CORONAVIRUS

Campo de la técnica La presente invención se relaciona con los campos de la virología y la industria farmacéutica. En particular, revela un péptido sintético con actividad antiviral frente a la infección por beta-coronavirus, así como la combinación sinérgica de dicho péptido con otros agentes anti vi rales.

Estado de la técnica anterior Los miembros de la familia Coronaviridae son responsables de un amplio espectro de enfermedades en animales y humanos. Hasta el año 2003 atraían poco interés, pero esto cambió dramáticamente con el zoonótico SARS-CoV (coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo) y la aparición una década más tarde del MERS-CoV (coronavirus causante del síndrome respiratorio de Oriente Medio) (Cui J y cois, 2019, Nature Reviews, volumen 17, doi.org/10.1038/s41579- 018-0118-9). Estos coronavirus han sido confirmados como causa importante de enfermedades respiratorias graves, y han provocado dos epidemias que acumularon cerca de 10 000 casos. Recientemente, se ha reportado un nuevo coronavirus, el SARS-CoV-2, causante del brote de la enfermedad de Coronavirus 2019 (COVID- 19), que más tarde se declaró como pandemia de COVID-19 por la Organización

Mundial de la Salud. Esta pandemia se está extendiendo rápidamente en todo el mundo, con cerca de 5 millones de casos confirmados, y más de 300 000 muertes, hasta el 21 de mayo de 2020.

Los coronavirus son miembros de la subfamilia Coronavirinae en la familia Coronaviridae y el orden Nidovirales (Comité Internacional de Taxonomía de virus). Esta subfamilia consta de cuatro géneros: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus y Deltacoronavirus (Cui J y cois, 2019, Nature Reviews, volumen 17, doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9). El SARS-CoV, MERS-CoV y SARS-CoV-2 pertenecen a los Betacoronavirus, que son causantes de epidemias e infecciones respiratorias graves. Los Betacoronavirus, a su vez, se dividen en cuatro linajes (A - D). El linaje B incluye SARS-CoV y el nuevo SARSCoV-2, mientras que el linaje C incluye el MERS-CoV (Letko M y cois, Nature Microbiology, volumen 5, 2020 pag 562-569. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0688-y). Desde el punto de vista terapéutico, no hay evidencia de ensayos clínicos cuyos resultados recomienden un tratamiento específico para pacientes con infección sospechada, o confirmada, de COVID-19. Lo más importante es asegurar un tratamiento de soporte precoz, administrar antimicrobianos para tratar los posibles agentes etiológicos del síndrome de distrés respiratorio agudo, no administrar corticoides de forma rutinaria, y adaptar el tratamiento a las condiciones de cada persona y sus comorbilidades.

Muchos medicamentos tienen actividad in vitro contra diferentes coronavirus. Sin embargo, hasta la fecha, no hay evidencia clínica que demuestre la seguridad y eficacia de algún fármaco contra cualquier coronavirus en humanos, incluido el SARS-CoV-2 (Kalil AC y cois, 2020, JAMA. Publicado en línea el 24 de marzo de 2020. Disponible en: https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2763802). Tampoco existe demostración clínica de un medicamento que muestre efecto antiviral en pacientes con infección persistente, de más de 14 días, con el SARS- CoV-2. Por tal motivo, el tratamiento de la infección por SARS-CoV-2 se mantiene como una necesidad médica no resuelta, y la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas antivirales para las infecciones por coronavirus, en particular por SARS-CoV-2, constituye una prioridad para la salud a nivel mundial. Explicación de la invención

La presente invención resuelve el problema antes planteado, al proveer un péptido para el tratamiento o la prevención de infecciones originadas por coronavirus. Dicho péptido posee una secuencia de aminoácidos identificada en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 1. En una materialización de la invención, el péptido es útil para el tratamiento o la prevención de infecciones originadas por betacoronavirus.

