar directamente péptidos o proteínas etiquetados que hayan sido purificados previamente, o estén contenidos en extractos de células que los expresen o cualquier otro formato soluble no purificado.

3. Frente a otros métodos de conservación péptidos o proteínas, el método descrito tiene la ventaja de que puede realizarse en un periodo de tiempo corto y no requiere instrumentos costosos ni voluminosos. 4. El método descrito evita los procesos de congelación-descongelación, que pueden provocan alteraciones en la estructura y/o actividad de los péptidos y proteínas a conservar, así como los cambios físico-químicos y los fenómenos de higroscopicidad aparecidos durante los procesos de liofilización

5. El método descrito también puede evitar el uso de agentes estabilizantes, que pueden interferir con la aplicación posterior del péptido o proteína.

Mediante el empleo de técnicas habituales en laboratorios bioquímicos, la presente invención comprende también el uso de un conjunto de útiles (kits) o dispositivos que permitan realizar el método para conservar péptidos o proteínas etiquetados, caracterizados porque incluyen:

(a) una matriz porosa sólida o semi-sólida derivatizada en forma de membrana para la inmovilización del péptido o proteína etiquetado.

(b) un soporte para contener la matriz y pasar a través de ella los distintos fluidos o soluciones utilizados, con las dimensiones y estanqueidad apropiadas para que encaje la matriz y todo el flujo pase necesariamente a través de su superficie derivatizada.

(c) tubos o jeringas acoplables al soporte para introducir el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado, la solución de lavado de la matriz, y la solución de recuperación con componentes específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.

(d) un dispositivo que permita ejercer la presión necesaria para que los distintos fluidos o soluciones utilizados pasen a través de la matriz, que puede ser por ejemplo: un embolo acoplado a la jeringa (Figura la); una salida del soporte acoplable a un sistema de vacío (Figura Ib); un tubo acoplable al soporte compatible con sistemas de centrifugación (Figura Ic).

(e) envoltorio para la conservación y/o envío de matriz con el péptido o proteína inmovilizado. (f) solución de lavado de la matriz.

(g) solución de recuperación con compuestos específicos que interrumpen la unión por afinidad entre la etiqueta (tag) del péptido o proteína y los grupos funcionales de la matriz sólida o semi-sólida derivatizada.

Asimismo, el objeto de la invención comprende la utilización de este método, mediante dichos kits o dispositivos, para conservar y/o transportar péptidos o proteínas de interés sanitario, diagnóstico, farmacéutico, agronómico, industrial o en el campo de la investigación en ciencias de la vida, sin necesidad de refrigeración con objeto de:

1. conservar péptidos o proteínas que serán utilizadas para estudio como muestras o controles en ensayos biológicos, inmunológicos, bioquímicos o analíticos.

2. intercambiar péptidos o proteínas de interés entre laboratorios de centros públicos o empresas privadas. 3. envío péptidos o proteínas para inmunizar animales de laboratorio con el fin de obtener anticuerpos contra dichos péptidos o para investigación sobre vacunas.

MODO DE REALIZACIóN DE LA INVENCIóN

Ejemplo 1. Conservación y recuperación de una proteína fluorescente (GFP) etiquetada con colas de histidinas en membranas derivatizadas.

El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado proteínas etiquetadas con colas de histidinas (Histag) en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.

Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.65 mm de grosor, y están derivatizadas con IDA-Ni. En primer lugar, se colocan cuatro discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol, utilizando una jeringa acoplada al soporte.

La proteína a conservar, 1 mg de green fluorescen protein (GFP) fusionada en su extremo carboxilo terminal a un Histag (GFP-Histag), se disuelve en 10 mi de la solución de lavado y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con la proteína inmovilizada se introducen en una placa de petri y se envían a otro laboratorio, por sistemas de correo-mensajería convencionales a temperatura ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un usuario distinto en la siguiente fase del ensayo.

Para recuperar la proteína inmovilizada en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa

acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 5 mi de una solución de recuperación compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 250 mM imidazol, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en un tubo limpio. La figura 2 muestra un esquema general del procedimiento y los materiales empleados. La figura 3 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse, la casi totalidad de la GFP-Histag es inmovilizada a su paso a través de los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.

Ejemplo 2. Inmovilización, almacenaje y liberación de proteína A etiquetada con dominios de unión a colina en membranas derivatizadas.

El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.

Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se colocan seis discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al soporte.

La proteína a conservar, 1 mg de proteína A fusionada en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-proteína A) usando un kit comercial de Biomedal, se disuelve en 10 mi de la solución de lavado y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con la proteína inmovilizada se introducen en una placa de petri y se envían a otro laboratorio, por sistemas de correo- mensajería convencionales a temperatura ambiente, donde tras 15 días es utilizada por un usuario distinto en la siguiente fase del ensayo.

