Peptide, die an amino-terminal verkürztes Amyloid-beta-Peptid binden und deren Verwendung

Die Erfindung bezieht sich auf Peptide, die an amino-terminal verkürztes Amyloid-beta- Peptid (AßpE3-x) binden und deren Verwendung. Stand der Technik

Die Alzheimersche Demenz (AD) ist die häufigste Demenzform und betrifft ca. 20 Millionen Menschen weltweit. Pathologisches Hauptmerkmal der AD ist die Bildung von senilen oder amyloiden Plaques, bestehend aus dem Aß-Peptid (Amyloid-Beta-Peptid, A-Beta-Peptid), und neurofibrillären Ablagerungen aus dem Tau-Protein. Die Amyloid-Kaskadenhypothese entstand in den 90er Jahren und postuliert, dass die Ablagerung von Aß in Form von Plaques Auslöser der Krankheitssymptome ist. Neuere Studien weisen darauf hin, dass kleinere, frei diffundierbare Aß-Oligomere toxischer sind als die in den Plaques abgelagerten Aß- Fibrillen. Neuen Arbeiten zufolge können die Plaques als Reservoir für oligomeres Aß angesehen werden, welches mit der Zerstörung von Synapsen und Neuronen kolokalisiert. Das Aß-Peptid entsteht durch die Aktivitäten mindestens zweier verschiedener Proteasen aus einem Vorläuferprotein, dem "Amyloid Precursor Protein" (APP). Dieses ist in der Zellwand von Neuronen lokalisiert. Bei dem proteolytischen Abbau von APP und durch nachträgliche Modifikation entstehen Aß-Fragmente unterschiedlicher Länge und Art. Nach Verdau durch die gamma-Sekretase werden Aß-Peptide unterschiedlicher Länge gebildet, z. B. Aß 1-42, Aß 1-40 und so weiter. Diese Spezies unterscheiden sich in ihrer Tendenz zur Aggregation. Zusätzlich ist bekannt, dass ein Teil der im menschlichen Gehirn vorkommenden

Aß-Spezies nicht mehr als ursprüngliches Peptid nachgewiesen werden kann, sondern als trunkiertes AßpE3-x. AßpE3-x sind amino-terminal verkürzte Peptide, deren freiliegender Glutaminsäure-Rest an der Position 3 in zyklisierter Pyroglutamatform vorliegt. Der

C-Terminus ist variabel, z. B. AßpE3-40, AßpE3-42 und so weiter. AßpE3-x, vor allem

AßpE3-42, wird zu einem großen Anteil im Zentrum der amyloiden Plaques detektiert und ist deutlich aggregationsfreudiger und zelltoxischer als nicht amino-terminal trunkiertes und modifiziertes Aß.

Es werden daher Substanzen benötigt, die die Menge von toxischen Aß Oligomeren und/oder trunkierten und veränderten Aß-Spezies reduzieren. Es existiert bisher kein ursächlich wirkendes Medikament gegen die Alzheimersche Demenz. Die bisher eingesetzten Medikamente sind bestenfalls in der Lage, einige Symptome zu mildern, können aber den Krankheitsfortschritt nicht verlangsamen, geschweige denn aufhalten. Nachteilig können somit bisher nur die Symptome der Alzheimerschen Demenz behandelt werden. Es gibt keine zugelassenen Medikamente, die die Krankheitsprozesse aufhalten oder rückgängig machen können. Die meisten der Substanzen, die für die Therapie der Alzheimerschen Demenz erforscht werden, fokussieren auf extrazelluläres Aß, dabei aber nicht gezielt auf lösliche Aß-Oligomere oder aggregationsfreudige trunkierte Aß-Spezies wie AßpE3-42. Um den Krankheitsprozess in frühen Stadien aufhalten zu können, ist aber genau das nötig.

Des Weiteren gibt es bisher keine Möglichkeit, die Alzheimersche Demenz vor dem Ausbruch der Symptome zu diagnostizieren. Die Alzheimersche Demenz wird heute hauptsächlich durch neuropsychiologische Tests der bereits an Demenzsymptomen leidenden Person erkannt. Des Weiteren können andere Erkrankungen (Traumata) durch verschiedene Untersuchungsmethoden ausgeschlossen werden. Es ist jedoch bekannt, dass Aß-Oligomere und zeitlich darauf folgend Plaques bis zu 20 Jahre vor dem Auftreten der Symptome im Gehirn der Patienten entstehen und irreversiblen Schaden anrichten.

