UTILISATION ASSOCIES

La présente invention concerne un peptide isolé qui peut être utilisé comme standard ou étalon pour le dosage de la protéine proAKAP4.

La présente invention concerne également un kit de détection/dosage de la proAKAP4 qui contient le peptide de l’invention.

La présente invention concerne également l’utilisation du peptide de la présente invention pour la détection ou le dosage, notamment par spectrométrie, de la protéine proAKAP4 humaine ou celle d’un autre mammifère.

La protéine AKAP4 est une protéine connue et présente dans la plupart des organismes, notamment les mammifères et les reptiles. Elle est également appelée AKAP82, notamment chez la souris.

La protéine AKAP4 a un précurseur, appelé protéine proAKAP4 ou proAKAP82. Ce précurseur a une masse moléculaire plus élevée que celle de la protéine.

Dans les spermatozoïdes, notamment de mammifères, la protéine AKAP4 est présente simultanément avec son précurseur, la protéine proAKAP4. Les deux protéines ont des structures très proches l’une de l’autre et sont donc difficiles à distinguer et par là-même à doser lorsqu’elles sont en mélange. Ainsi, la publication intitulée « Régulation of protein tyrosine phosphorylation in Human sperm by a calcium/calmodulin-dependant mechanism : identification of A Kinase Anchor Proteins major substrates for tyrosine-phosphorylation » et publiée en 1996 dans la revue « Developmental Biology, 180, pages 284 à 296, indique qu’il est permis de détecter dans le sperme humain la protéine AKAP4 et son précurseur (la proAKAP4) sans faire la distinction entre les deux. Dans le document précité, la détection est mise en oeuvre au moyen d’anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine AKAP82 préalablement séparée par électrophorèse. Ce document précise qu’en pratique les anticorps se lient à la fois à la protéine AKAP4 et à son précurseur et ne permettent donc pas de distinguer la protéine AKAP82 (ou AKAP4) de son précurseur (ou proAKAP4). Il existe par ailleurs des kits commerciaux qui permettent de doser la protéine AKAP4. Ainsi, la société CUSABIO® commercialise un kit ELISA pour la détection de la protéine AKAP4 humaine. Néanmoins, le mode d’emploi du kit indique qu’il ne permet pas de distinguer GAKAR4 de ces homologues et donc notamment la proAKAP4.

La société Mybiosource® commercialise également un kit du type ELISA Sandwich qui permet le dosage de GAKAR4 de porc. Ce kit utilise des anticorps qui ciblent des épitopes de conformation et non des épitopes linéaires. Le kit ne peut pas être utilisé pour le dosage de toutes les AKAP4 et en tout état de cause ne permet pas de doser GAKAR4 seule ou la proAKAP4 seule.

Le document WO 2015/032842 A1 décrit une méthode de détermination de la qualité du sperme qui met en œuvre la mesure du niveau d’expression de la protéine AKAP4 dans les spermatozoïdes. Ce document décrit un dispositif de type ELISA sandwich qui utilise, de manière classique deux anticorps, un polyclonal et un monoclonal. L’un est dirigé contre la partie C-terminale (le polyclonal) de la protéine AKAP4, l’autre contre sa partie N-terminale (le monoclonal). Ce kit utilise également une protéine recombinante humaine AKAP4 en tant que standard ; il permet ainsi la quantification de GAKAR4 (protéine entière et native) contenue dans un mélange obtenu à partir de spermatozoïdes lysés.

La protéine recombinante humaine AKAP4 est coûteuse. De plus, le kit décrit dans le document WO 2015/032842 A1 ne permet pas le dosage de la proAKAP4. Or, la proAKAP4 s’avère être utile à doser, notamment dans les spermatozoïdes de mammifères et notamment humains. Ainsi, chez l’Humain, des dosages quantitatifs de la proAKAP4 par ELISA mettent en évidence au moins deux groupes chez les patients normo-zoospermes, en fonction de la quantité de proAKAP4 : un groupe A caractérisé par la présence de la proAKAP4 et un groupe B caractérisé par la présence en faible concentration ou l’absence. La concentration de proAKAP4 est corrélée à la mobilité progressive des spermatozoïdes chez les normo-zoospermes. Une analyse statistique a été effectuée entre les groupes exprimant la proAKAP4 (groupes A et B). Dans le groupes A, le taux de fausses-couches est significativement réduit par rapport au groupe B. Pour les techniques de fécondation in vitro, FIV et ICSI confondues, une meilleure qualité embryonnaire, un taux de cryopréservation augmenté, une augmentation du taux de grossesse clinique et d’accouchement ont été observés dans pour le groupe A par rapport au groupe B.

