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Title:
PEPTIDES FOR INHIBITING THE INTERACTION OF PROTEIN KINASE A AND PROTEIN KINASE A ANCHOR PROTEINS
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2006/000213
Kind Code:
A2
Abstract:
The invention relates to a nucleic acid sequence that codes for peptides which inhibit the interaction of protein kinase A (PKA) and protein kinase A-anchor proteins (AKAP), a host organism, which has the nucleic acid sequence and, optionally, expresses the peptides. The invention also relates to the use of the peptides and of the host organism when studying diseases, which are associated with the AKAP PKA interaction, and to the use of the peptides as a pharmaceutical agent for treating diseases of this type.

Inventors:
KLUSSMANN ENNO (DE)
ROSENTHAL WALTER (DE)
HUNDSRUCKER CHRISTIAN (DE)
Application Number:
PCT/DE2005/001181
Publication Date:
January 05, 2006
Filing Date:
June 29, 2005
Export Citation:
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Assignee:
FORSCHUNGSVERBUND BERLIN EV (DE)
KLUSSMANN ENNO (DE)
ROSENTHAL WALTER (DE)
HUNDSRUCKER CHRISTIAN (DE)
International Classes:
C07K14/47
Foreign References:
DE10306085A12004-03-25
Other References:
ALBERTS ET AL., MOLEKULARBIOLOGIE DER ZELLE, 2004, pages 8,73,79,150
RÖMPP, BIOTECHNOLOGIE UND GENTECHNIK, 1999, pages 45 FF
RÖMPP, LEXIKON BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE, 2000, pages 28
Attorney, Agent or Firm:
LANGE, Sven (54/55 Kurfürstendamm, Berlin, DE)
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Claims:
Patentansprüche
1. Proteinkinase A/Proteinkinase A-Ankerprotein- Entkoppler, dadurch gekennzeichnet, dass die Entkoppler entweder (i) von einem AKAP185 oder (ii) von einem von AKAPl8δ verschiedenem Protein abgeleitet sind und gemäß (i) mindestens 8 H-Brücken bildende Aminosäuren oder gemäß (ii) die allgemeine Formel (1) aufweisen XXXXXXXXX[AVLISξ]XX[AVLIF] [AVLI]XX[AVLI] [AVLIF]xx[AVLISE]XXXX (1) , wobei X eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren sein kann.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend
a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID Nr. 1 - 39,
b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten Bedingungen hybridisiert,
c) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid¬ sequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,
d) ein Nukleinsäuremolekül,' das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder
d) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer■Nukleotidsequenz gemäß ä)' bis d) ist. 3. Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die unter c) angegebene Nukleotidsequenz mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % homolog zu einer der unter a) angegebenen Nukleotidsequenz ist .
4. Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es eine genomische DNA, eine cDNA und/oder eine RNA ist.
5. Vektor umfassend, ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4.
6. Wirtszelle umfassend den Vektor gemäß Anspruch 5.
7. Organismus umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5 und/oder' eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6.
8. Organismus nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus eine transgene Maus oder Ratte ist, wobei die Maus oder Ratte ■ vorzugsweise durch das Vorhandensein des Nukleinsäuremoleküls gemäß einem der Ansprüche 2 bis■ 4, des Vektors gemäß Anspruch 5 und/oder der Wirtszelle gemäß Anspruch 6 Diabetes insipidus entwickelt.
9. Polypeptid, kodiert durch ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4. 10. Polypeptid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass a) das Polypeptid eine Aminosäureseguenz nach SEQ ID 1 bis 39 umfasst, b) das Polypeptid nach a) durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu- einem Polypeptid nach a) ist und/oder c) das Polypeptid ein Polypeptid umfasst, das eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einem Polypeptid nach a)oder b) funktionsanalog zu sein.
11. Erkennungsmolekül ' gerichtet gegen . ein • Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, einen Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6 und/oder ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10.
12. Erkennungsmolekül nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisense-Konstrukt ist, insbesondere ein RNA-Inter- ferenzmolekül.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder ein Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12, gegebenenfalls mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass diese ein Aquaretika ist.
15. Kit, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, ein Vektor gemäß Anspruch 5, eine Wirtszelle gemäß Anspruch 6, ein Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10, ein .Erkennungsmolekül gemäß einem der Ansprüche 11 oder 12 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 umfasst.
16. Verfahren' zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition einer AKAP.-PKA-Interaktion umfassend die Schritte a) Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6 und/oder eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10 und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation an einer regulatorischen RII-Untereinheit der' PKA erfolgt.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die RII-Untereinheiten RIIa- und/oder Rllß-Untereinheiten sind. 19.. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der .Ansprüche 2 bis 4, eines Vektors nach Anspruch 5, einer Wirtszelle nach Anspruch 6, eines . Organismus nach Anspruch 7 oder 8, eines Polypeptids nach Anspruch 1, 9 oder 10, eines Erkennungsmoleküls nach Anspruch 11 oder 12, einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 und/oder eines Kits- nach Anspruch 15 zur Modifikation, insbesondere- einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion.
20. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet,' dass die Interaktion in einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus durchgeführt wird.
21. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Organismus nach Anspruch 7 oder 8 als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP-PKA-Inter¬ aktion verwendet wird, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus.
22. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Modifikation die Vasopressin-induzierte ' Umverteilung von AQPII modifiziert wird, insbesondere verhindert wird.
23. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid gemäß Anspruch 1, 9 oder 10 und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 13 oder 14 als Wasserverlust-verursachende Mittel eingesetzt werden, insbesondere' als Aquaretika. 24. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Interaktion der RIIa- oder RII/3-Untereinheiten des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert wird.
25. Verwendung nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Untereinheiten humanem oder murinem Ursprungs sind.
Description:
Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase' A-Ankerproteinen (AKAP) inhibieren, einen Wirtsorganismus, der die Nukleinsäuresequenz umfasst und die erfindungsgemäßen Peptide exprimiert sowie die Verwendung der Peptide sowie des Wirtsorganismus bei der Therapie und experimentellen Untersuchung von Krankheiten, die mit einer modifizierten AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind sowie die Verwendung der Peptide als pharmazeutisches Mittel für die Behandlung solcher Krankheiten, insbesondere Diabetes insipidus, Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus.

Die biologische Wirkung von Hormonen und Neurotransmittern wird über die Aktivierung von Signalkaskaden, welche den Phosphorylierungsstatus von Effektorproteinen verändern, vermittelt. An diesem reversiblen Prozess sind zwei Klassen von Enzymen' beteiligt: Proteinkinasen und Phosphoproteinphosphatasen. Die Phosphorylierung erfolgt durch Kinasen, welche die übertragung der endständigen Phosphatgruppe von ATP auf spezifische Serin- oder Threoninreste katalysieren, die Dephosphorylierung wird durch Phosphoproteinphosphatasen vermittelt. Ein Mechanismus zur Kontrolle und Regulation dieser Enzymaktivitäten ist die Kompartimentierung dieser Enzyme durch die Assoziation mit Ankerproteinen, die in der Nähe ihrer Substrate lokalisiert sind. Die Proteinkinase A (PKA) ist eine der multifunktionellen Kinasen mit einer breiten Substratspezifität, welche durch die so genannten protein kinase A anchoring proteins (AKAPs) an subzellulären Strukturen verankert wird.

Bei vielen wichtigen zellulären Prozessen wie Kontraktion, Sekretion, Stoffwechsel, Gentranskription, Zellwachstum und -teilung erfolgt die Weiterleitung extrazellulärer Signale über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, das G-Protein Gs, Aktivierung einer Adenylylzyklase und Bildung des secondmessenger zyklischen Adenosinmonophosphats (cAMP) . Die Effekte von cAMP werden durch die cAMP-abhängige PKA vermittelt.

Das Proteinkinase A (PKA) -Holoenzym besteht aus einem Dimer regulatorischer (R) Untereinheiten, an die jeweils eine katalytische (C) Untereinheit gebunden ist. Die Aktivierung der Kinase durch die Bindung von zwei Molekülen cAMP an jede R-Untereinheit induziert die Dissoziation der C-Untereinheiten, die die in ihrer Nähe befindlichen Substrate phosphorylieren. Entsprechend dem Vorhandensein von Typ I (RI) oder Typ II (RII) regulatorischen Untereinheiten wird das PKA-Holoenzym als Typ I- oder Typ II-PKA bezeichnet. Bei den RI-Untereinheiten existieren Rice und RI/3, bei den RII-Untereinheiten RIIa und RII/? und bei den C-Untereinheiten Coi, Cß und Cγ. Die unterschiedlichen PKA-Untereinheiten werden von verschiedenen Genen kodiert (Klussmann, 2004; Tasken und Aandahl, 2004) .

Die regulatorischen • Untereinheiten zeigen ein unterschiedliches Expressionsmuster. Während RIa und RIIa ubiquitär in den Geweben vorkommen, ist die regulatorische Untereinheit RIß in erster Linie im Gehirn zu finden.

Die Assoziation der beiden R-Untereinheiten mit intrazellulären Kompartimenten wird durch AKAPs vermittelt. Bei den Ankerproteinen handelt es sich um eine Gruppe funktionell verwandter Moleküle, die durch die Interaktion mit Typ I bzw. Typ II der regulatorischen Untereinheiten (RI bzw. RII) des PKA-Holoenzyms charakterisiert sind. Die ersten Ankerproteine wurden bei der affinitätschromatographischen Reinigung der R- Untereinheiten über cAMP-Sepharose isoliert. Diese assoziierten Proteine zeigten auch nach Transfer auf eine Nitrozellulosemembran eine RII-Bindung. Auf dieser Beobachtung beruht auch die gebräuchlichste Methode (RII-overlay) zur Detektion von AKAPs. Es handelt sich hierbei um einen modifizierten Western Blot, bei dem statt eines primären Antikörpers radioaktiv markierte RII-Untereinheiten als Sonde eingesetzt werden.

Zur funktionellen Bedeutung der RI-AKAP-Interaktion ist noch wenig bekannt. Auch wenn RIa hauptsächlich zytosolisch lokalisiert ist, zeigen verschiedene Studien eine Verankerung in vivo. Dabei scheint die dynamische Verankerung der Rlα-Untereinheiten im Gegensatz zur statischen Verankerung der RII-Untereinheiten von entscheidender Bedeutung für die Zelle zu sein. So wurde die Assoziation der RI-Untereinheiten mit der Plasmamembran von Erythrozyten und aktivierten T-Lymphozyten beschrieben. Bei der cAMP-vermittelten Inhibition der T-ZeIl- Proliferation durch die PKA Typ I könnte die Lokalisation des Enzyms möglicherweise auch durch AKAPs vermittelt werden. In knockout-Mäusen, die im Skelettmuskelgewebe keine regulatorischen Untereinheiten Typ II exprimieren, binden die Rlα-Untereinheiten an ein mit Kalziumkanälen assoziiertes AKAP und erhalten so die normale, cAMP- abhängige Kanalleitfähigkeit durch die korrekte Verfügbarkeit der katalytischen Untereinheiten der PKA.

In vivo konnte weiterhin gezeigt werden, dass die katalytischen Untereinheiten in der Zelle bevorzugt mit den RII-Untereinheiten assoziieren und Typ I-PKA-Holoenzym gebildet wird, wenn die Menge der freien katalytisehen Untereinheiten die Menge der freien RII-Untereinheiten übersteigt.

Die Spezifität in der PKA-Verankerung wird durch die targeting-Domäne erreicht, ein Strukturmotiv, das im Gegensatz zu der anchoring-Oomäne weder in der Sequenz noch in der Struktur der AKAPs konserviert ist. So werden AKAPs durch Protein-Protein-Interaktionen an strukturelle Elemente in der Zelle und durch Protein-Lipid-Interaktionen an Membranen verankert.

In der Literatur sind verschiedene AKAPs beschrieben, die mit unterschiedlichen zellulären Kompartimenten assoziieren, so zum Beispiel mit den Zentrosomen, den Mito- chondrien, dem endoplasmatischen Retikulum und dem Golgi-Apparat, der Plasma- und Kernmembran und mit Vesikeln.