Molekulare Sonden, die dem Patienten intravenös injiziert werden und die nach der Passage über die Blut-Hirn-Schranke an Aß-Oligomere und Plaques binden, könnten mittels bildgebender Methoden sichtbar gemacht werden und somit eine frühere Diagnose der Alzheimerschen Demenz ermöglichen.

Es gibt bisher auch keinerlei Sonden für das in-vivo-lmaging-Verfahren, die speziell an Pyro- Glu-Aß-Spezies binden und diese sichtbar machen. Da Pyro-Glu-Aß-Oligomere in der Krankheitsgeschichte eine so wichtige und frühe Rolle spielen, ist genau dieses wünschenswert.

Aufgabe und Lösung der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es neue Kandidaten für eine

A) Ursächliche Therapie von Morbus Alzheimer

und zum B) Nachweis der Alzheimerschen Demenz im Frühstadium der Entstehung bereit zu stellen.

Die Aufgabe wird durch das Peptid nach dem Hauptanspruch gelöst.

Gemäß der Erfindung lösen Peptide die Aufgabe der Erfindung, welche an amino-terminal verkürztes Aß-Peptid binden, dessen freiliegender Glutaminsäure-Rest an der Position 3 in zyklisierter Pyroglutamatform (AßpE3-x) vorliegt.

Es wurde erkannt, dass derartige Peptide die Bildung von toxischen Aß-Oligomeren oder Aggregaten unterbinden können. Die Peptide binden vorteilhaft an im Körper vorkommendes, trunkiertes Amyloid-ß-Peptid, das heißt an AßpE3-x, insbesondere an die pE3-42- Spezies. Die Bindung des Peptids an die monomere Form verhindert die Bildung von toxischen Aggregaten. Die Bindung an die oligomere Form löst diese wieder in untoxische Monomere auf oder detoxifiziert diese durch Umbildung zu untoxischen Aggregaten. Im Ergebnis wird vorteilhaft eine Enttoxifizierung durch die Bindung Peptid-zu-trunkiertes Amyloid-ß- Peptid (AßpE3-x) gewährleistet. Weiterhin werden die Peptide vorteilhaft als Sonden für den Einsatz in bildgebenden Methoden, wie z. B. Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder die Einzelphotonen- Emissionscomputertomographie (SPECT) eingesetzt.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung der Peptide als Sonden zur Identifizierung von Aß-Oligomeren, insbesondere von trunkierten Aß-Oligomeren oder trun- kierten Aß-Monomeren (Plaques).

Solche Sonden sind von großer Bedeutung, da damit eine frühe Diagnose der Alzheimerschen Demenz möglich wird. Damit kann der Krankheit schon in einem sehr frühen Stadium entgegengewirkt werden.

Solche molekularen Sonden enthalten das erfindungsgemäße Peptid und können den Pati- enten z. B. intravenös injiziert werden. Weitere Bestandteile der Sonden können sein: Farbstoffe, Fluoreszenzfarbstoffe, radioaktive Isotope (für z. B. PET), Gadolinium (für MRI) und/oder Bestandteile, die für Sonden in der Bildgebung eingesetzt werden. Nach der Passage über die Bluthirnschranke können die Sonden an die Aß-Oligomere und/oder Plaques binden. Die so markierten, trunkierten Aß-Oligomere und/oder Plaques aus trunkierten Aß-Oligomeren können mittels bildgebender Verfahren wie z. B. SPECT, PET, CT, MRT, Protonen-MR-Spektroskopie usw. sichtbar gemacht werden und zwar auch in vivo. Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Peptids zur Verhinderung der Vermehrung von besonders toxischem, trunkierten Aß-Oligomeren (AßpE3-x).

Die erfindungsgemäßen Peptide können außerdem auch zur Bildung von nichttoxischen Peptid-Aß-Oligomer-Komplexen verwendet werden. Besonders vorteilhaft bestehen die erfindungsgemäßen Peptide überwiegend oder ausschließlich aus D-enantiomeren Aminosäuren.