La publication intitulée « Relationship between sperm motility and the Processing and tyrosine phosphorylation of two human sprm fibrous sheath proteins, pro- hAKAP82 and hAKAP82 » de Regina M. O. Turner publiée en 1999 dans la revue « Molecular Human Reproduction », vol 5, n°9 pages 816 à 824 divulgue un peptide synthétique qui a pour séquence les acides aminés en position 131 jusqu’à 145 du prodomaine de la proAKAP4 humaine. Ce peptide est constitué de 15 acides aminés. Il n’est pas utilisé en tant que standard pour la quantification soit par immunofluorescence soit par électrophorèse. Ce peptide est utilisé pour la productions d’anticorps polyclonaux de lapins, lesquels permettent de détecter la proAKAP4 seulement ; ces anticorps ne se fixent pas sur la protéine AKAP4 mature.

La publication intitulée « Significant corrélation between the proAKAP4 concentration and the total and progressive motility in stallion sperm after thawing » publiée le 22 juin 2018 dans le volume 6, page 43 de la revue « Journal of equine veterinary science » fait référence à un kit de dosage de type ELISA de la proAKAP4 sans toutefois mentionner le standard utilisé ni les anticorps utilisés.

Le document AB46 concentration of proAKAP4 as a pertinent read-out of sperm quality in mammals » publié le 1 ^er janvier 2018 fait également référence à un nouveau kit de quantification ELISA de la proAKAP4 utilisable chez l’étalon. Ce document ne cite ni ne décrit ni le standard utilisé, ni les anticorps utilisés.

Il y a donc un réel besoin de mesurer de manière précise la proAKAP4, notamment lorsqu’elle se trouve dans en mélange avec la protéine AKAP4.

Un problème que se propose de résoudre la présente invention est de proposer un kit qui permet de doser la protéine proAKAP4.

Un autre problème que se propose de résoudre la présente invention est de proposer un kit de dosage de la proAKAP4 qui puisse être utilisé pour le dosage de la proAKAP4, même lorsque cette dernière est en mélange avec la protéine AKAP4 et notamment dans un mélange provenant de spermatozoïdes lysés. Un autre problème que ce propose de résoudre la présente invention est de fournir un kit qui permet de détecter et/ou doser la protéine proAKAP4 qui soit facile à fabriquer et peu coûteux.

Un autre problème que se propose de résoudre la présente invention est de fournir un kit de dosage de la proAKAP4 qui permet de détecter et/ou doser la proAKAP4 humaine mais également celle présente dans les spermatozoïdes d’autres animaux, notamment des mammifères, tels que par exemple, les porcins (notamment le verrat), les ovins (notamment le bélier), les bovins (notamment le taureau), les caprins (notamment le bouc), les équidés (notamment le cheval), les canidés (notamment le chien), les rongeurs (notamment la souris, le rat et le lapin).

Un autre problème que se propose de résoudre la présente invention est de fournir un standard permettant le dosage de la proAKAP4 et qui ne soit pas une protéine recombinante.

La présente invention concerne un peptide synthétique pouvant notamment servir de standard pour le dosage de la proAKAP4. De manière caractéristique, le peptide synthétique est choisi parmi les peptides comportant une extrémité N- terminale qui comporte ou est formée d’une région qui présente 100% d’identité avec une région de la séquence formée par les 188 premiers acides aminés de l’extrémité N-terminale de la protéine proAKAP4 représentée par la séquence SEQ ID NO 4 et une extrémité C-terminale qui comporte ou est formée d’une séquence qui présente 100% d’identité avec une région de la séquence C-terminale comprenant ou constituée des 100 derniers acides aminés de ladite protéine proAKAP4, en ce que ladite séquence formant ladite extrémité N-terminale dudit peptide comprenant en particulier au moins 6 et jusqu’à 12 acides aminés, en ce que ladite séquence formant ladite extrémité C-terminale dudit peptide comprenant au moins 6 et jusqu’à 10 acides aminés et ledit peptide comprenant de 16 à 50 acides aminés, et plus précisément 41 acides aminés.

