【발명의 명칭】

유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도

【기술분야】

본 출원은 2016년 7월 4일에 출원된 대한민국 특허출원 계 10-2016-0084357호 를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 본 발명은 유방암 표적용 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로 보다 상세 하게는 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유 방암 표적 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

【배경기술】

유방암은 여성에 있어 가장 흔한 암이며, 두 번째로 사망률이 높은 암이다. 2001년 유방암의 유병를은 미국에서 100 , 000 명당 90-100이었으며, 유럽에서는 100,000 명당 50-70이었다. 이 질환의 발병은 세계적으로 점점 증가하는 추세에 있 다. 유방암의 위험 인자는 인종， 나이 및 암 억제 유전자 BRCA-1 및 BRCA-2 및 p53 에서의 돌연변이 등을 포함한다. 알코올 섭취， 고지방 식이， 운동 부족， 외인성 폐 경 후 호르몬 및 이온화 방사선 또한 유방암의 발명 위험을 증가시킨다. 에스트로 겐 수용체 및 프로게스테론 수용체 음성 유방암 (각각 " _ER -" 및 R-" ) , 큰 종양 크 기, 높은 등급의 세포진단결과， 및 35세 이하인 경우 그 예후가 나쁘다 (Goldhi rsch et al . (2001) . J . Cl in. Oncol . 19： 3817-27) . 2005년 약 212, 000건의 새로운 침 습성 유방암 증례 및 58,000건의 새로운 비침습성 유방암증례가 진단될 것으로 추 산되며， 40 ,000명의 여성이 유방암으로사망할 것으로 예상된다. 현재의 유방암에 대한 치료 방법은 수술 이후， 항암 치료, 항호르몬 치료, 표적 치료 혹은 방사선 치료 등 향후 재발을 줄이기 위한 추가 보조적인 치료가 필 요한 경우가 많다， 유방암은 유방암 주요 수용체의 상태에 따라 암의 특성이 다르 며， 따라서 조직검사를 통해 호르몬 수용체 (ER 및 PR) 발현 유무와 'HER-2' 과발 현 여부 및 전이 상태 확인 및 림프절 전이 여부 (양성 또는 음성)를 고려하여 추후 치료 방법에 대한 근거를 확립하고 있다. 비록 이러한 임상적 정보들이 치료를 결 정짓는 지표로 널리 사용되고 있지만 임상적 지표의 표현형보다 암의 이질성이 더 커 모든 암의 예후를 판단할 수 없을뿐더러， 그 효용성에서도 한계를 드러내고 있 다. 호르몬 수용체 양성인 유방암의 경우 호르몬 치료제인 타목시펜 (Tamoxi fen) 이 효과적인 표적 치료제로 사용되고 있고, Her-2 과발현 유방암의 경우 항체치료 제인 허셉틴 (Hercept in)이 효과적인 표적 치료제로 사용되고 있다. 반면 삼중음성 유방암의 경우 표적 치료제가 아직 없으며 기존의 항암화학요법을 주로 시행하고 있으나 재발이 흔하고 재발시는 약물에 반응을 잘 하지 않아 예후가 나쁜 편이다. 한편， 약물을 특정 조직으로 선택적으로 전달하는 약물전달체계 또는 표적 치료는 많은 관심을 받아온 기술이다. 왜냐하면 동일 양의 치료제를 사용하더라도 약의 효력을 증가시킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 부작용을 크게 줄일 수 —있—커-때문어—다. 또—한—유전자 -치료에 _적용할 경운 바이—러스를 -특정 -조최쒜ᅳ선택적_으 로 전달시킴으로써 치료 효율을 을리고 심각한 부작용을 줄일 수 있다. 이를 위해 지금까지는 주로 특정 조직에 특이한 항원 및 이를 표적하는 항체를 개발하여 왔 다. 그러나 항체의 경우 면역반응의 우려 및 조직 내 침투의 낮은 효율성 등의 문 제가 존재한다. 반면 펩타이드의 경우는 분자량이 작아 면역반웅의 우려가 적고 조 직 내 침투가 용이한 것이 장점이다. 따라서 표적 펩타이드를 기존의 치료제와 연 결하게 되면 특정 조직에 선택적으로 약물을 전달하는 지능형 약물전달체로 활용될 수 있으므로， 유방암의 표적 펩타이드 개발이 요구되고 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에, 본 발명자들은 유방암의 치료 및 진단에 사용될 수 있는 유방암 표적 펩타이드를 개발하기 위하여 연구들 거듭하던 중， 파지 펩타이드 디스플레이 기술 을 이용하여 유방암 조직에 특이적인 펩타이드를 탐색하고， 상기 펩타이드가 유방 암의 진단 마커 및 지능형 약물 전달체로서 유용하게 사용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미 노산서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 템타이드를 암호화하는 염기서열을포함하는 폴 리뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이 다. 본 발명의 다른 목적은 상기 템타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으 로포함하는유방암 예방또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전달용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단 용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제 공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 포함하는 유방암 진단용 마커를 제 공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상 화용조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 유방암의 진단， 치료 또는 영상화용 제제를 제조하기 위한상기 펩타이드의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드와 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는유방암의 진단 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약물의 유효량을 이 를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 유방암의 치료 방법을 제공하 는 것이다.

