INTERÉS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud describe una secuencia peptídica de una proteína guía derivada del dominio SH3 de la proteína espectrina, en adelante llamada proteína guía SSD, para la producción de péptidos de interés en forma de proteína de fusión. ESTADO DEL ARTE

El estudio de péptidos a nivel terapéutico y como método de diagnóstico ha generado gran interés en la industria farmacéutica debido a su baja toxicidad, alta especificidad y alta actividad biológica, Vlieghe P et al, Drug Discov Today 2010,15-40, 56; así como también el uso agrícola, Hughes SR et al., 2012, Pharmaceuticals 5(10): 1054-1063; y como agente antimicrobiano, Yifeng Li, 201 1 , Protein Expression and Purification 80: 260-267.

Los péptidos cortos, de menos de 20 aminoácidos, comúnmente son producidos mediante síntesis química, con la adición secuencial de cada aminoácido (aa). Este método generalmente no es conveniente para la producción de péptidos de más de 30 aminoácidos, ya que disminuye su rendimiento con el aumento del tamaño del péptido. Además, utiliza reactivos en exceso para favorecer la reacción hacia los productos, lo que aumenta los costos y genera muchos desechos, algunos tóxicos para el medio ambiente como ácidos, limitando su escalabilidad.

La producción recombinante de péptidos tiene muchas ventajas sobre la síntesis química, incluyendo potencialmente mayor rendimiento, menor costo, mayor escalabilidad y menos contaminación residual. No obstante, aunque cualquier cadena polipeptídica puede ser teóricamente expresada en cualquier sistema microbiano, la expresión citoplasmática de péptidos suele generar problemas en la estabilidad del péptido expresado, dando como resultado un rendimiento decreciente. De hecho, péptidos expresados en una célula huésped pueden degradarse rápidamente por las proteasas endógenas y asimiladas por la célula huésped. Para superar este problema, los péptidos pueden expresarse fusionados a proteínas guía, las que adicionalmente pueden dirigir los péptidos a compartimentos subcelulares específicos o cuerpos de inclusión con el objetivo de lograr un alto rendimiento de expresión y evitar la degradación por proteasas. Por esta razón, las proteínas guía son particularmente una buena alternativa para la síntesis de péptidos entre 30 y 50 aa, para los que la síntesis química y la recombinante tradicional no son opciones costo- eficientes.

Actualmente, existen algunas proteínas guía comerciales para la producción de péptidos, tales como inteína-CBD (Chitin binding domain) de New England Biolabs y KSI (Ketoesteroid Isomerase) de Novagen, entre otras. Algunos de los inconvenientes del uso de estas proteínas guía son los bajos rendimientos obtenidos, la dificultad adicional que significa eliminar estos residuos (liberación de péptidos indeseados, generación de precipitados), usualmente en condiciones químicas extremas que resultan en modificaciones químicas indeseadas en el péptido de interés. Es por esto que nuevas técnicas de expresión recombinante de alto rendimiento para la producción de péptidos, mediante el uso de nuevas proteínas guía y con un proceso río abajo de purificación simplificado, deben ser desarrollados.

A continuación se presentan los documentos relevantes del Estado del Arte de la técnica en cuestión. La publicación "A FUSION PROTEIN SYSTEM FOR THE RECOMBINANT PRODUCTION OF SHORT DISULFIDE-CONTAINING PEPTIDES", Fairlie, W. Douglas, et al. Protein expression and purification, 2002, vol. 26, no 1 , p. 171 -178, describe un sistema de proteína de fusión recombinante para la producción, oxidación y purificación de péptidos cortos que contienen un único puente disulfuro. Los péptidos se expresan en Escheríchia coli como fusión a una proteína mutante del dominio SH2 N-terminal de la fosfatasa intracelular, SH2-P. Este pequeño dominio proteico confiere varias propiedades importantes que facilitan la producción de péptidos que contienen disulfuro: (i) se expresa en altos niveles en E. coli; (ii) puede purificarse a través de una Hexahistidina y HPLC de fase reversa; (iii) no contiene residuos de cisteína endógenos, permitiendo la formación de un intrapéptido disulfuro mientras todavía está unido a la proteína guía; (iv) es altamente soluble en soluciones nativas, facilitando la producción de péptidos muy hidrófobos y el uso directo de productos de fusión en ensayos bioquímicos; (v) contiene un residuo de metionina único en la unión del péptido y la proteína guía para facilitar la escisión del péptido por tratamiento con bromuro de cianógeno (CNBr). Sin embargo este documento no menciona el uso de una proteína derivada de espectrina.