Die genauen Mechanismen der Verankerung sind bisher nur für einige AKAPs bekannt. So wird das herzmuskelspezifische Ankerprotein mAKAP durch eine Region mit drei spektrinartigen Wiederholungssequenzen an der perinukleären Membran der Kardiomyozyten verankert. Zwei Isoformen der AKAP15/18 werden durch Lipidmodifikationen (Myristoylierung und Palmitoylierung) an der Plasmamembran verankert. Drei polybasische Regionen in der targeting-Domäne des AKAP79 sind an der Lokalisation des Proteins an der inneren postsynaptischen Membran (PSD, postsynaptic density) beteiligt.

Die AKAPs wurden zuerst durch die Interaktion mit der PKA charakterisiert. Einige dieser Proteine können jedoch auch andere an der Signaltransduktion beteiligte Enzyme binden. Durch die gleichzeitige Verankerung von Enzymen, die gegensätzliche ' Reaktionen katalysieren, wie zum Beispiel Kinasen und Phosphatasen, können diese, auch als scaffolding (gerüstbildende) Proteine bezeichneten AKAPs ganze Signalkomplexe in der Nähe bestimmter Substrate lokalisieren und so zur Spezifität und Regulation der zellulären Antwort auf extrazelluläre Signale beitragen. AKAP79 war das erste AKAP, für das die Interaktion mit mehreren Enzymen nachgewiesen werden konnte. Dieses Protein bindet die Proteinkinase A, die Proteinkinase C und die Proteinphosphatase Calcineurin (PP2B) , wobei jedes Enzym in gebundenem Zustand inhibiert ist. Da unterschiedliche Signale für die Aktivierung jedes einzelnen Enzyms notwendig sind, können an dieser Stelle verschiedene second messenger wie cAMP, Kalzium und Phospholipide zusammentreffen. Weitere Beispiele sind das AKAP220, welches die PKA und die Proteinphosphatase PPl an den Peroxisomen lokalisiert und das AKAP Yotiao, das neben der PKA ebenfalls die Proteinphosphatase ■ PPl bindet. Das AKAP CG-NAP bindet nicht nur die PKA und die Proteinphosphatase PPl, sondern auch noch, die Rho-abhängige Kinase PKN (NGF (nerve growth factor) -aktivierte Proteinkinase) und die Proteinphosphatase PP2A.

Auch andere Proteine können mit AKAPs assoziieren, so bindet Ezrin, ein Mitglied der zytoskelett-assoziierten ERM-Familie Ezrin/ Radixin und Moesin, das als AKAP identi¬ fiziert wurde, an ein Protein (EBP50/NHERF) , welches an der Regulation des Natrium-Protonen-Transportes in der apikalen Membran von Epithelzellen beteiligt ist. AKAPs vermitteln die Modulation der Leitfähigkeit der Ionenkanäle durch die Lokalisation der Proteinkinasen und -Phosphatasen in der Nähe bestimmter Kanaluntereinheiten, die wahrscheinlich durch Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert werden. Die Aktivität des NMDA-Rezeptors wird durch das AKAP Yotiao, welches auch die Proteinphosphatase PPl bindet, moduliert. Die in gebundenem Zustand aktive Phosphatase limitiert die Kanalleitfähigkeit des NMDA-Rezeptors, bis die PKA durch cAMP aktiviert wird und den Ionenkanal oder ein assoziiertes Protein phosphoryliert, wodurch die Leitfähigkeit rapide ansteigt. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass myristoylierte Ht31-Peptide, die die Interaktion zwischen PKA und ■ AKAP inhibieren, die cAMP- abhängige Inhibition der Interleukin 2-Transkription in Jurkat-T-Zellen aufheben und dass S-Ht31-Peptide die Spermienmotilität einschränken.

Auch bei den wichtigen komplexen biologischen Prozessen, wie die durch das Hormon GLP-I {glucagon-like peptide) -ver¬ mittelte Verstärkung der Insulinsekretion in den ß-Zellen des Pankreas und in RINm5F-Zellen (klonale ß-Zelllinie der Ratte) sind AKAPs beteiligt. Die Aktivierung der PKA durch GLP-I führt zur Phosphorylierung von L-Typ-Kalziumkanälen und begünstigt die Exozytose von Insulin aus sekretorischen Granula. Die Ht31-Peptid-vermittelte Inhibition der PKA-Verankerung führte zu einer deutlichen Verringerung der Insulinsekretion. Dabei wurden weder die cAMP-Bildung noch die Aktivität der katalytischen Untereinheiten der PKA durch die Peptide beeinflusst. Weiterhin konnte nach Expression des wildtypischen AKAPISCK in RINm5F-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen, welche AKAP18a nicht exprimierten, eine Erhöhung der Insulinsektretion nach GLP-I-Applikation nachgewiesen werden..

Die vom antidiuiretischen Hormon Arginin-Vasopressin (AVP) - abhängige Umverteilung des Wasserkanals Aquaporin-2 aus intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran von HauptZeilen des renalen Sammelrohres, die molekulare Basis der Vasopressin-vermittelten Wasserrückresorption, ist ein weiteres Beispiel für einen Prozess, der die Interaktion der PKA ■ mit AKAP-Proteinen erfordert (Klussmann et al. , 1999) . Wird die Interaktion, unterbunden, kann die Umverteilung nicht stattfinden. Die Interaktion spielt jedoch auch bei zahlreichen "anderen Vorgängen in einer Vielzahl unterschiedlicher. Zelltypen eine wichtige Rolle, zum Beispiel erhöht die Interaktion die Herzmuskelkontraktilitat (Hulme et al . , 2003) .

Um die Wirkung der PKA-AKAP-Interaktion zu analysieren, ist es erforderlich, die Interaktion effizient und selektiv zu modifizieren, insbesondere zu inhibieren bzw. zu entkoppeln. Derzeit steht für die Entkopplung der PKA von AKAP-Proteinen ein Ht31 Peptid zur Verfügung.' Das Peptid Ht31 kann an Stearat gekoppelt werden, um membranpermeabel vorzuliegen. Das Pepdid Ht31 entkoppelt PKA und AKAP jedoch in einer Weise, die für viele Untersuchungen oder gar für eine therapeutische Verwendung nicht ausreichend ist. Vor allem ist das Peptid Ht31 nicht in der Lage, selektiv mit den regulatorischen Untereinheiten RIIa oder RIIß der PKA zu interagieren, so dass die Bedeutung' der Untereinheiten für ausgewählte Prozesse nicht analysiert werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, die genannten Nachteile zu überwinden und insbesondere neue Nukleinsäuresequenzen bereitzustellen, die für Peptide kodieren, die die Interaktion von AKAP und PKA effizient und spezifisch modifizieren, insbesondere entkoppeln und die weiterhin als überexpremierende Stoffe in Wirtsorganismen eingesetzt werden können, um mit Hilfe dieser Wirtsorganismen - bei¬ spielsweise von Mäusen - modellhaft Krankheiten zu analysieren, die mit der AKAP-PKA-Interaktion assoziiert sind, vorzugsweise Diabetes insipidus, aber auch Ulcus duodeni, Hypertonie und Diabetes mellitus. Die vorliegende Erfindung löst dieses technische Problem durch die Bereitstellung einer isolierten Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend

a) ein Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleotid- sequenz kodierend mindestens eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe umfassend SEQ ID Nr. 1 - 39,

b) ein Nukleinsäuremolekül, welches mit einer Nukleotidsequenz gemäß a) unter stringenten ■Bedingungen hybridisiert,

c) ein Nukleinsäuremolekül, ■ umfassend eine Nukleotidsequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) oder b) funktionsanalog zu sein,

d) ein Nukleinsäuremolekül, das infolge des genetischen Codes zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) - c) degeneriert ist und/oder

e) ein Nukleinsäuremolekül gemäß einer Nukleotidsequenz nach a) - d) , welches durch Deletionen, Additionen, Substitutionen, Translokationen, Inversionen und/oder Insertionen modifiziert und funktionsanalog zu einer Nukleotidsequenz gemäß a) bis d) ist.

Es war überraschend, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen eingesetzt werden können, um Peptide gemäß Tab. 1 ■ (SEQ ID Nr. 1 - 39) zu kodieren, die die Wechselwirkung von AKAP und PKA modifizieren, vorzugsweise inhibieren, besonders bevorzugt entkoppeln. Mit Vorteil eignen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur Kodierung von Peptiden, die selektiv an regulatorische Untereinheiten der PKA binden, insbesondere an RIICH bzw. RI1/3. Weiterhin ermöglichen es die - durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodierten - Peptide, eine Modifizierung, Inhibition bzw. Entkopplung von AKAP und PKA in Abhängigkeit der verwendeten Spezies vorzunehmen. Die Nukleinsäuremoleküle bzw. die aus diesen abgeleiteten Peptide '.eignen sich mit Vorteil zur Herstellung transgener Organismen, beispielsweise von Mäusen, in denen die AKAP-PKA-Interaktion gewebs- und/oder zellspezifisch modifiziert ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz, die eine ausreichende Homologie aufweist, um zu einer. Nukleotidsequenz funktionsanalog zu sein, zumindest zu 40 % homolog. Im Sinne der Erfindung heißt, um zu den genannten Nukleinsäuresequenzen bzw. den mit diesen Nukleinsäuresequenzen hybridisierenden Sequenzen funktionsanalog zu sein, dass die kodierten homologen Strukturen eine effiziente und selektive Entkoppelung der PKA-AKAP-Interaktion ermöglichen und eine hohe Affinität für die Bindung an RII-Untereinheiten von PKA besitzen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung weist das Nukleinsäuremolekül. mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, bevorzugt 80 %, ganz besonders bevorzugt 90 % Homologie zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen auf.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül eine genomische DNA und/oder eine RNA; besonders bevorzugt ist das Nukleinsäuremolekül eine cDNA.

Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül umfasst. Weiterhin betrifft die Erfindung auch eine Wirtszelle, die den Vektor umfasst. Die Erfindung . betrifft auch ein Polypeptid, das durch mindestens ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kodiert wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Polypeptid eine Aminosäures.equenz nach SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 39, bzw. mindestens ein Polypeptid gemäß dieser Sequenzen. Die Erfindung ' betrifft auch ein Polypeptid, welches durch Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertion modifiziert ist und funktionsanalog zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39. ist und/oder ein Polypeptid, welches ein Polypeptid umfasst, das eine auseichende Homologie aufweist,um zu einem Polypeptid nach SEQ ID Nr. 1 bis 39 oder deren Mutationen (Deletion, Addition, Substitution, Translokation, Inversion und/oder Insertionen) funktionsanalog zu sein.

Folgende erfindungsgemäße Peptide sind besonders bevorzugt:

SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLYENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt) SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L304T) SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L308D) SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY • (AKAP18ö-L314E) SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP185-P) SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18ö-PP) SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos) SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI) SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr..20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVDLYL SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE SEQ ID Nr. 31 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS SEQ ID Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA , SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind entweder (i) von AKAP18 (delta) abgeleitet (SEQ ID Nr. 1 bis 7) oder aber (ii) von Proteinen, die nicht mit AKAP-Molekülen assoziiert sind (SEQ ID Nr.. 8 bis 39) .

Gemeinsam ist den Peptiden gemäß (i) :

Akapl8δ-wt AKAP185-L304T AKAP18ö-L314E Akapl8δ-RI

dass sie die RIIalpha Untereinheiten der PKA so stark wie kein anderes, von natürlichen AKAPs abgeleitetes Peptid binden. Dies wird von uns durch die Bindung über Wasserstoffbrücken (H-Brücken) zwischen Peptid und RII- dimer erklärt (s. Abb. Wasserstoffbrücken durch gestrichelte Linien dargestellt) . Entsprechend ist den Peptiden die Mindestanzahl (8) an H-Brücken bildenden Aminosäuren gemein.

Die folgenden Peptide sind ebenfalls von AKPA18 (delta) abgeleitet, zeichnen sich jedoch dadurch aus, daß sie trotz hoher Aminosäureähnlichkeit keine RII-Untereinheiten der PKA binden (Negativkontrollen; notfalls kann auf eine Patentierung verzichtet werden) . Gemein ist ihnen, daß sie aufgrund struktureller (1,2) oder aufgrund von Ladungsunterschieden (3,4) nicht mehr binden.

