L'invention concerne un peptide pour son utilisation dans le traitement d'une neuronopathie motrice.

L'amyotrophie spinale infantile (ou SMA, Spinal Muscular Atrophy) est une maladie neuromusculaire à transmission autosomique récessive. Elle est caractérisée par une dégénérescence des motoneurones alpha de la corne antérieure de la moelle épinière entraînant une atrophie musculaire et conduisant à la paralysie. Cette dégénérescence des neurones moteurs alpha compromet donc sensiblement le pronostic vital des patients. Chez le sujet sain, ces neurones transmettent les messages du cerveau aux muscles, entraînant la contraction de ces derniers. En l'absence d'une telle stimulation, les muscles s'atrophient. Par la suite, outre une faiblesse et une atrophie généralisées des muscles, et plus particulièrement de ceux du tronc, du haut des bras et des cuisses, ces troubles peuvent s'accompagner de graves problèmes respiratoires.

Il existe une forte corrélation entre l'âge d'apparition des symptômes et la sévérité de l'atteinte, de sorte que, plus la maladie commence précocement et moins le pronostic vital est favorable. C'est selon ce critère que cette maladie a été classée en 3 types cliniques comme suit:

le type I (maladie de Wernig-Hoffman), caractérisé par un début précoce, généralement avant 6 mois et dans lequel la station assise n'est jamais acquise et l'évolution gravissime. L'espérance de vie des enfants atteints dépasse rarement trois ans et se limite souvent à quelques mois,

le type II ou forme intermédiaire de la maladie de Wernig-Hoffman qui apparaît habituellement entre l'âge de six mois et de trois ans, dans lequel la station assise est acquise, mais la marche ne l'est jamais. Ce type clinique est souvent associé à de fréquentes infections respiratoires pouvant compliquer la cause de cette affection et diminuer l'espérance de vie.

le type III ou maladie de Kugelberg-Welander, qui apparaît généralement vers 3-4 ans et parfois jusqu'à 21 ans et dans lequel la marche est acquise avec des troubles de la démarche plus ou moins prononcés suivant la sévérité qui est très variable d'un patient à l'autre. Ce type de la maladie en général ne compromet pas l'espérance de vie.

Toutes les formes d'amyotrophie spinale s'accompagnent d'une faiblesse et d'une atrophie progressive des muscles, par suite de la dégénérescence des neurones de la corne antérieure de la moelle épinière. La SMA constitue actuellement l'une des causes de mortalité infantile la plus fréquente. Elle touche indifféremment filles ou garçons dans toutes les régions du monde avec une prévalence comprise entre 1/6000 et 1/10000.

Le gène impliqué dans les amyotrophies infantiles spinales a été localisé sur le chromosome 5 en position ql2-ql3, quel que soit le type clinique présenté. Ce gène code pour la protéine de survie des motoneurones (SMN). Cette protéine est localisée dans le cytoplasme et le noyau, où elle s'accumule dans des domaines ponctif ormes appelés Corps de Cajal ou Cajal bodies (CBs). Un défaut de cette accumulation est décrit dans la SMA.

Il est admis que la SMA est liée à une inactivation du gène SMN. Plus précisément, il a été mis en lumière deux gènes codant la protéine SMN : SMN1 et SMN2, les 2 gènes étant transcrits. L'analyse de leurs promoteurs a montré que ces éléments sont quasiment identiques tant au niveau de leur séquence qu'au niveau de leur activité. Aussi, le gène SMN2 code pour la même protéine SMN mais en moindre quantité. Il a d'ailleurs été constaté que l'inactivation du SMN1 peut être palliée en partie par l'expression du gène SMN2 quasi-identique.

Les patients atteints de SMA disposent actuellement de soins médicaux ou paramédicaux leur assurant la meilleure qualité de vie possible, tels que:

la kinésithérapie motrice et l'hydrothérapie qui consistent à aider le patient à constituer son schéma corporel;

- la kinésithérapie respiratoire qui permet de soulager les patients de l'encombrement des bronches, diminuant ainsi le risque d'affections respiratoires; ou encore la prise en charge orthopédique pour prévenir les déformations du squelette et des articulations.

Toutefois, ces soins ne visent qu'à soulager des symptômes et prévenir les complications de la maladie. Ils ne permettent pas de soigner la pathologie.

D'autre part, la sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou maladie de Charcot est une maladie neurodégénérative touchant principalement des adultes, et caractérisée par un affaiblissement puis une paralysie des muscles des jambes et des bras, des muscles respiratoires, ainsi que des muscles de la déglutition et de la parole. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 malade sur 25 000 personnes.

Cette maladie implique également la dégénérescence des neurones moteurs, en particulier ceux du cortex cérébral et de la corne antérieure de la moelle épinière. Cette dégénérescence conduit à une destruction du faisceau pyramidal. La SLA peut se présenter sous deux formes principales : la forme « spinale » et la forme « bulbaire ». La forme spinale est due à la dégénérescence des motoneurones situés dans la moelle épinière tandis que la forme bulbaire correspond à la dégénérescence des motoneurones du bulbe rachidien. Ces deux formes peuvent se succéder ou se développer simultanément, la maladie progressant presque toujours vers une forme complète (spinale et bulbaire).

Les patients souffrant de SLA disposent de soins médicaux visant non pas à la récupération des fonctions motrices mais à l'entretien des fonctions restantes, notamment grâce à la rééducation kinésithérapeute et orthopédique. En outre, il a été récemment proposé une stratégie thérapeutique se basant sur le Riluzole (commercialisé sous la dénomination Rilutek®). Mais cette stratégie permet uniquement de retarder l'évolution de la pathologie efficace et prolonge la phase de la maladie durant laquelle le patient est autonome. Aussi, ce composé améliore le pronostic des patients de seulement 30 , ce qui reste insatisfaisant. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace contre l'apparition et/ou le développement de la SLA. Π n'existe aucun traitement en vue de stopper de manière efficace la progression des neuronopathies motrices, en particulier pour freiner la dégénérescence des neurones moteurs. Il existe donc un besoin de longue date pour une stratégie thérapeutique efficace contre des neuronopathies motrices, en particulier les neuronopathies motrices de type amyotrophie spinale infantile et sclérose latérale amyotrophique.

Les inventeurs ont maintenant identifié de nouveaux partenaires de la protéine SMN, en particulier la protéine-phosphatase ΡΡΙγ, qui est une protéine régulatrice des interactions protéiques.