Para recuperar la proteína inmovilizada en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 5 mi de una solución de recuperación compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 250 mM cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en un tubo limpio. La figura 4 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 12% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse, la casi totalidad del polipéptido de fusión Lytag-proteína A es inmovilizado a su paso a través de los discos de membrana, y puede recuperarse fácilmente a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.

Ejemplo 3. Actividad de proteínas fluorescentes etiquetadas con dominios de unión a colina conservadas y recuperadas desde membranas derivatizadas.

El presente ejemplo describe como proteínas etiquetadas con dominios de unión a colina (Lytag) mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta, y también cuando son recuperadas nuevamente a solución acuosa.

Las proteínas fluorescentes utilizadas, GFPmut3, ECFP, EYFP y EGFP (Cormack, B.P., et al (1996). Gene, 173, 33-38; Heim, R., et al (1994) Proc Nati Acad Sci, 91, 12501-

12504; Ormδ, M. et al (1996) Science, 273, 1392-1395; Prasher, D. C, et al (1992) Gene,

111, 229-233), fueron fusionadas en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-GFPmut3;

Lytag-ECFP; Lytag-EYFP; y Lytag-EGFP) y expresadas en E. coli usando el sistema

CASCADE-LYTAG comercial de Biomedal. Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con

DEAE. En primer lugar, se colocan cuatro discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al soporte.

Extractos de cultivos de E.coli que superexpresan las distintas proteínas fluorescentes fusionadas a Lytag, se pasan dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas. Tras este periodo de tiempo se analiza la fluorescencia de dichas proteínas observándolas bajo una lámpara de luz ultravioleta. Después, se colocan estos discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Seguidamente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 2 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 250 mM cloruro de colina, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo los resultados en tubos limpios. Estos tubos, con las distintas proteínas fluorescentes en solución acuosa, así como los discos de membrana utilizados son analizados bajo una lámpara de luz ultravioleta. La figura 5 muestra los resultados de este ejemplo. Como puede observarse, las distintas proteínas fluorescentes mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas en las membranas derivatizadas, y también cuando son recuperadas nuevamente a solución acuosa.

Ejemplo 4. Conservación y recuperación de un anticuerpo o inmunoglobulina en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada.

El presente ejemplo describe como conservar a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado anticuerpos o inmunoglobulinas en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada.

Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de discos de 2.5 cm de diámetro y 0.2 mm de grosor, y están derivatizadas con DEAE (dietilaminoetilo). En primer lugar, se colocan tres discos de membrana en el interior de un soporte de propileno para filtración con las dimensiones apropiadas (support de filtre swinnex polipropilene, Millipore) y se lavan con 10 mi de una solución de inmovilización compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0, 300 mM NaCl y 5 mM cloruro de colina, utilizando una jeringa acoplada al

soporte. Seguidamente, se disuelve 1 mg de proteína A fusionada en su extremo amino terminal a un Lytag (Lytag-proteína A) en 10 mi de la solución de inmovilización y se pasa dos veces a través del soporte con los discos de membrana, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana con 25 mi de la solución de inmovilización. Estos discos de membrana con Lytag-proteína A inmovilizada se utilizan para conservar anticuerpos o inmunoglobulinas.

El anticuerpo monoclonal a conservar, 2.5 mg de inmunoglobulina IgG ₂₃ de ratón, se disuelve en 10 mi de una solución de lavado compuesta por 20 mM tampón fosfato potásico pH 7.0 y se pasa cuatro veces a través del soporte con los discos de membrana con Lytag- proteína A inmovilizada, utilizando la jeringa acoplada. Después se lavan los discos de membrana tres veces con 20 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen los discos de membrana del soporte y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar, placa de petri, etc). Estos discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado se conservan a temperatura ambiente durante 24 horas.

Para recuperar anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado en los discos de membrana, estos se colocan en el interior del soporte y se lavan con 10 mi de la solución de lavado, utilizando una jeringa acoplada al soporte. Finalmente, se pasan a través del soporte con los discos de membrana 6 mi de una solución de recuperación compuesta por 1 M Tris- HCl pH 9.0, utilizando la jeringa acoplada y recogiendo el resultado en fracciones de 2 mi. La figura 6 muestra los resultados de este ejemplo analizados por SDS-PAGE en geles con 10% de acrilamida teñidos con Coomassie. Como puede observarse: (i) en la primera fase del ensayo se consigue saturar los discos de membrana con Lytag-proteína A, para evitar interacciones inespecíficas entre el anticuerpo y los discos de membrana; (ii) una porción importante del anticuerpo o inmunoglobulina es inmovilizado a su paso a través de los discos de membrana con Lytag-proteína A; (iii) dicho anticuerpo o inmunoglobulina puede recuperarse a solución pasando a través de los discos de membrana la solución de recuperación.