1 AKAP18δ-P 2 AKAP185-PP 3 AKAP185-L308D 4 AKAP18δ-phos

Die erfindungsgemäßen Peptide, die von anderen Proteinen als AKAPs abgeleitet sind, besitzen eine definierte Größe, die überraschenderweise zu der Fähigkeit der Peptide, eine Interaktion zwischen AKAP und PKA zu modifizieren, beiträgt, da sie die Affinität der Peptide zu den RII (alpha) Untereinheiten der PKA beeinflusst . Die Peptide bestehen aus 25 Aminosäuren und sind dem gemäß 25mere. Werden die Peptide so ausgewählt, dass die kürzer oder länger sind (z.B. 17mere) , wird ihre Aktivität hierdurch geändert. Das gemeinsame strukturelle Merkmal der Länge der Peptide definiert zusammen mit dem funktionellen Merkmal der AKäP/PKA-Entkopplung die erfindungsgemäßen Strukturen. Diese erfindungsgemäßen Peptide sind charakterisiert durch die allgemeine Formel:

xxxxxxxxx[AVLISE]xx[AVLIFJ [AVLI]xx[AVLI] [AVLIF]xx[AVLISE]xx XX

wobei x eine beliebige Aminosäure repräsentiert; insbesondere ist durch- x dabei repräsentiert jeweils eine beliebige der 20 biogenen Aminosäuren (im Ein-Buchstaben- Code dargestellt • sind dies: A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, ' R, S, T, V,- W, Y) . Beansprucht ist jede Aminosäure, die im Alberts et al . (2004) Molekularbiologie der Zelle, S. 8, 73, 79 ff., 150 ff. oder 1717G, im Römpp (1999) Biotechnologie und Gentechnik, S. 45 ff, bzw. im Römpp (2000) Lexikon Biochemie und Molekularbiologie, S. 28 ff, oder in einem anderen Standardwerk der Biologie offenbart ist. Diese besonders bevorzugten Peptide besitzen entweder eine positiv geladene Aminosäure (H, K oder R)- in erster oder zweiter Position (Position ist die Nummer . der Aminosäure vom N-terminus) oder Leucin in den Positionen 19, 18 oder 14 oder Serin in Position 4.

Ein funktionsanaloges Peptid ist ein Peptid, das in der Lage ist, die PKA-AKAP-Interaktion zu modifizieren, bevorzugt zu entkoppeln.

Die Erfindung betrifft auch einen Organismus, der ein erfάndungsgemäßes Nukleinsäuremolekül überexprimiert bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor umfasst und/oder ein erfindungsgemäßes Polypeptid aufweist . Hierbei kann es sich zum Beispiel um eine transgene Maus oder Ratte bzw. um ein Rind, Pferd, Esel, Schaf, Kamel, Ziege, Schwein, Kaninchen, Meerschwein, Hamster, Katze, Affe oder Hund handeln, in der gewebs- und/oder zellspezifisch die PKA-AKAP-Interaktion gestört ist. Derartige Organismen, beispielsweise Mäuse, können insbesondere verwendet werden1, um Pharmaka zu entwickeln, die die PKA-AKAP-Interaktion modifizieren, bevorzugt entkoppeln.

Mittels der erfindungsgemäßen Organismen können auch in vivo Stoffwechselprozesse untersucht werden, bei denen die PKA-AKAP-Interaktion eine Rolle spielt oder bei denen geklärt werden soll, ob bei einem bestimmten Ereignis die AKAP-PKA-Interaktion involviert ist..

Bevorzugt handelt es sich bei dem Organismus um eine transgene Maus, die das stark bindende Peptid AKαP185-L304T oder AKAP18δ-L314E spezifisch in den Hauptzellen von Sammelrohren der Niere überexprimiert.. Vorteilhafterweise führt die Entkoppelung der PKA von AKAP-Proteinen dazu, dass in primär kultivierten Sammelrohrzellen die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2 verhindert wird, wodurch die Tiere insbesondere einen Diabetes insipidus aufweisen. Diese Erkrankung zeichnet sich durch großen Wasserverlust (Polyurie) aus, den beispielsweise humane Patienten durch ' die Aufnahme größerer Mengen Flüssigkeit zu kompensieren versuchen (Polydipsie) .

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen transgenen Organismen kann beispielsweise untersucht werden, wie die Entkoppelung der PKA bzw. von ausgewählten Untereinheiten von AKAP-Proteinen als therapeutisches Prinzip angesehen und genutzt werden kann. In der Folge derartiger Untersuchungen können dann vorteilhafterweise optimierte Substanzen (Pharmaka) analysiert werden, die ebenso wirken. Derart optimierte Substanzen wirken bevorzugt als Aquaretika und können daher mit Vorteil bei Patienten mit ödemen, beispielsweise bei Herzinsuffizienz oder bei Lebercirrhose, eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Erkennungsmolekül, das gegen das Nukleinsäuremolekül, den Vektor, die Wirtszelle und/oder das Polypeptid gerichtet ist. Erkennungssubstanzen im Sinne der Erfindung sind Moleküle, die mit den genannten Strukturen wie Nukleinsäuremolekülen oder -Sequenzen, Vektoren, Wirtszellen und/oder Polypeptiden bzw. deren Fragmenten wechselwirken können; insbesondere so wechselwirken, dass eine Detektion bzw. eine Manipulation dieser Strukturen möglich ist. Die Erkennungssubstanzen können insbesondere spezifische Nukleinsäuren sein, die an die genannten Nukleinsäuremoleküle oder Polypeptide binden, wie zum Beispiel Antisense-Konstrukte, cDNA oder mRNA- Moleküle bzw. deren Fragmente, aber auch Antikörper, Fluoreszenzmarker, markierte Kohlenhydrate oder Lipide bzw. Chelatoren. Es ist selbstverständlich auch möglich, dass die Erkennungssubstanzen nicht Proteine oder Nukleinsäuren bzw. Antikörper sind, sondern gegen diese gerichtete Antikörper. Die Erkennungssubstanzen können in solch einem Fall insbesondere sekundäre Antikörper sein.

In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Erkennungsmolekül ein Antikörper, ein Antikörperfragment und/oder ein Antisensekonstrukt, insbesondere ein RNA-Interferenzmolekül .

Die Antikörper im Sinne der Erfindung binden die erfin¬ dungsgemäßen Peptide spezifisch. Die Antikörper können auch modifizierte Antikörper sein (zum Beispiel oligomere, reduzierte, oxidierte und markierte Antikörper) . Der in der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriff Antikörper umfasst sowohl intakte Moleküle als auch Antikörper- Fragmente, wie Fab, F(ab')2 und Fv, die bestimmte Epitop- Determinanten der Polypeptide binden können. Bei diesen Fragmenten ist die Fähigkeit des Antikörpers zur selektiven Bindung seines Antigens oder Rezeptors teilweise erhalten geblieben, wobei die Fragmente wie folgt definiert sind:

(1) Fab, das Fragment, das ein monovalentes Antigen- bindungsfragment eines Antikörper-Moleküls enthält, lässt sich mittels Spaltung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Papain erzeugen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil einer schweren Kette erhalten werden;

(2) das Fab' -Fragment eines Antikörper-Moleküls lässt sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit Pepsin und anschließender Reduktion gewinnen, wobei eine intakte leichte Kette und ein Teil der schweren Kette erhalten werden; pro Antikörper-Molekül werden zwei Fab' -Fragmente erhalten;

(3) F(ab')2, das Fragment des Antikörpers, das sich mittels Behandlung eines ganzen Antikörpers mit dem Enzym Pepsin ohne anschließende Reduktion erhalten lässt; F(ab')2 ist ein Dimer von zwei Fab' -Fragmenten, die durch zwei Disulfid-Bindungen zusammengehalten werden;

(4) Fv, definiert als gentechnisch verändertes Fragment, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält und in Form von zwei Ketten exprimiert wird; und (5) Einzelketten-Antikörper ("SCA") , definiert als gentechnisch verändertes Molekül, das den variablen Bereich der leichten Kette und den variablen Bereich der schweren Kette enthält, die durch einen geeigneten Polypeptid-Linker zu einem genetisch fusionierten Einzelketten-Molekül verbunden sind.

Die Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül, den erfindungsgemäßen Vektor, die erfindungsgemäße Wirtszelle, das errfindungsgemäße Polypeptid und/oder das erfindungsgemäße Erkennungsmolekül, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die pharmazeutische Zusammensetzung ein Aquaretika. Aquaretika im Sinne der Erfindung modifizieren die Wechselwirkung zwischen PKA und AKAP-Proteinen, insbesondere entkoppeln sie die Wechselwirkung zwischen diesen beiden. Selbstverständlich ist es auch möglich, die erfindungsemäßen Erkennungsmoleküle als pharmazeutische Zusammensetzung einzusetzen, insbesondere die, die gegen das erfindungsgemäße Peptid oder die kodierende Nukleinsäure gerichtet sind.

Insbesondere die die erfindungsgemäßen Peptide, die erfindungsgemäßen Vektoren oder die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können bevorzugt bei Patienten mit ödemen, insbesondere bei Herzinsuffizienz oder Leberzirrhose eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Vektoren bzw. Nukleinsäuremoleküle können im Sinne der Erfindung als pharmazeutische Zusammensetzung auf der Nukleinsäureebene eingesetzt werden, wohingegen die erfindungsgemäßen Peptide, aber zum Teil auch die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, auf der .Aminosäureebene eingesetzt werden können. Je nachdem, ob die Therapie in der Entkoppelung von AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Peptide - bzw. ' in der Verhinderung der Entkoppelung zwischen AKAP und PKA - z.B. mittels der erfindungsgemäßen Antikörper gerichtet gegen die Peptide - besteht, kann der Fachmann bevorzugt die erfindungsgemäßen Peptide bzw. die erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküle, die zum Beispiel gegen diese Peptide oder andere Strukturen gerichtet sind, als pharmazeutische Zusammensetzung verwenden. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind insbesondere für die Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar uns somit beispielsweise bei ödemen. Die erfidnungsgemäßen Erkennungsmoleküle (z.B. Antikörper) sind insbesondere bei der Verhinderung der Entkoppelung von AKAP/PKA einsetzbar z.B. bei Diabetes insipidus.

Selbstverständlich ist es möglich, dass die erfindungs¬ gemäßen Peptide übliche Hilfsstoffe, bevorzugt Träger, Adjuvantien und/oder Vehikel umfassen. Bei den Trägern kann es sich beispielsweise um Füllmittel, Streckmittel, Binde¬ mittel, Feuchthaltemittel, Sprengmittel, Lösungsverzögerer, Resorptionsbeschleuniger, Netzmittel, Adsorptionsmittel .und/oder Gleitmittel handeln. In diesem Fall wird das Peptid insbesondere als Arzneimittel oder pharmazeutisches Mittel bezeichnet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das erfindungsgemäße Mittel als Gel, Puder, Pulver, Tablette, Retard-Tablette, Premix, Emulsion, Aufguss- formulierung, Tropfen, Konzentrat, Granulat, Sirup, Pellet, BoIi, Kapsel, Aerosol, Spray und/oder Inhalat zubereitet und/oder in dieser Form angewendet. Die Tabletten, Dragees, Kapseln, Pillen und Granulate können mit den üblichen, gegebenenfalls Opakisierungsmitteln enthaltenden, überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt sein, dass sie den oder die Wirkstoffe nur oder bevorzugt in einem • bestimmten Teil des Intestinaltraktes gegebenenfalls verzögert abgeben, wobei als Einbettungsmassen zum Beispiel Polymersubstanzen und Wachse verwendet werden können.

Die Arzneimittel dieser Erfindung können beispielsweise zur oralen Verabreichung in einer beliebigen oral verträglichen Dosierungsform verwendet werden, die Kapseln, Tabletten und wässrige Suspensionen und Lösungen einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesium- stearat, werden auch typischerweise zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform schließen verwendbare Verdün¬ nungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen oral verabreicht werden, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können bestimmte Süßmittel und/oder Ge¬ schmacksstoffe und/oder Farbmittel zugesetzt werden.

