ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El dolor representa un grave problema social y económico.

Se calcula que más de 2 millones de personas están incapacitadas diariamente por sufrir sensaciones dolorosas transitorias o crónicas. Claros ejemplos lo representan la algesia experimentada por pacientes de cáncer, jaqueca, artritis, quemados, accidentados y los operados quirúrgicamente. A pesar de la gravedad del problema, el arsenal farmacológico para combatirlo, prevenirlo y/o aminorar sus síntomas y progreso es sorprendentemente limitado, debido, en parte, a la falta de dianas terapéuticas específicas sobre las que actuar.

La sensación de dolor se inicia cuando las terminales periféricas de un grupo de neuronas sensoriales, conocidas como neuronas nociceptoras, se activan por estímulos nocivos de naturaleza química, mecánica o térmica (1,2) [véase el apartado relativo a la BIBLIOGRAFÍA]. Las neuronas nociceptoras transmiten la información acerca del daño tisular a los centros procesadores de la sensación de dolor en la médula espinal y el cerebro.

Aunque los mecanismos biológicos precisos de la transmisión del dolor no están claramente establecidos, recientemente se ha

descrito la clonación y caracterización de un receptor de membrana activado por la capsaicina (en adelante identificado como Anocireceptor VR1-) que está involucrado directamente en las vías de dolor (3-5). El nocireceptor VR1 está expresado específicamente en neuronas sensoriales y media la respuesta a estímulos nocivos de naturaleza química y térmica (3,4,6). Este nocireceptor es un canal iónico activado por ligando, y se caracteriza por poseer una alta permeabilidad al calcio (5,7). La alta permeabilidad al calcio del nocireceptor VR1 es consistente con la neurodegeneración observada por la activación prolongada de neuronas nociceptoras, por ejemplo, en condiciones de dolor crónico (1,5,6). Por consiguiente, una estrategia para aminorar la transmisión y sensación de dolor periféricos es controlar los canales iónicos implicados en la respuesta química de los nociceptores mediante el desarrollo de antagonistas específicos y potentes.

Además del nocireceptor VR1, también se ha descrito la participación del neurotransmisor excitatorio L-glutamato en la transmisión del dolor (8-10). El glutamato activa receptores de membrana que tienen actividad de canal iónico (receptores ionotrópicos) o que transducen la señal a través de proteínas G (receptores metabotrópicos) (11). Los receptores de glutamato ionotrópicos han sido implicados en nocicepción glutamatérgica debido a su permeabilidad a iones Ca2+ (10,11). El mecanismo molecular propuesto indica que niveles altos y crónicos de glutamato provocan una activación prolongada (hiperactivación) de los receptores ionotrópicos que cargan las neuronas sensoriales con iones Ca2+, disparando la activación masiva y excesiva de cascadas intracelulares que conducen a la transmisión de la sensación de dolor (2,8). De hecho, se ha descrito que los antagonistas de estos receptores son capaces de producir analgesia (12-17). De lo expuesto se deduce que una estrategia para prevenir o aminorar la algesia es controlar la actividad funcional de los receptores ionotrópicos de glutamato, específicamente, los presentes en las neuronas nociceptoras.

Por tanto, parece ser que el nocireceptor VR1 y los receptores ionotrópicos de glutamato son dianas terapéuticas importantes para controlar eficientemente el dolor periférico.