La patente US 8,796,431 , reivindica un método para la producción de péptidos de interés. El método consiste en expresar un péptido de fusión heterólogo en una célula genéticamente modificada, donde el péptido de fusión comprende una etiqueta de afinidad, una secuencia de escisión y el péptido de interés, en donde la secuencia de escisión es triptófano (Trp) y la reacción de escisión se realiza en presencia de N- clorosuccinmida mientras el péptido de fusión se encuentra unido al material de afinidad, liberando el péptido de interés. Sin embargo este documento tampoco menciona el uso de una proteína derivada de espectrina.

La publicación ""DESIGN AND IMPLEMENTATION OF A HIGH YIELD PRODUCTION SYSTEM FOR RECOMBINANT EXPRESSION OF PEPTIDES". Rodríguez et al. Biomed Central. Microbial Cell Faetones 2014, 13:65, 2014, describe la expresión de péptidos fusionados a la proteína cetoesteroide isomerasa (KSI) en una forma que pueden ser posteriormente separados y obtenidos con su secuencia original mediante corte con trombina. Con este sistema se obtuvo una productividad de 30 mg de péptido por gramo de peso seco celular. Sin embargo este documento no menciona el uso de una proteína derivada de espectrina.

La patente US20150051374, reivindica un método para producir péptidos recombinantes que contienen entre 10 y 200 aminoácidos usando nuevas proteínas guía derivadas de la proteína fluorescente verde y sus mutantes. Sin embargo este documento no menciona el uso de una proteína derivada de espectrina. El documento WO 1996017942, reivindica un método para el aislamiento y/o purificación de un péptido recombinante empleando una construcción de proteína de fusión que incluye una anhidrasa carbónica y un polipéptido fusionado variable. El método incluye la precipitación de la proteína de fusión o un fragmento de la proteína de fusión que incluye la anhidrasa carbónica. También incluye el método para expresar la proteína de fusión como parte de los cuerpos de inclusión. Sin embargo este documento no menciona el uso de una proteína derivada de espectrina De esta forma ninguno de los documentos del arte revisados, describen el uso de una proteína guía derivada de espectrina para la expresión de un péptido de interés. La presente solicitud describe así un proteína guía derivada de espectrina (SSD), utilizada en la construcción de un vector de expresión, el que se inserta en una célula huésped, permitiendo la expresión de un péptido de interés en una concentración cercana a 130 mg de péptido de interés por cada gramo de célula seca.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS.

Figura 1 : Comparación de expresión de la proteína de fusión utilizando proteína guia SSD (figura 1 A), vs utilizando proteína guia KSI ( Figura 1 B) para la producción del péptido de interés p53pAnt. En esta figura se muestra una comparación del Análisis SDS-PAGE de la proteína intracelular 1 : proteína total, 2: proteína soluble, 3: proteína insoluble. En la columna 1 , se observa que al utilizar la proteína guia SSD, se obtiene una mayor productividad total de proteína de fusión con respecto a la productividad que se obtiene al utilizar la proteína guia KSI; En la columna 2 se observa que con la proteína guia SSD se obtiene proteína de fusión en forma soluble, mientras que con KSI esta no se obtiene; En la columna 3 se observa que en para el caso SSD la proteína de fusión insoluble se encuentra en un mayor grado de pureza que al utilizar la proteína guia KSI, ya que no se observa ninguna banda contaminante.