En una realización de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva del péptido, como antiviral frente a coronavirus, está en el rango de 2,8 a 168 pg de péptido/ml, equivalente a 1-60 pM. El péptido identificado en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 1 se ha reportado como un inhibidor de la fosforilación de la Proteína Quinasa CK2 (Perea SE y cois, 2004 Cáncer Research 64: 7127-7129), con la consiguiente inducción de muerte celular. Sorpresivamente, este mecanismo no es el responsable del efecto antiviral observado en la infección por coronavirus. Este efecto antiviral, que se demostró en la invención por primera vez, se consigue a dosis que son 50 veces menores que las dosis del péptido que inducen muerte celular. Esas concentraciones no son inhibitorias de la fosforilación por CK2. De esta forma, el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 se presenta como una nueva alternativa de tratamiento antiviral en la infección por coronavirus, en particular del tratamiento antiviral para enfrentar la Covid-19. En la presente invención se revela por primera vez, frente a coronavirus, el efecto antiviral de un péptido sintético previamente caracterizado por su efecto anticelular. Se conoce que la fosforilación mediada por CK2 es un evento bioquímico clave para garantizar la viabilidad celular (Ahmed K y cois, 2002, Trends Cell Biol 12: 226-230), y es bien conocido que su inhibición farmacológica conlleva directamente a la muerte celular (Perera y cois, 2009, Mol Cáncer Ther;8(5); (Siddiqui-Jain A, y cois, 2010, Cáncer Res; 70(24).

En la presente invención se entiende por efecto anticelular a la muerte celular inducida por el péptido descrito, vía inhibición de la fosforilación mediada por la CK2 celular. Por su parte, en la presente invención se refiere como efecto antiviral a la inhibición del efecto citopático producido por coronavirus, en células permisibles no malignas. El efecto antiviral también se constató como rendimiento viral medido por conteo de unidades formadoras de placas virales (UFP) en el cultivo celular.

Es conocido, además, que la CK2 fosforila sustratos con roles estructurales y funcionales para numerosos virus patogénicos a humanos (Keating, J. A y cois, 2012, Reviews in Medical Virology, 22(3), 166-181). En estudios anteriores, el péptido de SEQ ID NO: 1 mostró efecto anti-VIH in vitro, a una concentración de 100 mM, mediante interacción con el sustrato de CK2 conocido como nucleofosmina (Nouri, K, 2015, PloS one, 10(12)), cuya inhibición por el péptido es también conocida (Perera y cois, 2009, Mol Cáncer Ther;8(5)). Sorpresivamente, el efecto anticelular y antiviral del péptido descrito se separan claramente en función de la dosis empleada. El efecto antiviral del péptido de la presente invención se produce en concentraciones muy por debajo de las que producen efecto anticelular, vía inhibición de la CK2, en las células no malignas infectadas por coronavirus. Por ejemplo, en células MDBK, la concentración inhibitoria 50 (IC ₅₀ ) anticelular del péptido es 150 pM y la IC ₅₀ antiviral es 3 pM. Por tanto, el péptido inhibe la infección viral (al 50%) en una cantidad 50 veces menor que la requerida para producir la muerte celular (al 50%), vía inhibición de la fosforilación mediada por CK2. De hecho, el péptido en concentraciones comprendidas entre 1-60 pM no inhibió la fosforilación mediada por CK2 en un panel de líneas celulares no malignas. En consecuencia, no afectó la viabilidad celular de estas líneas celulares en más de un 3%. Por tanto, el efecto antiviral del péptido de la invención no se relaciona con el mecanismo previamente descrito para el mismo, de inducción de muerte celular asociada a la inhibición de la fosforilación por la CK2 en células no malignas. Por tal razón, se recomienda como rango de dosis efectiva para el efecto antiviral, frente a coronavirus, al comprendido entre 1 y 60 mM, que es equivalente a 2,8 - 168 pg/ml.