Ils ont montré d'une part que la ΡΡΙγ joue un rôle dans la formation du complexe SMN et sa localisation aux CBs, et d'autre part que les protéines ΡΡΙγ interagissent avec la Gem-associated protein 8 également appelée Géminé 8, qui est une protéine du complexe SMN. En effet, le complexe SMN ubiquitaire est formé des protéines Gem- associated protein 2 à 8 (Géminé 2-8) et unrip.

Après de longs et fastidieux travaux, les inventeurs ont ainsi mis au point un peptide mimant le site d'interaction entre la Géminé 8 et ΡΡΙγ. Ils ont mis en lumière que ce peptide constitue une stratégie prometteuse pour restaurer le déficit en protéine SMN et ainsi traiter les neuronopathies motrices.

Peptide de l'invention

L'invention concerne donc un peptide comprenant:

- une séquence (a) de pénétration;

une séquence (b) comprenant le motif protéique représenté en SEQ ID N°l (HHVAWJ.

Typiquement, le peptide de l'invention est un peptide isolé. Typiquement, les séquences (a) et (b) sont des séquences d'acides aminés.

Par "séquence de pénétration" ou "navette de pénétration" ou encore "navette cellulaire", on entend une séquence d'acides aminés ayant la capacité d'induire la pénétration cellulaire d'un peptide comprenant ladite séquence de pénétration à l'intérieur de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou encore 100% des cellules constituant une population donnée de culture cellulaire. Aussi, la présence d'une séquence de pénétration dans la structure d'un peptide permet audit peptide de pénétrer dans les cellules après mise en contact dans des conditions appropriées, bien connues de l'homme du métier. Cette pénétration cellulaire consiste en le passage dudit peptide de l'environnement externe dans le milieu intracellulaire, y compris le cytoplasme, dans des conditions nettement supérieures à celles rencontrées lors de diffusion passive. Typiquement, ladite séquence (a) de pénétration est une séquence comprenant des acides aminés cationiques.

Préférentiellement, cette séquence de pénétration (a) est biologiquement inactive.

Par "séquence de pénétration biologiquement inactive", on entend une séquence qui n'induit aucun effet biologique notable. En outre, une séquence de pénétration biologiquement inactive est une séquence qui n'est pas capable d'internaliser des complexes protéiques.

Typiquement, une séquence de pénétration biologiquement inactive, prise seule, n'est pas susceptible d'avoir un effet bénéfique en thérapie, en particulier dans le traitement d'une neuronopathie motrice.

Dans le contexte de l'invention, lorsqu'une séquence de pénétration (a) biologiquement inactive est couplée à une séquence (b) telle que représentée en SEQ ID N°l, le peptide de l'invention ainsi constitué acquiert:

- la capacité d'internaliser un complexe protéique, typiquement horseradish peroxidase (HRP);

un effet biologique, en particulier en thérapie.

Préférentiellement, ladite séquence (a) de pénétration est une séquence d'acides aminés comprenant entre 6 et 8 acides aminés cationiques.

Typiquement, ladite séquence (a) de pénétration est choisie dans le groupe constitué des séquences d'acides aminés suivants: - SEQ ID N°2 (VKKKKIKREIKI);

- SEQ ID N°5 (RQKRLIRQKRLIRQKRLI) ;

- SEQ ID N°6 (RRRRRRRSRGRRRRTY) ;

- SEQ ID N°7 (PRRPGPTRKHYQPYA) ;

- SEQ ID N°8 ( VKKKKIKREIKIPRRPGPTRKH YQP Y A) ;

- SEQ ID N°9 (FRGRSRFRGRSR) ;

- SEQ ID N° 10 (VKKKKIKREIKIFRGRSRFRGRSR) ;

- SEQ ID N° 11 ( VKKKKIKREIKIARGRSRFRGRSR) ;

- SEQ ID N° 12 (VKKKKIKREIKIARGRSRARGRSR) ;

- SEQ ID N° 14 (RQIKrWFQNRRMKWKK) ;

- SEQ ID N° 15 (GWTNLS AGYLLGKINLKALA ALAKKIL) ;

- SEQ ID N° 16 (GALFLGFLGGAAGSTMGAWSQPKSKRKV) ;

- SEQ ID N° 18 (DAATATRGRSAARPTERPRAPARSASRPRRPVE);

- SEQ ID N° 19 (GDCLPHLKLCKENKDCCSKKCKRRGTNIEKRCR) ;

- SEQ ID N ^o 20 (KETWWETWWTEWSQPKKKRKV);

- SEQ ID N°21 (KLALKLALKALKAALKLA) ;

- SEQ ID N°22 (GALFLGWLGAAGSTMGAPKKKRKV) ;

- SEQ ID N°23 (RRWWRRWRR) ;

- SEQ ID N°24 (RRRRRRRRR) ;

- SEQ ID N°25 (RHSRIGIIQQRRTRNG) ; et

- SEQ ID N°26 (KGVIFYLRDK).

Plus préférentiellement, ladite séquence (a) de pénétration est une séquence d'acides aminés comprenant entre 6 et 8 acides aminés choisis parmi les résidus arginine et lysine.

Encore plus préférentiellement, ladite séquence (a) de pénétration a une séquence d'acides aminés telle que représentée par la SEQ ID N°2 (VKKKKIKREIKI). Cette séquence (a) est également dénommée "DPT-shl", ou encore "navette DPT-shl".

Dans un mode de réalisation préféré, ladite séquence (b) a une séquence d'acides aminés telle que représentée par la SEQ ID N° 3 (AYPQSFYDHHVAWQDYPCS). Dans un mode de réalisation préféré, le peptide de l'invention consiste en la séquence représentée par la SEQ ID N°4 (VKKKKIKREIKIAYPQSFYDHHVAWQDYPCS). Ce peptide est également dénommé "DPT-S1". Alternativement, le peptide de l'invention consiste une séquence ayant au moins 80%, préférentiellement au moins 85%, préférentiellement au moins 90%, plus préférentiellement au moins 95% d'identité avec la séquence SEQ ID N°4. Alternativement, le peptide de l'invention consiste en la séquence SEQ ID N°4, pour laquelle au moins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 acides aminés ont été substitués.

Alternativement, le peptide de l'invention est un fragment de la séquence SEQ ID N°4. Préférentiellement, ledit fragment comprend la séquence SEQ ID N° 1.

Typiquement, ce fragment comprend au moins 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou encore 30 acides aminés de la séquence représentée par SEQ ID N°4.

Par "pourcentage d'identité" entre deux séquences d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", on entend l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).

