L'intért de l'obtention de plantes dépourvues de pétales est parti de l'observation que les pétales sénescents, en tombant sur les feuilles pourraient fournir des foyers d'infection privilégiés pour les spores de certains champignons pathogènes. Dans le cas du colza, par exemple, le mode d'infection de Sclerotixia sclenotiorum suit principalement cette voie. Ce champignon est responsable en effet d'importants dommages sur les cultures de colza (Lamarque, 1983) et on ne connaît pas de résistance génétique à celui-ci ni chez le colza ni chez les espèces apparentées. Ainsi, à l'heure actuelle, seuls les traitements chimiques préventifs sont utilisés.

La lutte contre Sclerotinia sclerotiorum par le biais de plantes dont les fleurs n'auraient pas de pétales permettrait de diminuer l'utilisation de fongicide et limiterait donc la pollution des sols subséquente.

II s'agit donc de produire des plantes à fleurs sans pétale et d'éprouver ainsi une stratégie de lutte contre le susdit champignon basée sur une résistance "physique"et non pas sur l'utilisation de gènes de résistance au sens classique.

La présente invention propose donc d'obtenir des plantes dont les fleurs seraient dépourvues de pétales. Elle consiste à mettre en oeuvre une région promotrice contrôlant 1'expression spécifiquement dans les pétales d'une séquence (orf) codant pour une molécule susceptible de modifier les caractéristiques naturelles du pétale voire d'en inhiber la formation.

Ainsi, on peut envisager de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la structure des pétales de fleurs en plaçant, en aval de la région promotrice ci-dessus décrite des gènes impliqués dans la biosynthèse des pigments ou des gènes de régulation comme les protéines MYB (Noda et al. 1994). Ce type

d'expérience a déjà été réalisé (Elomma et al., 1996 ; Gutterson, 1995). Toutefois, les promoteurs utilisés sont plutôt de types constitutifs comme le 35S du CaMV alors qu'il serait intéressant de confiner 1'expression du transgéne à l'organe ciblé.

On peut donc, dans le cadre de la présente invention, envisager la création de plantes ornementales originales.

La présente invention a donc pour objet une séquence nucléotidique dont il a été démontrée que le gène correspondant s'exprime spécifiquement dans le pétale, cette séquence nucléotidique correspond à SEQ ID N° 5.

Par conséquent, la présente invention a pour objet une séquence nucléotidique qui correspond à tout ou partie : a) de la séquence selon SEQ ID N° 5, ou b) d'une séquence s'hybridant à la séquence selon a), ou c) d'une séquence présentant au moins 80 % d'homologie avec a) ou b).

Dans le cadre de la présente invention, la partie la plus intéressante de cette séquence nucléotidique est la région promotrice définie comme étant la séquence précédant (côté 5') le codon du début de traduction (ATG). Strito sensu cette région promotrice s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3265 (c'est-à-dire au dernier nucléotide précédant immédiatement le codon ATG) mais, compte tenu des sites de restriction, cette région s'étend préférentiellement du nucléotide 1 au nucléotide 3233 (correspondant au site AvaI) et plus préférentiellement encore du nucléotide 2911 au nucléotide 3233 de SEQ ID N° 5.

Cette région promotrice précède donc à l'état naturel, un orf qui est exprimé spécifiquement dans les pétales et dans le cas où cet orf est remplacé (par manipulation génétique) par un autre orf dont le produit est une molécule cytotoxique, cette dernière est susceptible de ne détruire que lesdits pétales. Le remplacement peut également tre réalisé par une partie de gène susceptible, lors de son expression spécifique dans le pétale, d'en modifier les caractéristiques d'origine.

La présente invention a donc également pour objet des vecteurs d'expression cellulaire comprenant une région promotrice telle que ci-dessus décrite placée en amont d'une séquence d'ADN codant pour un produit capable de modifier la structure, la forme, la coloration et/ou la texture des pétales de fleurs, ainsi qu'un procédé d'obtention de plantes ornementales comprenant l'insertion dans lesdites plantes d'un de ces vecteurs. L'invention comprend également le cas où ladite séquence d'ADN code pour un produit cytotoxique.

Avantageusement, le produit cytotoxique en question est une ribonucléase.

En effet, lorsque cette RNase s'exprimera spécifiquement dans les pétales, elle en détruira tous les ARN, ce à quoi le pétale ne pourra pas survivre.

