[0001 ] 本发明涉及甲鱼肽的用途，尤其是涉及在对辐 射危害有保护功能的药物领域中的 用途。 背景技术

[0002] 申请号 201010103157. 9专利文献中公开了甲鱼小分子多肽的制备方� �；《中国食 品学报》2008， 02：徐怀德等"甲鱼蛋白酶解产物体外 ACE抑制和抗氧化活性研究"公开了体 外实验证实甲鱼蛋白酶解物 ACE抑制和抗氧化活性的作用；现有技术和专利 中均未述及甲 鱼低聚肽关于辅助抑制肿瘤细胞生长或转移应 用的报导，也没有关于分子量在 1000以下 的甲鱼低聚肽在对辐射危害有保护功能方面的 报道。 发明内容

[0003] 本发明的目的是提供甲鱼肽的新用途，即在制 药中的新应用；本发明的另一目的 是提供一种能对辐射危害有保护功能，有较高 的营养价值，吸收率高,不妨害人体身体健康 的药物或保健食品。

[0004] 本发明甲鱼肽是以甲鱼为主要原料，分子量分 布在 lOOOODalton以内的小分子 肽，其中 140-1000分子量范围占 50%以上。

[0005] 本发明还涉及甲鱼肽在作为制备对辐射危害有 保护功能的药中的应用。

[0006] 涉及分子量分布在 lOOOODalton以内的甲鱼肽在作为制备对辐射危害� ��保护功 能的药中的应用。

[0007] 涉及分子量分布在 2000Dalt _O n以内的甲鱼肽在作为制备对辐射危害有� �护功能 的药中的应用。

[0008] 涉及分子量分布在 140〜 lOOODalton范围以内的甲鱼肽在作为制备对辐射� �害 有保护功能的药中的应用。

[0009] 涉及分子量分布在 300〜 700Dalton范围以内的甲鱼肽在作为制备对辐射危 害有 保护功能的药中的应用。

[0010] 本发明的甲鱼肽是鳖科动物鳖 Trionyx sinensis Wiegmann的全体为原料制备 的。

[0011 ] 为了更好地理解本发明的实质，下面将用分子 量在 140〜 lOOOODalton的甲鱼肽 的药理实验及结果来说明其在制药领域的新用 途。

C0012] 分子量小于 lOOOODalton的甲鱼肽在对辐射危害有辅助保护功� ��的功效研究。

[0013] 1. 材料与方法

1. 1样品来源及处理：受试药为甲鱼肽口服液干� �， lg甲鱼肽 /干粉，由江中药业股份 有限公司提供，人临床服用量为 4g甲鱼肽 /d， 100mL/do

[0014] 1. 2 实验动物及环境：清洁级健康昆明种小鼠，雄 性，体重 18- 22g，江西中医学院 实验动物中心提供，许可证号： SCXK (赣) 2006— 0001。 动物饲养于江西中医学院动物室， 环境许可证： SYXK (赣） 2004-0001，饲养环境温度 21〜 23°C，相对湿度 50〜 60%。

[0015] 1. 3实验方法

1. 3. 1 动物分组：根据体重随机分为 5组，每组 12只。 设立空白对照组,模型对照组， 甲鱼肽口服液低、中、高剂量组。

[0016] 1. 3. 2剂量设计：甲鱼肽口服液每人每日推荐摄入� �为：4. 0g/60kg体重。由此推 算出小鼠每日摄入量为：低剂量组, 0. 333g生药 /kg体重；中剂量组， 0. 667g生药 /kg体重； 高剂量组， 1. 334g生药 /kg体重，分别相当于人每日摄入量的 5、 10和 20倍。将样品以蒸馏 水配制成相应浓度（0. 333g干粉 /20mL、0. 667g干粉 /20mL、l. 334g干粉 /20mL)的灌胃液 进行实验。

[0017] 1. 3. 3 甲鱼肽口服液对辐射引起白细胞减少的影响： 取小鼠 60只，按体重随机分 成 5组，空白对照组、模型对照组，甲鱼肽口服� �低、中、高剂量组，每组 12只。 实验前各组 小鼠眼眶取血 20 μ L,血液分析仪计算每只小鼠白细胞数目。 空白组和模型组灌胃蒸馏水， 甲鱼肽口服液各组动物灌胃给予相应试液 0. 2mL/10g体重，每日 1次，连续 30天。 除空白 对照组外，所有动物于第 16天进行 ⁶ °Co照射,辐照剂量为 5Gy。各组小鼠于辐照后第 3天、 第 14天眼眶取血 20 μ L,血液分析仪计算每只小鼠白细胞数目。