Dans un autre mode de réalisation, ladite séquence (a) de pénétration est choisie parmi:

la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°27 (CRRWWRRWRR), dont la cystéine en position 1 forme un pont disulfure avec la cystéine en position 18 de la séquence SEQ ID N°3; et

- la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°28 (CRRRRRRRRR), dont la cystéine en position 1 forme un pont disulfure avec la cystéine en position 18 de la séquence SEQ ID N°3.

Préférentiellement, le peptide de l'invention est choisi parmi une des séquences telle que représentée aux formules I et II suivantes:

CRRWWRRWRR

RRR

aypqs ydHHVAWqdypcs

Ces peptides présentent de meilleures propriétés de pénétration.

L'invention concerne enfin un polynucléotide codant pour le peptide de l'invention. Ce polynucléotide est hautement avantageux pour être utilisé dans le cadre de thérapie génique. Applications thérapeutiques du peptide de l'invention

L'invention concerne le peptide tel que défini précédemment pour son utilisation en tant que médicament. L'invention concerne également le peptide tel que défini précédemment pour son utilisation dans le traitement d'une neuronopathie motrice choisie parmi l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy et la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Par "neurones moteurs" ou "motoneurones", on entend les neurones constituant la voie de sortie du système nerveux central (ou la voie finale) de tout acte moteur. Les corps cellulaires des motoneurones sont situés soit dans le tronc cérébral, soit dans la corne ventrale de la substance grise de la moelle épinière. Chaque motoneurone possède un axone qui part du système nerveux central pour innerver les fibres musculaires d'un muscle. L'ensemble constitué par un motoneurone et les fibres musculaires qu'il innerve constitue une unité motrice. On distingue trois types de motoneurones: les "motoneurones alpha", qui innervent les fibres musculaires responsables de la contraction, les "motoneurones gamma", qui innervent les fuseaux neuromusculaires, ajustant ainsi leur sensibilité à l'étirement, ainsi que les "motoneurones beta", qui innervent les deux types de fibres. Préférentiellement, le composé de l'invention est particulièrement avantageux pour le traitement de neuronopathies motrices impliquant la dégénérescence des neurones moteurs alpha.

Par "neuronopathie motrice", on entend une maladie impliquant la dégénérescence des neurones moteurs, qui se manifeste par une absence de stimulation des muscles conduisant à une amyotrophie.

Cette maladie est associée à un déficit en protéine SMN et/ou à une réduction du nombre de CBs et/ou à un défaut de localisation de la protéine SMN aux CBs.

Les symptômes d'une telle pathologie peuvent être variés et peuvent comprendre:

- un déficit moteur progressif;

une amyotrophie;

des fasciculations; et/ou des crampes.

Ladite neuronopathie motrice est l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy, ou la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Préférentiellement, ladite neuronopathie motrice est l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique. Plus préférentiellement, ladite neuronopathie est l'amyotrophie spinale infantile. Typiquement, ladite amyotrophie spinale infantile est de type I, de type II ou de type III.

Les inventeurs ont en effet mis en lumière que le peptide de l'invention permet l'augmentation de la distribution de la protéine SMN aux Corps de Cajal et/ou l'augmentation du nombre de Corps de Cajal. Aussi, le peptide de l'invention, en augmentant de manière significative la distribution de la protéine SMN aux Corps de Cajal et/ou le nombre de Corps de Cajal, constitue une stratégie thérapeutique pertinente pour le traitement des neuronopathies motrices, en particulier la SMA.

Le peptide de l'invention mime le site d'interaction entre les protéines de la famille des protéine-phosphatases PP1 et la Géminé 8. La famille des protéine-phosphatases PP1 regroupe un très grand nombre d'holoenzymes qui jouent un rôle prépondérant dans de nombreuses fonctions cellulaires fondamentales comme l'apoptose (Garcia et al., 2003 ; Godet et al., 2006), la plasticité synaptique (Dehmelt and Halpain, 2007) et la contraction musculaire (Cohen, 2002). Dans cette famille de protéine-phosphatases, les sous-unités catalytiques (C) sont capables de s'associer à une très grande variété de sous-unités régulatrices ou dites d'interaction (Bollen et al., 2010). Il existe chez les mammifères trois gènes codant pour les quatre sous-unités catalytiques de la PP1, PPl , PP1 β/δ et des variants d'épissage ΡΡΙγΙ (ici, ΡΡΙγ) et ΡΡ1γ2, spécifique du testicule (Moorhead et al., 2007). La distribution, la spécificité de substrat et l'activité de ces sous-unités catalytiques sont définies par leur association à la sous-unité régulatrice (Bollen et al., 2010). Dans la plupart des cas, ces protéines se lient aux sous-unités catalytiques PP1 par un motif consensus R/Kx _(0jl) V/IxW/F dégénéré. Les membres de cette famille de protéine-phosphatases sont aussi associés à des processus pathologiques impliqués dans des maladies comme les maladies neurodégénératives, l'insuffisance cardiaque, le diabète de type 2, le cancer et les infections virales (Nuytten et al., 2008; Kelsall et al., 2009; Boyce et al., 2005; Nicolaou et al., 2009). De nombreux inhibiteurs pharmacologiques ciblant les sous-unités catalytiques des phosphatases de type PPl ont été étudiés, leur faible sélectivité vis-à-vis de chacun des holoenzymes, ne permet pas une utilisation ciblée en thérapie humaine. Les inventeurs ont réussi à cibler spécifiquement un holoenzyme donné grâce à la mise au point du peptide de l'invention. En effet, l'interaction in vitro observée entre le complexe SMN immunopurifié et la protéine recombinante ΡΡΙγ les a conduit à rechercher parmi les protéines du complexe la signature du motif d'interaction à la PPl. Le motif potentiel HHVAW a été retrouvé dans la séquence peptidique de Géminé 8. Tout d'abord, les inventeurs ont démontré par des études de liaison in vitro que la protéine Géminé 8 pouvait interagir directement avec la protéine -phosphatase ΡΡΙγ. De plus, la mutation du motif HHVAW en HHAAA (SEQ ID N°17) dans des expériences de re-localisation de la protéine ΡΡΙγ endogène avec des cellules HeLa en culture démontre qu'il est impliqué dans le recrutement de ΡΡΙγ par Géminé 8 aux CBs. Ils ont ainsi mis en évidence le fait que le domaine protéique de Géminé 8 contenant le motif HHVAW est essentiel pour concevoir de nouvelles molécules peptidiques au potentiel thérapeutique contre les neuronopathies motrices, en particulier la SMA.