Der oder die Wirkstoffe können gegebenenfalls mit einem oder mehreren der oben angegebenen Trägerstoffe auch in mikroverkapselter Form vorliegen.

Suppositorien können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen wasserlöslichen oder wasserunlöslichen Träger¬ stoffe enthalten, zum Beispiel Polyethylenglycole, Fette, zum Beispiel Kakaofett und höhere Ester (zum Beispiel Ci4-Alkohol mit Ci6-Fettsäure) oder Gemische dieser Stoffe) .

Salben, Pasten, Cremes und Gele können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Bei¬ spiel tierische und pflanzliche Fette, Wachse, Paraffine, Stärke, Tragant, Cellulosederivate, Polyethylenglycole, Silikone, Bentonite, Kieselsäure, Talkum und Zinkoxid oder Gemische dieser Stoffe.

Puder und Sprays können neben dem oder den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe enthalten, zum Beispiel Milchzucker, Talkum, Kieselsäure, Aluminiumhydroxid, Calciumsilikat und Polyamidpulver oder Gemische dieser Stoffe. Sprays können zusätzlich die üblichen Treibmittel, zum Beispiel Chlor¬ fluorkohlenwasserstoffe, enthalten.

Lösungen und Emulsionen können neben den Wirkstoffen CHP und Gemcitabin die üblichen Trägerstoffe wie Lösungsmittel, Lösungsvermittler und Emulgatoren, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylen- glykol, Dimethylformamid, öle, insbesondere Baumwollsaatöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Ricinusδl und Sesamöl, Glycerin, Glycerinformal, Tetrahydofurfurylalkohol, Poly¬ ethylenglycole und Fettsäureester des Sorbitans oder Ge¬ mische dieser Stoffe enthalten. Zur parenteralen Appli¬ kation können die Lösungen und Emulsionen auch in steriler und blutisotonischer Form vorliegen.

Suspensionen können neben den Wirkstoffen die üblichen Trägerstoffe wie flüssige Verdünnungsmittel, zum Beispiel Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, Suspendiermittel, zum Beispiel ethoxilierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylen- sorbit- und Sorbitan-Ester, mikrokristalline Cellulose, Aluminiummetahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant oder Gemische dieser Stoffe enthalten.

Die Arzneimittel können in Form einer sterilen injizier¬ baren Zubereitung, zum Beispiel als sterile injizierbare wässrige oder ölige Suspension, vorliegen. Diese Suspension kann auch mit im Fachgebiet bekannten Verfahren unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel (wie zum Beispiel Tween 80) und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Mannit, Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösung. Außerdem werden üblicher¬ weise sterile, nichtflüchtige öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein belie¬ biges mildes nichtflüchtiges öl einschließlich syntheti¬ scher Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie ölsäure und ihre Glyceridderivate sind bei der Her¬ stellung von Injektionsmitteln verwendbar, wie es natür¬ liche pharmazeutisch verträgliche öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, insbesondere in ihren polyoxyethylierten Formen sind. Diese öllösungen oder Suspensionen können auch einen langkettigen Alkohol oder einen ähnlichen Alkohol enthalten als Verdünnungs- oder Dispergiermittel.

Die genannten Formulierungsformen können auch Färbemittel, Konservierungsstoffe sowie geruchs- und geschmacksverbes¬ serte Zusätze, zum Beispiel Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßmittel, zum Beispiel Saccharin, enthalten. Die erfindungsgemäßen Peptide sollen in den aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen vorzugsweise in einer Kon¬ zentration von etwa 0,01 bis 99,9, vorzugsweise von etwa 0,05 bis 99 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein.

Die aufgeführten pharmazeutischen' Zubereitungen können außer dem Peptid oder Strukturhomologen - z.B. Peptiden mit D-Aminosäuren - .oder Funktiohsanalogen - z.B. Peptidmimetika - weitere pharmazeutische Wirkstoffe enthalten. Die Herstellung der oben aufgeführten pharma¬ zeutischen. Zubereitungen erfolgt in üblicher Weise nach bekannten Methoden, zum Beispiel durch Mischen des oder der Wirkstoffe mit dem oder den Trägerstoffen.

Die genannten Zubereitungen können' bei Mensch und Tier ent¬ weder oral, rektal, parenteral (intravenös, intramuskulär, subkutan) , intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, lokal (Puder, Salbe, Tropfen) und zur Therapie der genannten Krankheiten angewendet werden. Als geeignete Zubereitung kommen Injektionslösungen, Lösungen und Suspensionen für die orale Therapie, Gele, Aufgussformulierungen, Emulsionen, Salben oder Tropfen in Frage. Zur lokalen Therapie können ophtalmologische und dermatologische Formulierungen, Silber- und andere Salze, Ohrentropfen, Augensalben, Puder oder Lösungen verwendet werden. Bei Tieren' kann die• Aufnähme auch über das Futter oder Trinkwasser in geeigneten Formulierungen erfolgen. Ferner können die Arzneimittel oder die Kombinationsmittel in andere Trägermaterialien wie zum Beispiel Kunststoffe, (Kunststoffketten zur lokalen Therapie) , Kollagen oder Knochenzement eingearbeitet werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Peptide in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5, bevorzugt von 0,5 bis 95, besonders bevorzugt von 20 bis 80 Gew.-% in einer pharmazeutischen Zubereitung eingebracht. Das heißt, die Peptide sind in den oben aufgeführten pharmazeutischen Zubereitungen, zum Beispiel Tabletten, Pillen, Granulaten und anderen, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,1 bis 99,5 Gew.-% der Gesamtmischung in einem bestimmten Verhältnis vorhanden. Die Wirkstoffmenge, das heißt die Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung, die mit den Trägermaterialien kombiniert wird, um eine einzige Dosierungsform zu erzeugen, wird von dem Fachmann in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Patienten und der besonderen Verabreichungsart variieren können. Nach Besserung des Zustandes des Patienten kann der Anteil der wirksamen Verbindung in der Zubereitung so geändert werden, dass eine Erhaltungsdosis vorliegt, die die Krankheit zum Stillstand bringt. Anschließend kann die Dosis oder Frequenz der Verabreichung oder beides als Funktion der Symptome auf eine Höhe verringert werden, bei der der verbesserte Zustand beibehalten wird. Wenn die Symptome auf das gewünschte Niveau gelindert worden sind, sollte die Behandlung aufhören. Patienten können jedoch eine Behandlung mit Unterbrechung auf Langzeitbasis nach beliebigem Wiederauftreten von ErkrankungsSymptomen benötigen. Demgemäß ist der Anteil der Verbindungen, das heißt ihre Konzentration, in der Gesamtmischung der pharmazeutischen Zubereitung ebenso wie ihre Zusammen¬ setzung oder Kombination variabel und kann vom Fachmann aufgrund seines Fachwissens modifiziert und angepasst wer¬ den.

Dem Fachmann ist bekannt, dass die erfindungsgemäßen Peptide mit einem Organismus, bevorzugt ■ einem Menschen oder einem Tier, auf verschiedenen Wegen in Kontakt gebracht werden können. Weiterhin ist dem Fachmann bekannt, dass insbesondere die pharmazeutischen Mittel in verschiedenen Dosierungen appliziert werden können. Die Applikation sollte hierbei so erfolgen, dass die Erkrankung möglichst effektiv bekämpft wird bzw. der Ausbruch einer solchen Krankheit in einer prophylaktischen Gabe verhindert wird. Die Konzentration und die Art der Applikation können vom Fachmann durch Routineversuche eruiert werden. Bevorzugte Applikationen der erfindungsgemäßen Verbindungen sind die orale Applikation in Form von Pulver, Tabletten, Saft, Tropfen, Kapseln oder ähnlichem, die rektale Applikation in Form von Zäpfchen, Lösungen und ähnlichem, parenteral in Form von Injektionen, Infusionen und Lösungen sowie lokal in Form von Salben, Pflastern, Umschlägen, Spülungen und ähnlichem. Bevorzugt erfolgt das In-Kontakt-Bringen der er¬ findungsgemäßen Verbindungen prophylaktisch oder therapeu¬ tisch.

Die Eignung der gewählten Applikationsformen wie auch der Dosis, des Applikationsschemas, der Adjuvantswahl und der¬ gleichen kann beispielsweise durch Entnahme von Serum-Alliquoten aus dem Patienten, d.h. dem Mensch oder dem Tier, und dem Testen auf ■ das Vorhandensein von Krankheitsindikatoren im Verlauf des Behandlungsprotokolls bestimmt werden. Alternativ und begleitend hierzu kann der Zustand der Niere, aber auch die Menge von T-Zellen oder anderen Zellen des Immunsystems, auf herkömmliche Weise begleitend bestimmt werden, um einen Gesamtüberblick über die immunologische Konstitution des Patienten und insbesondere die Konstitution von stoffwechselwichtigen Organen, zu erhalten. Zusätzlich kann der klinische Zustand des Patienten auf die gewünschte Wirkung hin beobachtet werden. Wenn eine unzureichende therapeutische Effektivität erzielt wird, . kann der Patient mit erfindungsgemäßen Mitteln ggf. mit anderen bekannten Medikamenten modifiziert weiterbehandelt werden, von denen eine Verbesserung der Gesamtkonstitution erwartet werden kann. Selbstverständlich ist es auch' möglich, die Träger oder Vehikeln des pharmazeutischen Mittels zu modifizieren oder den Verabreichungsweg zu variieren.

Neben der oralen Aufnahme kann es dann zum Beispiel vor¬ gesehen sein, dass Injektionen beispielsweise intramuskulär oder subkutan oder in die Blutgefäße ein weiterer bevor¬ zugter Weg für die therapeutische Verabreichung der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen sind. Zeitgleich kann auch die Zufuhr über Katheter oder chirurgische Schläuche angewendet werden; beispielsweise über Katheter, die direkt zu bestimmten Organen wie den Nieren führen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in einer bevorzugten Ausführungsform in einer Gesamtmenge von bevorzugt 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht je 24 Stunden eingesetzt werden, bevorzugt von 5 bis 100 mg/kg Körpergewicht. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um eine therapeutische Menge, die verwendet wird, um die Symptome einer Störung oder respon-siven, pathologisch physiologischen Kondition zu verhindern oder zu verbessern.