【가술적 해결방법】

상기한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 템타이드를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백터를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 템타이드를 포함하 는 유방암에 특이적인 약물 전달용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성 분으로 포함하는 유방암 진단용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하 는 유방암 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 템타이드를 포함하 는 유방암 진단용 마커를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성 분으로포함하는 유방암 영상화용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 유방암의 진단， 치료 또는 영상화용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 펩타이드의 유효량을 이를 필 요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 유방암의 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약 물의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 유방암의 치 료 방법을 제공한다. 이하 본 ^' 발명에 대해 상세히 설명한다 . 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포 함하는 유방암 표적 펩타이드를 제공한다. 유방암은 하나의 질환으로 여겨져 왔지만， 최근 유방암에는 다양한 종류의 아형 (subtype)이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에서 상기 유방암은 암의 발병 과 밀접하게 관련이 되어 있는 단백질에 따라 크게 세 종류의 그룹으로 구분되어질 수 있다. 즉， HER-2(human epidemal growth factor receptor 2) 과발현 유방암， 에 스트로겐 수용체 양성인 루미날형 유방암 및 에스트로겐 수용체， 프로게스테론 수 용체 및 HER-2가 모두 발현되어 있지 않은 삼중음성 유방맘으로 구분될 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열올 갖는 펩타이드를 루미날형 유방암 세포인 MCF7, HER-2형 유방암 세포인 Skbr3 또는 삼중 음성 유방암 세포인 MDA-MB-231세포에 각각 처리한 결과， 모든 아형의 유방암 세포 에 결합하는 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서도， 상기 펩타이드는 삼중 음성 유 방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 것으로 확인되었다. 삼중음성 유방암은 전체 유방암의 15¾정도로서 그 빈도는 낮은 편이나 다른 유방과는 달리 표적 수용체가 발현되어 있지 않아 마땅한 타겟 치료제가 없으며， 항암화학요법 이후 잘 재발하여 예후가 나쁜 편이다. 따라서, HER-2형 유방암 및 루미날형 유방암보다 삼중 음성 유방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 본 발명 의 펩타이드들은 현재 효과적인 치료제가 부족하고 잘 재발하는 삼중음성 유방암에 대한 효율적인 치료제 개발에 유용하게 활용될 수 있다. 따라서， 본 발명에서 상기 유방암은 루미날형 , HER-2형 또는 삼중음성 유방 암일 수 있고, 가장 바람직하게는 삼중음성 유방암일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 (Creighton, Proteins ; Structures and Molecular Pr inciples , W. H. Freeman and Co . , NY, 1983)에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은. 아니지만 액체 또는 고체상 합성， 단편 웅축， F-M0C 또는 T-B0C 화학법이 포함된다 (Chemical Approaches to the Synthesi s of Pept ides and Proteins , Wi l l iams et al . , Eds . , CRC Press , Boca Raton Florida, 1997； A Pract ical Approach, Athert on & Sheppard, Eds . , IRL Press , Oxford, England, 1989) . 또한 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선， 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이 드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해， 예컨대， 자동 DNA 합성기 (Biosearch 또는 Appl ied Biosys terns 사에서 판매하는 것) 를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 작제된 DNA 서열은 이 . DNA 서열에 작동 가능하게 연결되어 (operat ively l inked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열 (expression control sequence) (예: 프로모터, 인핸서 등 )을 포함하는 백터에 삽입시키고， 이로부터 형성된 재조합 발현 백터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여， 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적 으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법 (예컨대， 크 로마토그래피)올 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩티드' 라 함은 본 발명에 따른 펩티드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적 으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 펩티드 합성을 위한 유전공학적 방 법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al . , Molecular Cloning; A laboratory Manual , Cold Spring Harbor laboratory, 1982； Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Press, N.Y. , Second (1998) and Third(2000) Edition; Gene Expression Technology , Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds. ) , Academic Press, San Diego, Calif, 1991； 및 Hitzeman et al . , J. Biol. Chem. , 255:12073—12080， 1990. 본 발명에서 상기 서열번흔 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드는 이 의 기능적 변이체를 포함하는 개념이다. "기능적 변이체" 란 유방암 세포에 결합 하는 본 발명의 펩타이드의 성질에는 영향을 미치지 아미노산 위치에서 일부 아미 노산의 치환이 발생된 모든 유사한 서열을 의미한다. 한편, 본 발명은 서열번호 1 내지 4로 아루어진 군에서 선택된 아미노산 서 열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현백터 ^' 및 상기 발현백터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기에서 기재한 바와 같이 수득할 수 있으며， 바 람직하게는 각각 서열번호 5 내지 서열번호 8의 염기서열을 가질 수 있다. 발현백 터는 숙주 세포 내에서 삽입된 핵산을 발현할 수 있는 당 분야에 공지된 플라스미 드， 바이러스 백터 또는 기타 매개체를 의미하는 것으로서, 당업계에 공지된 통상 의 발현백터에 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 것일 수 있다. 상기 발현백터는 일반적으로 숙주세포에서 증식할 수 있는 복제원점, 발현을 조절하는 하나 이상의 발현 조절 서열 (예. 프로모터， 인핸서 등 )， 선별 마커 (selective marker) 및 발현 조절 서열과 작동가능하게 연결된 본 발 명의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 형질전환체는 상 기 발현백터에 의해 형질전환된 것일 수 있다. 바람직하게는 형질전환체는 본 발명 의 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 백터를 당업계에 공 지된 방법， 예를 들어 이에 한정되지는 않으나， 일시적 형질감염 (transient transfection), 미세주사， 형질도입 (transduct ion)， 세포융합， 칼슘 포스페이트 침 전법， 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란- 매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfect ion) , 폴리브렌-매개된 형질감 염 (polybrene一 medi ated transfect ion) , 전기침공법 (electropora t ion) , 유전자 종 (gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 숙주세 포에 도입하여 수득할 수 있다 (Wu et al . , J . Bio . Chem. , 267 : 963-967， 1992 ; Wu and Wu, J . Bio . Chem. , 263 : 14621-14624 , 1988) . 본 발명은 또한 본 발명의 템타이드 및 이와 결합하는 약물을 유효성분으로 포함하는 유방암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 본 발명의 펩타이 드 단독 또는 템타이드 및 이와 결합하는 유방암 치료물질을 포함할 수 있다. 상기 에서 "약학적으로 유효한 양" 이란 음성 대조군에 비해 그 이상의 반웅을 나타내 는 양을 말하며 바람직하게 _는_ -유방—암을 방 _또_는— 료하 Z 충분한 양을 말한.다. 본 발명의 펩타이드에 연결될 수 있는 약제는 종래 유방암의 치료에 사용되 는 것이라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면， 이에 한정되지는 않으나， 유방 암을 예방하는 약물로 허가 받은 라록시펜 하이드로클로라이드 (Raloxi fene hydrochlor ide) , 타목시펜 시트레이트 (Tamoxi fen ci trate) 등 이거나， 또는 유방암 을 치료하는 약물로 허가 받은 메쏘트렉세이트 (Methotrexate) , 파클리탁셀 (Pacl i taxel ) , 트라스투주맙 (Trastuzumab)， 에버로리무스 (Everol imus) 등일 수 있 다. 본 발명의 펩타이드와 유방암 치료물질의 결합은 당업계에 공지된 방법， 예 컨대， 공유 결합, 가교 등을 통해 수행될 수 있으며， 본 발명의 펩타이드와 유방암 치료물질이 직접적으로 결합되거나 또는 매개체를 통하여 간접적으로 결합될 수도 있다. 아울러， 상기 결합은 생체 외에서 수행될 수도 있으나， 본 발명의 펩타이드 및 유방암 치료물질은 개별적으로 투여되어 생체 내에서 결합될 수도 있다. 이를 위해 본 발명의 펩타이드 또는 유방암 치료물질은 필요하다면 그 활성이 소실되지 않는 범위에서 화학적으로 수식 (modi f i cat ion)될 수 있다. 본 발명의 펩타이드가 유방암 세포에 결합되어 유방암 치료물질이 적절하게 투여되었는지 여부를 용이하게 확인하기 위하여， 본 발명의 펩타이드는 발색효소， 방사성 동위원소 등으로 표지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함되는 본 발명의 펩타이드 및 이와 결합되는 유방암 치료물질의 양은 결합되는 약제의 종류 및 양에 따라 달라질 수 있으며， 바람직하 게는 유방암 세포에 충분히 전달되어, 유효한 효과를 보이는 양일 수 있다. 그러 나， 약물은 그 투여 경로 및 치료 횟수뿐 만 아니라 환자의 연령， 체중, 건강 상 태， 성별， 질환의 중증도， 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대 한 유효 투여량이 결정되는 것이므로， 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 펩타이드를 약제와 결합시켜 유방암을 치료하기 위한 용 도에 따른 본 발명의 펩타이드의 적절한 유효량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 템타이드를 포함하는 약학적 조성물은 본 발명에 의한 효과 를.ᅵ보으 1는ᅳᅳ한ᅳ^ᅵ형 투여 경로ᅳ및„—투싀ᅳ방ᅳ법이ᅵ 별히 제한되지_아ᅳ니ᅳ한다—.—폐컨 대， 본 발명의 펩타이드는 경구 투여 또는 비경구 투여될 수 있다. 경구 투여 시에 는 위장관 내 소화효소에 의한 분해를 방지하기 위하여 본 발명의 펩타이드를 L형 아미노산으로 구성하여 사용하는 것이 바람직하다. 상기 비경구 투여로는 피하 주 사, 근육내 주사, 정맥 주사 등이 있는데， 바람직하게는 정맥 주사일 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물을 경구 투여하는 경우 본 발명의 약학적 조성물은 적합한 경구 투여용 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말， 과립, 정계， 환제, 당의정제， 캡슐제， 액제， 겔제, 시럽계, 현탁액， 웨이퍼 등의 형태로 제형화 될 수 있다. 적합한 담체의 예로는 락토즈， 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비롤， 만니 를， 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포함하^ 당류와 옥수수 전분， 밀 전분， 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류， 셀를로즈， 메틸 셀를로즈， 나트륨 카 르복시메틸샐를로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀를로즈 등을 포함하는 셀를로즈 류， 젤라틴， 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 층전제가 포함될 수 있다. 또한， 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈， 한천， 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해 제로 첨가할 수 있다. 나아가， 상기 약학적 조성물은 항웅집제， 윤활제, 습윤제， 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다 또한, 본 발명의 약학적 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우 본 발명의 약 학적 조성물은 적합한 비경구용 담체와 함께 예를 들면， 주사제의 형태로 당 업계 에 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되 어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사 제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나， 물, 에탄을， 폴리을 (예 를 들어, 글리세를， 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)， 이들의 흔합 물 및 /또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는， 적합한 담체로는 행크스 용액， 링거 용액， 트리에탄을 아민이 함유된