[0018] 1. 3. 4 甲鱼肽口服液对辐射引起骨髓有核细胞数减少 和骨髓细胞 DNA含量降低 的影响：取小鼠 60只，按体重随机分成 5组,空白对照组、模型对照组，甲鱼肽口服液� ��、中、 高剂量组，每组 12只。 空白组和模型组灌胃蒸熘水，甲鱼肽口服液各 组动物灌胃给予相应 试液 0. 2mL/10 _g 体重，每日 1次，连续 30天。 除空白对照组外,所有动物均于第 27天进行 ^Co照射，辐照剂量为 5Gy。各组小鼠于辐照后第 3天脱颈椎处死动物，剥离出股骨,用 lmL 注射器（6. 5号针头）吸取一定体积的 Hank' s液，冲出股骨中的全部骨髓细胞，然后让细� � 悬液通过 4号针头的注射器，让细胞在悬液中充分分散� �镜下计数每 mL骨髓细胞悬液中的 有核细胞数。 另取骨髓细胞液用紫外分光光度计于 260nm处测定，计算 DM含量。

C0019] 1. 3. 5 甲鱼肽口服液对辐射引起血清和肝组织超氧化 物歧化酶（SOD)活性下降 的影响：取小鼠 60只，按体重随机分成 5组，空白对照组、模型对照组，甲鱼肽口服� �低、中、 高剂量组，每组 12只。 空白组和模型组灌胃蒸馏水，甲鱼肽口服液各 组动物灌胃给予相应 试液 0. 2mL/10g体重,每日 1次，连续 30天。 除空白对照组外，所有动物均于第 23天进行 ^Co照射，辐照剂量为 7Gy。各组小鼠于辐照后第 7天取血分离血清，尔后脱颈椎处死动物， 取肝脏， SOD试剂盒检测各组小鼠红细胞及肝组织 S0D活性。

[0020] 1. 3. 6 甲鱼肽口服液对辐射小鼠免疫功能的影响：取 小鼠 60只，按体重随机分 成 5组，空白对照组、模型对照组，甲鱼肽口服� �低、中、高剂量组，每组 12只。 空白组和模 型组灌胃蒸馏水，甲鱼肽口服液各组动物灌胃 给予相应试液 0. 2mL/10g体重,每日 1次,连 续 30天。 除空白对照组外，所有动物均于第 15天进行 Co照射，辐照剂量为 2Gy。 各组小 鼠于辐照后第 15天进行血清溶血素的测定，血清溶血素的测� ��采用血凝法，计算抗体体积 数。

C0021 ] 1 . 4 统 计 方 法 ： 实 验 数 据 以

¾表示，釆用单因素方差分析，比较空白组� ��模型对照组、甲鱼肽组之间的差异， Ρ<0. 05 判断为差异具有显著性。

[0022] 2结果 2. 1 甲鱼肽口服液对辐射引起白细胞减少的影响

试验结果见表 1。与空白对照组比较，模型对照组在辐照后� � 3、 14天 WBC值明显下降， 提示造模成功。 甲鱼肽口服液中、髙剂量组小鼠在辐照后第 3天 BC值较辐照前减少,但与 模型对照组比较，其 WBC值明显升高，提示甲鱼肽口服液预防给药有 抑制辐射引起的 WBC减 少的作用。与模型对照组相比，甲鱼肽口服液 中、高剂量组小鼠在辐照后第 14天对小鼠 WBC 值明显升高且有统计学意义,低剂量组小鼠 WBC值有升高的趋势，但无统计学意义，提示甲 鱼肽口服液给药有对抗辐射引起的 WBC减少的作用。

甲鱼肽口服液对辐射引起白细胞减少的影响（ _§ )

与空白对照组比较， *P〈0. 05, **P<0. 01；与模型对照组比较， ^A P〈0. 05,

[0024] 2. 2甲鱼肽口服液对辐射引起骨髓有核细胞数减� �和骨髓细胞 DNA含量降低的影 响

试验结果见表 2。 与空白对照组相比，模型对照组小鼠骨髓有核 细胞数明显减少，骨髓 细胞 DNA含量明显降低；与模型对照组比较，甲鱼肽 口服液中、高剂量组小鼠骨髓有核细胞 数明显增加，骨髓细胞 DNA含量明显升高，提示甲鱼肽口服液有较好的 对抗辐照所致的骨 髓损伤作用。

[0025] 表 2 甲鱼肽口服液对辐射引起骨髓有核细胞数减少 和骨髓细胞 DNA含量降低的 影响（ t _s )

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与空白对照组比较， *P〈0. 05， **P〈0. 01；与模型对照组比较， ^A P<0. 05, ^AA P<0.

[0026] 2. 3甲鱼肽口服液对辐射引起超氧化物歧化酶（SO D)活性下降的影响

试验结果见表 3。 与空白对照组相比，模型对照组小鼠血清和肝 组织 SOD活性明显降 低；与模型对照组比较，甲鱼肽口服液中、高 剂量组小鼠血清和肝组织 SOD活性明显升高， 提示甲鱼肽口服液能较好的对抗福照所致的机 体氧化还原反应的受损。

[0027] 表 3 甲鱼肽口服液对辐射引起血清和肝组织 S0D活性下降的影响（ )