Selon un autre mode de réalisation, le pourcentage d’identité entre les régions du peptide et celles de la protéine proAKAP4 précitées est égal à 70% ou compris entre 70% et 90% ou 95% ou égal à 90% ou 95%. Le pourcentage d’identité d’une région peut être différent d’une autre. La protéine proAKAP4 représentée par la séquence SEQ ID NO 4 correspond à la protéine dont le numéro d’entrée est le Q5JQC9 dans la base de données Uniprot, version d’entrée 1 1 1 (du 28 février 2018).

Les 188 premiers acides aminés de la protéine proAKAP4 correspondent aux acides aminés situés de la position 1 à la position 188 de la séquence SEQ ID NO 4.

Les 100 derniers acides aminés correspondent aux acides aminés situés de la position 753 à la position 853 sur la séquence SEQ ID NO 4.

Tous les numéros d’entrée des protéines citées dans le Tableau 1 sont les numéros d’entrée dans la base de données Uniprot, version d’entrée 1 1 1 (du 28 février 2018). La Demanderesse a en effet constaté qu’un tel peptide pouvait servir à la détection et au dosage de la proAKAP4 ; de manière inattendue, un peptide tel que précité se comporte comme la protéine proAKAP4 et peut être reconnu par des anticorps monoclonaux ou polyclonaux anti-proAKAP4. Il peut servir à la détection de la proAKAP4 ou à son dosage, notamment dans un mélange complexe, tel que le mélange provenant de la lyse de spermatozoïdes. En effet, dans un tel mélange, les interactions entre protéines sont nombreuses ; la proximité des protéines proAKAP4 et AKAP fait qu’elles sont difficiles à distinguer l’une de l’autre. La forme tridimensionnelle de la protéine proAKAP4 n’est pas connue et elle peut changer en fonction du milieu dans lequel se trouve la protéine. Il n’était donc pas évident pour l’Homme du Métier qu’un peptide tel que précité puisse se comporter et être reconnu comme la protéine proAKAP4 elle-même.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide comporte 42 acides aminés et la séquence N-terminale comporte 12 acides aminés, tandis que la séquence C- terminale comporte 10 acides aminés.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide comporte 28 acides aminés, la séquence N-terminale comporte 12 acides aminés et la séquence C-terminale comporte 10 acides aminés.

La Demanderesse a également mis en évidence que le peptide de l’invention permet le dosage de la proAKAP4 humaine mais aussi celles d’autres animaux et notamment mammifères. Elle permet ainsi, par exemple, le dosage de la proAKAP4 des animaux listés dans le Tableau 1 ci-après.

Quel que soit le mode de réalisation du peptide de l’invention, celui-ci peut être contenu dans une composition, notamment une solution tampon, contenant en tant que solvant du PBS (tampon phosphate salin contenant de manière classique du NaCI, KCI, Na2HP0 ₄ et KH2PO4), un mélange de PBS et de caséine, notamment un mélange contenant du PBS et 0,04% en masse de caséine, du tris (2-amino-2- hydroxyméthyl-1 ,3-propanediol), de l’HEPES ou un mélange d’au moins deux de ces tampons. De manière similaire, le kit de l’invention, quel que soit son mode de réalisation peut comporter une solution telle que précitée.

Selon un premier mode de réalisation particulier, le peptide est choisi parmi

- les peptides comprenant une séquence de formule générale I :

X1X2X3 (I) dans laquelle

X1 est un peptide représenté par la séquence SEQ ID NO : 1 DLQKYALGFQHA ; X2 est un peptide contenant de 4 à 20 acides aminés ;

X3 est un peptide représenté par la séquence SEQ ID N02 : EVMKFAKERQ ; et

- les peptides présentant au moins 80% d’identité et jusqu’à au moins 90% d’identité avec la formule générale I ou avec les peptides X1 et/ou X2, la fonction amine liée au peptide X1 et/ou le groupe carboxyle associé au peptide X3 étant éventuellement protégé(e)(s) par un groupement protecteur.

Le groupe protecteur est, à titre d’exemple, un groupe phénylméthoxycarbonyle, un groupe 1 , 1 -diméthyléthoxycarbonyle, un groupe éthyle, méthyle ou benzyle.