PBS( phosphate buf fered sal ine) 또는 주사용 멸균수， 10% 에탄을， 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤， 클로로부탄올， 페놀， 소르빈산 ^' ， 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한， 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가 로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington ' sPharmaceut ical Sci ences , 19th ed. , Mack Publ i shing Company, East on, PA, 1995) . 이외에도 본 발명의 조성물에는 일반적인 약학적 조성물에 통상적으로 첨가되는 약학적으로 허용되는 담체가 추가로 포함될 수 있다. 상기 "약학적으로 허용되는' '이란 생리학적으로 허용되고 사람이나 동물에 투여될 때, 통상적으로 위장 장애， 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유 사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경 우에는, 예컨대 완층제 (예를 들어, 식염수 또는 PBS) , 카보하이트레이트 (예를 들 어, 글루코스， 만노즈， 슈크로즈 또는 텍스트란)， 항산화제， 정균제， 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA 또는 글루타치온)， 아쥬반트 (예를 들어， 알루미늄 하이드톡사이 드)， 현탁제， 농후제， 보존제, 무통화제， 가용화제， 등장제 및 /또는 안정화제를 사 용할 수 있다. 이와 같이 본 발명의 펩타이드를 포함하는 조성물와 제형은 상술한 바와 같아 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어， 주사제의 경우에는 단위 투약 앰 플 또는 다수회 투약 포함제 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 포함하 는 약물 전달용 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 약물 투여 방법으로 투여될 수 있다. 또한， 본 발명의 약학적 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속， 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형 화될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 포함하는 유방암에 특이적인 약물 전 달용 조성물을 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 유방암 치료제와 같은 약물을 유방암 조직에 선택적으 로 전달하는 지능형 약물 전달체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 펩타이드를 종래 유방암 치료제와 연결하여 유방암 치료에 이용한다면 본 발명의 펩타이드에 의해 유방암 치료제가 유방암 세포에만 선택적으로 전달되기 때문에 약의 효력을 증가시 킬 수 있고 동시에 정상조직에 미치는 약물의 부작용을 현저히 줄일 수 있다. 상기 약물은 이에 한정되지는 않으나， 파클리탁샐， 독소루비신, 빈크리스틴， 다우노루비신 (daunorubicin), 빈블라스틴 (vinblastine)， 액티노마이신-