Im Weiteren bedeutet der Begriff„überwiegend aus D-enantiomeren Aminosäuren", dass die einzusetzenden Monomere mindestens zu 60 %, bevorzugt zu 75 %, 80 %, besonders bevorzugt zu 85 %, 90 %, 95 %, insbesondere zu 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 % aus

D-Aminosäuren aufgebaut sind.

Die D-enantiomeren Peptide sind vorteilhaft synthetisch herstellbar und kommen in der Regel in der Natur nicht vor. Sie verhalten sich zu L-enantiomeren Peptiden wie Bild und Spiegelbild. Sie sind durch Spiegelbild-Phagendisplaytechnik erhältlich.

Im Körper vorkommende Enzyme, wie z. B. Proteasen, oder Proteine des Immunsystems, erkennen vorteilhaft die D-enantiomeren Peptide nicht. Daher sind sie im Vergleich zu den L-enantiomeren Peptiden in vivo resistenter gegenüber Proteasen und lösen, wenn überhaupt, eine nur schwache Immunantwort hervor. Dies reduziert vorteilhaft die Gefahr von Nebenwirkungen signifikant.

In einer Spieglbild-Phagendisplayselektion wurden insgesamt vier neue D-enantiomere Peptide selektioniert, die vornehmlich an trunkiertes AßpE3-x binden.

Vier verschiedene dodekamere D-Peptide (Einbuchstabencode) wurden selektioniert und als neue Kandidaten bei der Lösung der Aufgabe identifiziert.

D7 HTRFEYYVYH MS gemäß SEQ I D NO: 1

D6 AGERLKFIDEHV gemäß SEQ ID NO:2

D4 KMEHPNHPPPQR gemäß SEQ ID NO:3 und

D5 NGAPNKIPRDRE gemäß SEQ ID NO:4. Diese wurden aus den selektierten spiegelbildlichen L-Peptiden abgeleitet. D4 und D5 hatten Aggregationskeim-frei präpariertes AßpE3-x als Selektionsziel, D6 und D7 jeweils niedermolekulare oder hochmolekulare AßpE3-x-Aggregate.

Die Strukturen nach einer der Sequenzen mit der SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 oder einer Mischung hieraus sind besonders vorteilhaft neue Kandidaten für therapeutische Mittel zur Behandlung der Alzheimerschen Demenz.

Besonders vorteilhaft sind die Strukturen auch neue Kandidaten zum Nachweis der Alzheimerschen Demenz und der damit assoziierten Plaques.

Das Verfahren zum Nachweis von Plaques, welche zumindest teilweise aus amino-terminal verkürzten Aß-Peptiden (AßpE3-x) bestehen, deren freiliegender Glutaminsäure-Rest an der Position 3 in zyklisierter Pyroglutamatform vorliegt, erfolgt mit den Schritten: in Kontakt bringen der Plaques mit einem markierten Peptid oder einer Sonde, welches an das amino-terminal verkürzte Aß-Peptid bindet,

- Nachweis der Plaques durch ein bildgebendes Verfahren. Das Verfahren sieht die Auswertung der Bilder außerhalb des Körpers durch Vergleich mit Bildern von gesunden Probanden vor. Vorteilhaft wird dadurch der Nachweis von Plaques auch in vivo ermöglicht.

Besonders vorteilhaft werden Peptide zum Einsatz gebracht, welche überwiegend oder ausschließlich aus D-enantiomeren Aminosäuren bestehen. Das Verfahren ist in einer Ausgestaltung der Erfindung gekennzeichnet durch Wahl eines Peptids mit einer der Sequenzen mit der SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:4 oder einer Mischung hieraus.

Ausführunqsbeispiel: Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Ausführungsbeispiels und der beigefügten

Figur näher beschrieben, ohne dass es hierdurch zur Einschränkung der Erfindung kommen soll.