Selon un mode de réalisation particulier du premier mode de l’invention, le peptide X2 a la formule générale II suivante :

Il (X4X5) _n n étant un entier allant de 3 à 10 compris, dans laquelle X4 est un acide aminé choisi parmi D, E, K et R

X5 est un acide aminé choisi parmi A, G, I, V, L.

X4 et X5 peuvent être choisi indépendamment l’un de l’autre. Avantageusement X4 et X5 sont identiques. Ils peuvent par exemple être tous deux de l’alanine.

La Demanderesse a constaté que le peptide permettait un dosage précis lorsque le peptide X2 n’était pas trop long et en particulier, lorsque n était égal ou supérieur à 3 ou égal ou inférieur à 10 dans la formule II précitée.

Avantageusement, n=3 ou 5 dans la formule II. La Demanderesse a en effet constaté que le peptide ainsi obtenu se comportait de manière très proche de la proAKAP4, notamment lorsqu’elle est dans un mélange complexe et qu’il pouvait donc servir au dosage de cette dernière, notamment dans un mélange complexe.

Selon un mode de réalisation particulier, le peptide de l’invention est représenté par la séquence SEQ ID NO 3 : DLQKYALGFQHADADADAEVMKFAKERQ. La Demanderesse a montré qu’un tel peptide était un standard particulièrement performant.

La présente invention concerne également un kit permettant la détection et/ou le dosage de la protéine proAKAP4. De manière caractéristique, le kit de l’invention comporte, notamment en tant que standard, le peptide selon l’invention, éventuellement en solution et notamment dans une solution telle que précitée. Ce kit peut être un kit qui permet le dosage de la proAKAP4 par spectrométrie, notamment par spectrophotométrie au moyen de la mesure de la densité optique ou par spectrométrie de fluorescence, par exemple.

La présente invention concerne également tout kit de détection (sans dosage) de la proAKAP4 qui contient le peptide selon l’invention.

Le kit de l’invention n’est pas limité à un type de kit spécial. Il peut s’agir, par exemple, d’un kit ELISA, d’un kit de type ELISA sandwich ou d’une bandelette immuno- chromatographique sur laquelle sont fixés un ou des anticorps. Sur le principe de l’ELISA sandwich, il peut s’agir de méthodes bien connues de l’état de l’art comme les tests de détection rapide de type « latéral flow test », les tests utilisant le gadolinium pour la détection d’anticorps par RMN, les tests permettant la mesure à l’échelle moléculaire comme le test commercialisé par la société Quanterix® ou les tests mettant en oeuvre la variation de flux cytométrique (CyTOF). Ainsi, selon un mode de réalisation particulier du kit de l’invention, il comporte des premiers anticorps dirigés contre la partie N-terminale de la protéine proAKAP4 ou dirigés contre la partie C-terminale de la protéine proAKAP4 et éventuellement des deuxièmes anticorps dirigés contre l’extrémité de la protéine proAKAP4 qui n’est pas détectée par lesdits premiers anticorps et un marqueur de détection lié auxdits premiers ou deuxièmes ou apte à réagir avec les premiers ou deuxièmes anticorps. Lorsque le kit comporte deux types d’anticorps tels que précités, il peut être un kit de type ELISA sandwich ou un kit de type bandelette immuno-chromatographique.

Ainsi, le kit peut comporter une bandelette immuno-chromatographique qui comporte lesdits premiers et/ou deuxièmes anticorps ou une plaque comportant une pluralité de puits au fond desquels sont fixés ou peuvent être fixés lesdits premiers ou deuxièmes anticorps.

Le marqueur n’est pas limité selon l’invention. Il peut être choisi parmi les marqueurs radio détectables, les colorants, les enzymes dont les peroxydases, la biotine, les colloïdes et les fluorochromes, le gadolinium, les nano billes ou nano particules colorées ; le kit peut également comprendre, en fonction du type de marqueur, une solution de révélation apte à régir avec ledit marqueur afin de permettre la détection visuelle de ce dernier, soit en lumière naturelle, soit par fluorescence.

Lorsque le kit comprend une bandelette immuno-chromatographique, le marqueur est avantageusement choisi parmi les nano billes colorées, nanobilles fluorescentes, les billes d’or colloïdales, les billes de polystyrène, les billes de latex et les colorants, permettant ainsi une détection visuelle, sans révélation, de la présence d’un certaine quantité donnée (et connue) de la proAKAP4 dans l’échantillon dosé.