Selbstverständlich wird die Dosis vom Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Empfängers, dem Grad der Krankheit, der Art einer notwendigen gleichzeitigen Behandlung, der Häufigkeit der Behandlung und der Art der gewünschten Wir¬ kungen und der Nebenwirkungen abhängen. Die tägliche Dosis von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht kann einmalig oder mehrfach angewendet werden, um die gewünschten Ergebnisse zu erhalten. Typischerweise werden insbesondere pharmazeu¬ tischen Mittel zur etwa 1- bis 10-maligen Verabreichung pro Tag oder alternativ oder zusätzlich als kontinuierliche In¬ fusion verwendet. Solche Verabreichungen können als chronische oder akute Therapie angewendet werden. Die Wirkstoffmengen, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden, um eine einzelne Dosierungsform zu erzeugen, können in Abhängigkeit von dem zu behandelnden Wirt und der besonderen Verabreichungsart selbstverständlich variieren. Bevorzugt ist es, die Targetsdosis auf 2 bis 5 Appli¬ kationen zu verteilen, wobei bei jeder Applikation 1 bis 2 Tabletten mit einem Wirkstoffgehalt von 0,05 bis 500 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Selbstverständlich ist es möglich, den Wirkstoffgehalt auch höher zu wählen, bei¬ spielsweise bis zu einer Konzentration bis 5000 mg/kg. Die Tabletten können auch retardiert sein, wodurch sich die Anzahl der Applikationen pro Tag auf 1 bis 3 vermindert. Der Wirkstoffgehalt der retardierten Tabletten kann 3 bis 3000 mg betragen. Wenn der Wirkstoff - wie ausgeführt - durch eine Injektion verabreicht wird, ist es bevorzugt, 1- bis 10-mal pro< Tag bzw. durch Dauerinfusion den Wirt mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in . Kontakt zu bringen, wobei Mengen von 1 bis 4000 mg pro Tag bevorzugt sind. Die bevorzugten Gesamtmengen pro Tag haben sich in der Humanmedizin und in der Veterinärmedizin als vorteilhaft erwiesen. Es kann erforderlich sein, von den genannten Dosierungen abzuweichen und zwar in Abhängigkeit von der Art und dem Körpergewicht des zu behandelnden Wirts, der Art und der Schwere der Erkrankung, der Art der Zubereitung der Applikation des Arzneimittels sowie dem Zeitraum bzw. dem Intervall, innerhalb welchem die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen bevorzugt sein, den Organismus mit weniger als den genannten Mengen in Kontakt zu bringen, während in anderen Fällen die angegebene Wirkstoffmenge überschritten werden muss. Die Festlegung der jeweils erforderlichen optimalen Dosierungen und der Applikationsart der Wirkstoffe kann durch den Fachmann aufgrund seines Fachwissens leicht erfolgen.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das pharmazeutische Mittel in einer Einzel- gäbe von 1 bis 100, insbesondere von 2 bis 50 mg/kg Kör¬ pergewicht eingesetzt. Wie auch die Gesamtmenge pro Tag kann auch die Menge der Einzelgabe pro Applikation von dem Fachmann aufgrund seines Fachwissens variiert werden. Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können in den ge¬ nannten Einzelkonzentrationen und Zubereitungen zusammen mit dem Futter bzw. mit Futterzubereitungen oder mit dem Trinkwasser auch in der Veterinärmedizin gegeben werden. Eine Einzeldosis enthält vorzugsweise die Menge Wirkstoff, die bei einer Applikation verabreicht wird, und die gewöhn- lieh einer ganzen, einer halben Tagesdosis oder einem Drittel oder einem Viertel einer Tagesdosis entspricht. Die Dosierungseinheiten können demgemäß bevorzugt 1, 2, 3 oder 4 oder mehrere Einzeldosen oder 0,5, 0,3 oder 0,25 einer Einzeldosis enthalten. Bevorzugt wird die Tagesdosis der erfindungsgemäßen Verbindungen auf 2 bis 10 Applikationen verteilt, bevorzugt auf 2 bis 7, besonders bevorzugt auf 3 bis 5 Applikationen. Selbstverständlich ist auch eine Dauerinfusion der erfindungsgemäßen Mittel möglich.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfin¬ dung werden bei jeder oralen Applikation der erfin¬ dungsgemäßen Verbindungen 1 bis 2 Tabletten gegeben. Die erfindungsgemäßen Tabletten können mit dem Fachmann be¬ kannten überzügen und Hüllen versehen sein und auch so zusammengesetzt ■ werden, dass sie den oder die Wirkstoffe nur bei bevorzugten, in einem bestimmten Teil des Wirts freigeben.

Bevorzugt ist es in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung, dass die Peptidabschnitte gegebenenfalls mitein¬ ander assoziiert oder mit einem Träger verbunden in Lipo¬ somen eingeschlossen sind, wobei der Einschluss in Lipo¬ somen im Sinne der Erfindung nicht zwingend bedeuten muss, dass die Peptide im Inneren der Liposomen vorliegen, ein Einschluss im Sinne der Erfindung kann auch bedeuten, dass die Peptide mit der Membran der Liposomen assoziiert sind, beispielsweise so, dass diese auf der äußeren Membran ver¬ ankert sind. Eine solche Darstellung der erfindungsgemäßen Peptide in oder auf den Liposomen ist vorteilhaft, wenn der Fachmann die Liposomen so auswählt, dass sie eine immun¬ stimulierende Wirkung haben. Dem Fachmann sind aus der DE 198 51 282 verschiedene Möglichkeiten bekannt, die im¬ munstimulierende Wirkung von Liposomen zu modifizieren. Bei den Lipiden kann es sich um einfache Lipide handeln, wie beispielsweise Ester und Amide oder um komplexe Lipide wie zum Beispiel um Glycolipide wie Cerebroside oder Ganglio- side, um Sphingolipide oder um Phospholipide.

Beispielsweise ist es möglich, einzelne oder Gruppen von Aminosäuren in den Peptiden auszutauschen, ohne dass die Aktivität der Peptide in Bezug auf die Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe nachteilig beeinflusst wird. Für den Austausch . derartiger Aminosäuren sei auf die entsprechenden Standardwerke der Biochemie und der Genetik verwiesen.

Im Stand der Technik sind verschiedene Möglichkeiten zur Herstellung von Peptiden offenbart. Peptide, die von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend mit solchen Verfahren entwickelt werden, sind von der erfindungemäßen Lehre mit erfasst. Eine Möglichkeit des Generierens von funktions¬ analogen Peptiden ist beispielsweise in PNAS USA 1998, Oct . 13; 9521:12179-84, WO 99/6293 und/oder WO 02/38592 be¬ schrieben; diese Lehren sind in den Offenbarungsgehalt der Erfindung ' mit aufgenommen. Das heißt, sämtliche Peptide, Peptidfragmente oder Strukturen, die Peptide umfassen, die mit den genannten Verfahren - von den erfindungsgemäßen Peptiden ausgehend - generiert werden, sind Peptide im Sin¬ ne der Erfindung, sofern sie die erfindungsgemäße Aufgabe lösen. Die erfidnungsgemäßen Peptide sind auch Leitstrukturen für die Entwicklung von Peptidmimetika.

Dem Fachmann ist weiterhin bekannt, dass einzelne Amino¬ säuren analoge physikochemische Eigenschaften aufweisen, die mit Vorteil dazu führen, dass diese Aminosäuren unter¬ einander ausgetauscht werden können. Hierzu gehören bei¬ spielsweise die Gruppe der Aminosäuren (a) Glycin, Alanin, Valin, Leucin und/oder Isoleucin; bzw. die Aminosäuren (b) Serin und Threonin, die Aminosäuren (c) Asparagin und Glutamin, die Aminosäuren (d) Asparaginsäure und Glutamin¬ säure; die Aminosäuren (e) Lysin und, Arginin sowie die Gruppe der aromatischen Aminosäuren (f) Phenylalanin, Tyrosin und/oder Tryptophan. Aminosäuren innerhalb ein und derselben Gruppe (a-f) können ' untereinander ausgetauscht werden. Weiterhin ist es möglich, dass Aminosäuren durch modifizierte Aminosäuren oder spezifische Enantiomere aus¬ getauscht werden. Weitere Modifikationen sind gemäß der Lehre nach der WO 99/62933 oder WO 02/38592 möglich, die in den Offenbarungsgehalt ' der erfindungsgemäßen Lehre mit aufgenommen sind.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Peptid einen Linker und/oder einen Spacer, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend: ά-Aminocarbonsäuren sowie deren Homo- und Heterooligomere, α,ω-Aminocarbonsäuren sowie deren verzweigte Homo- oder Heterooligomere, sonstige Aminosäuren sowie die linearen und verzweigten Homo- oder Heterooligomere (Peptide) ; Amino-oligoalkoxy-alkylamine; Maleinimidocarbonsäure-Derivate; Oligomere von Alkylaminen; 4-Alkylphenyl-Derivate; 4-Oligoalkoxyphenyl- oder 4-Oligo- alkoxyphenoxy-Derivate; 4-Oligoalkylmercaptophenyl- oder 4-Oligoalkylmercaptophenoxy-Derivate; 4-0ligoalkylamin- phenyl- oder 4-Oligoalkylaminyphenoxy-Derivate; (Oligo- alkylbenzyl) -phenyl- oder 4-01igoalkylbenzyl) -phenoxy- Derivate sowie 4-Oligoalkoxybenzyl) -phenyl- oder 4-Oligo- alkoxybenzyl) -phenoxy-Derivate; Trityl-Derivate; Benzyl- oxyaryl- oder Benzylöxyalkyl-Derivate; Xanthen-3-yl-oxyal- kyl-Derivate; (4-Alkylphenyl)- oder ω- (4-Alkylphenoxy) - alkansäure-Derivate; Oligoalkyl-Phenoxyalkyl- oder Oligo- alkoxy-phenoxyalkyl-Derivate; Carbamat-Derivate; Amine; Trialkylsilyl- oder Dialkyl-alkoxysilyl-Derivate; Alkyl- oder Aryl-Derivate und/oder Kombinationen davon; weitere mögliche Strukturen werden in der EP 1 214 350 beschrieben, die in den Offenbarungsgehalt der Erfindung mit aufgenommen sind.

Bevorzugt können synthetische Peptide oder Fragmente hiervon durch chemische Crosslinker multimerisiert werden oder an ein Trägermolekül wie BSA, Dextran, KLH oder andere gekoppelt werden. Die hierzu verwendeten chemischen Cross¬ linker sind in "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996 aufgelistet, die in den Offenbarungsgehalt der erfindungsgemäßen Lehre mit aufge¬ nommen sind. Bevorzugte Crosslinker sind homobifunktionale Crosslinker, bevorzugt: NHS-Ester, wie DSP, DTSSP, DSS, BS, DST, Sulfo-DST, BSOCOES, SuIfo-BSOCOES, EGS, Sulfo-EGS, DSG oder DSC, homobifunktionale Imidoester, wie DMA, DMP, DMS oder DTBP, homobifunktionale SuIfhydryl-reaktive Cross¬ linker, wie DPDPB, BMH oder BMOE, Difuorobenzenderivate, wie DFDNB oder DFDNPS, homobifunktionale photoreaktive Crosslinker, wie BASED, homobifunktionale Aldehyde, wie Formaldehyd oder Glutaraldehyd, Bis-Epoxide, wie 1,4-Butan- dioldiglycidylether, homobifunktionale Hydrazide, wie Adipinsäuredihydrazide oder Carbohydrazide, Bis-diazonium- derivate, wie o-Tolidin, bisdiazotisiertes Benzidin oder Bisallkylhaloid.

Bevorzugt sind auch heterobifunktionale Crosslinker, ins¬ besondere aminreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie SPDP, LC-SPDP, SuIfo-LC-SPDP, SMPT, Sulfo-LC-SMPT, SMCC, Sulfo- SMCC, MBS, Sulfo-MBS, SIAB, Sulfo-SIAB, SMPB, Sulfo-SMBP, GMBS, Sulfo-GMBS, SIAX, SIAXX, SIAC, SIACX oder NPIA, carbonylreaktive und sulfhydrylreaktive Crosslinker, wie MPBH, M2C2H oder PDPH, aminreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie NHS-ASA, Sulfo-NHS-ASA, Sulfo-NHS-LC-ASA, SASD, HSAB, Sulfo-HSAB, SANPAH, SuIfO-SANPAH, ANB-NOS, SAND, SADP, Sulfo-SADP, Sulfo-SAPB, SAED, Sulfo-SAMCA, p-Nitrophenyldiazopyruvat oder PNP-DTP, Sulfhydryl und photoreaktive Crosslinker, wie ASIB, APDP, Benzophenon-4- iodoacetamid oder Benzophenon-4-maleimid, carbonylreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ABH, carboxylatreaktive und photoreaktive Crosslinker, wie ASBA, argininreaktive Crosslinker, .wie APG, trifunktionale Crosslinker, wie 4- Azido-2-nitrophenylbiozytin-4-nitrophenylester, SuIfo-SEBD, TSAT und/oder TMEA. • •

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die erfindungsgemäßen Peptide und rekombinant hergestellte Strukturen, durch Peptidbrücken mit einer Länge- von 0 bis 50 Aminosäuren verbunden. Dies beinhaltet auch rekombinante Proteine, die aus zwei N-terminalen und einer C-terminalen Sequenz bestehen oder Hexamere bestehend aus drei N-terminalen Sequenzen und drei C-terminalen Sequenzen, oder Multimere der zuvor aufgeführten rekombinanten Strukturen, wobei zwischen den N- und den C- terminalen Sequenzen je eine Peptidbrücke von 0 bis 50 Aminosäuren vorhanden sein kann. Die Peptide können zum Zwecke der ■ Aufreinigung, Solubilisierung bzw. der Konformationsveränderung mit spezifischen Fusionsanteilen entweder am N- oder am ' C-Terminus' versehen sein, wie zum Beispiel CBP (Calmodulin-Bindungsprotein) , His-Tag und/oder andere. ähnliche Konstrukte können auch von DNA, die zum therapieren verwendet wird, kodiert werden.