Les inventeurs ont ainsi développé ce nouveau peptide, hautement pertinent pour pallier le déficit en protéine SMN au niveau des CBs. En effet, ce dernier permet d'augmenter de manière significative la distribution de SMN dans les CBs.

Par conséquent, le peptide de l'invention constitue une stratégie thérapeutique pertinente dans le traitement des neuronopathies motrices, en particulier la SMA ou la SLA.

Par "Corps de Cajal" ou "Cajal bodies" ou encore "CBs" on entend le site des modifications initiales et de l'assemblage de plusieurs petits ARNs nucléaires avec leurs ribonucléoprotéines, les snRNPs (small nuclear ribonucleoproteins) importés depuis le cytoplasme par le complexe SMN, ou recyclés dans le noyau. Les CBs présentent une ultra structure révélant des fils enroulés, d'où leur autre nom de « coiled bodies ». Les CBs sont des structures dynamiques et leur nombre peut varier rapidement s'il y a un changement du niveau de transcription. L'abondance des CBs peut être aisément déterminée par l'homme du métier, en particulier par l'immuno-détection de la protéine coiline (marqueur des CBs) et le nombre de CBs ainsi détecté. Comme indiqué précédemment, la protéine SMN s'accumule dans les Corps de Cajal. Un défaut de cette accumulation est d'ailleurs décrit dans la SMA.

Compositions pharmaceutiques

Les inventeurs ont mis en évidence un effet synergique entre le peptide de l'invention et la cyclosporine A pour la distribution de la protéine SMN aux CBs. Cette combinaison est donc hautement prometteuse pour le traitement de neuronopathies motrices telles que l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy ou la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

La cyclosporine A ou CsA est un peptide cyclique composé de onze acides aminés qui se fixe aux cyclophilines et provoque l'inhibition spécifique de la protéine -phosphatase 2B (PP2B). Son nom IUPAC est comme suit: [R-[[R*,R*-(E)]]-cyclic(L-alanyl- D- alanyl-N-methyl-L-leucyl- N-methyl-L-leucyl-N-methyl- L-valyl-3-hydroxy-N,4- dimethyl- L-2-amino-6-octenoyl-L-a-amino- butyryl-N-methylglycyl-N-methyl- L- leucyl-L-valyl-N-methyl-L-leucyl). Son numéro CAS est 59865-13-3. Du fait de son effet immunosuppresseur, la CsA est déjà utilisée en thérapie chez l'homme.

La cyclosporine est disponible commercialement, elle est notamment disponible auprès de la société Cell Signaling.

L'invention concerne donc également une composition comprenant :

un peptide comprenant une séquence (a) de pénétration et une séquence (b) comprenant le motif protéique représenté en SEQ ID N°l; et

une cyclosporine A.

Les caractéristiques techniques développées précédemment relativement audit peptide sont applicables ici. Les inventeurs ont montré que le peptide de l'invention en combinaison avec la cyclosporine A exercent en synergie un effet bénéfique sur l'accumulation de la protéine SMN aux CBs dans les fibroblastes de patients atteints des trois formes de l'amyotrophie spinale infantile. Par conséquent, la combinaison du peptide de l'invention avec la cyclosporine exerce en synergie un effet thérapeutique.

La composition selon l'invention peut associer le peptide de l'invention et la cyclosporine A à d'autres agents actifs, notamment des agents actifs susceptibles de traiter les neuronopathies motrices. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple:

le riluzole (Haddad H et al., Riluzole atténuâtes spinal muscular atrophy disease progression in a mouse model, 2003. 28(4):432-437; et Wadman RI et al. 2012. Drug treatment for spinal muscular atrophy type I, Cochrane Database Syst Rev. 4:CD006281);

l'hydroxyurée (Chen TH et al., Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of hydroxyurea in spinal muscular atrophy, Neurology, 2010 75:2190-21); les inhibiteurs de l'ubiquitine/protéasome (Chang HC et al., Dégradation of survival motor neuron (SMN) protein is mediated via the ubiquitin/proteasome pathway, Neurochem Int., 2004, 45: 1107-1112; et Kwon DY et al., Increasing expression and decreasing dégradation of SMN ameliorate the spinal muscular atrophy phenotype in mice, Hum Mol Genêt., 2011, 20:3667-3677);

les inhibiteurs des histone déacétylases (Lunke S et al., The emerging rôle of epigenetic modifications and chromatin remodeling in spinal muscular atrophy. J Neurochem, 2009, 109(6): 1557-1569);

les inhibiteurs des protéines phosphatases (Novoyatleva T et al., Protein phosphatase 1 binds to the RNA récognition motif of sever al splicing factors and régulâtes alternative pre-mRNA processing, Hum. Mol. Genêt., 2008, 17, 52- 70);

l'olésoxime (TR019622), Bordet T et al., Identification and characterization of cholest-4-en-3-one, oxime (TRO 19622), a novel drug candidate for amyotrophic latéral sclerosis, J Pharmacol Exp Ther, 2007, 322(2):709-720.);

les aminoglycosides (Mattis VB et al., Analysis of a read-through promoting compound in a severe mouse model of spinal muscular atrophy, 2012, 525(l):72-75);

le salbutamol (Pane M et al., Daily salbutamol in young patients with SMA type II, Neuromuscul Disord., 2008, 18:536-540);

- l'isoindoline (demande US 2010/0267712) ;

- l'ibudilast (demande US 2009/0062330);

les modulateurs des kinases (Burnett BG, et al., Régulation of SMN protein stability, Mol Cell Biol., 2009, 29(5): 1107-1115);

les variants d'IGF-l (Murdocca M et al., IPLEX administration improves motor neuron survival and améliorâtes motor functions in a severe mouse model of

SMA, Mol Med. 2012 May 29. doi: 10.2119/molmed.2012.00056);

les facteurs de croissance humains (demande US 2008/0187512);

les pyrimidines bicycliques inhibant la PTK (Hastings ML et al., Tetracyclines that promote SMN2 exon 7 splicing as therapeutics for spinal muscular atrophy, Sci Transi Med., 2009, l(5):5ral2);

la quinazoline inhibant l'EGFR (Butchbach ME et al., Effects of 2,4- diaminoquinazoline derivatives on SMN expression and phenotype in a mouse model for spinal muscular atrophy, Hum Mol Genêt., 2010, 19(3):454-467); les inhibiteurs de tyrosine kinases (demande US 2010/0305036);