D(actinomycin-D), 도세탁셀 (docetaxel )， 에토포사이드 (etoposide)， 테니포사이드 (teniposide) , 비산트렌 (bisantrene)， Jl≤-¾11¾£ ^'l d(homoharringtonine) , 글리백 (Gleevec; STI-571), 시스플라틴 (cisplain)， 5-플로오우라실 (5-fluouraci 1)， 아드 리아마이신 (adriamycin), 메토트렉세이트 (methotrexate)， 부설판 (busul fan)， 클로 람부실 (chlorambucil), 시클로포스파미드 (cyclophosphamide)， 멜팔란 (melphalan)， 니트로겐 무스타드 (nitrogen mustard), 니트로소우레아 (nitrosourea)， 스트렙토키 나제 (streptokinase), 유로키나제 (urokinase)， 알테플라제 (alteplase)， 안지오텐신 (angiotensin) II 억제제, 알도스테론 (aldosterone) 수용체 억제제， 에리트로포이 에틴 (erythropoietin), NMDA (N-methyl-d-aspartate) 수용체 억제제， 로바스타틴 (Lovastatin), 라파마이신 (Rapamycin)， 셀레브렉스 (Celebrex)， 티클로핀 (Ticlopin) 마리마스타트 (Marimastat)및 트로케이드 (Trocade) 등일 수 있다. 본 발명의 펩타이드와 상기 약물은 공유결합으로 연결될 수 있고， 특히， 링 커 (Linker)에 의해 연결될 수 있으나， 이에 제한을 두지 않는다. 또한， 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 진단 용 조성물을 제공한다. 이 때， 본 발명에서 "진단 "이란 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것 을 의미한다. 본 발명의 목적상， 진단은 유방암의 존재 또는 특징을 확인하는 것이 다. 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 펩타이드는 서열번호 1 내지 4로 이루어 진 군에서 선택된 아미노산 서열을 가질 수 있으며， 상기 기재한 바와 같이 화학적 또는 유전공학적 방법에 의해 수득된 것일 수 있다. 본 발명의 펩타이드는 유방암 세포에 대해서 유용하게 표적되므로 유방암 진단을 위하여 유용하게 사용될 수 있 다. 상기 진단용 조성물에는 본 발명의 펩타이드 이외에도 펩타이드 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완층액 또는 반웅액이 추가로 포함될 수 있으 며, 또한， 안정성을 유지하기 위해， 분말 상태 또는 적절한 완층액에 용해된 상태 또는 4 ^° C가 유지된 상태로 제공될 수 있다. 본 발명의 펩타이드가 유방암 조직에 결합하였는지 여부를 용이하게 확인， 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명의 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉， 검출가능한 표지에 링크 (예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출 가능한 표지는 발색효소 (예: 퍼옥시다제 (peroxidase) , 알칼라인 포스파타제