Die D-enantiomeren Peptide mit der SEQ ID NO:1-4 wurden wie folgt erhalten. In einer Spieglbild-Phagendisplayselektion wurden insgesamt vier neue D-enantiomere Peptide selektioniert, die vornehmlich an trunkiertes AßpE3-x binden. Synthetisch hergestelltes AßpE3-x wurde als Zielmolekül in verschiedenen Spiegelbild-Phagendisplay- Selektionsprozessen eingesetzt. Die Methode des Phagendisplay ermöglicht es, aus einer sehr großen Bibliothek verschiedener Peptide diejenigen zu selektionieren, die an ein bestimmtes Zielmolekül binden. Dafür werden die Peptide auf Bakteriophagen präsentiert. Spiegelbild-Phagendisplay ist eine Sonderform des Phagendisplay. Im Phagendisplay wird das L-enatiomere Zielprotein als Target in der Selektion eingesetzt. Die Phagen präsentieren eine Peptidbibliothek auf ihrer Oberfläche und die Phagen, die Bindepartner für das Zielmo- lekül ("Target") präsentieren, werden durch iterative Runden von Bindung, Waschen und Amplifikation angereichert. Im Spiegelbild-Phagendisplay wird das Spiegelbild des eigentlichen Targets eingesetzt. Durch Phagendisplay werden dann L-enantiomere Peptide selektiert, die an das Spiegelbild des Zielmoleküls binden. Das Spiegelbild des so identifizierten L-Peptides (identische Aminosäuresequenz aber alle Aminosäuren bestehen aus

D-Enantiomeren) bindet dann an das eigentliche, ursprüngliche Zielmolekül. Die Selektionen im Spiegelbild-Phagendisplay wurden gegen AßpE3-x ohne Aggregationskeime, das heißt hauptsächlich Monomer, und in niedermolekularer sowie hochmolekularer Aggregatform durchgeführt.

Für die Präparation von hochmolekularen Aggregaten von Pyroglutamat-Aß wurden

AßpE3-38-Bio (Bio: Biotin, zur Immobilisierung der Peptide zur Selektion auf Streptavidin- Mikrotiterplatten) sowie AßpE3-40 zu jeweils 10 sowie 100 μΜ in Hexafluoroisopropanol (HFIP) verdünnt. Anschließend wurden beide Peptide in einem Verhältnis von 1 :20 zusammen zu 15 g aliquotiert. Zur Präparation von hochmolekularen Aggregaten wurde der Peptidfilm in 5 μΙ Dimethylsulfoxid angelöst und in 95 μΙ physiologischem Puffer PBS (140 mM NaCI; 2.7 mM KCl; 10 mM Na ₂ HP0 ₄ , pH 7,4) aufgenommen. Anschließend erfolgte die

Inkubation bei 37 °C und 500 rpm für 3 Tage, gefolgt von einer 1 -stündigen Immobilisierung. Für die Präparation von niedermolekularen Aggregaten wurden ebenfalls AßpE3-38-Bio und AßpE3-40 eingesetzt. Zunächst wurde 871 ng AßpE3-38-Bio als Peptidfilm in NaOH angelöst und in Natriumphosphat-Puffer pH 7,4 (NaPi) aufgenommen und zu 87 ng pro Well aliquo- tiert. Nach einer 20-minütigen Immobilisierung wurde die Lösung abgenommen und verworfen. Anschließend wurde 871 ng AßpE3-40 ebenfalls in NaOH angelöst und in 250 μΙ NaPi aufgenommen, zu dem prä-immobilisierten Well gegeben und für weitere 2 Stunden immobilisiert. Für die Präparation von Peptiden ohne Aggregationskeime wurde die 1 mM Stammlösung von AßpE3-38-Bio in HFIP zu 1 μΜ weiter verdünnt und zu je 871 ng aliquotiert. Nach dem Abdampfen von HFIP über Nacht wurde der Peptidfilm in 53 μΙ NaOH angelöst, 947 μΙ NaPi zugegeben und jeweils 100 μΙ mit 87 ng Aß in die Wells pipettiert. Es folgte eine Immobilisierung für 30 Minuten.

In der Spieglbild-Phagendisplayselektion wurden neue D-enantiomere Peptide selektioniert, die vornehmlich an trunkiertes pEAß3-x binden sollten. Die Selektionen im Spiegelbild- Phagendisplay wurden gegen AßpE3-x ohne Aggregationskeime, das heißt hauptsächlich Monomer, und in niedermolekularer sowie hochmolekularer Aggregatform durchgeführt. Vier verschiedene dodekamere D-Peptide D4 (KMEHPNHPPPQR gemäß SEQ ID NO:3), D5 (NGAPNKIPRDRE gemäß SEQ ID NO:4), D6 (AGERLKFIDEHV gemäß SEQ ID NO:2) und D7 (HTRFEYYVYHMS gemäß SEQ ID NO:1 ) wurden aus den selektierten spiegelbildlichen L-Peptiden abgeleitet. D4 und D5 hatten Aggregationskeim-frei präpariertes AßpE3-x als Selektionsziel, D6 und D7 jeweils niedermolekulare oder hochmolekulare Aß pE3-x- Aggregate.