El péptido descrito, además, muestra efecto virucida directo, en un rango de concentraciones similar al utilizado para el ensayo de ECP en células. Se entiende por efecto virucida a la inhibición de la infección viral mediante la unión directa del péptido con el virus. Para medir el efecto virucida, el betacoronavirus bovino evaluado se incubó 1 hora con el péptido, a varias concentraciones, a 37°C, y posteriormente el virus fue purificado y titulado mediante la determinación de UFP. El efecto virucida del péptido es mucho mayor que el observado para la Ribavirina. La invención revela, además, una composición farmacéutica para el tratamiento o la prevención de infecciones originadas por coronavirus que se caracteriza porque comprende el péptido cuya secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 1 y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición es útil para el tratamiento o la prevención originada por betacoronavirus. Sin que se limite el alcance de la invención, en una materialización, en la composición el péptido se encuentra en un rango de 5-70 mg por vial, como polvo liofilizado. En una realización de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva como antiviral está en el rango de 2,8 a 168 pg de péptido/ml, equivalente a 1-60 pM. La composición que comprende el péptido puede ser administrada por ruta parenteral o por ruta mucosal.

En línea con los resultados in vitro, el péptido antiviral descrito en la invención produjo efecto antiviral en pacientes enfermos con Covid-19, enfermedad causada por el coronavirus SARS-CoV-2. En particular, tanto la administración intravenosa como la administración intranasal de composiciones que comprenden el péptido redujeron el tiempo de negativización del virus en casos positivos de SARS-CoV-2. Estudios previos de farmacocinética del péptido, administrado por ruta intravenosa, evidencian que la aplicación de una dosis de 1,6 mg/kg permite alcanzar niveles de concentración máxima del mismo en sangre de 14 pg/ml, que equivale a 5 pM (Batista-Albuerne N y cois, 2018, J Med Oncol. Vol.1 No.1:4). Por tanto, la administración intravenosa de esta dosis de péptido garantiza niveles de concentración en sangre cercanos al valor de la IC50 antiviral en la infección por coronavirus.

En otro aspecto la invención provee una combinación farmacéutica para el tratamiento de infecciones originadas por coronavirus que se caracteriza porque comprende: a) una composición que comprende el péptido cuya secuencia de aminoácidos se identifica como SEQ ID NO: 1 y b) un medicamento antiviral seleccionado del grupo compuesto por Ribavirina, Penciclovir, Nitazoxanida, Nafamostat, Remdesivir, Favipiravir, interferón (IFN) a, IFN y, o una combinación de ellos. En una realización preferida, la infección tratada con la combinación es originada por betacoronavirus. En una materialización, la composición que comprende el péptido y el medicamento antiviral que forman parte de la combinación se administran de manera simultánea, o secuencial, en el curso de un mismo tratamiento al paciente. La invención revela el uso del péptido que posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de infecciones originadas por coronavirus. En una realización particular, la dosis terapéuticamente efectiva del medicamento está en el rango de 2,8 a 168 pg de péptido/ml, equivalente a 1-60 pM. En una materialización, el medicamento se formula para ser administrado por ruta parenteral o mucosal.

Es también parte de la invención, el uso del péptido que posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1 para la potenciación del efecto antiviral de un medicamento para el tratamiento de infecciones originadas por coronavirus donde el medicamento se selecciona del grupo compuesto por Ribavirina, Penciclovir, Nitazoxanida, Nafamostat, Remdesivir, Favipiravir, interferón (IFN) a, IFN g, o una combinación de ellos. Para ello, la dosis terapéuticamente efectiva del péptido está en el rango de 2,8 a 168 pg de péptido/ml, equivalente a 1- 60 pM.

En otro aspecto, la invención provee un método de tratamiento o prevención de infecciones originadas por coronavirus que se caracteriza porque se administra al individuo que lo necesita una dosis terapéuticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende el péptido que posee una secuencia de aminoácidos identificada como SEQ ID NO: 1. En una realización particular el método se emplea para el tratamiento y prevención de una infección originada por betacoronavirus. En una materialización del método de la invención, la dosis terapéuticamente efectiva es de 1 a 10 mg de péptido/kg del individuo. Sin que se limite el alcance del método de la invención, la composición farmacéutica que comprende el péptido se administra por ruta parenteral o mucosal.