12 125 111 99m 32 35

(alkal ine phosphatase) ) , 방사성 동위원소 (예: I I In, Tc , P, S) , 크로모포어 (chromophore) , 바이오틴 (biot in)， 발광물질 또는 형광물질 (예 : FITC, RITC, 로다민 (rhodamine) , 텍사스레드 (Texas Red) , 플로레신 (f luorescein)， 피코에 리트린 (phycoerythrin) , 퀀텀닷 (quantum dots)) , 자기공명영상조영계 (예: 수퍼파라 마그네틱 산화철 (superparamagnet ic iron oxides , SPIO) , 을트라수퍼파라마그네틱 산화철 (ultrasuperparamagnet ic iron oxides , USPI0)) 등 일 수 있다. 유사하게， 상기 검출 가능한 표지는 항체 에피토프 (epi tope) , 기질 (substrate)， 보조인자 (cofactor) , 저해제 또는 친화 리간드일 수 있다. 이러한 표지는 본 발명의 펩타이 드를 합성하는 과정 중에 수행할 수도 있고， 이미 합성된 펩타이드에 추가로 수행 될 수도 있다. 만약 검출가능한 표지로 형광물질을 이용하는 경우에는 형광단층촬 영 (Fluorescence mediated tomography:FMT)으로 유방암을 진단할 수 있다. 예컨대， 형광물질로 표지된 본 발명의 펩타이드를 혈액 내로 순환시키고 형광단층촬영으로 펩타이드에 의한 형광을 관찰할 수 있다. 형광이 관찰된다면， 유방암으로 진단된 다. 또한 검출가능한 표지로 방사선 물질올 이용하는 경우에는 양전자단층촬영 (Posi tron emission tomography: PET)으로 펩타이드에 의한 방사능을 관찰하여 유방 암을 진단할 수 있다. 이 경우에는 보다 민감하게 유방암의 진단 및 분자영상이 가 능할 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 템타이드를 포함하는 유방암 진단용 키트를 제공 한다. 본 발명의 키트에는 상기한 바와 같은 발색효소 또는 방사선 동위원소 등으 로 표지된 펩타이드가 포함될 수 있다. 본 발명의 키트에는 본 발명의 펩타이드 이외에 상기 펩타이드와 유방암 세 포의 결합 반웅을 위한 적당한 완층용액 또는 배지 및 대조군 세포 (정상 뇌세포)를 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드가 표지되지 않은 채로 제공되는 경우에는， 펩타이드의 표지를 위한 검출가능한 표지가 추가로 키트에 포함될 수 있 다. 양—자택일적으로 _ΤΓ 본 발명의—펩타아 에ᅳ대한 -항체 _Γ ᅳ형광물질로ᅳ표지된— 2차ᅵ항 체， 발색 기질 등이 상기 키트에 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명의 펩티드에 대 한 항체는 상기 기재한 바와 같이 당업계에 공지된 통상적인 항체의 제조방법에 따 라 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 펩타이드는 플레이트의 표면에 코팅된 형태로 제공될 수도 있다. 이 경우에는 상기 플레이트에 직접 유방암 세포를 접종하여 적당한 조건쎄서 반응시킨 후, 플레이트의 표면상에서의 유방암 세포와 펩타이드의 결합을 관찰하여 유방암을 진단할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 유방암 영상화 용 조성물을 제공한다. 본 발명의 유방암 영상화용 조성물은 본 발명의 펩타이드를 함유하여 유방암 을 영상화하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 템타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 유방암 영상화용 조성물 은 반음영부를 영상화하거나 검출 및 정량하는데 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 종래 음영부의 영상화 기술을 이용하여 반음영부와 음영부의 상대적 크기 및 정도 를 측정함으로써 약물 치료를 통한 예후를 예측하는데도 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 상기 펩타이드는， 이에 한정되지는 않으나, 발색효소， 방사성동 위원소， 크로모포어 (chromophore) , 발광물질， 형광물질 ( f luorescer)， 상자성입자 (superparamagnet i c part i cles) 또는 초상자성입자 (ul trasuper paramagnet i c part ic les)로 표지된 것일 수 있다. 본 발명의 다른 일실시예에서는 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 루미날형 유방암 세포인 MCF7 , 삼중음성 유방암 세포인 MDA-MB- 231세포， 폐암 세포인 A549 세포, 정상 폐 세포인 BEAS-2B 세포， 정상 콩팔 세포임 HEK-293 세포에 각각 처리한 결과， 상기 펩타이드는 삼증음성유방암세포에 결합능 이 상대적으로 더 높은 것으로 보아， 삼중 음성 유방암 세포에 더 높은 특이성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명의 또 다른 일실시예에서는 MDA-MB-231 세포를 마우스의 피부 아래 이식한 뒤 상기 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드를 정맥 주사 로 투여한 뒤， 각 종양을 적출하여 형광 세기를 측정한 결과， 서열번호 1 및 서열 번호 4의 펩타이드를 처리한 종양 조직이 대조군에 비해 높은 형광 세기를 나타냈 으며, 서열번호 1의 펩타이드를 처리한 종양 조직이 다른 펩타이드를 처리한 종양 조직에 비하여 더 높은 형광 세기를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 본 발명은 유방암의 진단， 치료 또는 영상화용 제제를 제조하기 위한 상기 펩타이드의 용도를 제공한다. 본 발명은 상기 펩타이드의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것 을 특징으로 하는 유방암의 진단 방법을 제공한다. 본 발명은 상기 펩타이드 및 이와 결합하는 약물의 유효량을 이를 필요로 하 는 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 유방암의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 유방암의 개선， 치 료， 예방， 검출 또는 진단 효과를 나타내는 양을 말하며， 상기 '개체' 란 동물， 바 람직하게는 포유동물， 특히 인간올 포함하는 동물일 수 있으쪄， 동물에서 유래한 세포， 조직， 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 상기 효과가 필요한 환자 (pat ient ) 일 수 있다.

본 발명의 상기 '치료' 는 유방암 또는 유방암 관련 질환 또는 유방암 관련 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하 거나， 실질적으로 예방하거나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며, 유 방암 또는 유방암 관련 질환으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.

【유리한 효과】

본 발명의 펩타이드는 유방암에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에, 유방암 의 진단， 치료 또는 영상화용 조성물의 제조에 유용하게 활용될 수 있다/

【도면의 간단한 설명】

도 1은 파지 라이브러리 스크리닝을 위해 본 발명에서 사용된 두 가지 전략 인 negat ive subtract ion(A) 및 posit ive select ion(B) 스크리닝 과정을 나타낸다. 도 2는 MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 세포를 대상으로 negat ive subtract ion 스 크리닝한 결과， 각 라운드 (Rl ~ R5)에서 회수된 파지 역가를 나타낸다. 도 3은 MDA-MB-231 세포를 대상으로 posi t ive select ion 스크리닝한 결과， 각 라운드 (Rl~ R5)에서 회수된 파지 역가를 나타낸다. 도 4는 negat ive subtract ion 스크리닝 (A) 및 posi t ive select ion 스크리닝 (B)을 통해 선별한 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자 서열을 읽은 다음， 이^ 아미노산 서열로 전환 및 유사 아미노산 서열끼리 배열한 결과의 일부를 나타 낸다. 도 5A는 negat ive subtract ion 스크리닝 전략으로부터 선별된 6개의 파지 클 론의 MDA-MB-231 세포에 대한 결합능을 플라크 에세이를 통해 조사한 결과를 나타 낸다.