Préférentiellement, la RNase est la barnase, dont l'orf correspondant a été isolé de Bacillus amyloliquefasciens (Hartley RW, 1988).

Il s'agit donc d'introduire un vecteur conforme à l'invention dans une souche bactérienne susceptible de réaliser la transformation de cellules de plantes <BR> <BR> telles qu'Agrobacterittn1 tumefaciens. Ceci peut notamment tre réalisée par la méthode d'infiltration de plantes d'Arabidopsis thaliana décrite par Bechtold et al. ; 1993. Cette technique consiste à introduire la bactérie dans les cellules des hampes florales par infiltration sous vide. Les plantes sont ensuite repiquées en serre et leurs graines récoltées. Environ une graine sur mille donne naissance à des plantes dont toutes les cellules portent le transgène. La transformation d'autres plantes et notamment du colza peut tre réalisée par l'intermédiaire d'Agro- bacterium tumefaciens et/ou d'Agrobacterium rhizogenes à l'aide de diverses techniques, maintenant classiques (transformation de disques foliaires, d'hypo- cotyles de hampes florales....) associant une phase de co-culture de la bactérie avec les tissus végétaux, suivie de la sélection et de la régénération des cellules transformées en plantes entières. D'autres techniques de transformation ne font pas intervenir cette bactérie et permettent de transférer directement le gène clone dans des cellules ou des tissus (électroporation, canon à particules...) et de sélectionner et d'obtenir des plantes transformées (technique revue par Siemens et Schieder).

La présente invention a également pour objet des cellules de plantes transformées avec un vecteur conforme à l'invention ainsi que des plantes comprenant lesdites cellules. L'invention a également pour objet des plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales.

Comme indiqué précédemment, la présente invention permet donc l'obtention de plantes dont les fleurs n'ont pas de pétales ; le procédé conforme à l'invention comprenant l'insertion dans les plantes d'un vecteur tel que ci-dessus décrit et comprenant une séquence d'ADN codant pour un produit cytotoxique.

Dans le cadre de la présente invention, on peut également envisager d'obtenir des plantes hybrides par croisement de deux lignées dont on chercherait à associer les qualités agronomiques. Cependant, afin que la pollinisation entomophile s'opère de façon optimum, il est nécessaire que les parents de l'hybride en question portent des pétales. Un tel croisement n'est donc possible qu'au moyen d'un système d'activation du gène toxique à double composante. Le principe d'un tel système consiste à disposer de deux lignées portant chacune un constituant n'ayant pas d'activité cytotoxique. L'activité toxique spécifique est alors restaurée dans les hybrides de ces deux lignées par combinaison des deux constituants.

Un exemple possible d'un tel système consiste à inactiver le produit d'expression que l'on veut contrôler par insertion d'au moins un codon stop au début de la séquence codante correspondante puis d'ajouter en trams dans le système, un ARNt dit"suppresseur"qui va reconnaître le ou les codon (s) stop et apporter l'acide aminé qu'il porte au lieu de terminer la traduction. La protéine pourra alors tre traduite intégralement et son activité restaurée. Un tel système a déjà été expérimenté concernant la séquence codante du gène GUS dans laquelle a été insérée le codon stop ambre, l'ARNt suppresseur utilisé étant porteur de la leucine. De plus, la fonctionnalité d'un tel système de transactivation utilisant un ARNtL'U suppresseur a été vérifié iii planta dans Arabidopsis flialiatia et Mcotialla tabac7lm. Ce modèle a été ensuite appliqué au cas de la bamase. Des

gènes mutes (c'est-à-dire dans lesquels ont été insérés un codon stop) codant pour la barnase et dépendant de 1'expression du gène de ARN'tL,, ont été obtenus et testés en expression transitoire dans des protoplastes de tabac (Choisne Nathalie, 1997).

La présente invention concerne donc également un procédé d'obtention de plantes hybrides dont les fleurs n'ont pas de pétale et comprenant les étapes de : a) transformation de plantes d'une lignée A avec un vecteur conforme à l'invention et comprenant une séquence d'ADN codant pour séquence cytotoxique modifiée par l'insertion d'au moins un codon stop, b) croisement des plantes de lignée A ainsi obtenues avec des plantes de lignée B exprimant le gène d'un ARNt suppresseur, c) sélection des plantes hybrides avec des fleurs sans pétales.

Dans le cadre de la présente invention, les plantes de lignée A sont transformées par une construction similaire à pIB352 telle que représentée dans la figure 7.