En una materialización del método de la invención, al individuo que lo necesita también se le administra un medicamento antiviral seleccionado del grupo compuesto por Ribavirina, Penciclovir, Nitazoxanida, Nafamostat, Remdesivir, Favipiravir, interferón (IFN) a, IFN y, o una combinación de ellos. En particular, el pretratamiento de las células infectadas con el péptido incrementa el efecto antiviral de los antivirales mencionadas, en al menos 2 veces. Por tal motivo, el péptido descrito en la presente invención puede resolver un problema adicional en la práctica médica en relación con las infecciones por coronavirus.

De igual forma, la administración intranasal del péptido previno del contagio con SARS-CoV-2a individuos que fueron contactos directos de casos infectados por este coronavirus. Además, en esta invención la administración nasal del péptido concomitante al tratamiento con una combinación de IFN a e IFN g redujo significativamente el tiempo de negativización del SARS-CoV-2. El 83% de los pacientes previamente positivos al SARS-CoV-2 fueron negativos al cabo de 24 horas de concluida la administración del péptido de conjunto con la combinación de interferones. En cambio, el tratamiento con la combinación de interferones produjo negativización a las 24 horas después del tratamiento en el 13% de los pacientes. Breve descripción de las figuras

Figura 1. Efecto antiviral y anticelular del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en células MDBK. El efecto antiviral se representa como porciento de inhibición del efecto citopático (ECP) del coronavirus bovino Mebus. El efecto anticelular se representa como porciento de viabilidad celular. Ejemplos de realización

Ejemplo 1. Demostración del efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1.

El péptido identificado en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 1 se obtuvo por síntesis química, mediante el método de síntesis en fase sólida, y con calidad para uso clínico en humanos. Con el objetivo de evaluar el efecto antiviral de dicho péptido, las células MDBK de riñón bovino fueron sembradas en placas de 24 pocilios, a una densidad celular de 280 000 células por pocilio, en medio de cultivo DMEM que contiene 10% de suero fetal bovino, las placas se incubaron a 37°C, y 5% de CO2. Al cabo de 24 horas, se retiró el medio de cultivo, y se procedió a la infección de las células con la cepa Mebus de coronavirus bovino, a una multiplicidad de infección (M.O.I.) de 0,04; durante una hora, en un volumen de 200 mI de medio DMEM libre de suero. Se mantuvieron las mismas condiciones de incubación. Seguidamente, se completó el volumen de cada pocilio hasta 1 mi, con medio de cultivo libre de suero. Al cabo de una hora post-infección, se añadió el péptido a cada pocilio en un rango de concentraciones desde 1 hasta 100 mM, para evaluar el efecto antiviral. Para evaluar el efecto anticelular, se añadió el péptido a cada pocilio desde 1 hasta 300 mM, debido a que se conoce que las células no malignas muestran mayor resistencia a la muerte celular inducida por el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. La incubación con el péptido se prolongó por

96 horas, y seguidamente se procedió al revelado del efecto antiviral y anticelular, mediante la tinción de células viables con violeta cristal (0,1%). Alternativamente, las células se tiñeron con la solución CC8K (Sigma). Finalmente, la absorbancia a 580 nm fue cuantificada en cada pocilio, en un lector de placas (Amersham). Para la obtención de los valores de concentración inhibitoria 50 (CI50) antiviral y anticelular se obtuvieron las correspondientes curvas dosis-respuesta (Figura 1), y se estimaron dichos valores mediante el Software CurveExpert. Los resultados del efecto antiviral se muestran en porciento de inhibición del ECP, y el efecto anticelular se expresa como porciento de viabilidad celular. Los resultados obtenidos demuestran que el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 ejerce efecto antiviral en la infección por coronavirus, en un rango de dosis donde no hay afectación de la viabilidad celular. También se evidencia que la Cl ₅₀ antiviral (3,2 mM) es 46 veces inferior a la Cl ₅₀ anticelular. En paralelo, para la determinación del efecto del péptido sobre el rendimiento viral, se colectó el sobrenadante del cultivo en cada pocilio, y se procedió a la determinación del número de UFP, mediante la incubación de diluciones seriadas de dichos sobrenadantes con las células MDBK y carboximetilcelulosa (3%), en medio DMEM 2X. Al cabo de las 96 horas de incubación a 37°C y con 5% de CO2, las UFP visibles fueron cuantificadas por conteo directo. Los resultados, que se aprecian en la Tabla 1, demuestran que el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 afectó el rendimiento viral en un rango de concentraciones de 1 - 60 mM, en el cual no se observó muerte celular.