A pesar del avance realizado en los últimos años, todavía no se han desarrollado inhibidores de receptores neuronales implicados en la transmisión del dolor que sean analgésicos potentes, selectivos y carentes de toxicidad. Gran parte del esfuerzo realizado hasta el momento ha estado en desarrollar opioides que reconozcan a los receptores opiáceos del sistema nervioso central (1,2). Estas moléculas, aunque potentes analgésicos, presentan importantes efectos secundarios, tales como adicción, tolerancia, anomalías cognitivas, etc., que limitan su uso clínico (17,18). También se ha realizado un esfuerzo importante para desarrollar antagonistas competitivos y no competitivos de glutamato y/o glicina [un coagonista que participa en la activación del receptor de glutamato activado por N-metil-D-aspartato (NMDA)]. Estos inhibidores se han mostrado eficaces y potentes mitigando la sensación de dolor pero han presentado una utilidad clínica restringida debido, de nuevo, a los efectos secundarios que presentan (10). La desventaja fundamental de usar antagonistas competitivos y no competitivos es que estas moléculas interaccionan con sus receptores inhibiendo la neurotransmisión inespecíficamente, y afectando tanto a la actividad patológica del glutamato como a su actividad fisiológica (10). Una estrategia para superar este obstáculo terapéutico es usar antagonistas no competitivos y/o acompetitivos que se unen preferentemente al complejo agonista- receptor. La ventaja mas importante de utilizar estos antagonistas es que estos agentes actúan fundamentalmente sobre receptores hiperactivados (receptores patológicos), mostrando una interacción marginal sobre receptores que funcionan en procesos de neurotransmisión excitadora rápida (receptores fisiológicos) (10). Esta actividad preferente sobre los receptores Apatológicos_ hace que estos tipos de antagonistas estén valorados como agentes terapéuticos prometedores para prevenir la

transmisión del dolor (10-16). Moléculas como la fenciclidina y la dizolcipina son antagonistas acompetitivos potentes del receptor de NMDA que actúan como neuroprotectores eficaces in vitro (10,14-16). Sin embargo, su uso clínico está cuestionado por los efectos psicotomiméticos (10).

Sigue existiendo, por tanto, la necesidad de buscar productos capaces de aminorar y/o tratar la sensación de dolor periférico que superen los inconvenientes previamente mencionados.

La invención proporciona una solución a la necesidad existente que comprende el desarrollo de unos péptidos ricos en aminoácidos básicos capaces de bloquear la respuesta a sustancias químicas y estímulos térmicos o mediadores de la inflamación de los nociceptores, preferentemente inhibiendo al nocireceptor VR1 y los receptores ionotrópicos de L-glutamato.

Por tanto, un objeto de esta invención lo constituye un péptido capaz de bloquear la respuesta a sustancias químicas o estímulos térmicos o mediadores de la inflamación de los nociceptores.

Un objeto adicional de esta invención lo constituye una composición que comprende dicho péptido, tal como una composición farmacéutica o una composición cosmética. El empleo de dicho péptido en la elaboración de dicha composición constituye otro objeto adicional de esta invención.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La invención proporciona un péptido de fórmula general (I) aal-X-aa2 (I) donde aal representa el resto del aminoácido del extremo amino; aa2 representa el resto del aminoácido del extremo carboxilo; y X representa un resto de 2 a 8 aminoácidos, iguales o

diferentes, contenidos entre aal y aa2, y sus sales farmacéuticamente aceptables, con la condición de que, al menos, 3 de los aminoácidos presentes en la secuencia son básicos, y, al menos, 1 de los aminoácidos presentes en la secuencia es un aminoácido aromático.

El péptido de fórmula (I), en ocasiones denominado en esta descripción como péptido de la invención, tiene una longitud de 4 a 10 aminoácidos, preferentemente, de 5 a 8 aminoácidos, más preferentemente, 6 aminoácidos.

Los aminoácidos que constituyen las unidades estructurales del péptido de fórmula (I) pueden ser aminoácidos naturales o sintéticos, e incluyen tanto los aminoácidos más habituales en las proteínas, como los aminoácidos modificados y menos frecuentes en las proteínas.

Los aminoácidos presentes en el péptido de fórmula (I) pueden tener la configuración D o L.

Los aminoácidos de los extremos amino (aal) y carboxilo (aa2) pueden ser iguales o diferentes.

El aminoácido del extremo amino (aal) puede tener el grupo amino terminal acetilado, mientras que el aminoácido del extremo carboxilo (aa2) puede tener el grupo carboxilo terminal amidado.

Por tanto, la presente invención también incluye derivados del péptido de fórmula (I) en los que el extremo amino terminal está acetilado y/o en los que el extremo carboxilo terminal está amidado.