Die Erfindung betrifft auch einen Kit, der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, einen erfindungsgemäßen' Vektor,' eine erfindungsgemäße Wirtszelle, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, ein erfindungsgemäßes Erkennungsmolekül und/oder eine pharmazeutische Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit einer Information - zum Beispiel einem Beipackzettel oder eine Internetadresse, die auf Homepages mit weiteren Informationen verweist, etc. - über die Handhabung bzw. über die Kombination der Inhalte des Kits umfasst. Die Information zur Handhabung der Inhalte des Kits kann beispielsweise ein Therapieschema für ödeme, Herzinsuffizienz, ■ Leberzirrhose, Hyperinsulinismus, Hypertonie, Ulcus duodeni umfassen. Die Information kann jedoch auch Angaben darüber umfassen, wie die erfindungsgemäßen Stoffe und Erzeugnisse innerhalb einer Diagnose von Krankheiten, die mit der AKAP-PKA-Interaktion oder deren- Entkoppelung assoziiert sind, einzusetzen sind. Der erfindungsgemäße Kit kann auch in der Grundlagenforschung verwendet werden. Innerhalb der Grundlagenforschung ist der Kit bevorzugt einsetzbar, um zu detektieren, ob ein Stoffwechselphänomen mit der Wechselwirkung bzw. mit der nicht vorhandenen Wechselwirkung von AKAP und PKA assoziiert ist . Insbesondere ist es möglich, mit Hilfe des erfindunggemäßen Kits zu bestimmen, welche Untereinheiten von AKAP und/oder PKA für die Interaktion dieser beiden Moleküle oder für das NichtZustandekommen der Interaktion zwischen diesen verantwortlich sind.

Die erfindungsgemäßen ■ Erzeugnisse, wie beispielsweise Peptide, Vektoren, Nukleinsäuremoleküle, können andere vorteilhafte Nukleinsäuren, Aminosäuren, Kohlenhydrate bzw. Lipide umfassen. Es kann beispielsweise bevorzugt sein, dass die Peptide mit einem Fettrest, wie zum Beispiel einem Stearat, so modifiziert werden, dass diese gut membranpermeabel sind. Mit derartigen Peptiden können an Zellkulturen Versuche durchgeführt' werden. Solche Peptide können als Werkzeuge eingesetzt werden, um die PKA besonders effizient von AKAP-Proteinen in Zellen, Zellkulturen, Gewebekulturen, Organkulturen oder Organismen zu entkoppeln. Die Peptide im Sinne der Erfindung werden in Zellkulturen insbesondere zur Beantwortung der Frage herangezogen werden können, ob ein bestimmter Prozess von der Verankerung der PKA an AKAP-Proteine abhängt. Aufgrund der vorteilhaften hohen Affinität für die humanen RIIa- Untereinheiten der PKA eignen sich die erfindungsgemäßen Peptide insbesondere ' für Untersuchungen an humanen Systemen. Durch den Vergleich mit Peptiden, die die PKA mit anderer Affinität binden, werden weiterhin quantitative Aussagen möglich sein, die definieren, bis zu welchem Grad eine PKA-AKAP-Interaktion notwendig ist, um den Ablauf eines physiologischen Prozesses zu gewährleisten. Insbesondere die erfindungsgemäßen Kits können verwendet werden, um diesen Ablauf des physiologischen Prozesses zu studieren. Von Vorteil ist es hierbei, dass die erfindungsgemäßen Peptide, die die RII-Untereinheiten der PKA stärker binden als die typischen PKA-Bindungsdomänen von AKAPlδδ. Da die . erfindungsgemäßen Peptide vorteilhafterweise RIIa- bzw. RII/3-spezifisch sind, können zum Beispiel mit dem Kit , besonders detaillierte Erkenntnisse über die Interaktion gewonnen werden. Die Entkoppelung der einen oder der anderen regulatorischen Untereinheiten der PKA von AKAP-Proteinen kann insbesondere Aufschluss darüber geben, welche PKA, Typllα oder TypII/3, an dem jeweiligen zu untersuchenden Prozess beteiligt ist. Insbesondere- das Peptid AlδδRIIßRnl bindet selektiv RUß Untereinheiten der PKA.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Modifikation, insbesondere eine Inhibition, bevorzugt eine Entkoppelung, einer AKAP-PKA-Interaktion bzw. der Interaktion von AKAP bzw. PKA-Untereinheiten umfassend die Schritte:

a) Bereitstellung eines ■ erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, eines erfindungsgemäßen Vektors, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle und/oder eines erfindungsgemäßen Polypeptids und b) In-Kontakt-Bringen mindestens eines Erzeugnisses gemäß a) mit einer Zelle, einer Zellkultur, einem Gewebe und/oder einem Zielorganismus.

Bevorzugt ist es, dass die Interaktion an einer regulatorischen R-Untereinheit analysiert bzw. modifiziert wird, besonders bevorzugt an einer Rllα- und/oder RII/3- Untereinheit.

Die Erfindung betrifft auch ' die Verwendung eines erfindungsgemäßen Nukleinmbleküls, einer erfindungsgemäßen Wirtszelle, eines erfindungsgemäßen Organismus, eines erfindungsgemäßen Polypeptids, eines erfindungsgemäßen Erkennungsmoleküls, einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und/oder eines erfindungsgemäßen Kits zur Modifikation, insbesondere einer Inhibition, einer AKAP-PKA-Interaktion. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von Bruchstücken oder Teilbereichen . der erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren. Weiterhin kann' es vorgesehen sein, die erfindungsgemäßen Peptide oder Nukleinsäuren um weitere Aminosäuren oder Nukleotide zu erweitern. Selbstverständlich ist es auch möglich, die Peptide mit Lipid- oder Kohlenhydrat-Strukturen zu modifizieren.

In . einer bevorzugten 'Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Zelle.- beispielsweise als Zellkultur - oder der Organismus als Modell für die gewebs- und/oder zellspezifische AKAP- PKA-Interaktion verwendet, insbesondere als Modell für Diabetes insipidus. ■ Weitere bevorzugte Modelle sind Zellkulturen, oder Gewebe, die erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle oder Peptide umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird durch die AKAP-PKA-Modifikation die Vasopressin-induzierte Umverteilung von AQP2 modifiziert, insbesondere verhindert.

In einer weiteren besonders' bevorzugten Ausführungsform werden das Polypeptid und/oder die pharmazeutische Zusammensetzung als Wasserverlust-verursachende Mittel verwendet, insbesondere als Aquaretika.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, insbesondere der erfindungsgemäßen Verwendung, wird die Interaktion der Rllce- oder RIIß-Untereinheit des PKA mit AKAP modifiziert, insbesondere inhibiert.

In einer weiteren bevorzugten. Verwendung sind die Untereinheiten humanem oder' murinem Ursprungs.

Im Folgenden soll die Erfindung anhand von Beispielen näher erläutert werden, ohne auf dieses beschränkt zu sein.

Peptide zur Inhibition der Interaktion von Proteinkinase A und Proteinkinase A-Ankerproteinen

Material und Methoden

Herstellung von Peptidbibliotheken, die von der Sequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP185 abgeleitet sind, auf Membranen

Alle Chemikalien und Lösungsmittel wurden bei Fluka (Steinheim) oder Sigma Aldrich (München) gekauft und ohne weitere Reinigungsschritte benutzt. Fmoc-geschützte Aminosäurepentafluorophehylester wurden bei Novabiochem Merck Biosciences GmbH (Darmstadt) gekauft. Peptidbibliotheken wurden durch automatische SPOT-Synthese auf Whatman 50 Zellulosemembranen gemäß Standardprotokollen mittels Fmoc-Chemie und AutoSpot-Robot ASS 222 (Intavis Bioanalytical Instruments AG, Köln) synthetisiert. Schutzgruppen der Aminosäureseitenketten wurden durch eine Mischung aus Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) abgespalten (Frank, 1992; Kramer und Schneider- Mergener, 1998) . Zur Kontrolle wurden Spots (ca. 50 nmol Peptid pro Spot) aus der Zellulosemembran herausgeschnitten, von .der Membran durch Behandlung mit 0,05m NaOH ■ abgespalten und mit HPLC und MALDI-TOF-Massenspektrometrie analysiert .

Detektion membranassoziierter Peptide im RII-overlay-Experiment mit regulatorischen RIIa- und RII/3- Untereinheiten der PKA als Sonde

Material

1. Regulatorische RIIα>- (human) und RII/3- (Ratte) Untereinheiten der PKA erhalten von Prof. Dr. Friedrich W. Herberg, Universität Kassel

2. Katalytische Untereinheiten, der PKA, Promega, Mannheim, Bestellnr. : V5161

3. Dy32P]ATP 5000 Ci/mmol Amersham Biosciences, Braunschweig, Bestellnr. : AA0018

4. Sephadex G 50, medium Pharmacia, Bestellnr. : 17-0043-01

5. Phosphat-gepufferte Saline (PBS) NaCl 8 g KCl 0, 2 g Na2HPO4 ■ 1,44 g KH2PO4 0, 24 g in 800 ml H2O lösen, auf pH 7,4 einstellen und mit H2O auf 1 1 auffüllen.

6. Tris-gepufferter Saline mit Tween 20 Tris-HCl 10 mM NaCl 150 mM Tween 20 0, 05% pH 7,5

Radioakive Markierung der regulatorischen Untereinheit von PKA .N C

1. Reaktionsansatz

Endkonzentration Stammlsg. im Ansatz

RIIa oder RII/3 15 μg 7 μg/μl 5, 6 μl Katalytische 2 μg 0, 9 μg/μl 2 μl Untereinheit der PKA. Kaliumphosphatpuffer, 25 mM 1 M 12,5 μl pH 7,0 cAMP 10 μM 1 mM 5 μl MgCl2 10 mM 0, 5 M 10 μl DTT 0,5 mM 50 mM 5 μl [γ32P]ATP/ATP 0,1 μM radioaktiv: 3,3 x 10ö cpm/ml = 75 μCi 5 μCi/μl 15 μl nicht radioaktiv: 10 μM 5 μl H2O 434,9 μl 10 min Inkubation bei 0 0C (auf Eis) . 2. Einstellung der■ATP-Konzentration

Die ATP-Konzentration ' wurde durch Zugabe von nicht radioaktivem ATP auf 10 μM eingestellt (Zugabe von 5 μl einer 1 mM Lösung) . Der Ansatz wurde weitere 50 min auf Eis inkubiert .

3. Stoppen der Reaktion und überprüfung der Reaktion

Die Reaktion wurde ■ durch Zugabe von Dextranblau und Abtrennung freier Nukleotide gestoppt. Das freie ATP wurde über eine Sephadex G50-Säule abgetrennt .

Abtrennung der markierten RII-Untereinheit der PKA , von freien Nukleotiden über Sephadex G50-Säulen

Nicht eingebaute Nukleotide wurden von den RII-Untereinheiten durch die Fraktionierung über Sephadex G 50-Säulen getrennt.

1. Quellen des Sephadex G 50-Materials: 20 g wurden in 400 ml PBS über Nacht bei Raumtemperatur gequollen. Nicht abgesetztes Material wurde anschließend mit einer Pasteurpipette entfernt. Das gequollene Material wurde in 50 ml Falcon Röhrchen aliquottiert und bei 4 0C gelagert. Zur- Konservierung wurde Natriumazid in einer Endkonzentration von 0,01 % zugesetzt.

2. Das Material wurde in eine mit- einer Glaskugel verschlossene ■ 10 ml sterile Einmalpipette gegossen. Zum Setzen des Säulenbettes liefen etwa 50 ml PBS, das 1 mg/ml BSA (bovines Serumalbumin) enthielt, durch. Bis zur Benutzung' der Säule wurde sie oben mit Parafilm verschlossen.

3. Die markierten RII-Untereinheiten (500 μl) wurden mit Dextranblau (70 μl einer 20 mg/ml Lösung) auf die Säule aufgetragen (Gesamtvolumen = 570 μl) .

4. Nachdem die Probe in die Matrix eingewandert war, wurde mit PBS aufgefüllt .

5. Kurz bevor das Dextranblau eluierte, wurde begonnen Fraktionen zu sammeln (2 Fraktionen je 1,5 ml, die weiteren Fraktionen je 1 ml) .