Figura 2: Análisis SDS-PAGE de la proteína de fusión purificada desde la proteína total en una única etapa de cromatografía. 1 : Proteína de fusión purificada. Figura 3: Análisis SDS-PAGE de precipitación de la proteína de fusión inducida por temperatura. 1 : proteína intracelular total; 2: proteína intracelular soluble; 50 ^e C durante 10 min, 3: pellet, 4: sobrenadante; 45° C durante 15 min, 5: pellet; 6: sobrenadante; 40 ^e C durante 20 min, 7: pellet; 8: sobrenadante; 35 ^e C durante 30 minutos, 9: pellet; 10: sobrenadante; 30 °C durante 35 min 11 : pellet; 12: sobrenadante. En la columna 11 , se observa la precipitación selectiva de la proteína de fusión con una pureza aproximada de 75%.

Figura 4: Comparación de productividad de proteína de fusión obtenida utilizando proteína guia KSI a 37°C, SSD a 37°C, SSD a 25°C. Se observa que la productividad obtenida con proteína guia SSD a 37°C es mayor a la obtenida con la proteína guia del arte, así como también que la productividad obtenida realizando la expresión a 25°C es superior a la obtenida a 37°C. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud hace referencia a una secuencia peptídica, de acuerdo a la SEQ ID NO 1 , de una proteína guía, aquí llamada proteína guia SSD, la cual es utilizada para la producción recombinante de péptidos de interés, incluidos en una proteína de fusión recombinante, así como también a la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO 2, que codifica para dicha proteína guia SSD.

La presente solicitud describe también un vector de expresión que comprende a dicha secuencia que codifica para dicha proteína guia SSD, y una secuencia que codifica para al menos un péptido de interés. Este vector de expresión es utilizado para la producción recombinante de una proteína de fusión.

La presente solicitud describe también una célula huésped transformada con dicho vector de expresión. Esta célula huésped, al ser cultivada en forma de cultivo por lotes, cultivo semicontinuo, o cultivo continuo, expresa la proteína de fusión que comprende a la proteína guia SSD, y al péptido de interés.

La presente solicitud describe también un proceso para la producción recombinante de péptidos de interés. Dicho proceso comprende la construcción de un vector de expresión para la producción recombinante de una proteína de fusión. Dicha proteína de fusión comprende la proteína guía SSD, y al menos una copia de un péptido de interés. Dicho vector es introducido en una célula huésped, la que expresa la proteína de fusión. La proteína de fusión producida comprende además un sitio de escisión entre las secuencias de la proteína guía SSD y el péptido de interés, y una etiqueta de purificación para facilitar la recuperación de la proteína recombinante. Este proceso comprende las etapas de

A) construir vector de expresión,

B) insertar vector de expresión en célula huésped,

C) expresar la proteína de fusión,

D) recuperar la proteína de fusión, E) escindir la proteína de fusión,

F) purificar el péptido de interés.

Estas etapas se describen en detalle a continuación:

A) Construir vector de expresión.

Construir un vector de expresión, el que comprende:

• una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína guía SSD de secuencia SEQ ID NO 1 , o una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína guia con una similitud de al menos 90% con respecto a la SEQ ID NO 1 ,

• al menos una secuencia que codifica para un péptido de interés,

• una secuencia que codifica para un sitio de escisión, con el que es posible luego separar el péptido de interés del resto de la proteína, en donde el sitio de escisión es preferiblemente un sitio de reconocimiento para la proteasa trombina, y

• una secuencia que codifica una etiqueta de purificación, con el que es posible luego facilitar la purificación de la proteína de fusión, en donde la etiqueta de purificación es preferiblemente una etiqueta de polihistidinas.

B) Insertar el vector de expresión en célula huésped.