La proteína LYTAG-proteína A podría previamente ser inmovilizada a la membrana por activación de una unión covalente a la membrana por agentes que lo conjuguen y que son conocidos por expertos en la materia. De esta forma, el anticuerpo puede ser despegado de la

membrana sin dicha proteína, usando una solución de pH ácido y decepcionando la inmunoglobulina en una solución tamponada.

Ejemplo 5. Estabilidad de la β-galactosidasa etiquetada con colas de histidinas conservada en membranas derivatizadas.

El presente ejemplo describe como proteínas etiquetadas con colas de histidinas

(Histag) mantienen su estructura y/o actividad cuando son conservadas inmovilizadas a temperatura ambiente durante periodos de tiempo prolongado en membranas derivatizadas con grupos funcionales que tienen afinidad por dicha etiqueta.

Las membranas empleadas en este ejemplo tienen forma de láminas adaptables a equipos de Vacuum Manifold para hacer Dot-Blot, y están derivatizadas con EDA-Ni. En primer lugar, se incuban las láminas de membrana durante 10 min a temperatura ambiente en una solución de lavado compuesta por 50 mM tampón fosfato potásico pH 8.0, 300 mM NaCl y 10 mM imidazol. Seguidamente, se colocan las láminas de membrana en el interior de un equipo de Vacuum Manifold con adaptador para hacer Dot-Blot conectado a un sistema de vacío, y por cada uno de los pocilios se pasan 0.2 mi de extractos de cultivos de E.coli que superexpresan β-galactosidasa fusionada en su extremo amino terminal a un Histag (Histag-β- galactosidasa). Después se lavan los pocilios con 4 mi de la solución de lavado. Entonces se extraen las láminas de membrana del equipo de Vacuum Manifold y se secan a temperatura ambiente durante al menos 30-60 min en un ambiente limpio (campana de flujo laminar). Cada uno de los puntos (dots) se recortan en segmentos de igual tamaño y se conservan a temperatura ambiente hasta su utilización en el ensayo de actividad β-galactosidasa. La figura

7 muestra que la Histag-β-galactosidasa conservada en láminas de membrana mantiene al menos un 50% de su actividad inicial después de 15 días a temperatura ambiente.

DESCRIPCIóN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Esquema reflejando distintas formas de hacer pasar a través de la matriz derivatizada el fluido o solución que contiene el péptido o proteína etiquetado. Puede utilizarse: un soporte con la matriz en su interior, al que se le acopla una jeringa con émbolo para introducir el fluido o solución y ejercer la presión necesaria (a); un soporte con la matriz en su interior y con una salida a un sistema de vacío para ejercer la presión necesaria, al que se le acopla una jeringa para introducir el fluido o solución (b); o bien, un soporte con la

matriz en su interior adaptable a un tubo compatible con sistemas de centrifugación para ejercer la presión necesaria (c). La flecha negra muestra donde se dispone la matriz en cada uno de los ejemplos.

Figura 2. Esquema general del método de conservación y recuperación de proteínas etiquetadas en membranas derivatizadas.

Figura 3. Conservación y recuperación de GFP-Histag en membranas derivatizadas con IDA- Ni. Marcador de pesos moleculares (M); solución de GFP-Histag antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); solución de GFP-Histag recuperada de los discos de membrana (3).

Figura 4. Conservación y recuperación de Lytag-proteína A en membranas derivatizadas con DEAE. Marcador de pesos moleculares (M); solución de Lytag-proteína A antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); solución de Lytag-proteína A recuperada de los discos de membrana (3).

Figura 5. Actividad de proteínas fluorescentes conservadas y recuperadas en membranas derivatizadas con DEAE. Proteínas fluorescentes: control sin proteínas (1); Lytag-GFPmut3 (2); Lytag-ECFP (3); Lytag-EYFP (4); y Lytag-EGFP (5). Discos de membrana con las distintas proteínas fluorescentes inmovilizadas (A). Soluciones acuosas con las distintas proteínas fluorescentes recuperadas de los discos de membrana (B). Discos de membrana tras recuperar a solución acuosa las distintas proteínas fluorescentes (C).

Figura 6. Conservación y recuperación de un anticuerpo o inmunoglobulina en membranas derivatizadas con proteína A inmovilizada. Marcador de pesos moleculares (M); solución de Lytag-proteína A antes de su paso por los discos de membrana (1) y después de su paso por los discos de membrana (2); lavado de los discos de membrana con proteína A inmovilizada (3); solución de anticuerpo o inmunoglobulina (IgG) antes de su paso por los discos de membrana con proteína A inmovilizada (4) y después de su paso por los discos de membrana con proteína A inmovilizada (5); 1 ^er , 2 ^o y 3 ^er lavado de los discos de membrana con el anticuerpo o inmunoglobulina inmovilizado (6-8); distintas fracciones con el anticuerpo o inmunoglobulina recuperado de los discos de membrana (9-11).

Figura 7. Estabilidad de Histag-β-galactosidasa conservada en membranas derivatizadas.