Les anticorps utilisés dans le kit de l’invention ne sont pas limités. Selon un mode de réalisation particulier de ces derniers, lesdits premiers anticorps sont aptes à se lier à la région de la protéine proAKAP4 comprise de l’acide aminé en position 1 17 à l’acide aminé en position 128 et lesdits deuxièmes anticorps sont choisis parmi les anticorps aptes à se lier à la région de ladite protéine proAKAP4 comprise de l’acide aminé en position 824 à l’acide aminé en position 833.

La combinaison de tels anticorps avec le peptide de l’invention, utilisé en tant que standard permet la quantification précise de la proAKAP4. Les anticorps peuvent être, par exemple, les anticorps anti-AKAP4 (clone 7E10) et les anticorps anti-AKAP4 (clone 6F12) commercialisés par la société SPQI®.

Pour la mise en œuvre du dosage de la proAKAP4, avec un kit de type ELISA sandwich, on fixe d’abord des premiers anticorps sur le fond des puits d’une plaque. Dans les puits qui vont servir d’étalon, on ajoute des concentrations connues du peptide de l’invention. Dans les autres puits, on ajoute le mélange à doser, éventuellement dilué (le taux de dilution étant connu). Le peptide vient se fixer sur le premier anticorps tout comme la protéine proAKAP4. On ajoute ensuite le second anticorps qui vient se fixer sur l’autre extrémité du peptide ou sur la protéine proAKAP4. On mesure alors la densité optique des mélanges contenus dans les puits et grâce à la courbe étalon obtenue pour les puits contenant le peptide, on déduit la concentration en proAKAP4 dans les autres puits contenant le mélange à doser. Si le deuxième anticorps comporte un fluorochrome, on mesure la fluorescence émise pas les puits soit avec un lecteur densitométrique équipé d’un système UV, soit avec un spectrofluoromètre. Si le marqueur comporte un radio isotope, on mesure l’intensité du rayonnement émis. Si le marqueur est une enzyme (par exemple, peroxydase ou phosphatase alcaline), l’anticorps marqué est détecté par ajout du substrat de l’enzyme ; on obtient ainsi un produit coloré dont on mesure la coloration par spectrophotométrie. Si l’anticorps est marqué à la biotine, il est détecté par ajout d’avidine ou de streptavidine, elle-même marquée avec plusieurs enzymes ou plusieurs fluorochromes.

La présente invention concerne également l’utilisation du peptide selon l’invention pour le dosage par spectrométrie de la proAKAP4, notamment dans un mélange obtenu par lyse de spermatozoïdes, notamment de spermatozoïdes de mammifère et notamment d’humain. .

La présente invention concerne également une première méthode de dosage de la proAKAP4 humaine ou autre contenue dans un échantillon, selon laquelle :

- on prépare des solutions servant de standard et contenant chacune une quantité connue du peptide selon l’invention, lesdites solutions contenant chacune une quantité différente dudit peptide ; - on dépose sur le fond de plusieurs puits une quantité donnée d’un premier anticorps tel que précité ;

- on ajoute dans des puits distincts, une quantité donnée de chacune desdites solutions standard et l’on ajoute une quantité donnée d’un deuxième anticorps marqué tel que précité ;

- on rince éventuellement pour éliminer lesdits deuxièmes anticorps surnuméraires qui ne sont pas liés audit peptide contenu dans lesdites solutions standard.

- on mesure la densité optique de chacune des solutions contenues dans les puits et on en déduit une courbe étalon qui corréle la densité optique de chacune des solutions avec le logarithme de leur concentration molaire ou massique en proAKAP4 ou, dans le cas du dosage d’une proAKAP4 non humaine, on détermine à partir du rapport massique suivant : masse moléculaire de la proAKAP4 humaine/Masse moléculaire de la proAKAP4 contenue dans l’échantillon, la densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique de la proAKAP4 contenue dans l’échantillon.

Selon cette méthode, on dose soit simultanément à l’élaboration de la courbe étalon, soit séparément, la concentration en proAKAP4 de l’échantillon de la manière suivante :

- on ajoute dans un moins un puit au fond duquel on a fixé la même quantité donnée dudit premier anticorps que pour l’élaboration de la courbe standard, une quantité donnée dudit échantillon, éventuellement dilué ;

- on ajoute une quantité donnée dudit deuxième anticorps marqué et on rince éventuellement pour éliminer les anticorps surnuméraires ;

- on mesure la densité optique de la solution contenue dans le ou les puits et on en déduit en utilisant la courbe étalon, la concentration en proAKAP4 dudit échantillon.