Introducir el vector de expresión construido en la etapa A, en una célula huésped, en donde la célula huésped es preferiblemente seleccionada de entre Escherichia coli, Bacillus subtilis o Saccharomyces cerevisiae.

C) Expresar la proteína de fusión.

Esta etapa consiste en cultivar las células huésped transformadas de la etapa B, en un medio de cultivo para la expresión de la proteína de fusión, en donde el medio de cultivo comprende un medio nutritivo, un marcador de selección, y un inductor. Preferentemente dicho medio nutritivo es Luria Bertani (medio LB); dicho marcador de selección es ampicilina; y dicho inductor es isopropil- -D-1 -tiogalactopiranósido (IPTG). En este cultivo, las células huésped transformadas realizan la producción de la proteína de fusión que comprende al péptido de interés, y a la proteína guía SSD. Esta proteína de fusión es acumulada por la célula huésped preferentemente hacia cuerpos de inclusión. Esta etapa de expresión de la proteína de fusión se realiza en un rango de temperatura entre 20 y 40 °C, preferentemente entre 23 y 26° C, y por un tiempo entre 1 y 24 horas para cultivos en lote, o por tiempo indefinido para un cultivo en continuo.

Este rango preferente de temperatura entre 23 y 26° C, es distinto a los rangos preferentes utilizados comúnmente en el arte, los que usualmente se encuentran entre 35 y 40°C, preferentemente a 37°C.

En este rango preferente de temperatura entre 23 y 26°C, la célula huésped obtiene un resultado productivo superior a lo descrito en el arte. (Figura 4)

Este resultado productivo superior no es obtenible con ninguna proteína guia descrita en el arte, además de la consecuente disminución de la temperatura de trabajo, generando un ahorro energético.

D) Recuperar la proteína de fusión

Una vez que la proteína de fusión que contiene al péptido de interés se produce y acumula en el interior de la célula huésped, la presente solicitud describe una etapa de separación y purificación de la proteína de fusión.

Dicha etapa de separación y purificación comprende lisar la célula huésped para luego recuperar la proteína de fusión en forma total o parcial utilizando métodos tradicionales de separación y purificación, tales como centrifugación, precipitación y cromatografía, en donde el método de cromatografía es preferentemente cromatografía de afinidad a metales.

E) Escindir la proteína de fusión

La proteína de fusión recuperada es solubilizada en solución de escisión mediante al menos una etapa de diálisis, dilución, retención en columna de cromatografía, o precipitación y disolución, y luego para remover la proteína guía SSD, es procesada por métodos proteolíticos, tales como proteólisis enzimática, proteólisis química mediante escisión con proteasa, escisión química o escisión catalizada por metales, y donde la solución de escisión es preferentemente una solución semidenaturante y el método proteolítico es proteólisis enzimática con trombina.

F) Purificar el péptido de interés

Finalmente el péptido de interés es recuperado por métodos de cromatografía y/o de precipitación, preferentemente cromatografía de afinidad a metales, exclusión por tamaño, o fase reversa.

Entre las ventajas técnicas de la presente solicitud se encuentra que el proceso obtiene un resultado mejorado de productividad de proteína de fusión en un rango de temperatura de entre 23 y 26 °C, valor menor al utilizado usualmente de entre 35 y 40°C, generando un ahorro energético (Figura 4).

La proteína guia SSD descrita, permite hacer opcional la etapa de cromatografía para la recuperación de la proteína de fusión, otorgando la flexibilidad de escoger entre : 1 ) recuperar en una única etapa de cromatografía la totalidad de la proteína de fusión producida, (Figura 2 columna 1 ); o

2) recuperar sin necesidad de cromatografía, sólo la fracción de proteína de fusión producida en forma insoluble, (Figura 1 A columna 3);o

3) recuperar sin necesidad de cromatografía, sólo la fracción soluble de la proteína de fusión, mediante una precipitación selectiva por incubación en una temperatura específica. (Figura 3, columna 1 1 ).