Tabla 1. Efecto del péptido de secuencia identificada como SEQ ID NO: 1 sobre el rendimiento viral del coronavirus bovino Mebus en células MDBK.

Concentración de péptido (pM) Número de UFP 0 178 + 8

1 ,125 101 + 6

3,25 85 + 4

7,5 41 + 8

15 19 + 5

30 0

60 0

En resumen, los resultados demuestran que el péptido cuya secuencia se identifica como SEQ ID NO: 1 no solo inhibe el ECP del coronavirus bovino, medido por viabilidad celular, sino que además inhibe el rendimiento viral, según el ensayo de UFP (Tabla 1).

Ejemplo 2. Relación entre inhibición de la CK2, efecto anticelular y efecto antiviral en células no malignas infectadas por coronavirus.

Sobre la base de que la inhibición de la fosforilación de CK2 por el péptido es un evento molecular asociado con su efecto anticelular en células tumorales, y que se conoce que la CK2 fosforila proteínas virales, se investigó la relación existente entre la inhibición de CK2, el efecto anticelular y el efecto antiviral ejercido por el péptido identificado como SEQ ID NO: 1, en células de origen no maligno. Con este propósito, se investigaron los tres parámetros mencionados en seis líneas celulares de origen no maligno. Las líneas celulares empleadas fueron: células Vero, de riñón de mono, TC-HHA (cultivo primario de epitelio pulmonar humano), TC-NCC (cultivo primario de epitelio pulmonar humano), TC-IMN (cultivo primario de epitelio pulmonar humano), TC-AAN (cultivo primario de epitelio de prepucio humano), y TC-KLJ (cultivo primario de epitelio de prepucio humano). Tanto el proceso de infección viral, como la evaluación experimental del efecto antiviral y anticelular en las líneas celulares mencionadas, se realizaron según se detalla en el Ejemplo 1.

La actividad enzimática de CK2 se determinó en los extractos celulares, provenientes de las líneas celulares tratadas con diferentes concentraciones del péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Para la determinación de la actividad enzimática de CK2 se realizó una reacción de fosforilación in vitro para CK2, donde se utilizó un sustrato específico basado en un péptido de secuencia RRREEETEEE, que representa el dominio consenso optimizado para la fosforilación por CK2 (Promega). La mezcla de reacción se realizó en 50 mI de buffer Tris-HCL 25 mM pH 7,5; 1 mqί de ³² P- gATR; 100 mM ATP; 2 mg/ml del péptido sustrato; 0,2 M NaCI;

10 mM MgCI y 30 pg del extracto celular. La reacción se incubó a 37°C durante

10 minutos. Seguidamente, se aplicaron 5 mI de la reacción en papel de filtro Whatmann PE-81, y se realizaron cuatro lavados con 10mM de H3PO4 _. Finalmente, se leyó la radiactividad asociada al papel de filtro, y la cantidad de conteos de radioactividad por minuto (cpm) por muestra refleja directamente la actividad enzimática de CK2.

Los resultados de estas determinaciones se muestran en la Tabla 2. Como se puede observar, los valores de actividad enzimática de CK2 se inhiben apreciablemente a partir de 100 pM del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 (señalado en negritas), y dicha inhibición se incrementa con la concentración del mismo hasta 200 pM (ver columnas identificadas como CK2). En concordancia con esto, los valores de porciento de inhibición de la viabilidad (columna AC) se incrementaron a medida que se disminuyó la actividad enzimática de CK2 a 100 pM del péptido. En cambio, el efecto antiviral (columna AV) se observó en un rango de concentración hasta 60 pM del péptido, sin afectación de la actividad de CK2 ni de la viabilidad celular.