도 5B는 상기 도 5A의 6개의 파지 클론 중 5-14 CVLKKPR)의 SKBR3 유방암 세 포주 또는 MDA-MB-231 유방암 세포주에서의 결합능을 플라크 에세이를 통해 평가한 결과를 나타낸다. 도 6은 positive selection 스크리닝 전략으로부터 선별된 7개의 파지 클론 의 MDA-MB231, SKBR3, 및 MCF7 세포에 대한 각각의 특이적 결합능을 플라크 에세이 를 통해 조사한 결과를 나타낸다. 도 7은 negative subtraction 스크리닝 및 positive selection 스크리닝 전 략을 통해 선별해 낸 네 가지 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 MDA-MB231, MCF7, 및 SKBR3 세포에 대한 결합능을 형광현미경을 통해 조사한 결과 를 나타낸다. 도 8은 네 가지 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 MDA- MB231, MCF7, 및 SKBR3 세포에 대한 결합능을 유세포분석기 (FACS)를 이용해 조사한 결과를 나타낸다. 도 9는 네 가지 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 유방암 세포가 아닌 다른 종류의 암세포와 정상 폐， 콩팔 세포 (MDA-MB-231, MCF7, A549, BEAS-2B 및 HEK-293 세포)에 대한 결합능을 .유세포분석기 (FACS)를 이용해 조사한 결과를 나타낸다. 도 10은 MDA-MB-231 세포를 투여하여 만든 유방암 마우스 모델에 형광표지된 후보 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)를 처리하고 종양을 적출한 후， 생체 광학영상시스템 (IVIS)을 이용해 형광 세기를 측정한 결과를 나타낸다. 도 11은 ^' MDA-MB-231 세포를 투여하여 만든 유방암 마우스 모델에 형광표지된 후보 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)를 처리한 다음， 적출해낸 종양과 간 을 얇게 단면화한 후， 형광현미경을 이용해 그 결합능을 검증한 결과를 나타낸다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. <실시예 1〉

삼중음성유방암세포를 특이적으로 표적하는 펩타이드의 발굴

<1-1> Negat ive subtract ion통한 파지 라이브러리의 스크리닝

파지 스크리닝은 T7 파지 소수성 아미노산 (hydrophobic amino acid) 라이브 러리 (1 X 10 ⁷ pfu/ul )를 이용하여 수행하였다. 본 라이브러리는 양말단에 시스테인 과 중간에 7 개의 무작위 아미노산으로 구성된 CXXXXXXXC (X = random sequence)의 아미노산 서열을 가지면서， 7 개의 무작위 아미노산 중 최소 한 개 이상에서 소수 성 아미노산을 갖는 것을 특징으로 하고 있다. 유방암세포주로는 MCF7(에스트로젠 수용체 /프로제스테론 수용체 양성， luminal type) , SKBR3(Her2 수용체 양성, Her2 type) , 및 MDA-MB23K에스트론젠 수용체 /프로제스테론 수용체 /Her2 수용체 삼중음 성, basal type)—를 이용하였다. Ngg t† e subTract ion 스크라닝의 ^" 과정—은 도 1에서 간단하게 도시하였다. 즉， 삼중음성유방암세포가 아닌 MCF7 및 SKBR3 세포에 결합 하는 파지를 제거하는 negat ive subtract ion을 하고， 삼중음성유방암세포인 MDA- MB231 세포에 결합하는 파지를 회수하는 posi t ive select ion으로 진행하였다. 먼저

10 ⁹ pfu의 T7 파지를 80만개의 MCF7 세포가 부착 되어 있는 35 mm culture di sh에 넣고 4 ^° C에서 30분간 결합시켰다. 이후 MCF7 세포에 결합하지 않은 파지가 있는 상 층액을 회수하여 SKBR3 세포가 부착되어 있는 35 mm culture dish에 옮겨 4 ^° C에서— 30분간 결합시켰다. SKBR3 세포에 결합하지 않는 파지가 있는 상층액을 회수하여 MDA-MB231 세포가 부착,되어 있는 di sh에 상기 회수한 파지를 넣고 4 ^° C에서 한 시간 동안 결합시켰다. 이후 상층액올 제거하여 MDA-MB231 세포에 결합하지 않은 파지를 제거한 후， 세포층에 0.D 1.0 까지 배양한 BL21 호스트 대장균을 300ul 넣고 5분간 반응시켜 MDA-MB231 세포에 결합된 파지를 용출 (elut ion)시키고 회수하였다. 회수 된 파지 용출액 300ul 중 lOul을 이용해 플라크 어세이 (plaque assay)를 수행하여 그 수 (t i ter)를 계산하였다. 나머지 용출액은 호스트 대장균을 이용해 파지 증폭을 수행함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 5 라 운드까지 반복하여 수행하였다. 그 결과， 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하여 도 2에 나타내었다. 라 운드가 진행함에 따라， 용출해 낸 파지의 수가가 점진적으로 증가함을 볼 수 있었 다. 1 라운드를 수행했을 때， 용출된 파지의 수는 약 2.2 X 10개였고, 최종적으로

5라운드를 진행한 이후 2.3 X 10 ⁸ 개의 파지가 용출되었음을 알 수 있었다. 즉， 1라 운드에서 5라운드 까지 진행한 결과， 약 10.4배의 파지 수의 증가를 볼 수 있었다. 아미노산 서열분석을 위해, 3， 4, 5 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부터， 각각 10, 20， 40개의 클론들을 각각 취합하여 lOul Tris-buffered saline 완층액에 보관하였으며， PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하 는 유전자의 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하였다.

<1-2> Positive selection을 통한 파지 라이브러리의 스크리닝

35醒 culture plate에 준비된 MDA-MB231 세포에 10 ⁹ 개의 T7 파지를 주입하 여 4°C 조건 하에서 한 시간 동안 세포와 결합시킨 후， 상충액을 제거한 다음， LB 배지에서 0.D 1.0 까지 배양한 BL21 호스트 대장균을 300ul 넣고 5분간 반응시킨 후 MDA-MB-231 세포와 결합한 파지를 용출해 내었다. 회수된 파지 용출액 300ul 중 lOul을 이용해 플라크 어세이 (plaque assay)를 수행하여 그 수 (titer)를 계산하였 다. 나머지 용출액은 호스트 대장균을 이용해 파지 증폭을 수행함으로써 그 다음 라운드에 사용할 파지를 확보하였다. 이와 같은 과정을 5 라운드까지 반복하여 수 행하였다. 그 결과， 각 라운드 별 회수된 파지의 수를 계산하여 도 3에 나타내었다. 각 라운드를 진행함에 따라 용출된 파지의 숫자가 증가하였으며 1라운드의 역가에 비 해 5라운드에서 약 360배의 용출 파지 수의 증가를 관찰할 수 있었다. 아미노산 서 열분석을 위해， 3， 4, 5 라운드의 역가 측정에 쓰인 플라크 어세이의 결과물로부 터， 각각 20， 30， 50개의 클론들을 각각 취합하여 lOul Tris-buffered saline 완층 액에 보관하였으며， PCR을 통해 이들 파지에 삽입된 펩타이드를 코딩하는 유전자의 염기서열 파악과 이에 따른 아미노산 서열분석을 수행하였다.