Entre los aminoácidos más habituales en las proteínas se encuentran alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Entre los aminoácidos modificados y menos frecuentes en las proteínas se encuentran, por ejemplo, el ácido 2-aminoadípico, ácido ácido2-aminobutírico,ácido4-ß-alanina, aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 3-aminoisobutírico,ácido2-ácido

aminopimélico, citrulina, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2, 3-diaminopropiónico, N- etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, homocisteína, homoserina, isodesmosina, N- metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metillisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina y ornitina. Esta relación de aminoácidos es ilustrativa, no limitativa.

En el sentido utilizado en esta descripción, el término Aaminoácidos basics-se refiere a los aminoácidos que tienen un punto isoeléctrico (pI) superior a 7, por ejemplo, arginina (pI : 10,76) y lisina (pI : 9,74), preferentemente, arginina.

Análogamente, el término Aaminoácido aromático-se refiere a los aminoácidos que contienen, al menos, un anillo aromático, tal como, fenilalanina, tirosina y, preferentemente, triptófano.

El péptido de fórmula (I) proporcionado por esta invención debe contener, al menos, 3 aminoácidos básicos, iguales o diferentes, colocados en cualquier posición de la secuencia, incluyendo los extremos amino y carboxilo, y pueden estar juntos o separados por otros aminoácidos. Asimismo, el péptido de fórmula (I) debe contener, al menos, 1 aminoácido aromático, el cual puede estar presente en cualquier posición de la secuencia.

La presencia de los aminoácidos básicos junto con el aminoácido aromático parece ser necesaria para que el péptido de fórmula (I) se comporte como un potente bloqueador del nocireceptor VR1 y de los receptores ionotrópicos de glutamato, al bloquear el canal iónico de dichos receptores.

Dentro del alcance de esta invención se encuentran las sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos de fórmula (I) proporcionados por esta invención. El término Asales farmacéuticamente aceptables-incluye las sales habitualmente utilizadas para formar sales metálicas o sales de adición de ácidos o bases libres. La naturaleza de la sal no es crítica, siempre y cuando sea farmacéuticamente aceptable. Las sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos de fórmula (I) pueden obtenerse a partir de ácidos o bases, orgánicos o

inorgánicos. Dichas sales pueden obtenerse por métodos convencionales bien conocidos por los técnicos en la materia haciendo reaccionar el ácido o la base apropiados con el péptido de fórmula (I).

En una realización particular de esta invención [véase el Ejemplo 1], el péptido de fórmula (I) tiene una secuencia de 6 aminoácidos seleccionada del grupo formado por las secuencias mostrada en SEC. ID. NI : 1, SEC. ID. NI : 2 y SEC. ID. NI : 3 [véase el apartado relativo a la LISTA DE SECUENCIAS]. Como puede apreciarse, el péptido mostrado en la SEC. ID. NI : 1 [Arg-Arg- Arg-Arg-Trp-Trp] tiene 4 restos de arginina consecutivos, uno de los cuales constituye el resto del extremo amino terminal (aal), y 2 restos de triptófano, uno de los cuales constituye el extremo carboxilo terminal (aa2). El péptido mostrado en la SEC. ID. NI : 2 [Arg-Arg-Trp-Trp-Ile-Arg] tiene 3 restos de arginina, uno de los cuales constituye el resto del extremo amino terminal (aal) y otro constituye el resto del extremo carboxilo terminal (aa2), y un resto de triptófano. Asimismo, el péptido mostrado en la SEC. ID. NI : 3 [Arg-Tyr-Tyr-Arg-Arg-Trp] tiene 3 restos de arginina y 3 restos de aminoácidos aromáticos (2 Tyr y 1 Trp), uno de los restos de Arg constituye el resto del extremo amino terminal (aal) mientras que el resto de Trp constituye el resto del extremo carboxilo terminal (aa2).

Adicionalmente, el péptido de la invención puede sufrir modificaciones reversibles con el fin de aumentar su biodisponibilidad y facilidad de paso de la barrera hematoencefálica y tejido epitelial.