De conjunto, los resultados de este estudio demuestran que el efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1, frente a coronavirus, no guarda relación con la inhibición de la fosforilación. En particular, resulta de interés el rango de concentraciones entre 1 mM y 60 pM del péptido descrito, donde no existe inhibición alguna de la fosforilación por CK2 y se alcanza un plateau de efecto antiviral, sin afectación de la viabilidad celular.

Tabla 2. Actividad anticelular, actividad antiviral y efecto del peptido identificado como SEQ ID NO: 1 sobre la actividad enzimática de CK2.

Péptido Vero TC-HHA TC-NCC TC-IMN TC-AAN TC-KLJ

(mM) CK2 AC AV CK2 AC AV CK2 AC AV CK2 AC AV CK2 AC AV CK2 AC AV

(cpm) (%) (%) (cpm) (%) (%) (cpm) (%) (%) (cpm) (%) (%) (cpm) (%) % (cpm) (%) (%) 0 7351 0 0 8057 0 0 6114 0 0 5643 0 0 8590 0 0 10056 0 0

+ 54 +27 ±64 ±81 ±52 ±66

1,125 7890 0 24 8210 0 18 6005 0 34 5701 0 15 8450 0 31 9900 0 39

±72 ±31 ±90 ±100 ±98 ±221

3,25 8100 0 51 7950 0 44 6490 0 53 5532 0 40 8641 0 56 10115 0 51

±100 ±45 ±88 ±82 ±34 ±101

7,5 7770 0 68 8023 0 56 6221 0 69 5189 0 61 8585 0 70 10087 0 67

±31 ±30 ±121 ±99 ±80 ±103

15 7619 0 79 8104 0 72 6194 0 74 5600 0 79 8600 0 82 11001 0 78

±15 ±21 ±71 ±71 ±79 ±170

30 7812 0 90 7815 0 90 6090 0 80 5711 0 88 8576 0 88 10230 0 83

±41 ±74 ±51 ±70 ±91 ±131

60 7300 0 86 7949 0 87 6200 0 82 5489 0 92 8531 0 91 10400 0 78

±36 ±101 ±80 ±100 ±61 ±140

100 5900 15 NE 6421 25 NE 5115 10 NE 5680 21 NE 7212 5 NE 7991 31 NE

±44 ±70 ±56 ±60 ±40 ±104

150 3270 57 NE 3910 63 NE 2890 48 NE 2719 52 NE 4005 37 NE 5003 62 NE

+ 20 + 21 ± 71 ± 74 ± 52 ± 67

200 1005 81 NE 670 92 NE 1100 91 NE 800 83 NE 1768 62 NE 2317 90 NE

± 12 ± 17 ± 30 ± 26 ± 75 ± 76

AC: Actividad anticelular, expresada en % de inhibición de la viabilidad celular. AV: Actividad antiviral, expresada en % de inhibición del rendimiento viral, medido en UFP. NE: No evaluado, debido a la afectación de la viabilidad celular. La actividad enzimática de CK2 celular se expresa en valores de cpm (conteos de radioactividad por minuto).

N

5

Ejemplo 3. Demostración del efecto virucida del péptido identificado como SEQ ID NO: 1.

Para evaluar el efecto virucida de dicho péptido, la cepa Mebus de coronavirus bovino fue incubada con el péptido a diferentes concentraciones, durante 1 hora a 37°C, antes de la realización del ensayo de ECP, determinado mediante la generación de UFP en células MDBK. Seguidamente, el virus fue ultracentrifugado durante 1 hora, a 33000 rpm y 4°C de temperatura. El sedimento viral se disolvió en 500 pl de medio DMEM libre de suero. Posteriormente, el virus purificado fue inoculado en las células MDBK, sembradas en placas de 24 pocilios a una M.O.I de 0,04. El ensayo para evaluación de UFP se realizó como se describe en el Ejemplo 1.