- les inhibiteurs de VEGFR (demande US 2010/0331296) ;

les inhibiteurs de l'HSP90 (Suzuki K et al., Pathogenesis-targeting therapeutics for spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA), Neuropathology, 2009, 29(4):509-516);

les antagonistes de la myostatine (Rose FF Jr et al., Delivery of recombinant follistatin lessens disease severity in a mouse model of spinal muscular atrophy,

Hum Mol Genêt., 2009, 18(6):997-1005);

l'héparine à faible poids moléculaire (demande US 2002/0040013);

- la néramexane (demande US 2010/0234402);

- la nicergoline (demande US 2003/0134869);

- les inhibiteurs de la protéine kinase G3SKB (Makhortova NRet al., A screenfor regulators of survival of motor neuron protein levels, Nat Chem Biol., 2011, 7(8):544-552); les inhibiteurs de RhoA et de Rho-associated kinase (ROCK pathway) (Bowerman M et al, Mol Cell Neurosci, 2009, 42:66-74 et Bowerman M et al, Hum Mol Genêt 2010, 19: 1468-1478);

-les antioxydants (Wan L et al., Inactivation of the SMN complex by oxidative stress, Mol Cell., 2008 31(2):244-254);

les inhibiteurs de l'apoptose (Sareen D et al., Inhibition of apoptosis blocks human motor neuron cell death in a stem cell model of spinal muscular atrophy. PLoS One. 7(6):e39113. 2012); ou encore

les modulateurs des voies ERK et PI3K/AKT kinases. (Biondi O et al., In vivo NMDA receptor activation accélérâtes motor unit maturation, protects spinal motor neurons, and enhances SMN2 gene expression in severe spinal muscular atrophy mice, J Neurosci., 2010 30: 11288-11299.)

Aussi, l'invention concerne également une composition comprenant au moins un peptide selon l'invention, au moins une cyclosporine A et au moins un agent actif choisi parmi le riluzole, l'hydroxyurée, les inhibiteurs de l'ubiquitine/protéasome, les inhibiteurs des histone déacétylases, les inhibiteurs des protéines phosphatases, l'olésoxime, les aminoglycosides, le salbutamol, l'isoindoline, l'ibudilast, les modulateurs des kinases, les variants d'IGF-l, les facteurs de croissance humain, les pyrimidines bicycliques inhibant la PTK, la quinazoline inhibant l'EGFR, les inhibiteurs de tyrosine kinases, les inhibiteurs de VEGFR, les inhibiteurs de l'HSP90, les antagonistes de la myostatine, l'héparine à faible poids moléculaire, la néramexane, la nicergoline, les inhibiteurs de la protéine kinase G3SKB, les inhibiteurs de RhoA et de Rho-associated kinase (ROCK pathway), les anti- oxydants, les inhibiteurs de l'apoptose et les modulateurs des voies ERK et PI3K/AKT kinases.

Dans la suite, l'expression "composition de l'invention" désigne une composition comprenant:

un peptide comprenant une séquence (a) de pénétration et une séquence (b) comprenant le motif protéique représenté en SEQ ID N°l, et

une cyclosporine A,

avec ou sans un agent actif tel que définis aux deux paragraphes qui précèdent. Typiquement, la composition de l'invention comprend du Riluzole pour une utilisation dans le traitement de la sclérose latérale amyotrophique. L'invention concerne également la composition de l'invention pour son utilisation en tant que médicament.

L'invention concerne également la composition de l'invention pour son utilisation dans le traitement d'une neuronopathie motrice choisie parmi l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy et la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Préférentiellement, l'invention concerne la composition de l'invention pour son utilisation dans le traitement de l'amyotrophie spinale infantile.

Typiquement, l'association du peptide de l'invention et de la cyclosporine peut être simultanée, séparée ou étalée dans le temps. Aussi, l'invention concerne le peptide selon l'invention et la cyclosporine A pour leur administration simultanée, séparée ou séquentielle pour leur utilisation dans le traitement d'une neuronopathie motrice choisie parmi l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy et la maladie de Charcot-Marie-Tooth.

Enfin, l'invention concerne aussi des compositions pharmaceutiques pour une utilisation dans des méthodes de traitement de neuronopathies motrices chez l'homme, lesdites compositions comprenant au moins un peptide selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Préférentiellement, ladite composition pharmaceutique comprend également la cyclosporine A.

La forme des compositions pharmaceutiques, leur voie d'administration, leur dosage et leur posologie dépendent naturellement de la sévérité de la pathologie, de son stade d'évolution, de l'âge, du sexe, du poids du sujet à traiter, etc. L'homme du métier veillera donc à adapter les dosages en fonction du patient à traiter, en particulier lors du traitement de la SMA dans laquelle les patients sont des enfants.

Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées pour une administration topique, orale, systémique, intra-nasale, parentérale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, ou autre. Selon le mode d'administration, la composition selon l'invention peut se présenter sous toutes les formes galéniques.

De préférence, le peptide de l'invention, et éventuellement la cyclosporine sont compris dans une composition qui est administrée par voie orale. Par voie orale, les compositions peuvent se présenter sous forme de comprimés, de gélules, de dragées, de sirops, de suspensions, de solutions, de poudres, de granulés, d'émulsions, de microsphères ou nanosphères ou vésicules lipidiques ou polymériques permettant une libération contrôlée.

Pour une application topique sur la peau, la composition peut avoir la forme notamment de solution aqueuse ou huileuse ou de dispersion du type lotion ou sérum ; d'émulsion de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H) ; d'émulsion de consistance molle du type crème ; d'émulsion biphasée; de gel aqueux ou anhydre ; de mousse ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique, ou encore de formules pulvérisables de type « spray ». Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles connues de l'homme de l'art. Pour une application par voie systémique, la composition peut se présenter sous forme de solution aqueuse ou saline.

Méthode de traitement

L'invention concerne également des méthodes de traitement d'un sujet souffrant d'une neuronopathie motrice, telle que l'amyotrophie spinale infantile, la sclérose latérale amyotrophique, la sclérose latérale primaire, la maladie de Kennedy ou encore la maladie de Charcot-Marie-Tooth comprenant l'étape d'administration audit sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un peptide de l'invention. Par "quantité thérapeutiquement efficace" on entend une quantité suffisante pour traiter et/ou stopper la progression neuronopathies motrices.

Les caractéristiques techniques développées précédemment sont applicables ici.