6. Zur Bestimmung der Inkorporation von 32P wurde 1 % (5,7 μl) der Probe vor der Säule (das entspricht 1 % der eingesetzten Radioaktivität) und 3 μl jeder Fraktion eingesetzt.'

7.. Die Fraktionen des ersten Peaks, welcher die Sonde enthielt, wurden vereinigt. Die Einbaurate wurde in % errechnet und die spezifische Aktivität (cpm/μg Protein) bestimmt.

RII-overlay

1. Proteine (40 μg) wurden mittels SDS-PAGE getrennt und durch das semi dry-Elektroblotverfahren auf eine PVDF-Membran (PVDF, Polyvinylidenfluorid) übertragen. Die membranassoziierten Proteine wurde mit Ponceau S gefärbt, um die Markerproteine auf der Membran zu identifizieren. Entfärbt wurde mit TBS. 2. Die Membran wurde in Blotto/BSA für 16 h bei 4 0C inkubiert : 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.4 0,15 M NaCl 8,766 g/l 5 % (w/v) Magermilchpulver 50 g/l 0,1 % (w/v) BSA 1 g/l (0,01 % antifoam (Sigma) ) 0,02 % NaN3 0,2 g/l

3. Das Blotto/BSA wurde durch frisches ersetzt und 32P markierte RII-Untereinheiten dazugegeben (105 cpm/ml) . Es wurde für 4-6 h bei Raumtemperatur inkubiert.

4. Die Membran wurde 4 x 15 min in Blotto/BSA und 2 x 10 min in 10 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, 0,15 M NaCl gewaschen.

5. . RII-bindende Proteine wurden durch Exposition auf eine Phosphoimagerplatte detektiert.

Ergebnisse

Es wurde eine Peptidbibliothek, abgeleitet von der wildtypischen Aminosäuresequenz der PKA-Bindungsdomäne von AKAP18δ (PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY; Henn et al . , 2004) auf einer Membran synthestisiert. Dazu wurde jede Aminosäure der wildtypischen Sequenz mit den 20 möglichen Aminosäuren substituiert. Figur 1 zeigt die Detektion der Peptide mittels der RII-overlay-Methode. Als Sonde wurden in diesem Fall radioaktive PKA Rllce- und RII/3-Untereinheiten gleichzeitig eingesetzt. In allen späteren Experimenten wurden entweder RIIa- oder RII/3-Untereinheiten als Sonde eingesetzt. Das Ergebnis zeigt deutliche Unterschiede in der Bindungsfähigkeit der einzelnen Peptide an die R-Untereinheiten (unterschiedliche Signalintensitäten) .

Figur 2 zeigt eine Wiederholung des Experiments mit ausgewählten Peptiden (AKAP18δ-L304T, AKAP18δ-L308D, AKAP18δ-L314E) deren Bindungsfähigkeit an RIICH- bzw. RII/3-Untereinheiten aber separat in unterschiedlichen RII-overlay-Experimenten getestet wurde. Als Kontrollen wurden die Peptide Ht31, Ht31-P, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-wt (wildtypische Sequenz) auf den gleichen Membranen synthetisiert und dem RII-overlay-Experiment unterzogen. Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Die Quantifizierung spricht für eine stärkere Bindung von AKAP18δ-L304T und AKAP18δ-L314E sowohl an RIICü- als auch an RII/3-Untereinheiten, AKAP18δ-RI und AKAP18δ-L308D dagegen schwächer. Das bekannte Peptid Ht31 bindet beide regulatorische. Untereinheiten etwa 5fach schwächer als das AKAP18δ-wt und etwa 5-6fach. schwächer als AKAP18δ-L304T und AKAP18δ-L314E. Die Bindung von Ht31 an die hier verwendeten regulatorischen RIIa- und RII/3-Unter- einheiten ist nur unwesentlich stärker als die Bindung der Untereinheiten' an Ht31-P, das. die AKAP-PKA-Interaktion nicht hemmt (Klussmann et al . , 1999; Alto et al . , 2003) . Damit sind die Peptide AKAP18δ-wt, AKAP18δ-L304T und und AKAP18δ-L314E wesentlich effizientere Inhibitoren einer AKAP-PKA-Interaktion als- Ht.31.

Alto et al . (2003) entwickelten ein Peptid, AKAP13, das die Interaktion zwischen der murinen Rllα-Untereinheit der PKA mit ξfach höherer Affinität bindet (KD = 0,45 nM) als das Peptid Ht31 (KD = 2,2 nM) . In unseren RII-overlay-Experimenten binden die Peptide AKAPis und Ht31 sowohl die humane RIIa- als auch die RII/3-Untereinheit der PKA. aus der Ratte kaum, die von uns identifizierten Peptide AKAP18δ-wt und AKAP18δ-L304T und und AKAP185-L314E dagegen stark. Dieses Ergebnis spricht für Speziesunterschiede zwischen den murinen und humanen Rllα-Untereinheiten, die zu unterschiedlichen Bindungsaffinitäten für die gleichen Peptide führen.

Identifizierung von Peptiden, die spezifisch RII/3-Unter- einheiten der PKA binden

Um Peptide zu finden, die entweder RIIa- oder RII/3-Untereinheiten der PKA binden und damit spezifisch die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der Typ IIa bzw. der Typ Iljß PKA hemmen, wurden anhand von dreidimensionalen Strukturmodellen der PKA-Untereinheiten aus der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAPlδδ Peptide abgeleitet, die die AKAP-Bindungstasche blockieren könnten. Die Peptide (1-19) wurden parallel auf zwei Membranen synthetisiert und anschließend in RII-overlay-Experimenten auf ihre Bindungsfähigkeit an RIIa- oder RI1/3- Untereinheiten der PKA getestet (Figur 3A) . Die quantitative Auswertung zeigte u. a. einen deutlichen Unterschied der Bindung der beiden PKA-Untereinheiten an das Peptid 7, dessen Sequenz neben derer der anderen Peptide in der Figur 3B aufgelistet ist.

Ausgehend von der Sequenz des Peptids 7 wurden zwei Peptidbibliotheken auf Membranen synthetisiert und RII- overlay-Experimenten mit RIIα- bzw. RII/3-Untereinheiten als Sonden unterzogen. Figur 4 zeigt, dass einige Peptide RIIa- binden, aber nicht RIIß-Untereinheiten (zum Beispiel die Peptide 10/11 und 10/12) und umgekehrt (zum Beispiel Peptid 21/4) . Darüber hinaus weisen einige Peptide eine stärkere Bindung an Rllce-Untereinheiten als an RII/3-Untereinheiten auf. Bei anderen ist es umgekehrt. Sie binden Rllα-Unter- einheiten schwächer als an . RII/3-Untereinheiten. Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass wir mit den genannten Peptiden AlδδRIIαHsl ■ und 2 und A18δRII/3Rnl die ersten Blocker gefunden haben, die selektiv die Interaktion von RIIa- bzw. RII/3-Untereinheiten der PKA. mit AKAP- Proteinen identifiziert haben.

Tab . 1 A

Nr . A ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . B ANDAQLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . C ASDAQLVRLSKRLVENAVLKΆVQQY Nr . D ASDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . E ARDAKLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . F ARDAQLVRLSKRLVENAVLKΆVQQY Nr . G ANDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . H ASDARLVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . I ASDAKTVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . J äNDAKTERLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . K ANDAKTERLSQRLVENAVLKAVQQY Nr . L ANDAKTQRLSQRLVENAVLKAVQQY Nr . M PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY Nr . N PEDAELVRLSKRLVENAVLQAVQQY Nr . O PEDAELVRLSKRLVENAVLNGVQQY' Nr . P PEDAELVRLSKRLVENAVLNGQQQY Nr . ■ Q PEDAELVRLSKRLVENAVLNGNQQY Nr . R - PEDAELVRLSKRLVENAVKNGNQQY Nr . S PEDAELVRLSKRLVENAVKNGAQDY Nr . T PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (Akapl8δ-wt) Nr . U PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18ö-L304T) Nr . V PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-L308D) Nr . W PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18ö-L314E) Nr . X •PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-P) Nr . Y PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18δ-PP) Nr . Z PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPlδδ-phos) Nr . AA EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (Akapl8δ-RI) Nr . BB ANDARLVRLSKRLRENAVLKAVQQY (AlδδRIIαHsl (14/14)) Nr . CC ANDARLVRLSKRLYENAVLKAVQQY (A18δRIIαHs2 (14/19)) Nr . DD ANDARLVRLSKRLVENAVLKFVQQY (AlδδRIIßRnl (21/4)) Nr . EE ANDARLVRLNKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIIcxRn2 (10/11)) Nr . FF ANDARLVRLPKRLVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn3 (10/12)) Nr . GG ANDARLVRLSKRDVENAVLKAVQQY (A18δRIIαRn4 (13/02)) Nr . HH YQEQLEEEVAKVIVSMSIAFAQQTE (AKAP450_JL) Nr . I I NLQKIVEEKVAAALVSQIQLEAVQE (AKAP450 2)

Tab. 1

SEQ ID Nr. 1 PEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQY (AKAPl8δ-wt) SEQ ID Nr. 2 PEDAELVRTSKRLVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L304T) SEQ ID Nr. 3 PEDAELVRLSKRDVENAVLKAVQQY (AKAP18δ-L308D) SEQ ID Nr. 4 PEDAELVRLSKRLVENAVEKAVQQY (AKAP18ö-L314E) SEQ ID Nr. 5 PEDAELVRLSKRLPENAVLKAVQQY (AKAP18ö-P) SEQ ID Nr. 6 PEDAELVRLSKRLPENAPLKAVQQY (AKAP18δ-PP) SEQ ID Nr. 7 PEDAELVRLDKRLPENAPLKAVQQY (AKAPl8δ-phos) SEQ ID Nr. 8 EPEDAELVRLSKRLVENAVLKAVQQYLEETQ (AKAP18δ-RI) SEQ ID Nr. 9 NTDEAQEELAWKIAKMIVSDIMQQA SEQ ID Nr. 10 VNLDKKAVLAEKIVAEAIEKAEREL SEQ ID Nr. 11 NGILELETKSSKLVQNIIQTAVDQF SEQ ID Nr. 12 TQDKNYEDELTQVALALVEDVINYA SEQ ID Nr. 13 LVDDPLEYQAGLLVQNAIQQAIAEQ SEQ ID Nr. 14 QYETLLIETASSLVKNAIQLSIEQL SEQ ID Nr. 15 LEKQYQEQLEEEVAKVIVSMSIAFA SEQ ID Nr. 16 EEGLDRNEEIKRAAFQIISQVISEA SEQ ID Nr. 17 ETSAKDNINIEEAARFLVEKILVNH SEQ ID Nr. 18 ADRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 19 SDRGSPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 20 TDRGFPALSSEALVRVLVLDANDNS SEQ ID Nr. 21 FLAGETESLADIVLWGALYPLLQDP SEQ ID Nr. 22 SELLKQVSAAASWSQALHDLLQHV SEQ ID Nr. 23 EKESLTEEEATEFLKQILNGVYYLH SEQ ID Nr. 24 EKGYYSERDAADAVKQILEAVAYLH SEQ ID Nr. 25 WLYLQDQNKAADAVGEILLSLSYLP SEQ ID Nr. 26 LKISPVAPDADAVAAQILSLLPLKF SEQ ID Nr. 27 SKTEQPAALALDLVNKLVYWVOLYL SEQ ID Nr. 28 VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS SEQ ID Nr. 29 VKLSNLSNLSHDLVQEAIDHAQDLQ SEQ ID Nr. 30 APSDPDAVSAEEALKYLLHLVDVNE SEQ ID Nr. 31 QMKAKRTKEAVEVLKKALDAISHSD SEQ ID Nr. 32 KDKLKPGAAEDDLVLEWIMIGTVS SEQ ID. Nr. 33 EKRVADPTLEKYVLSWLDTINAFF SEQ ID Nr. 34 QENLSLIGVANVFLESLFYDVKLQY SEQ ID Nr. 35 HQSWYRKQAAMILNELVTGAAGLE SEQ ID Nr. 36 QQLQKQLKEAEQILATAVYQAKEKL SEQ ID Nr. 37 HSVMDTLAVALRVAEEAIEEAISKA SEQ ID Nr. 38 RQVQETLNLEPDVAQHLLAHSHWGA SEQ ID Nr. 39 DIPSADRHKSKLIAGKIIPAIATTT. Tab. 2