Los resultados de esta experimentación demuestran que la incubación del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 directamente con el coronavirus evaluado produce una afectación de la capacidad infectiva de este, al reducir considerablemente el número de UFP (Tabla 3). Por tanto, se evidencia el carácter virucida de dicho péptido.

Tabla 3. Efecto virucida del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 sobre la cepa Mebus de coronavirus bovino.

Concentración de péptido (pM) Número de UFP

0 378 + 18

1 ,125 250 + 16 3,25 223 + 14 * 7,5 180 + 38 ** 15 105 + 14 ** 30 14 + 10** 60 8 + 4**

* (p < 0,05), **(p < 0,001)

Ejemplo 4. Demostración del efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en la infección por el coronavirus SARS-CoV-2 en pacientes con Covid-19. Combinación con otros agentes antivirales.

Se investigó el efecto del tratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1 de pacientes recientemente infectados con coronavirus SARS-CoV-2. El péptido se obtuvo con calidad para uso clínico en humanos, y se administró por vía intravenosa o intranasal. El punto final evaluado fue el tiempo para la negativización de la presencia de ácido ribonucleico (ARN) viral del SARS-CoV-2 en exudados nasofaríngeos de pacientes, realizados cada 48 horas, por 15 días, una vez concluido el tratamiento. La presencia de ARN viral del SARS-CoV-2 se determinó mediante un kit de PCR en tiempo real, comercialmente disponible (Roche).

Se tomó como referencia el comportamiento del ARN viral en un grupo de 30 pacientes que fueron tratados con el arsenal terapéutico frecuentemente usado en los protocolos de tratamiento de la Covid-19, basados en Kaletra ^® (Lopinavir/Ritonavir) e IFN a2b (Cohorte 1). A dicho tratamiento se le denominó en lo adelante “tratamiento estándar plus”. Se incluyeron, además, otras dos cohortes, con 30 pacientes cada uno, en similares condiciones de la enfermedad, los cuales se trataron con el “tratamiento estándar plus” más el péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Los pacientes de la Cohorte 2 recibieron el péptido a razón de 1,6 mg/kg (dosis que garantiza una concentración en sangre de 5 pM); por ruta intravenosa; durante 5 días seguidos. Los pacientes de la Cohorte 3 recibieron el péptido en gotas nasales, en una concentración de 14 pg/ml (5 pM), diariamente, durante 5 días. En el mismo estudio se incluyó un cuarto grupo de 30 pacientes, donde se evaluó la administración concomitante de: a) el péptido identificado como SEQ ID NO: 1, administrado por vía intranasal, formulado como gotas nasales, a una concentración de 14 pg/ml (5 pM), diariamente, durante 5 días; y b) una formulación combinada de IFN a2b (3,0 millones de unidades internacionales (MUI)) e IFN y (0,5 MUI), administrada 2 veces en una semana, por vía intramuscular (Cohorte 4). Estos pacientes también recibieron “tratamiento estándar plus”. La Cohorte 5 consistió de 30 pacientes, los que se trataron con el “tratamiento estándar plus” más la misma formulación combinada de IFN a2b e IFN g, dos veces en una semana, por vía intramuscular. Los pacientes de los cinco grupos tenían similares condiciones de la enfermedad.

De manera importante, los resultados indicaron un incremento del número de individuos negativos al SARS-CoV-2 después del tratamiento con el péptido administrado, tanto por vía nasal como intravenosa, de conjunto con el “tratamiento estándar plus” (Tabla 4). En las dos cohortes de pacientes tratados con el péptido, tanto en el tratamiento por vía intravenosa como intranasal, aumentó el número de pacientes negativos al SARS-CoV-2 desde las primeras 24 horas de haber concluido el tratamiento con el mismo. Por su parte, los resultados observados en la Cohorte 4, de pacientes que se trataron con “tratamiento estándar plus” y la combinación del péptido con la formulación de IFN a2b e IFN y, fueron igualmente sorprendentes. En esta cohorte se pudo constatar que el 83% de los pacientes fueron negativos a SARS-CoV-2 a las 24 horas de concluido el tratamiento.