Estas 3 formas, no son obtenibles utilizando una proteína guia conocida del arte. Esto es un resultado técnico que se obtiene gracias a las propiedades moleculares de la proteína guia SSD. Este proceso permite una productividad intracelular bruta mayor a 130 mg de péptido de interés por cada gramo de célula seca, lo que corresponde a una mejora sustancial de rendimiento. Esta mejora no es obtenible a partir del uso de las proteínas guia descritas en el arte. Según el proceso de recuperación de la proteína de fusión que se utilice, se recupera hasta 100 mg de péptido de interés por gramo de células secas, lo que corresponde a una mejora en productividad final respecto a lo descrito en el arte. La presente invención permite una mejora en rendimiento respecto al arte previo. El uso de esta proteína guía SSD, permite evaluar distintas alternativas de recuperación de la proteína recombinante.

Además de obtener una productividad aumentada en un proceso de expresión y recuperación de cualquier péptido recombinante de interés, realizado en un rango de temperatura menor al descrito en el arte.

EJEMPLOS DE APLICACIÓN

EJEMPLO

ETAPA A: Construcción de un vector de expresión

Se construyó un vector de expresión que contiene una secuencia que codifica para la proteína guía SSD de secuencia SEQ. ID NO:1 . Se incorporó además una secuencia que codifica un péptido de polihistidinas al extremo N-terminal de la proteína guía SSD y una secuencia codificante para un sitio de corte con trombina al extremo C-terminal. Por último, se incorporó sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Avrll y Pací, para ser usados como sitio de clonamiento de cualquier secuencia nucleotídica codificante para algún péptido de interés. El diseño permite que esta última secuencia sea insertada a continuación de la secuencia codificante para el sitio de corte con trombina. El ADN fue incorporado al vector de expresión pET22b(+) utilizando los sitios de restricción reconocidos por las enzimas Ndel y Xhol, quedando toda la región codificante bajo el control del promotor T7lac. La secuencia codificante para el péptido de interés p53pAnt fue insertada en el vector de expresión que contiene la secuencia codificante para la proteína guía SSD. Para esto, la secuencia nucleotídica codificante para el péptido p53pAnt fue sintetizada como dos pares de oligonucleótidos de hebra simple complementarios. Los oligonucleótidos se sintetizaron con los sitios de restricción para las enzimas Ανή\ y Pac\, para su clonación en el vector de expresión, en el marco de lectura de la proteína guía. Este gen fue digerido, simultáneamente con el vector de expresión, con las enzimas Ανή\ y Pac\ y luego ambos fragmentos fueron ligados.

ETAPA B: Insertar el vector de expresión en célula huésped

Células E. coli BL21 (DE3) fueron transformadas con el producto de ligación, utilizando resistencia a ampicilina como marcador de selección.

ETAPA C: Expresar de la proteína de fusión.

Un cultivo de células Escherichia co// ^' transformadas con el vector de expresión se creció en medio LB con 100 ug/mL de ampicilina durante 15 horas y se utilizó como inoculo para crecimiento celular en medio fresco LB con 100 ug/mL de ampicilina. Las células se crecieron hasta una densidad óptica aproximada de 1 ,0 a 600 nm. Luego, se agregó el inductor IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubó a 25°C durante 3,5 horas. Las células fueron colectadas por centrifugación (5 min a 5.000 x g) y el pellet fue congelado a -20 ^e C para su posterior procesamiento. En la Figura 1 , se puede observar que la proteína de fusión se acumula dentro de la célula alcanzando a formar cerca del 60% de la proteína total intracelular (columna 1 ).

ETAPA D: Recuperar la proteína de fusión

La recuperación de la proteína de fusión se realizó utilizando 3 formas distintas.