<1-3>파지 클론의 유전자 및 번역된 아미노산의 서열 분석

실시예 1-1， 1-2에서 각각 수집한 70， 100개의 파지 클론에 삽입된 펩타이드 코딩 유전자의 염기서열 파악을 마크로젠 (주) 사에 의뢰하여 수행였다. 분석된 염 기서열을 그에 상응하는 아미노산 서열로 변환하였으며， 유사한 서열 또는 모티프 를 분석하기 위하여 Clustal X프로그램을 이용하여 서열을 정렬하였다. 그 결과， 도 4에서 보듯이， 염기성 성질흘 가진 아미노산인 아르기닌 (R) 또 는 라이신 (K)이 공통적으로 많이 분포되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 펩타이드 의 아미노산 서열 상 6개 이상 잔기를 지니는 펩타이드를 다음 단계의 실험 후보로 선별하였다.

<1-4> 파지 클론의 삼중음성유방암세포에 대한 선택적 결합능 평가

삼중음성유방암세포에 대한 선별된 파지의 결합력을 세포에 결합된 파지의 수를 측정함으로써 평가하였다. 이를 위해 세포가 5만개 배양된 96-wel l di sh에 6 개의 후보 파지 각각을 10 ⁹ pfu만큼 넣고 각각 한 시간 동안 4 ^° C에서 결합시킨 다 음, 결합한 파지를 용출하여 그 수를 계산하였다. 그 결과, 도 5에서 보듯이, negat ive subtract ion 스크리닝으로부터 선별해 낸 6개 후보군 중 3-6 및 5-14 파지 클론이 MDA-MB231세포에 대한 높은 결합을 보 였다. 또한 MDA-MB-231 cel l에 가장 높은 결합력을 보인 5-14 파지 클론은 MDA-MB- 231 세포와 비교하여 Skbr3 세포에 현저히 낮은 결합을 보였다. 또한 도 6에서 보듯이， posit ive select ion 스크리닝으로부터 선별해 낸 7개 의 후보군의 MDA-MB— 231， Skbr3 , MCF7 세포에 대한 결합을 조사한 결과， 7개의 후 보 모두 Skbr3 및 MCF7 세포와 비교해 MDA-MB-231 세포에 더 높은 결합력을 보였 다. 특히 4R-28CCRPMRPR)의 경우 MDA-MB-231 세포에 7개 후보 중 가장 높은 결합을 보였 며， 4R-12 CSLKKPR)는 MCF7 및 Skbr3 세포 대비 MDA-MB-231 세포에 상대적으 로 가장 높은 결합력을 보였다 (MCF7 에 비해 약 11배 , Skbr3 에 비해 약 38배) . 이 를 바탕으로 하여 CRPMRPR 및 CSLKKPR 펩타이드를 추가 실험 후보로서 택하였다.

<실시예 2>

펩타이드의 삼중음성유방암세포에 대하 선택적 결합능 평가 <2-1> 펩타이드의 합성

(주) 펩트론 (Peptron Co, Daegeon, Korea. )에 의뢰하여 카복시말단에 형광물 질인 f luorescein isothiocyanate(FITC)가 접합된 펩타이드를 합성하였다. 각 펩타 이드들은 표준 Fmoc 방법에 의하여 합성되었고 질량분석기에 의하여 정제되었다. <2-2>면역형광현미경법을 이용한 펩타이드의 삼증음성유방암세포에 대한결 합능 평가

Negat ive subtract ion 스크리닝에서 선별한 CVRAKGKPC 및 CVLKKPR 펩타이드 와 posi t ive select ion 스크리닝에서 선별한 CSLKKPR 및 CRPMRPR 펩타이드의 삼중 음성유방암세포 특이적인 결합올 확인하기 위해 면역형광현미경법올 수행하였다. 이를 위해 삼중음성유방암세포인 MDA-MB-231 세포 및 비삼중음성유방암세포인 luminal A type와 MCF7 세포와 HER2 type의 Skbr3 세포를 4-wel l 배양용기에 5 X

10 ⁴ cel ls/wel l 배양하고 1 ) 소혈청알부민이 포함된 세포배양액을 전처리한 후， 10 μ Μ의 펩타이드를 4'C에서 한 시간 동안 결합시켰다. 이후 핵을 카운터염색한 후 형광현미경을 통한 촬영 및 Nuance program (Perkin elmer사)을 이용한 분석을 하 였다. 그 결과， 도 7에서 보듯이， CVRAKGKPC, CVLKKPR, 및 CRPMRPR 펩타이드는 MCF7 및 Skbr3 세포와 비교해 MDA-MB-231 세포에 더 강한 결합 및 FITC 형광 신호 를 ί였다. 특히， 이들 중 CRPMRPR 펩타이드는 MDA-MB-231 세포에 대해 가장 높은 특이성을 보였다. 반면， CSLKKPR 펩타이드는 MDA-MB-231 세포 뿐만아니라 MCF7 및 Skbr3 세포에도 비교적 잘 결합하여 삼중음성유방암세포에 대한 특이성은 적었다. 한편， 대조군 펩타이드 (NSSSVDK)는 상기 세포들에 대한 결합이 상대적으로 약하였 다.