Avantageusement, les plantes conformes à l'invention appartiennent à la famille des Brassicacées, préférentiellement, il s'agit du colza.

La figure 1 illustre l'analyse par hybridation de type Northem d'ARN polyA+ (2 u. g) et des ARN totaux (10 llg) de colza. La membrane est hybridée <BR> <BR> <BR> avec 1'ADNc 9.2 entier marqué au 32p La révélation est faite après 24 heures d'exposition à-80°C avec un écran. Les ARNm identifiés ont une taille <BR> <BR> <BR> approximative de 800 pb. Plantule 1 : plantule d'une semaine ; Plantule 2 : plantule de deux semaines La figure 2 illustre la comparaison des séquences protéiques d'Arabidopsis <BR> <BR> <BR> thaliana (en haut) et du colza (en bas) déduites respectivement de ADNc X74360 (SEQ ID N° 1) et 9.2 (SEQ ID N° 2). La protéine d'Arabidopsis thaliana présente une longueur de 140 aa alors que la protéine de colza présente une longueur de 147 aa. L'homologie entre les deux étant de 74,6 %. Les étoiles repèrent les acides aminés communs aux deux séquences et les points figurant

dans 1'ADNc d'Arabidopsis thalia) 1a n'ont été indiqués que pour permettre de placer l'une en face de l'autre les séquences communes aux deux plantes, la séquence d'Arabidopsis thaliaua devant se lire en continu, c'est-à-dire en faisant abstraction desdits points.

La figure 3 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des ADNc 9.2 du colza (en bas) et X74360 d'Arabidopsis thalia7la (en haut), les deux séquences présentant une homologie totale de 83 %.

La figure 4 représente les cartes de restriction partielles des clones gnomiques (A : Aval, B : BamHl, EI : EcoRl, EV : EcoRV, H : HindIII, Hc : HincII, P : PstI, S : Sacl, SI : Sall, Xb : Xbal, Xh : Xhol).

La figure 5 représente la séquence 5'-)-3'du clone gnomique 4.1.1 (SEQ ID N° 5). La séquence palindromique a été soulignée deux fois, la séquence codante a été soulignée une fois. Les sites de restriction suivants ont été repérés : BamHI (en position 1) : GGATCC ; SalI (en position 2911) : GTCGAC et Aval (en position 3229) : CCCGAG.

La figure 6 représente les constructions réalisées avec les promoteurs des clones gnomiques 4.1.1 et 8.1.1. région promotrice distale du clone gnomique 4.1.1 séquence palindromique région promotrice proximale du clone gnomique 4.1.1 région promotrice de 322 pb du clone gnomique 4.1.1 région promotrice de 322 pb du clone gnomique 8.1.1 terminateur du gène de la nopaline synthase séquence codante du gène rapporteur gus séquence codante du gène 4.1.1 région 3'du gène 4.1.1 non traduite La figure 7 illustre les constructions réalisées avec le promoteur de 322 pb du clone gnomique 4.1. 1.

promoteur de 322 pb du clone génomique 4.1.1 séquence codante du gène rapporteur gus séquence codante du gène de la bamase sauvage séquence codante du gène de la barnase mutée terminateur du gène de la nopaline synthase terminateur 19S du CaMV L'invention ne se limite pas à seule description ci-dessus, elle sera mieux comprise à la lumière des exemples ci-après qui ne sont cependant donnés qu'à titre illustratif.

EXEMPLE 1 : Mise en évidence d'un promoteur spécifique des pétâtes La première étape a consisté en l'obtention de clones d'ADN complémentaires (ADNc) exprimés spécifiquement dans le pétale. Pour cela, les ADNc ont été synthétisés à partir d'ARN messagers (ARNm) de pétale de colza.

Parallèlement, des ADNc ont été synthétisés à partir d'ARNm de feuilles, de boutons floraux dont les pétales ont été enlevés et d'étamines.

Les ADNc provenant desdits organes ou tissus ont été soustraits aux ADNc dérivés des ARNm exprimés dans le pétale de colza. Les molécules résultant de cette soustraction ont été utilisées lors d'une expérience d'hybridation différentielle d'une banque d'ADNc de pétale selon une technique similaire à celle présentée par Atanassov et al. 1996.

Plusieurs clones d'ADN de colza ont été isolés à l'issue de cette expérience.