Rllα-Bindung Rllß-Bindung Peptid KD [nM] KD [nM]

AKAP18δwt 0,4 - 1 ,5 1 - 6

AKAP185L304T 0,3 - 0,9 35

AKAP186L314E 0,2 - 1 ,3 22

AKAP185L308D keine Bindung keine Bindung

AKAP186-P keine Bindung keine Bindung

AKAP186-PP keine Bindung keine Bindung

Ht31 15 35

Ht31-P keine Bindung keine Bindung

AKAPis keine Bindung keine Bindung

AKAPis-P keine Bindung keine Bindung

Tabelle 2. Bindungskonstanten für die Interaktion von humanen RIIa- und Rllß-Untereinheiten aus der Ratte mit den angegebenen Peptiden, die aus der wildtypischen RII- Bindungsdomäne von AKAPlδδ (AKAP18δwt) abgeleitet wurden. Die Werte wurden durch surface plasmon resoπaπce-Messungen erhalten. L, Leuzin, T,. Threonin, D, Aspartat, P, Prolin, IS, in silico. 304, 308 und 314 bezeichnen die Position der entsprechenden Aminosäuren in AKAP188. Weitere Peptide, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen

Neben den in den Abbildungen 1-4 beschriebenen Peptiden konnten weitere identifizieren werden, die als Hemmer von AKAP-PKA-Interaktionen wirken. Zum Nachweis dieser Eigenschaft wurden die unten aufgeführten Peptide auf einer Zellulosemembran synthetisiert (SPOT-Syntheseverfahren) und einem RII-overlay unterzogen (Abb. 5) ., Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, , die regulatorische PKA- Untereinheiten gebunden haben. Die Peptide wurden in sechs Blöcken synthetisiert. Die Peptide der Reihe A Positionen 1-17 sind Positivkontrollen und in allen Blöcken identisch. Die Namen der unten aufgeführten Peptide sind aus ihren Koordinaten in den Blöcken 1-6 abgeleitet, beispielsweise ist das Peptid 1.B13. (Sequenz: YIALNEDLRSWTAADTAAQISQRKL) im Block 1 in der Reihe B an der Position 13 zu finden.

Die Abb. 5. zeigt die Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA-Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Peptidsequenzen sind in der beigefügten Liste (Tab. 3) aufgeführt:

Tab. 3. Sequenz der Peptide

No Sequence Name/ID-Nr. YIALWEDLRSWTAADTAAQISQRKL 1C17 HUMAN 2ISKEHWNPTIVALVYNVLKTLMEMN 2A5A HUMAN 3DAPEFHSRYITTVIQRIFYTVNRSW 2ACA HUMAN 4GSTFQNTYNLKDIAGEAISFASGKI 2ACA HUMAN LSRYNDQASSSRIIERIFSGAVTRG 2ACA HUMAN EASEFHSRYITTVIQRIFYAVNRSW 2ACC HUMAN QSEYSWRKMLSGIAAFLLGLIFLLV 2DOB HUMAN LLLLFWLGWLGMLAGAWI IVRAPR 4F2 HUMAN LYFHLAPKAEVGVIAKALVRLLRSH A3B2 HUMAN VKQNVKMSESQAALPSALKTLQQKL A4E1 HUMAN DPGALGRLGAWALLFFLVTTLLASA AAAT HUMAN 3QEVEGMNILGLWFAIVFGVALRK AAAT HUMAN EPTTGMDPKARRFLWMLILDLIKTG ABC2 HUMAN RLRGI SWKDEARWKWALEKLELTK ABC2 HUMAN LIQSLESNPLTKIAWRAAKPLLMGK ABCR HUMAN AYTTQSLASVAYLINTLANNVLQML ABI2 HUMAN TLSKTKNLRLLILVGRLFMWEEPξI ABM2 HUMAN RYGAAξPHTIAAFLGGAAAQEVIKI ABP1 HUMAN NKDDDESPGLYGFLHVIVHSAKGFK ABR HUMAN PTTHAMSPRLRHVLLELLPRLLGSP ACHE HUMAN PGSAQEKSIERRFLNGLFSKLQPRD AD13 HUMAN HFDPTTAFRAPDVARALLRQIQVSR AGRN HUMAN HYKETWKALEALVAKGLVQALGLSN AKA1 HUMAN QKLYLDRNLIAAVAPGAFLGLKALR ALS HUMAN KEIKSYLKRIFQLVRFLFPELPEEG ALS2 HUMAN AISPWKTYQLVYFLDKILQKSPLPP AMPB HUMAN GGAAGDEAREAAAVRALVARLLGPG ANAG HUMAN 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WD10 HUMAN 790 IPADPEAGGIGRWNGAFMVLKGHR WD22 HUMAN 791 RQNKDξRYSIKDLLNHAFFQEETGV WNK1 HUMAN 792 RKTSKSKLKAGKLLNPLVRQLKWA WNK2 HUMAN 793 RTDKNERFTIQDLLAHAFFREξRGV WNK4 HUMAN 794 TAFGADTEGSQWIIGYLLQKVISNL XP04 HUMAN 795 LGLNDETMVLSVFIGKIITNLKYWG XP07 HUMAN 796 LNYLATRPKLATFVTQALIQLYARI XP07 HUMAN 797 AMFVEYRKQLKLLLDRLAQVSPELL XPOT HUMAN 798 QNWQTTRFMEVξVAIRLL YMLAEAL XPOT HUMAN 799 FPAATSGRMVEAFARRALWDAGLNY XPP2 HUMAN 800 LLKASHVRDAVAVIRYLVWLEKNVP XPP2 HUMAN 801 SILTQPHLYSPVLISQLVQMASQLR Y310 HUMAN 802 ISIGTIYFRAHKLVLAAASLLFKTL Y478 HUMAN 803 RDVLRVQGVSLTALRLLLADAYSGR Y711 HUMAN 804QLEGLENATARNLLGKLINILLAVM Y779 HUMAN 805 PPLIVDRERLKKLLDLLVDKSNNLA YC40 HUMAN 806EDTKEKRTIIHQAIKSLFPGLETKT YI97 HUMAN 807 DQKTNLPEYLQTLLNTLAPLLLFRA Z294 HUMAN 808 RSREHGTLWSLIIAKLILSRSISSD • Z294 HUMAN 809VLASAYTGRLSMAAADIVNFLTVGS- Z297 HUMAN 810 ϊRNKMDPPRSSIFLQEVITTVYGYK ZAN HUMAN 811 VDLAYSNYHVKQFLEALLRNSAAPS ZBT8 HUMAN 812 LKLRSLRVNVGQLLAMI VPDLDLQQ ZCW3 HUMAN 813ELQKQAELMEFEIALKALSVLRYIT ZM10 HUMAN 814 DALHMLTDLSAIILTLLALWLSSKS ZNT4 HUMAN 8151MD C; EENYSAAS,KΆVRQVLHQLKRLG ZW10 HUMAN

Bildlegenden

Figur 1 . Identifizierung von Peptiden, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit der PKA hemmen. Eine Bibliothek von Pep¬ tiden, die von . der PKA-Bindungsdomäne des AKAP18δ abgeleitet wurden, wurde auf einer Membran synthetisiert. Die Membran wurde mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- und RIIß-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert ■ mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz der wildtypischen PKA-Bindungsdomäne von AKAP185; horizontal: die 20. Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden.

Figur 2 Identifizierung von Peptiden, abgeleitet von AKAPlδδ, die die Interaktion von AKAP-Proteinen mit den regulatorischen RIICK- und RII/3-Untereinheiten der PKA hemmen. A. Peptide, die von der- PKA-Bindungsdomäne des AKAP185 abgeleitet wurden, wurden auf zwei- Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIICK- (obere Reihe) oder RII/?-Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII-overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII- Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKαP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. B: Die Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A angegeben sind.

Figur 3A Peptide, abgeleitet von AKAPlδδ, die RIIa- und RII/3-Unter- einheiten der PKA unterschiedlich stark binden. A. Die Peptide 1-19, die von der PKA-Bindungsdomäne des AKAPlδδ abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (obere Reihe) oder RIIjS- Untereinheiten (untere Reihe) der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Für die Quantifizierung wurden die Signale densitometrisch ausgewertet und auf das Signal, das für AKAP18δ-wt erhalten wurde, bezogen. Das Peptid 7 ist aufgrund des großen Unterschieds in der Bindung an die beiden RII-Unterein¬ heiten durch rote Schrift hervorgehoben. B: Die Aminosäuresequenzen der Peptide (Einbuchstabenkodierung) , die in A mit 1-19 bezeichnet sind.

Figur 4 Unterschiedliche Peptide, abgeleitet von AKAPlδδ, binden RIIa- und RII/3-Untereinheiten der PKA unterschiedlich stark. Zwei Bibliotheken von Peptiden, die von dem Peptid 7 aus Figur 3 abgeleitet wurden, wurden auf zwei Membranen synthetisiert. Die Membranen wurden mit radioaktiv markierten regulatorischen RIIa- (linke Seite) oder RIIjS- Untereinheiten der PKA (rechte Seite) inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Jeder schwarze Punkt repräsentiert ein Peptid, an das die RII-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) . Die Aminosäuresequenzen' der Peptide lassen sich anhand der angegebenen Kürzel (Einbuchstabenkodierung) ablesen. Vertikal: Sequenz des Peptids 7; horizontal: die 20 Aminosäuren, die für die Substitution der wildtypischen Sequenz eingesetzt wurden. Horizontale und vertikale Reihen sind zusätzlich durch arabische Zahlen beschriftet. Diese Koordinaten erleichtern die Zuordnung, so bedeutet zum Beispiel 10/11: Reihe 10 Peptid 11. Die unten aufgelisteten Peptide werden entsprechend ihrer Bindung an RIIa mit AlδδRIIαHsl und 2 bzw. entsprechend ihrer Bindung an RUß mit A18δRII/?Rnl bezeichnet.'

Fig. 5: Identifizierung von Peptiden, die AKAP-PKA- Interaktionen hemmen. Kandidatenpeptide wurden auf einer Membran synthetisiert und mit . radioaktiv markierten regulatorischen RIID-Untereinheiten der PKA inkubiert (RII- overlay-Experiment) . Alle schwarzen Punkte repräsentieren Peptide, die regulatorische PKA-Untereinheiten gebunden haben (detektiert mit einem Phosphoimager) .

Fig. 6. Einfluß von Wasserstoffbrücken auf die Bindung zwischen Peptiden und RII (alpha) -Untereinheiten der PKA. (A,B) Vergleichende schematische Darstellung der Interaktion zwischen RII (alpha) und den Peptiden AKAP18 (delta) -wt oder AKAP18 (delta) -L314E sowie zwischen RII (alpha) , Ht31 oder AKAi3. Rllalpha ist als Rechteck und durch ausgewählte Aminosäuren, die Peptide sind anhand ihrer Aminosäure-Sequenz dargestellt. Aminosäuren als Partner einer Wasserstoffbrückenbindung, sind durch eine unterbrochene Linie miteinander verbunden. Aminosäuren der Peptide, die sich in Positionen für hydrophobe Molekülkontakte befinden sind grün unterlegt (Pos. der Aminosäuren von AKAP18 (delta) -wt im Vergleich zum Protein sind angegeben) . (C,D) Um den Einfluß der Aminosäuren für die Bindungsstärke zu untersuchen, wurden Alanin- substituierte Peptide auf Membranen synthetisiert, mittels RII overlay auf RII (alpha) -Bindung überprüft und densitometrisch quantifiziert. Die Peptide, ausgehend von AKAP18 (delta) -L314E, wurden in allen möglichen Kombinationen für die Aminosäuren, die Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden können (vgl. A) substitutiert . Die Quantifizierung für alle Peptide, sortiert nach der Affinität ist in C dargestellt. Die Quantifizierung für alle Einzelsubstitutionen (wie angegeben) , sowie representative „Spots" aus einem RII Overlay (darüber) sind in D dargestellt. Referenzen

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