<2-3>유세포분석기법을 이용한펩타이드의 삼중음성유방암세포에 대한 결합 능 평가

펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR)의 삼증음성유방암세포에 대한 선택적 결합력을 유세포분석기법을 이용하여 평가하였다. 이를 위해， 세포를 각각 1.5mL 튜브에 3 X 10 ⁵ eel ls/tube로 준비한 후， 1% 소혈청알부민이 포함된 세 포배양액으로 37 ^° C에서 30분간 전처리를 거친 다음， FITC 형광이 표지된 펩타이드 와 4 ^° C에서 한 시간 동안 반웅하였다. 반응이 끝난후 유세포분석기를 이용하여 세 포에 대한 펩타이드의 결합 분석하였다. 그 결과， 도 8에서 보듯이, 상기 4개의 펩타이드 모두 MCF7 및 Skbr3 세포와 비교해 MDA-MB231 세포에 더욱 잘 결합하고 이에 따라 MFI (Mean Fluorescence Intensity: 평균형광강도) 값이 더 높은 것을 알 수 있었다. 한편， 각 펩타이드의 선택성을 보다 더 다양한 세포에서 검증하기 위하여， 유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF7 세포， 폐암세포주인 A549 세포， 정상 폐. 세포주 인 BEAS-2B 세포 및 정상 콩팔 세포주인 HEK-293 세포를 이용하여 유세포분석기법 을 실시하였다. 세포를 각각 1.5mL 튜브에 3 X 10 ⁵ eel ls/tube로 준비한 후， 1% 소 혈청알부민이 포함된 세포배양액으로 37 ^° C에서 30분간 전처리를 실시하였다. 그 다 음， FITC 형광표지된 펩타이드를 4 ^° C에서 한 시간 동안 반응시킨 후, 유세포분석기 를 이용하여 펩타이드의 결합력을 분석하였다. 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이， CVRAKGKPC, CVLKKPR, CSLKKPR, CRPMRPR 펩타이드는.비삼중음성유방암세포인 MCF7 세포， 폐암세포인 A549 세포 및 정상세포 인 BEAS-2B 세포와 HKE-293 세포에 비하여 , 삼중음성유방암세포인 MDA— MB-231 세포 에서 펩타이드의 결합력 및 평균형광강도 (MFI)가 상대적으로 더 높은 것으로 나타 났다. 이를 통해， 이들 후보 펩타이드가 삼중음성유방암세포주에 특이적인 결합능 을 가지는 것을 확인할 수 있었다.

<2-4>마우스 종양모델을 이용한 펩타이드의 삼증음성유방암에 대한 생체내 표적능 평가

세 가지 펩타이드 (CVRAKGKPC, CVLKKPR, CRPMRPR)의 삼중음성유방암세포에 대 한 생체내 표적능을 종양 마우스 모델을 이용하여 검증하였다.

모든 동물 실험은 위원회 지침서 (institutional guidelines)에 따라， 그리고 경북대학교 IACUC의 가이드라인 (guideline of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Kyungpook National University)에 의해 승인받은 동물 실험 프로토콜 (permission No. KNU 2014-0001-121)에 따라 수행되었다. 8 주령 Balb/c 마우스를 Orient laboratoriesCSeongnam, Korea)로부터 구입하였고， 사료 및 물을 자유식이하며 SPF (specific—pathogen- free condition)에서 사육되었다.

MDA-MB-231 세포를 마우스의 피부 아래 이식하여 그 종양을 성장시켰다. 이 후 FITC 형광표지된 대조군 펩타이드 NSSSVDK와 상기 세 가지의 펩타이드를 종양 마우스에 각각 정맥 주사하였다. 이 후 두 시간이 지난 다음 각 종양을 적출해 내 어 이를 생체광학영상시스템 (IVIS)을 이용해 R0I (Region of Interest)의 형광 세기 를 측정하였다. R0I 값이 높을수록 종양조직에 형광이 강하며， 이는 종양조직에 형 광표지 펩타이드가 많이 표적 및 ^' 축적되었음을 나타낸다. 그 결과 도 10에 나타난 바와 같이 , CVRKGKPC 및 CRPMRPR 펩타이드晕 처리 한 종양세포는 음성대조군인 NSSSVDK 펩타이드를 처리한 종양세포에 비해 형광 값 의 수치가 더 높은 것으로 나타났다. 특히， CVRAKGKPC 펩타이드를 처리한 종양세포 에서 형광 값의 수치가 가장 높은 것으로 나타났다. 반면, CVLKKPR 펩타이드를 처 리한 종양세포는 대조군에 비해 형광 값이 낮은 것으로 나타났다.

이를 통해， CVRAKGKPC 펩타이드가 유방암 마우스 모델에서 다른 펩타이드에 비해 상대적으로 더 높은 생체내 표적능을 가지는 것을 확인할 수 있었고， CVLKKPR 펩타이드는 생체내 표적능이 대조군 대비 우수하지 않은 것을 확인할 수 있었다. 한편， 적출한 종양조직의 동결절편을 제작하고, 형광 현미경을 통해 관찰하 였다. 또한 펩타이드의 조직 특이성을 검증하기 위하여 간조직의 형광도 관측하였 다. 그 결과 도 11에 나타난 바와 같이， 음성 대조군인 NSSSVDK 펩타이드를 정 맥 주사한 마우스의 종양조직에서는 형광이 상당히 낮은 것으로 나타났으며， CVRAKGKPC 펩타이드를 정맥 주사한 쥐의 종양 조직에서 다른 펩타이드에 비해 형광 이 가장 높은 것으로 관측되었다. 이는 생체형광영상시스템 ( IVIS)을 이용한 실험의 결과와 유사한 것을 확인할 수 있었다. 또한 CVRAKGKPC 펩타이드는 종양에서 관찰 된 형광 신호와는 달리 간 조직에서는 형광신호가 낮은 것으로 나타났다.

【산업상 이용가능성】

본 발명의 펩타이드는 유방암에 특이적으로 결합할 수 있기 때문에， 유방암 의 진단, 치료 또는 영상화용 조성물의 제조에 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이 용가능성이 매우 우수하다.