Die Bindeeigenschaften der vorliegenden Peptide an Aß-PIaques wurden untersucht. Für die Färbung von frontalen Hirnschnitten wurden Präparate transgener Tg2576-Mäuse im Alter von 10 bis 11 Monaten verwendet, die aufgrund des humanen APP-Gens mit der schwedischen Mutation eine erhöhte Aß1-42 Expression und Plaquebildung aufweisen. In diesen Mäusen konnte auch AßpE3-x als Plaquebestandteil nachgewiesen werden.

Für die Versuche wurden die Peptide durch einen kommerziellen Anbieter synthetisch hergestellt und markiert. Anschließend wurde ex-vivo untersucht, welche Bereiche der Plaques vornehmlich gebunden werden. Dabei ist davon auszugehen, dass Aß-PIaques aus verschiedenen Aß-Spezies, wie z. B. Aß1-40, 1-42 und AßpE3-x bestehen.

Die Ergebnisse sind in der Figur 1 dargestellt.

Figur 1 : Histologische Färbung von Plaques im Gehirn (Kortex) von transgenen Alzheimermäusen (Tg2576), welche das humane Aß-Vorläufer-Protein exprimieren, mit den D-enantiomeren Peptiden D4, D5, D6 und D7.

Alle Peptide sind zur Detektion mittels Fluoreszenzmikroskop mit einem Fluoresceinisothio- cyanat (FITC) verknüpft. Als Positivkontrolle wurde das D1-FITC-Peptid, welches Aß- PIaques (speziell Aß 1-42) bindet (Wiesehan et al., ChemBioChem 2003, 4, 748-753; Van Groen et al., ChemMedChem 2009, 4, 276-282), verwendet. Als weitere Kontrolle wurden im Anschluss Kongorot-Färbungen derselben Proben durchgeführt, die zur Verifizierung der Plaquestrukturen dienten (jeweilige untere Abbildung). Es ist davon auszugehen, dass die Plaques aus verschiedenen Aß-Isoformen (Aß1-40, 1-42, AßpE3-x) zusammengesetzt sind. Schnitte von Wildtyp-Tieren ohne Plaquebildung wurden ebenfalls behandelt. In diesen Proben konnte keine Kongorot- sowie Fluoreszein- Fluoreszenz detektiert werden (Daten nicht gezeigt).

In den Gehirnschnitten, die mit D4, D5 und D6 behandelt wurden, wurden nur Plaques mit einer relativ dichten Struktur, bestehend aus Aß-Fibrillen, gefärbt, keine kleinen und diffusen Plaques, bestehend aus amorphen Aß-Aggregaten. Des Weiteren wurden ringförmige Struk- turen um den inneren Kern der Plaques stärker gefärbt. D7 färbte ebenfalls nur dichte Strukturen, aber abweichend zu den anderen Peptiden den inneren Kern der Plaques. Dies deutet darauf hin, dass in den Plaques möglicherweise eine spezifische Verteilung der verschiedenen Aß-Isoformen von den D-Peptiden erkannt wurde.

Die selektierten D-Peptide D4, D5, D6 und D7 sind somit erfindungsgemäß interessante Kandidaten für die Entwicklung von biomolekularen PIaquesonden und deren Verwendung in diagnostischen Nachweisverfahren. Die selektive und möglicherweise spezifische Affinität für unterschiedliche Plaquestrukturen und Aß-Isoformen könnte die Diagnose der Alzheimer- schen Demenz in bildgebenden Verfahren unterstützen und der Abgrenzung von anderen Amyloid assoziierten neurodegenerativen Krankheiten dienen. Eine Nutzung der Peptide für therapeutische Zwecke ist gegeben. Bisher sind keine Peptide bekannt, die in einer Selektion gegen pEAß generiert wurden und die diagnostisch und therapeutisch genutzt werden könnten.