Selon l’invention, selon une deuxième méthode, il est aussi possible de déposer sur un substrat, par exemple, une bandelette immuno- chromatographique, une quantité donnée dudit premier anticorps et la même quantité dudit deuxième anticorps marqués. Les anticorps étant comme définis en référence à la première méthode. On dépose également sur ledit support la même quantité du peptide selon l’invention, à distance desdits anticorps. Dans les deux méthodes, le terme quantité fait référence non pas à la masse de substance dé posée mais au nombre de moles déposées. On met ensuite une extrémité de la bandelette avec une quantité donnée dudit échantillon éventuellement diluée dans une solution d’élution. L’apparition d’une bande plus ou moins colorée sur le substrat indique de manière plus grossière la concentration en proAKAP4, par comparaison avec un étalon qui montre des bandes colorées et associe des plages de concentrations à ces bandes, voire un indice numérique ou autre indicatif de la qualité du sperme.

Les deux méthodes précitées peuvent être appliquées, notamment à un échantillon de sperme humain ou autre dont les spermatozoïdes sont lysés avant application de la méthode de dosage.

Le terme proAKAP4 désigne la protéine humaine dénommée AKAP4 dont le numéro d’entrée est le Q5JQC9 dans la base de données Uniprot, version d’entrée 1 1 1 (du 28 février 2018). Il s’agit de la proAKAP4 humaine. Lorsqu’il est fait référence à une protéine proAKAP4 d’origine non humaine, l’organisme d’origine est spécifié.

Le terme «pourcentage d’identité» désigne le pourcentage de résidus d’acides aminés identiques entre la séquence de l’invention et la séquence à comparer, à travers une fenêtre de comparaison, ledit pourcentage étant obtenu après le meilleur alignement. Cet alignement peut être global (on aligne la totalité de la séquence comparée à la séquence du peptide) ou local (on n’aligne que les parties C et N terminales du peptide à comparer avec les séquences SEQ ID NO° 1 et SEQ ID NO°2 du peptide de l’invention). Les peptides ayant un % d’identité avec le peptide de l’invention, tel que défini dans la formule I, notamment peuvent ainsi comprendre des insertions ou des délétions d’un ou plusieurs acides aminés (par exemple des « gaps ») par rapport à la séquence du peptide de l’invention (qui ne comprend donc pas ces insertions ou ces délétions).

Les termes «dosage» et «quantification» désignent, si aucune autre précision n’est indiquée, soit le fait de mesurer la quantité de proAKAP4 dans un échantillon soit de déterminer le fait que la concentration en proAKAP4 dans l’échantillon est bien au moins égale à une valeur donnée et connue, qui correspond, notamment à la quantité d’anticorps utilisés pour la quantification. Ainsi dans le cas d’un kit comportant une bandelette immuno- chromatographique, on s’assure que la quantité (concentration) de proAKAP4 contenue dans l’échantillon testé est bien égale ou supérieure à une valeur donnée.

La présente invention, ses caractéristiques et les divers avantages qu’elle procure apparaîtront mieux à la lecture des exemples qui suivent, présentés à titre non limitatif et qui font référence aux dessins annexes sur lesquels :

La [fig. 1 ] représente une courbe étalon (densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique) obtenue à partir du peptide de la présente invention pour le dosage de la proAKAP4 du cheval dans des spermatozoïdes de cheval, préalablement lysés ;

La [fig. 2] représente une courbe étalon (densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique) obtenue à partir du peptide de la présente invention pour le dosage de la proAKAP4 du taureau dans des spermatozoïdes de taureau, préalablement lysés ;

La [fig. 3] représente une courbe étalon (densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique) obtenue à partir du peptide de la présente invention pour le dosage de la proAKAP4 de porc dans des spermatozoïdes de porc, préalablement lysés ;

La [fig. 4] représente une courbe étalon (densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique) obtenue à partir du peptide de la présente invention pour le dosage de la proAKAP4 humaine dans des spermatozoïdes humains, préalablement lysés ;

[EXEMPLES]