Recuperación forma 1 : Recuperación del total de la proteína de fusión expresada. Las células de Escherichia coli conteniendo en su interior la proteína de fusión que comprende la secuencia de la proteína guía SSD fusionada a la secuencia del péptido de interés fueron solubilizadas en solución Tris 40 mM, NaCI 500 mM, Urea 8M, pH 8.0, y lisadas mediante sonicación. La solución fue centrifugada 10 min a 10.000 x g y se colectó el sobrenadante que contiene la proteína de fusión. La proteína de fusión fue purificada por cromatografía de afinidad a metales utilizando una columna de níquel. Por este método fue posible obtener 400 mg de proteína de fusión por gramo de peso seco celular, con pureza superior al 95 % en un único paso cromatográfico. En la Figura 2, columna 1 , se muestra la proteína total recuperada.

Recuperación forma 2: Recuperación parcial de la proteína de fusión expresada: fracción insoluble Las células de Escheríchia coli conteniendo en su interior la proteína de fusión fueron solubilizadas en solución Tris 40 mM, NaCI 500 mM, pH 8.0, y lisadas mediante sonicación. La solución fue centrifugada 10 min a 10.000 x g y se colectó el pellet, el cual fue solubilizado en Tris 40 mM, NaCI 500 mM, Urea 8M, pH 8.0. La proteína solubilizada fue sometida a centrifugación por 10 min a 10.000 x g y se recuperó el sobrenadante conteniendo la proteína de fusión. Por este método fue posible obtener cerca de 300 mg de proteína de fusión por gramo de peso seco celular, con pureza superior al 90 % sin necesidad de purificación por cromatografía. En Figura 1 , columna 3, se muestra la proteína insoluble recuperada.

Recuperación forma 3: Recuperación parcial de la proteína de fusión expresada: fracción soluble

Las células de Escheríchia coli conteniendo en su interior la proteína de fusión fueron solubilizadas en solución Tris 40 mM, NaCI 500 mM, pH 8.0, y lisadas mediante sonicación. La solución fue centrifugada 10 min a 10.000 x g y se recuperó el sobrenadante. La proteína de fusión contenida en el sobrenadante fue recuperada mediante precipitación selectiva por temperatura. Se obtuvo alrededor de 100 mg de proteína de fusión, con una pureza de aproximadamente 75%, mediante incubación a 30 ^e C durante 35 minutos y sin necesidad de purificación por cromatografía. En Figura 3, columna 1 1 , se muestra la proteína soluble recuperada.

ETAPA E: Escindir la proteína de fusión

El péptido de interés fue recuperado desde la proteína de fusión. Para esto, se introdujo previamente, en la construcción de la proteína de fusión, una secuencia de corte entre la proteína guía SSD y el péptido de interés.

La proteína de fusión fue solubilizada en solución de escisión Tris 20 mM, NaCI 150 mM, pH 8.0, 0,3 % sarkosyl para ser digerida por proteasa trombina. Para esto, la proteína de fusión recuperada según la forma 1 , fue dializada contra solución de escisión; la proteína de fusión recuperada según la forma 2, fue precipitada mediante dilución y luego disuelta en solución de escisión; la proteína de fusión recuperada según la forma 3, fue disuelta directamente en solución de escisión. La escisión enzimática resultó en la digestión de hasta un 95% de la proteína de fusión. ETAPA F: Purificar el péptido de interés El péptido de interés liberado en la escisión enzimática fue purificado mediante cromatografía de afinidad a metales utilizando una columna de níquel, recuperándose un 80 % del péptido libre.

Para el caso en que la proteína de fusión fue recuperada en la etapa E, según la forma 1 , se logró una productividad final de 100 mg de péptido por gramo de peso seco celular; en el caso en que la proteína de fusión fue recuperada según la forma 2, se logró una productividad final de 55 mg de péptido por gramo de peso seco celular; y en el caso en que la proteína de fusión fue recuperada según la forma 3, se logró una productividad final de 20 mg de péptido por gramo de peso seco celular.