Leur profil d'expression a été étudié par la technique d'hybridation moléculaire de type Northern. En l'absence de clone strictement spécifiques du pétale (au seuil de détection de la technique) le candidat le plus pertinent a été retenu pour la suite des études ; il s'agit du clone 9.2. Ce clone est fortement exprimé dans le pétale au

stade jeune (bouton de 3 mm environ) et très faiblement dans les étamines (figure ).

Les recherches d'homologie de séquences dans les banques de données montrent une forte similitude entre la protéine déduite de la phase ouverte de <BR> <BR> lecture (orf) du clone 9.2 et la séquence codante d'un gène d'Arabidopsis íhaliana<BR> <BR> (X74360) codant pour une protéine putative de la paroi dont 1'expression est régulée par les gibbérellines (Phillips et Huttly, 1994) (figure 2). Le degré d'homologie présenté par les séquences d'ADNc respectives correspondantes est supérieur à 80 % dans les 500 premières bases puis disparaît totalement sur les 220 restantes (figure 3).

Le clone d'ADNc 9.2 de colza a servi de sonde pour cribler une banque gnomique de colza. Sept clones gnomiques ont été isolés. Sur la base des cartes de restriction et des séquences, ces sept clones se répartissent en deux groupes suggérant 1'existence chez le colza d'une famille d'au moins deux gènes nommés dans la suite du texte 4.1.1 et 8.1.1 (figure 4). L'ADNc 9.2 est dérivé du gène correspondant du clone gnomique 4.1.1.

Une étude préliminaire par amplification PCR a été réalisée sur le clone 9.4.1 appartenant au groupe du 4.1.1. En effet, la structure du clone gnomique a permis d'amplifier une région amont de 3233 pb en utilisant des techniques d'amplification de grands fragments d'ADN et de séquençage progressif par PCR.

Cette région de 3233 pb s'étend du nucléotide 1 au nucléotide 3233 de la séquence représentée sur la figure 5 et elle se termine au niveau du site AvaI au niveau duquel la coupure a été effectuée ainsi que le clonage pour l'obtention de "bouts francs".

Puis les régions amonts susceptibles de contenir les séquences régulatrices ont été sous-clonées dans des vecteurs de clonage à partir des deux clones gnomiques (4.1.1 et 8.1.1). On dispose donc actuellement, pour le clone 4.1.1, de plus de 4 kb de séquence correspondant majoritairement à l'orf et aux régions amonts (figure 5).

EXEMPLE 2 : Vérification de la spécificité de la rézion oromotrice Différentes constructions comprenant le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle de certaines de ces séquences ont été réalisées afin d'étudier 1'expression de ces gènes chimériques (c'est-à-dire constitués de la séquence codante d'un gène connu précédé de la région promotrice conforme à l'invention) dans des plantes transformées d'Arabidopsis thalias7a et de colza.

Ces constructions se regroupent en deux catégories en fonction de l'orf placée sous le contrôle des séquences régulatrices : -le gène rapporteur GUS pour étudier les profils d'expression et vérifier la spécificité conférée par le promoteur, -le gène de barnase sauvage ou inactivé pour empcher la formation du pétale par expression dans cet organe de ce gène toxique (les figures 6 et 7 détaillent la composition de chaque construction).

Les profils d'expression du gène rapporteur GUS chez les transformants d'Arabidopsis obtenus dans le cas du pIB100 montrent une certaine variabilité sur l'ensemble des plantes (voir tableau 1 ci-après qui énumère les parties des plantes transformées chez lesquelles on a observé une coloration bleue). Cependant, chez près de la moitié des plantes présentant une coloration bleue (13/30), le gène rapporteur ne s'exprime que dans les pétales (au seuil de détection de la technique). On retrouve chez certaines plantes une faible expression dans les étamines, peu surprenante du fait des résultats des hybridations de type Northern, mais aussi parfois une expression dans d'autres organes floraux ce qui pourrait suggérer l'influence d'effets de position du transgène dus à sa petite taille.

Toutefois 1'existence d'une proportion significative de plantes présentant le profil attendu laisse à penser que le fragment proximal de 322 pb est capable de conférer une expression spécifique du pétale. La stabilité de cette expression a été testée sur les descendants en autofécondation de ces plantes. Pour la plupart, on retrouve bien la spécificité"pétale" (données non montrées).