El péptido de fórmula (I) puede obtenerse por técnicas convencionales, bien mediante el empleo de la tecnología del ADN recombinante, o bien mediante técnicas de síntesis química de péptidos, preferentemente por esta última via debido al pequeño tamaño de los péptidos. En general, dichos péptidos se sintetizan químicamente mediante métodos convencionales de síntesis en fase sólida y se purifican mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC). Los péptidos se analizan, por ejemplo,

mediante espectrometría de masas.

Péptidos de fórmula (I) son capaces de bloquear la actividad del canal iónico característica del nocireceptor VR1 <BR> <BR> <BR> <BR> expresado en ovocitos de rana Xenopus laevis (X. laevis). Además, se ha observado que los péptidos ensayados [véase el Ejemplo 1] no se comportan como antagonistas competitivos del ligando capsaicina.

La capacidad de los péptidos de fórmula (I) para bloquear el canal iónico del nocireceptor VR1 expresado en ovocitos de X. laevis se puede demostrar mediante un ensayo que evalúa la potencia de dichos péptidos bloqueando la corriente iónica activada por agonista en ovocitos de X. laevis que expresan receptores neuronales, tales como el nocireceptor VR1 [véase el Ejemplo 1.2] y receptores ionotrópicos de glutamato (19,20). Una ventaja importante de este ensayo biológico es que permite la búsqueda de antagonistas en receptores funcionalmente activos, incrementando la potencialidad de su uso in vivo.

La capacidad de los péptidos de fórmula (I) para evaluar su eficacia analgésica se puede demostrar mediante un ensayo que consiste en determinar el efecto dichos péptidos sobre la respuesta electrofisiológica de las fibras nerviosas sensoriales nociceptoras que inervan la córnea del gato anestesiado, tal como se describe detalladamente en Belmonte et al. (6). Brevemente, el método consiste en la disección de los nervios ciliares que inervan la córnea, en finos filetes nerviosos, hasta localizar e identificar por estimulación eléctrica una única unidad aferente.

La fibra aislada se somete a estudios electrofisiológicos que comprenden la determinación de la localización y extensión del campo receptor, la medida de la velocidad de conducción, y la exploración de su quimio-sensibilidad a la capsaicina, y el umbral de termosensibilidad y mecanosensibilidad. Determinados todos estos parámetros y caracterizada electrofisiológicamente la fibra sensorial aferente, se procede a estudiar su modulación por los distintos antagonistas del nocireceptor VR1.

Debido al papel central del nocireceptor VR1 en la

integración de las vías de dolor, una consecuencia de la actividad bloqueadora de los péptidos de fórmula (I) es el desarrollo potencial de una nueva familia de analgésicos. Es más, los resultados obtenidos parecen indicar que los péptidos de fórmula (I), por la potencia bloqueadora del nocireceptor VR1 que manifiestan, son firmes candidatos a constituir una nueva generación de analgésicos.

Los péptidos de fórmula (I) son, por tanto, útiles como bloqueadores del canal iónico del nocireceptor VR1 y de los receptores ionotrópicos de glutamato per se, por lo que dichos péptidos son adecuados para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas mediadas por la actividad o función de los canales iónicos de los nocireceptores VR1 y de los receptores ionotrópicos de glutamato, por ejemplo, la sensación de dolor en respuesta a diversos estímulos nocivos (mecánicos, químicos y térmicos) Los péptidos de la invención pueden formar parte de diversos tipos de composiciones para su aplicación en el cuerpo de un mamífero, preferiblemente el ser humano. En este sentido, la invención proporciona una composición que comprende un péptido de fórmula (I). En una realización particular, dicha composición es una composición farmacéutica, mientras que en otra realización particular, dicha composición es una composición cosmética.

La composición farmacéutica proporcionada por esta invención comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de fórmula (I) junto con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los péptidos de la invención pueden administrarse para tratar la algesia por cualquier medio que produzca el contacto del péptido con el sitio de acción del mismo en el cuerpo de un mamífero, preferiblemente el hombre.