Synthèse du peptide

Un peptide de l’invention, correspondant à la séquence SEQ ID NO°3 a été synthétisé en phase solide, de manière classique. La synthèse peptidique a été réalisée à l’aide d’acides aminés dont les fonctions amines ont été protégées (Fmoc). La synthèse débute par le dernier acide aminé en position carboxy -terminal vers le premier acide aminé de l’extrémité amino-terminale. A chaque cycle de synthèse le groupe de protection N-terminal sur l’acide aminé C-terminal du peptide est d’abord déprotégé. Après le retrait du groupe de protection, l’acide aminé qui est ajouté est activé sur la fonction carboxylique par un agent de couplage comme par exemple le DCC (dicyclohexyl carbodiimide) ou DIC (diisopropyl carbodiimide), facilitant ainsi la formation d’une liaison peptidique entre la partie amino-terminale déprotégée du premier acide aminé et la fonction acide carboxylique activée. Le nouveau groupe amino-terminal du peptide synthétisé est à nouveau déprotégé et couplé à l’acide aminé suivant. Ce cycle de couplage est renouvelé jusqu’à obtention de la séquence du peptide selon la séquence précitée.

Exemple de protocole dosage de la proAKAP4 dans un mélange issu de la lyse de spermatozoïdes avec un kit de type ELISA sandwich

On prépare les solutions suivantes qui sont ensuite conservées à 4°C. L’eau est toujours de l’eau norme ISO 3696

Tampon carbonate (tampon de revêtement)

On prépare une solution 0, 1 M de NaHC03 0.1 M : (NaHC03 PM=84.01 ), 4.2 g pour 500 mL d’H20 norme ISO 3696. On ajoute du carbonate de sodium anhydre (2,645g) dans 250 mL d’eau norme ISO 3696 (Na2C03 PM=105.99) pour former une solution 0, 1 M. On Ajoute progressivement la solution précitée dans la solution de NaHC03 jusqu’à l’obtention d’un pH=9.6

Tampon citrate/phosphate (tampon de révélation)

On dissout 10.5 g d’acide citrique dans 100 mL d’eau (C6H807, H20 PM=210.14). On dissout 14,91 g de Na2P04 dans 210 mL d’eau. On mélange 207.5 mL de la solution de Na2P04 avec 97 mL de la solution d’acide citrique. On complète avec de l’eau et on ajuste le pH à 5 avec de l’acide citrique.

Tampon pbs 1x :

On dilue un sachet de préparation pour tampon PBS (commercialisé par la société Sigma - Ref :P3813-10PAK) dans 1 L d’eau.

Caséine 0.4% (tampon de saturation)

A préparer la veille et agiter plusieurs heures pour homogénéiser

On pèse 0.4g de caséine, on ajoute du tampon PBS 1x pour obtenir 100mL. On agite sur la demi-journée - On conserve à 4°C sous agitation tampon pbs/tween 0.05% (tampon de lavage)

On dilue un sachet de PBS 1x dans 1 L d’eau. On ajoute 500 pL de Tween20 Tampon pbs/caséine 0,04% (tampon de dilution)

On dilue le tampons PBS/Caséine 0,4% au dixième dans du PBS 1x. acide sulfurique (solution d’arrêt de la réaction)

Mélanger 10.32 ml_ H2S04 dans 89.78 ml_ d’H20.

Revêtement des plaques

On réalise des solutions de revêtement. Anticorps anti-AKAP4 clone 7E10 (ref. 4BDX-1702) dilué à 1 ,5 pg/mL dans le tampon carbonate (tampon de revêtement). « Coating » (revêtement) en plaques NUNC F8 Maxisorp®. On dépose 100 pL/puits d’anti-AKAP4 (préalablement dilué dans le tampon de revêtement. On incube 1 nuit à 4°C avec agitation.

Saturation : On éliminer la solution de revêtement en lavant 3 fois avec 300pL/puits de tampon PBS (tampon de lavage)

Incubation échantillons

On prépare les échantillons dilués dans le PBS/Caséine 0,04% (Dilution buffer) :

On réalise une gamme étalon avec le peptide de l’invention (séquence SEQ ID NO° 3). On prépare les solutions suivantes contenant respectivement : 300, 150, 75, 37, 5, 17.25, 8.6125, 4.362 ng/puits.

Traitement des spermatozoïdes

On lyse les spermatozoïdes de manière connue. On dépose 100pL/ puit de semence lysée et on laisse incuber 2h à température ambiante.