L'ensemble des références citées dans cette demande est incorporé par référence. Figures Figure 1: Analyse quantitative de l'internalisation du peptide DPT-Sl dans les cellules. Les cellules HeLa (A) ou les fibroblastes de patients SMA (B) ont été incubées 6 heures avec 125 nM de peptides. En présence de peptide DPT-Sl on observe une incorporation de 449 pg de HRP pour 10 ⁵ cellules HeLa et de 519 pg de HRP pour 10 ⁵ cellules fibroblastes de patients SMA.

Figure 2: Effet des différents peptides sur la viabilité cellulaire. Les cellules HeLa ou les fibroblastes humains transformés ont été incubés 24 heures en présence de différentes concentrations de peptides. La survie a été analysée par le test MTT. Figure 3: Démonstration par immunomarquage de l'effet exercé sur la proportion de cellules HeLa pour lesquelles la distribution de la protéine SMN aux Cajal bodies (CBs) est observée par le traitement avec le peptide DPT-Sl suivant sa concentration en micromolaire. A) histogramme représentant la dose-réponse des cellules HeLa (test de khi-2, p<0.001, 300 < n < 500 cellules par condition) et

B) Confirmation de l'effet exercé par le peptide DPT-Sl à 25 micromolaires avec les cellules HeLa (test khi-2, p<0.001, 6 expériences).

Figure 4: Démonstration par immunomarquage de l'effet exercé sur les fibroblastes immortalisés d'un patient atteint de la forme sévère de SMA pour lesquels la distribution de la protéine SMN aux Corps de Cajal (CBs) est observée avec le traitement à la cyclosporine A suivant la concentration (nanomolaire). Histogramme représentant la dose-réponse des cellules. 500 < n < 1800 cellules par condition ; 2 (25 nM) ou 3 expériences indépendantes (10, 50 et 100 nM).

Figure 5: Démonstration par immunomarquage de l'effet exercé sur les fibroblastes immortalisés d'un patient SMA atteint de la forme sévère (type I) pour lesquels la distribution de la protéine SMN aux Corps de Cajal (CBs) est observée avec le traitement par le DPT-S1 en synergie avec la cyclosporine A. (khi-2, p<0.001. 1300 < n < 2200 cellules par condition; 3 expériences indépendantes). Figure 6. Démonstration par immunomarquage de l'effet exercé sur les fibroblastes en culture primaire d'un patient de chacun des trois formes de SMA pour lesquels la distribution de la protéine SMN aux Corps de Cajal (CBs) est observée par le DPT-S1 avec la cyclosporine A. Les trois formes de la maladie vont du type I (sévère) au type III (modéré) de la maladie. Une valeur égale à 1 a été donnée arbitrairement au traitement avec le DPT-shl et CsA qui sert de condition témoin afin de calculer la valeur d'induction, (khi-2, p<0.001. 500 < n < 2200 cellules par condition).

Figure 7: Analyse de l'internalisation d'HRP par des peptides contenant des séquences issues de Géminé 8.

Des cellules HeLa et des fibroblastes de patients SMA sont incubés 6 heures avec 125nM de peptides biotinylés couplés à la streptavidine-HRP. Le témoin négatif est obtenu par incubation des cellules avec la même quantité de streptavidine-HRP que celle utilisée avec les peptides. 17,7 ± 8,2ng et 16,3 ± 5,3ng d'HRP ont été internalisés respectivement dans les fibroblastes SMA et dans les cellules HeLa par le peptide pénétrant de référence TAT qui sert de témoin positif. Les données regroupent 3 expériences indépendantes.

Figure 8: Effets biologiques des peptides pénétrants dérivés de la protéine Géminé 8 sur les CBs avec les fibroblastes immortalisés de la forme sévère de l'amyotrophie spinale. Les cellules sont traitées pendant 16 heures. Mes données regroupent 7 expériences indépendantes. Les cellules ont été traitées avec chacun des peptides en présence de la cyclosporine A (10 nM). Une augmentation franche n'est observée qu'avec le peptide DPT-S1 qui contient la navette Shl (Test de Khi-2, p<0,001). EXEMPLES

1- Internai isation dans la cellule HeLa et le fibroblaste SMA dit nouveau peptide pénétrant DPT-S1 contenant la séquence Géminé 8. Méthode:

Les cellules HeLa ou fibroblastes immortalisés d'un patient SMA atteint de la forme sévère du type 1 (1 à 2.10 ⁵ pour 200μ1) sont ensemencées dans des plaques de 96 puits avec du milieu complet DMEM en présence de 10 % sérum de veau fœtal. Après une nuit d'incubation à 37°c dans une étuve à C02 (5%), les cellules sont incubées 24 heures à 37 °C en présence de 125 nM de peptides biotinylés, qui ont été eux-mêmes préincubés 40 minutes à température ambiante avec la Streptavidine- horseradish peroxidase (HRP) dans une proportion de 4 moles de peptides pour 1 mole de Streptavidine-HRP. Après 6 heures d'incubation, les cellules soumises à une étape de trypsination, puis sont lavées avec du PBS et centrifugées 10 min à 600g. Le culot cellulaire est repris avec 0,3 ml de tampon lyse (0,1 M Tris-HCI pH 8, 0,5% NP-40 buffer) et laissé 10 minutes sur la glace. Après centrifugation 10 minutes à 4°C et à 13000g on élimine les débris cellulaires puis on récupère le surnageant de lyse qui est alors incubé avec 50 μΐ de tampon OPD (25,7 ml dibasic sodium phosphate 0,2 M + 24,3 ml acide citrique 0,1 M + 50 ml d'eau distillée; ajustée pH 5,0) et 50 μΐ de solution OPD (un comprimé d'OPD "Free base de SIGMA CHEMICAL COMPANY P- 5412"est dissout dans 50 ml de tampon OPD avec 40 μΐ d'H ₂ 0 ₂ 30%.). La réaction, environ 15 minutes, est arrêtée par ajout de 100 μΐ HC1 1M. L'activité peroxydase est déterminée par lecture à 490 nm au lecteur ELISA. La quantité de peroxydase dans les lysats est calculée d'après la courbe de référence puis rapportée au même nombre de cellules. Résultats:

Les inventeurs ont analysé, dans les cellules HeLa et dans les fibroblastes SMA, l'internalisation du complexe protéique- Streptavidine-HRP par le peptide DPT-S1 contenant la séquence dérivée de Géminé 8 (résidus 77-88, SEQ ID N°l) associée à la séquence de la navette DPT-shl (SEQ ID N°2).

La figure 1 montre que, comme décrit précédemment par les inventeurs, la navette DPT-shl seule n'internalise pas de complexe HRP.