La cantidad de péptido terapéuticamente eficaz que debe administrarse así como su dosificación para tratar un estado patológico con los péptidos y/o composiciones farmacéuticas de la invención dependerá de numerosos factores, incluyendo la edad,

estado del paciente, la severidad de la alteración o trastorno, la ruta y frecuencia de administración y del péptido particular a utilizar.

Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de fórmula (I) pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida, liquida, semisólida, gel, pomada, crema o pasta, y pueden administrarse por cualquier via apropiada, por ejemplo, por via oral, parenteral, rectal o tópica, para lo cual incluirán los excipientes farmacéuticamente aceptables necesarios para la formulación de la forma de administración deseada. Una revisión de las distintas formas farmacéuticas de administración de medicamentos y de los excipientes necesarios para la obtención de las mismas puede encontrarse, por ejemplo, en el ATratado de Farmacia Galénica-, C. Faulí i Trillo, 1993, Luzán 5, S. A. Ediciones, Madrid.

Por tanto, un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de los péptidos de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento para la atenuación de la actividad nerviosa de las neuronas sensoriales primarias implicadas en las sensaciones de dolor evocadas por la aplicación de sustancias químicas exógenas o por estímulos térmicos o por la liberación endógena de sustancias por tejidos inflamados, o en la elaboración de un medicamento que inhibe los canales iónicos que se activan por sustancias químicas exógenas o por estímulos térmicos o por mediadores de inflamación que conducen a la sensación de dolor.

De forma más concreta, la invención se refiere al empleo de un péptido de fórmula (I) en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de enfermedades y alteraciones patológicas mediadas por la acitividad de los canales iónicos de los nocireceptores VR1 y de los receptores ionotrópicos de glutamato, por ejemplo, la sensación de dolor en respuesta a un estímulo nocivo.

En una realización particular, la composición farmacéutica de la invención es adecuada para el tratamiento de quemaduras

superficiales y se presenta en forma de una pomada para su aplicación tópica, de tipo similar a las comercializadas con las marcas Halibut7 o Positon7.

La invención proporciona, además, un método para el tratamiento en un paciente de enfermedades y alteraciones patológicas mediadas por la actividad de los canales iónicos de los nocireceptores VR1 y de los receptores ionotrópicos de glutamato, por ejemplo, la sensación de dolor mediada por el nocireceptor VR1 y los receptores ionotrópicos de glutamato en respuesta a diversos estímulos nocivos, por ejemplo, mecánicos, químicos y térmicos, que comprende administrar a dicho paciente que padece dicha enfermedad o alteración patológica una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de fórmula (I), preferiblemente, en forma de una composición farmacéutica que lo contiene.

La composición cosmética proporcionada por esta invención comprende una cantidad cosméticamente eficaz de un péptido de fórmula (I) junto con al menos un excipiente o adyuvante cosméticamente aceptable.

Los péptidos de la invención pueden administrarse en composiciones cosméticas para calmar, reducir, atenuar o aliviar el dolor o la irritación cutánea producida por estímulos térmicos, por ejemplo, exposición al sol, mecánicos, por ejemplo, depilaciones, afeitado, o químicos, poco agresivos. La composición cosmética de la invención puede presentarse en cualquier forma adecuada para permitir el contacto del péptido con el sitio de acción del mismo en el cuerpo del mamífero sobre el que se aplica.

La cantidad de péptido a administrar depende de numerosos factores, entre los que se encuentra el grado de dolor o irritación producido por los estímulos térmico, mecánico o delpéptidoautilizar.químico,y Las composiciones cosméticas que contienen los péptidos de fórmula (I) pueden presentarse en cualquier forma de administración, por ejemplo, sólida, liquida, semisólida, gel,