Tabla 4. Efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 contra el coronavirus SARS-CoV-2 en pacientes con Covid-19. Se representa la proporción de pacientes negativos al SARS-CoV-2, por cada cohorte, en el día indicado.

Ejemplo 5. Efecto profiláctico del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 frente a la infección por SARS-CoV-2 en individuos sanos en contacto con pacientes enfermos de Covid-19.

Se investigó el efecto profiláctico del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en individuos sanos expuestos a la infección por SARS-CoV-2. Para ello, se estudió la frecuencia de aparición de casos positivos a este coronavirus, de manera comparativa. La presencia de ARN viral del SARS-CoV-2 se determinó mediante un kit de PCR en tiempo real, comercialmente disponible (Roche). El estudio incluyó 40 individuos tratados con el péptido de SEQ ID NO: 1, administrado por vía intranasal, y otros 40 individuos que no se trataron con ningún medicamento profiláctico. Ambos grupos tuvieron comparable nivel de exposición permanente a la infección por SARS-CoV-2, mediante contacto directo con casos positivos que padecían Covid-19. El tratamiento y parámetros estudiados se corresponden con la cohorte equivalente del Ejemplo 4.

Los resultados de esta investigación se muestran en la Tabla 5, y fueron sorprendentes, al observarse que solo 2 individuos (5%) del grupo tratado con el péptido se contagiaron con el SARS-CoV-2. Por el contrario, se constató que el 47,5% de los individuos del grupo no tratado se contagiaron con dicho coronavirus.

Tabla 5. Efecto profiláctico del péptido en individuos expuestos a la infección por SARS-CoV-2.

Grupo Proporción de casos contagiados por % de contagiados por SARS-

SARS-CoV-2 CoV-2

A 19/40 47,5%

B 2/40 5,0% Grupo A: No tratados. Grupo B: Tratados con el péptido de SEQ ID NO: 1 .

Ejemplo 6. Potenciación del efecto de compuestos antivirales por cotratamiento con el péptido identificado como SEQ ID NO: 1.

Se evaluó el sinergismo del efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 combinado con un grupo de compuestos antivirales registrados, o en fase de investigación preclínica. Para ello, se procedió con el sistema de infección por la cepa Mebus de coronavirus bovino en células MDBK, tal como se describe en el Ejemplo 1. El efecto antiviral se representó como inhibición del ECP. En este caso, el péptido identificado como SEQ ID NO: 1, en una concentración fija de 3 mM, se incubó con cada compuesto antiviral, en concentraciones desde 1 hasta 50 pM, y se evaluó la inhibición del ECP. Los compuestos antivirales evaluados fueron Ribavirina, Penciclovir, Nitazoxanida, Nafamostat, Remdesivir y Favipiravir. Finalmente, el valor de CI50 antiviral (estimado de las curvas dosis-respuesta) se comparó con el del mismo compuesto en ausencia del péptido. Como se puede observar en la Tabla 6, los valores de CI50 antiviral para cada compuesto se redujo a más del doble cuando se combinaron, de manera concomitante, con 3 pM del péptido identificado como SEQ ID NO: 1. Los resultados del ensayo demuestran una potenciación del efecto antiviral de los compuestos mencionados, por el cotratamiento con el péptido descrito. Tabla 6. Efecto antiviral del péptido identificado como SEQ ID NO: 1 en combinación con compuestos antivirales.

Cl ₅₀ del compuesto solo Cl ₅₀ del compuesto + péptido (mM) (pM)

Ribavirina 42 8

Penciclovir 31 2

Nitazoxanida 89 14

Nafamostat 110 23

Remdesivir 68 3

Favipiravir 104 50