L'addition de la séquence 77-88 de Géminé 8 (SEQ ID N°l), contenant un motif potentiel d'interaction de Géminé 8 avec ΡΡΙγ, met en évidence la propriété "cargo" et démontre le caractère pénétrant du peptide bipartie DPT-S1. 2- Effet du peptide pénétrant contenant une séquence dérivée de Géminé 8 sur la viabilité des cellules HeLa et des fibroblastes de patients SMA

Méthode:

Le protocole MTT-Kit Sigma (ref G4000) a été suivi pour cette expérience.

Les cellules HeLa ou les fibroblastes SMA (3000 cellules pour 200 μΐ) sont ensemencées dans des plaques de 96 puits avec du milieu complet DMEM en présence de 10 % sérum de veau fœtal. Après une nuit d'incubation à 37°c dans une étuve à 5% C0 ₂ , les cellules sont cultivées en présence de différentes concentrations de peptides ajoutés directement dans le milieu de culture. Après 24h d'incubation, on ajoute 10 μΐ de la Solution MTT du kit par puit. L'incubation est réalisée dans le noir à 37°C pendant 3heures avant ajout de 100 μΐ de la solution de "Solubilisation/STOP" du kit par puit. Après homogénéisation des puits à la pipette, les plaques sont incubées lh à 37°C ce qui permet une lyse complète des cellules. Ceci permet d'homogénéiser- la dissolution du produit de réaction dans les puits avant la lecture des plaques à 570 nm avec un filtre de référence à 630 mn. Résultats:

Les inventeurs ont analysé la toxicité des peptides DPT-shl et DPT-Sl après 24 heures, d'incubation avec à la fois les cellules HeLa et les fibroblastes SMA. Les résultats indiquent que DPT-Sl utilisé entre 1 et 50 μΜ n'a pas d'effet toxique significatif sur les cellules HeLa (Fig.2A) et sur les fibroblastes SMA (Fig.2B).

3- Effets exercés sur la distribution de la protéine SMN aux CBs avec les cellules HeLa et les fibroblastes SMA lors du traitement par le peptide DPT-Sl

Méthode & Résultats

La première série d'expériences a d'abord servi à valider sur des cellules HeLa en culture les effets exercés sur les CBs par le peptide DPT-Sl. Pour évaluer la relation entre la concentration (dose égale à 5, 10, 25 et 50 micromolaires) et l'effet (réponse) sur les CBs des cellules HeLa, nous avons d'abord construit une courbe dose-réponse avec le peptide DPT-SI en le comparant à la navette DPT-shl seule (Fig. 3).

L'augmentation du nombre de CBs dans les cellules HeLa (10 000 cellules par puit de 0,8 cm ) après 16 heures de traitement a été analysée pour chacune des concentrations. Pour déterminer si le peptide DPT-Sl exerçait un effet positif, nous avons compté la proportion de cellules qui avaient la protéine SMN à 0 ou 2 CBs, à 3 ou 4 CBs et à 5 CBs et plus, dans des cellules choisies au hasard pour chaque expérience.

L'analyse par immunomarquage à l'aide des anticorps spécifiques (commerciaux et produit à façon) des protéines SMN et coiline (autre marqueur des CBs) montre que la navette seule n'exerce pas d'effet sur la localisation de la protéine SMN aux CBs (Fig. 3A).

La proportion de cellules HeLa avec une augmentation du nombre de CBs (3 à 4) croît avec l'augmentation de la concentration du peptide DPT-Sl. Les résultats obtenus à partir de cette expérience «dose-réponse » montre que le DPT-Sl à une concentration de 25 micromolaires augmente de manière significative le nombre de CBs (khi-2, p<0.001, nombre total de cellules comptées pour chacune des conditions est égal au moins à 300).

Nous avons ensuite répété le traitement à 25 micromolaires (Fig. 3B); et les données obtenues à partir de six expériences indépendantes ont permis de conclure que ce peptide était capable d'augmenter de manière significative la distribution de la protéine SMN aux CBs dans les cellules HeLa (khi-2, p<0,001, n=1320 cellules pour le DPT-shl et n=2163 cellules pour DPT-S1).

A la recherche des processus moléculaires mis en jeu et induisant les effets sur les CBs, nous avons évalué le rôle que pourrait jouer la protéine-phosphatase 2B (PP2B).

Les inventeurs ont décidé de tester la cyclosporine A. Il s'agit d'un peptide cyclique composé de onze acides aminés qui se fixe aux cyclophilines et provoque l'inhibition spécifique de la PP2B. Avec son effet immunosuppresseur, la CsA est déjà utilisée en thérapie chez l'Homme.

Les inventeurs ont d'abord évalué la relation entre la concentration (10, 25, 50 et 100 nanomolaires) et l'effet bénéfique sur les CBs des fibroblastes SMA immortalisés (Fig. 4). La concentration efficace médiane (CE50) de la CsA dans nos conditions expérimentales est d'environ 25 nanomolaires. D'autre part, il a été rapporté que la valeur de CE50 pour la CsA était de 18 nM lors d'une étude portant sur la translocation nucléocytoplasmique du facteur nucléaire NFATcl, substrat de la PP2B (fiche technique NFATcl redistribution assay, Thermo Scientific). La valeur retrouvée ici est donc compatible avec les concentrations associées aux effets de la CsA ciblant spécifiquement l'activité de la protéine-phosphatase PP2B.

Les inventeurs ont fait l'hypothèse selon laquelle le peptide DPT-S1 (à 25 micromolaires) et la CsA (à 10 nanomolaires) pourraient agir en synergie sur la distribution de la protéine SMN aux CBs chez les fibroblastes de patients. A cette concentration, les inventeurs ont préalablement montré que la CsA n'a pas d'effet détectable (Fig. 4). Les inventeurs ont ensuite mené des expériences d'immunomarquage similaires aux précédents d'abord en utilisant les fibroblastes SMA immortalisés traités ou non avec une combinaison du peptide DPT-Sl et de la CsA (Fig. 5).