pomada, crema o pasta, y pueden administrarse por cualquier via apropiada, preferentemente por via tópica, para lo cual incluirán los excipientes o adyuvantes cosméticamente aceptables adecuados para la forma de presentación de la composición cosmética. En una realización particular, la composición cosmética que comprende un péptido de fórmula (I) es un producto para después de tomar el sol, por ejemplo, una crema, pomada o loción Aaftersun, adecuada para reducir, calmar las molestias producidas por las quemaduras solares debidas a la exposición solar. En otra realización particular, la composición cosmética de la invención es un producto para después del afeitado, por ejemplo, una crema, bálsamo o loción para después del afeitado, que resulta adecuada para calmar, reducir, atenuar o aliviar el dolor o la irritación cutánea producida por estímulos mecánicos (afeitado). En otra realización particular, la composición cosmética de la invención es un producto para después del depilado, por ejemplo, una crema, pomada o loción para después del depilado, que resulta adecuada para calmar, reducir, atenuar o aliviar el dolor o la irritación cutánea producida por la depilación. Una revisión de las distintas formas de presentación de composiciones cosméticas y de los excipientes o adyuvantes necesarios para su obtención puede encontrarse, por ejemplo, en ACosmetología Teórico-Práctica-, Prof. A. del Pozo, publicado por el Consejo General de Colegios Oficiales de Edición,1985.30 Por tanto, un objeto adicional de esta invención lo constituye el empleo de los péptidos de fórmula (I) en la elaboración de una composición cosmética adecuada para calmar, reducir, atenuar o aliviar el dolor o la irritación cutánea producida por estímulos térmicos, mecánicos o químicos.

La invención proporciona, además, un método cosmético para calmar, reducir, atenuar o aliviar el dolor o la irritación cutánea producida por estímulos térmicos, mecánicos o químicos en un mamífero, preferiblemente el ser humano, que comprende administrar a dicho mamífero una cantidad eficaz de un péptido de fórmula (I), preferiblemente, en forma de una composición

cosmética que lo contiene.

Por otra parte, un requisito fundamental para identificar moléculas bioactivas es disponer de un ensayo que permita determinar su actividad biológica sobre las dianas terapéuticas.

El solicitante ha desarrollado un ensayo biológico que permite evaluar la potencia de moléculas que bloquean la corriente iónica activada por agonista en ovocitos de X. laevis que expresan receptores neuronales, tales como el nocireceptor VR1 y receptores glutamatérgicos (19,20). Una ventaja importante de este ensayo biológico es que permite la búsqueda de antagonistas en receptores funcionalmente activos, incrementando la potencialidad de su uso in vivo.

Los métodos de expresión heteróloga de receptores en ovocitos de X. laevis han sido descritos con detalle por Ferrer- Montiel y Montal (19).

Por tanto, la invención también proporciona, además, un ensayo biológico para identificar antagonistas acompetitivos del nocireceptor VR1, adecuado como ensayo de cribado (screening) de alto rendimiento para cribar quimiotecas combinatorias de diversidad química variada, así como moléculas aisladas.

Este ensayo comprende poner en contacto ovocitos de X. laevi que expresan el nocireceptor VR1 con un agonista (ligando) para dicho nocireceptor VR1, por ejemplo, capsaicina, en presencia o en ausencia del compuesto a ensayar, manteniendo el voltaje transmembrana constante a-80 mV, y detectar la actividad inhibitoria de dicho compuesto a ensayar midiendo la corriente iónica activada por el agonista en presencia y en ausencia del compuesto a ensayar. La potencia y eficacia de la actividad inhibitoria del compuesto a ensayar se puede determinar mediante la obtención de las curvas dosis-respuesta. Para ello, se examina la magnitud del bloqueo de la corriente iónica activada por la capsaicina en ovocitos de X. laevi que expresan el nocireceptor VR1 en presencia de concentraciones crecientes del compuesto a ensayar. La relación de intensidades de corriente iónica en presencia y ausencia del compuesto a ensayar permite obtener

curvas dosis-respuesta (19,20). Estas gráficas se pueden ajustar a funciones logarítmicas para determinar el bloqueo máximo (potencia) y la concentración de antagonista que produce la mitad del bloqueo máximo (IC50, eficacia).

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención y no deben ser considerados en sentido limitativo de la misma.