Incubation Anticorps de détection

On lave 3 fois avec 300 pL/puits avec le tampon PBS/Tween 0.05%/Proclin 0,035% (tampon de lavage). On prépare l’anticorps de détection dans le mélange PBS/caséine 0.04% (tampon de dilution). On utilise l’anticorps Anti-AKAP4-Nter : 6F12 conjugué commercialisé par la société - SPQI (ref :4BDX-1701 ) - mouse monoclonal - 0,5pg/ml_ dans la solution PBS/caséine 0,04% (tampon de dilution). On dépose 100 pL/puits de l’anticorps de détection et on incube 1 h à T°C ambiante avec agitation

Révélation (Jour 2)

On lave 5 fois avec 300 pL/puits du tampon PBS/Tween 0.05%/Proclin 0,035% (tampon de lavage). On prépare la solution de révélation (au dernier moment et à l’abri de la lumière). Pour 1 plaque, on ajoute 10 ml_ de tampon Citrate/Phosphate (tampon de révélation) + 1 pastille de TMB. Une fois la pastille dissoute, on ajoute 2pL H202 30% ou Alternativement on utilise du TMB prêt à l’emploi. On ajoute 100pL/puits de solution. On incube 30min à température ambiante (à l’obscurité). On stoppe la réaction avec 50 pL/puits d’acide sulfurique à 30% (H2S04). La lecture se fait avec un spectrophotomètre à 450nm.

Le protocole précité a été utilisé pour obtenir les courbes standard des Fig. 1 à 4 pour le dosage de la proAKAP4 dans des spermatozoïdes de verrat, de cheval, d’Homme et de taureau. Dans ces exemples, c’est la protéine proAKAP4 du mammifère concerné qui est dosé. Le peptide de l’invention permet en effet de doser les protéines proAKAP4 de différents animaux et notamment mammifères, du fait de la présence des séquences N-terminale et C-terminale du peptide de l’invention dans les protéines proAKAP4 de ces animaux. Ainsi, le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO° 3 permet notamment de détecter ou de doser les protéines proAKAP4 des animaux regroupés dans le tableau 1 ci-dessous. Cette liste n’est pas limitative.

Tableau 1

Exemple de courbe étalon pour le dosage de la proAKAP4 équine contenue dans un mélange issu de la lyse de spermatozoïdes équins

La Fig. 1 représente la courbe étalon qui représente la densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique en proAKAP4 équine. Connaissant la concentration massique en peptide de chacune des solutions utilisées pour la courbe étalon, on en déduit en fonction du rapport de la masse moléculairel du peptide / masse de la proAKAP4 équine (laquelle est connue) (voir Tableau 1 ), le logarithme de la concentration massique en proAKAP4 équine.

Exemple de courbe étalon pour le dosage de la proAKAP4 du taureau, laquelle est contenue dans un mélange issu de la lyse de spermatozoïdes de taureau

La Fig. 2 représente la courbe étalon qui représente la densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique en proAKAP4 bovine. Connaissant la concentration massique en peptide de chacune des solutions utilisées pour la courbe étalon, on en déduit en fonction du rapport masse de peptide / masse moléculaire de la proAKAP4 bovine (laquelle est connue) (voir Tableau 1 , le logarithme de la concentration massique en proAKAP4 bovine.

Exemple de courbe étalon pour le dosage de la proAKAP4 du verrat, laquelle est contenue dans un mélange issu de la lyse de spermatozoïdes de verrat

La Fig. 3 représente la courbe étalon qui représente la densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique en proAKAP4 porcine. Connaissant la concentration massique en peptide de chacune des solutions utilisées pour la courbe étalon, on en déduit en fonction du rapport de la masse du peptide / masse moléculaire de la proAKAP4 porcine (laquelle est connue) (voir Tableau 1 ) le logarithme de la concentration massique en proAKAP4 porcine.

Exemple de courbe étalon pour le dosage de la proAKAP4 de l’Homme, laquelle est contenue dans un mélange issu de la lyse de spermatozoïdes d’homme

La Fig. 4 représente la courbe étalon qui représente la densité optique en fonction du logarithme de la concentration massique en proAKAP4. Connaissant la concentration massique en peptide de chacune des solutions utilisées pour la courbe étalon, on en déduit en fonction de la densité optique, le logarithme de la concentration massique en proAKAP4 humaine.