Les résultats obtenus à partir de 3 expériences indépendantes ont permis de conclure à l'effet synergique entre le DPT-Sl et la CsA (khi-2, p<0,001; 1300<n<2200 cellules par conditions). Nous avons aussi recherché l'effet exercé après 16 heures de traitement avec le DPT-Sl et la CsA sur l'augmentation du nombre de CBs avec SMN dans des cultures primaires de fibroblastes du type I (sévère), type II (forme intermédiaire) et du type III (forme modérée). L'action synergique du peptide et de la CsA sur les CBs a aussi été retrouvée avec les cultures primaires de fibroblastes (Fig. 6). Les cultures des trois formes répondent globalement de la même manière avec un facteur d'induction d'une valeur moyenne égale à environ 2. Cette similarité pourrait être liée à l'existence d'une boucle de rétrocontrôle déjà rapportée avec la protéine SMN. L'analyse statistique à partir de ces expériences a permis de montrer que le peptide DPT-Sl avec la CsA exerce en synergie un effet bénéfique sur l'accumulation de la protéine SMN aux CBs dans les fibroblastes de patients atteints des trois formes de la maladie. Conclusion

Les inventeurs ont ainsi mis en évidence qu'un nouvel agent peptidique DPT-Sl a un effet bénéfique prometteur car il permet un recrutement de la protéine SMN aux CBs dans les cellules HeLa et les fibroblastes dérivés de la peau d'enfants atteints de neuronopathie motrices en particulier de l'amyotophie spinale infantile. 4. Analyse de l'influence de la séquence de pénétration

Les inventeurs ont développé plusieurs peptides afin d'étudier l'influence de la séquence de pénétration sur, entre autres, l'efficacité du peptide à produire et-l'accumulation de la protéine SMN aux CBs dans les fibroblastes. Les séquences des peptides synthétisés sont récapitulées dans le tableau ci-après :

DPT-S2* contient le motif de liaison de Bcl2 à PP1 alpha

DPT-Sl et DPT-S3 contiennent le motif de liaison sauvage et se différencient par la navette utilisée

Dans le contexte des expériences suivantes, chacune des séquences est greffée à une biotine.

A. Analyse de l'internalisation d'HRP par des peptides contenant des séquences issues de Géminé 8

Des cellules HeLa et des fibroblastes de patients SMA sont incubés 6 heures avec 125 nM de peptides biotinylés couplés à la streptavidine-HRP. Le témoin négatif est obtenu par incubation des cellules avec la même quantité de streptavidine-HRP que celle utilisée avec les peptides.

17,7 ± 8,2ng et 16,3 ± 5,3ng d'HRP ont été internalisés respectivement dans les fibroblastes SMA et dans les cellules HeLa par le peptide pénétrant de référence TAT qui sert de témoin positif (figure 7). Ces résultats indiquent que la navette TAT qui permet la pénétration n'a pas un effet biologique efficace.

Aussi, la séquence DPT-S4 ne suffit pas pour induire l'effet biologique résultant de l'interaction spécifique de ΡΡΙγ avec DPT-S4. Ceci indique clairement que la localisation intracellulaire de DPT-Sl, distincte de celles de TAT & DPT-S3, est importante pour l'effet biologique.

Par conséquent, ces résultats montrent que la nature de la séquence de pénétration influe sur l'efficacité du peptide.

B. Comparaison des effets biologiques des peptides

Les cellules HeLa sont traitées pendant 16 heures avec chacun des peptides et des expériences d'immunofluorescence en double marquage sont réalisées. Les CBs sont détectés à l'aide de 2 anticorps spécifiques, l'un pour la protéine coiline et l'autre pour la protéine SMN. La présence de la protéine SMN aux CBs est révélée lors d'une co- localisation des 2 anticorps aux structures ponctiformes dans le noyau des cellules (n> 6).

Le nombre optimal de CBs a été montré égal à 3 ou 4 par noyau avec les cellules HeLa (Stanek et al, 2008).

Ici, les traitements avec les peptides DPT-Sl et DPT-S3 montrent une augmentation significative du nombre de cellules HeLa présentant 3 ou 4 CBs (Khi-2, p<0,001). Les résultats montrent que l'effet d'induction est franchement supérieur avec le peptide DPT-Sl (contenant la navette Shl) qu'avec le peptide DPT-S3 (contenant la navette TAT).

C. Conclusion

Concernant la pénétration et la localisation intracellulaire de DPT-Sl, le remplacement de la navette DPT-shl par la navette Tat démontre que le fait de faire pénétrer la séquence DPT-S4 ne suffit pas pour induire l'effet biologique résultant de l'interaction spécifique de ΡΡΙγ avec DPT-S4. Ceci suggère clairement que la localisation intracellulaire de DPT-Sl, distincte de celles de TAT&DPT-S3, est importante pour l'effet biologique. Concernant l'interaction spécifique de ΡΡΙγ avec DPT-Sl, nous avons montré que DPT-S2, le peptide mutant inactif de DPT-Sl dans lequel on a remplacé le motif d'interaction de ΡΡΙγ par celui de PPla, pénètre dans la cellule via l'interaction avec PPla sans aucune influence sur le nombre de CBs.

Ces résultats montrent également que le peptide DPT-S 1 exerce un effet biologique en combinaison avec la cyclosporine A, cet effet n'est pas observé avec le peptide DPT-S3 (figure 8).

Enfin, ces résultats confirment que la séquence de pénétration du peptide ne peut être choisie de manière arbitraire, et que la sélection spécifique de ce peptide confère un effet biologique, essentiel pour son utilisation efficace en thérapie.

5. Analyse de l'efficacité de peptide dérivé de géminé présentant une séquence de pénétration avec point disulfure Les inventeurs ont développé des peptides ayant une séquence de pénétration présentant un pont disulfure entre deux cystéines.

La séquence (a) de pénétration des peptides est comme suit:

la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°27 (CRRWWRRWRR), dont la cystéine en position 1 forme un pont disulfure avec la cystéine en position 18 de la séquence SEQ ID N°3; et

- la séquence d'acides aminés représentée en SEQ ID N°28 (CRRRRRRRRR), dont la cystéine en position 1 forme un pont disulfure avec la cystéine en position 18 de la séquence SEQ ID N°3. Les peptides ainsi obtenus sont comme suit: CRRWWRRWRR aypqsfydHHVAWqdypcs

CRRRRRRRRR

(■■)

S I aypqsfydHHVAWqdypcs

Les cellules HeLa sont traitées pendant 16 heures avec chacun des peptides à des concentrations différentes et des expériences d'immunofluorescence en double marquage sont réalisées. Les CBs sont détectés à l'aide de 2 anticorps spécifiques, l'un pour la protéine coiline et l'autre pour la protéine SMN.

La présence de la protéine SMN aux CBs est révélée lors d'une co-localisation des 2 anticorps aux structures ponctiformes dans le noyau des cellules (n=3).

Les résultats montrent une amélioration des propriétés de pénétration de ces peptides.