EJEMPLO 1 Péptidos capaces de bloquear el nocireceptor VR1 1.1 Síntesis de péptidos Se han sintetizado los péptidos mostrados en SEC. ID. NI : 1, SEC. ID. NI : 2 y SEC. ID. NI : 3 mediante métodos convencionales de síntesis de péptidos en fase sólida. Los péptidos resultantes se purificaron por HPLC y se analizaron por espectrometría de masas.

1.2 Evaluación de la actividad biológica Para evaluar la actividad biológica de los péptidos obtenidos en el Ejemplo 1.1 se desarrolló un ensayo que evalúa la potencia de dichos péptidos con que bloquean la corriente iónica activada por agonista en ovocitos de X. laevis que expresan el nocireceptor VR1.

La expresión heteróloga de receptores en ovocitos de X. laevis puede llevarse a cabo según el procedimiento descrito por Ferrer-Montiel y Montal (19). Brevemente, los ovocitos de ranas adultas X. laevis se recogen, manipulan, e inyectan con cDNA que codifica el nocireceptor VR1 (5,19). Las corrientes iónicas activadas por el agonista capsaicina se registran con la técnica de mantenimiento del voltaje constante con dos microelectrodos (two-microelectrode voltage clamp) (19,20). Los ovocitos que expresan el nocireceptor VR1 se transfieren a la cámara de registro y se perfunden utilizando un sistema de perfusión de 8 salidas. La capsaicina en ausencia y presencia de los péptidos se disuelve en tampon de Ringer (Hepes 10 mM pH 7,4, NaCl 100 mM,

BaCl2 0,1 mM, MgCl2 2,0 mM, KCl 3,0 mM) suplementado con ácido flufenámico 100 pM (19,20). Esta disolución tamponada se utiliza para minimizar la contribución del canal iónico endógeno de cloruro activado por calcio a la corriente iónica del nocireceptor VR1 (19,20). El voltaje transmembrana se mantiene constante a-80 mV, y las corrientes iónicas se activan aplicando pulsos de la disolución de capsaicina (20 H. M) en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de los péptidos. La actividad inhibitoria se detecta midiendo la corriente iónica activada por el agonista en presencia y ausencia de los péptidos.

La potencia y eficacia de la actividad inhibitoria de los péptidos se determina mediante la obtención de las curvas dosis- respuesta. Para ello, se examina la magnitud del bloqueo de la corriente iónica activada por la capsaicina en ovocitos que expresan el nocireceptor VR1 en presencia de concentraciones crecientes de los péptidos. La relación de intensidades de corriente iónica en presencia y ausencia de los péptidos se utiliza para obtener curvas dosis-respuesta (19,20). Estas gráficas se ajustan a funciones logarítmicas para determinar el bloqueo máximo (potencia) y la concentración de antagonista que produce la mitad del bloqueo máximo (ICso, eficacia).

Los resultados obtenidos pusieron de manifiesto que los 3 péptidos ensayados (Ejemplo 1.1.) bloquearon la actividad del canal iónico característico del nocireceptor VR1 expresado en ovocitos de rana X. laevis. Las concentraciones de péptido que inhibieron la mitad de la respuesta de VR1 (ICso) activada por capsaicina a una concentración de 20 gM fueron aproximadamente 100 nM para el péptido identificado como SEC. ID. NI : 1, aproximadamente 2 µM para el péptido identificado como SEC. ID.

NI : 2, y aproximadamente 10 µM para el péptido identificado como SEC. ID. N1 : 3.

Adicionalmente se observó que dichos péptidos no se comportaron como antagonistas competitivos del ligando capsaicina.

Dado el papel del nocireceptor VR1 en la integración de las vias de dolor, una consecuencia de la actividad bloqueadora de estos péptidos es su empleo como analgésicos. Los resultados obtenidos indican que péptidos ricos en aminoácidos básicos (3 o más restos) junto con, al menos, un aminoácido aromático, pueden actuar como potentes bloqueadores del nocireceptor VR1.

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