Des séquences promotrices plus longues ont également été mises en oeuvre par le biais des constructions pIB 102 et pIB 105 et les plantes transformées <BR> <BR> d'rabidopsis thaliana ont été observées (le tableau 2 énumère les parties des plantes transformées par pIB102 et présentant une coloration bleue, le tableau 3 énumère les parties des plantes transformées par pIB105 et présentant une coloration bleue). On ne retrouve pas la spécificité pétale dans la proportion précédemment observée car dans presque tous les cas, le gène rapporteur est effectivement exprimé dans le pétale mais également dans d'autres organes de la fleur.

De mme, des plantes transformées de colza ont été obtenues avec une construction comportant comme séquence régulatrice le fragment amont du gène 4.1.1 de 3233 pb clone après amplification par PCR. Sur les neuf plantes de colza qui ont déjà pu tre observées, le gène rapporteur s'exprime dans le pétale mais aussi dans d'autres organes de la fleur (données non montrées), comme on l'observe chez Arabidopsis avec ces grandes régions promotrices.

Ces résultats suggèrent que ces fragments sont trop longs alors que l'on pense que le précédent (322 pb) pourrait tre un peu court et donc amplifier les effets de position éventuels. Ce dernier cependant donne lieu aux résultats les plus prometteurs.

Les promoteurs pIB351 et pIB352 (figure 7) analogues au pIB100 mais comportant respectivement la séquence codante du gène de la barnase sauvage et cette mme séquence inactivée par insertion d'un codon stop (dénommée alors barnase mutée) au lieu de la séquence codante du gène rapporteur ont été introduites dans Arabidopsis thaliana (résultats non encore disponibles).

TABLEAU 1 SEPALES PETALES ETAMINES PISTILS FEUILLES SILIQUES AUTRES PLANTES (Nombre) TRANSFORMEES (Nombre) 4----13 -4-haut stigmate-- -4-sous papille-- -2/4-sauf papille 2 pointes- -1/4 1 fleur-sous papille I fleur 4 pointe jeune 4 étamine pistil Pédoncule floral 4 haut filet sous papille 4légers petit bouton intérieur sauf papille intérieur 4 jeune sauf papille bouton 4-peu haut stigmate--3 bouton4 tissu connectif stigmate pointe Pédoncule floral pointe4 haut filet intérieur certains 4 connectif pistil pointe + marge bord4 pointe sous papille bord 4 haut sac pollinique haut stigmate 30plantes TABLEAU 2 SEPALES PETALES ETAMINES PISTILS FEUILLES SILIQUE AUTRES PLANTES (Nombre) TRANSFORMEES nombre 2 sur qq fleurs 4 sous papille 6 4filet sous papille-- bouton4 sous papille bouton 4 sac pollinique ; filet sous papille-- + + + sauf papille bouton 4 entier bouton sauf papille âgée pointe haut Pédoncule Soral 19plantes TABLEAU 3 SEPALE PETALE ETAMINE PISTIL FEUILLE SILIQUE AUTRES PLANTES (Nombre) TRANSFORMEES (Nombre) 1fleur souspapille 4 sac pollinique, filet sous papille 6 4 entier sauf papille bordure Pédoncule floral bouton-----1 bouton 4 entier sauf papille bouton 4 entier sauf papille petites Pédoncule floral 3 bouton 4 sac pollinique, filet sous papille 19 bouton 4 filet sous papille pointes 3 36 plantes REFERENCES

Atanassov I et al. (1996) Plant Science 118,185-194 Bechtold N. et al (1993) Comptes-Rendus de l'Académie des Sciences 316, 1194-1199 <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Choisne Nathalie (1997). Etude de l'expression in vivo d'une gène d'ABTt leu de Plaaseolis vulgaris et l'utilisation de ce gène dans un système de suppression.

Thèse de doctorat de l'université de Paris XI (N° d'ordre 4691).

Elomaa P. et al. (1996). Molecular Breeding 2 : 41-50.

Gutterson N. (1995). HortScience, Vol. 30 (5), August 1995.

Hartley RW, 1988. Barnase and barstar : expression of its cloned inhibitor permits expression of a cloned ribonuclease. J. Mol. Biol, 202,913-915.

Lamarque C. (1983) Proc. 6 int. Rapeseed Cong. 1983, Paris, France, pp 903- 907 Noda K-I, et al. (1994). Nature. Vol 369.23 June 1994.

Phillips A. L. and Huttly A. K. (1994). Plant Mol Biol. 24 : 603-615 Siemens and Schieder 1996. Plant Tissue Culture and Biotechnology, 2,66-75