与空白对照组比较， *P<0. 05, **P〈0. 01；与模型对照组比较， ^A P〈0. 05，

[0028] 2. 4 甲鱼肽口服液对辐射小鼠血中溶血素水平的影 响

试验结果见表 4。与空白对照组相比,模型对照组小鼠血清溶� ��素水平明显降低；与模 型对照组比较，甲鱼肽口服液中、高剂量组小 鼠血清溶血素水平明显升高,提示甲鱼肽口服 液能较好的对抗辐照所致的机体免疫系统的损 伤。

[0029] 表 4 甲鱼肽口服液对辐射引起血清和肝组织 S0D活性下降的影响（ _¾$ )

与空白对照组比较， *P<0. 05， **P〈0. 01；与模型对照组比较， ^A P<0. 05,

[0030] 3. 结论：

根据甲鱼肽口服液复合粉人群推荐日摄入量 4. 0g生药 /60kg体重扩大 5、 10和 20倍 设置低、中、高三个剂量组，即 0. 333g生药、 0. 667g生药、 1. 334g生药 /kg体重，另设 ⁶ °Co照 射模型对照组和空白对照组。灌胃给予相应药 物 30天。实验结果以 P<0. 05判断为差异具 有显著性。 经动物实验研究表明：甲鱼肽口服液中、高剂 量能明显升高辐照后小鼠 WBC值； 甲鱼肽口服液中、高剂量组能升高辐照后小鼠 骨髓有核细胞数和骨髓细胞 DNA含量；甲鱼 肽口服液中、高剂量组能升高小鼠血清和肝组 织 SOD活性，甲鱼肽口服液中、髙剂量能明显 升高辐照后小鼠血清溶血素水平，认为甲鱼肽 口服液对辐射危害有辅助保护功能。 具体实施方式

[0031 ] 实施例 1

一、甲鱼低聚肽制法：

1. 以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼 100kg，去除内脏和油脂,搅碎，加入 1000L纯水， 100° C煎煮 2h ;

2.冷却至 60° C，按原料甲鱼的重量的 2%的比率加入碱性蛋白酶 2kg,60'C恒温酶解 3h,再分别按原料甲鱼重量的 0. 5%的风味蛋白酶 0. 5kg, 55'C恒温酶解 0. 5h,将得到的酶 解液升温至 100° C，灭酶 30tnin ;

3.将酶解液离心后过滤,上清液经过膜截留分子 量为 10万道尔顿的中空超滤膜,精制 分离，进口压力为 2. 5bar,出口压力 1. 8bar,酶解液温度为 30。 C进行超滤分离，薄膜浓 缩，喷雾干燥即得到 11. 6kg粉末甲鱼肽干粉，加入 290升纯水，配制成甲鱼肽口服液。

[0032] 二、甲鱼低聚肽含量测定：

1. 方法提要

低分子量的蛋白质水解物 (包含肽类及游离氨基酸）可溶于三氯乙酸溶� �：高分子量的 蛋白质在三氯乙酸溶液中易沉淀。 样品经三氯乙酸溶液溶解后，离心分离出沉淀 蛋白质物 质,测定出离心清液中的酸溶蛋白质含量，清� �中的酸溶蛋白质含量减去游离氨基酸含量 即为低聚肽的含量。

[0033] 2. 分析步骤

2. 1 酸溶蛋白质含量的测定

称取 2g (精确至 lmg)样品，加入 10mL15%三氯乙酸溶液，混合均匀，静置 10min。 将样 品溶液在 4000rpm下离心 lOmin后，取全部清液，按 GB/T 5009. 5规定的方法测定清液中的 酸溶蛋白质,蛋白质换算系数为 6. 25。 检验结果根据样品的干燥失重，折算为干基。

[0034] 2. 2游离氨基酸含量的测定

样品前处理：称取 20〜 30mg样品，精确到 0. OOOlg,用 3 %磺基水杨酸溶液溶解均匀。 将样品溶液转移至 50ml容量瓶中，定容。 将样品溶液在转速为 4000r/mi _n 离心机上离心 5min得清液，再用 0. 45 μ m微孔滤膜过滤清液,将滤液转移至 50ml容量瓶中，定容后作为仪 器检测用样品。 其余操作同 GB 12292水果、蔬菜汁游离氨基酸含量的测定规定� ��方法。

[0035] 2. 3结果的表述

低聚肽的含量 按式（1 )计算：

:j¾ = ( 1 )

式中 -

1-——样品中低聚肽含量（以干基计),％；

4——样品中酸溶蛋白质含量 (以干基计)，％；

A——样品中游离氨基酸含量（以干基计)，％� ��

[0036] 2. 4测定结果

测定甲鱼低聚肽含量，结果见表 4。

[0037] 表 4甲鱼肽粉中低聚肽的含量测定结果

[0038] 3.相对分子质量小于 1000的肽所占比例（髙效凝胶过滤色谱法）

3. 1方法提要

采用髙效凝胶过滤色谱法测定。 即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子 体积大 小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长 220nm条件下检测，使用凝胶色谱测定相对分 子质量分布的专用数据处理软件 (即 GPC软件)，对色谱图及其数据进行处理，计算� �到低聚 肽的相对分子质量大小及分布范围。

[0039] 3. 2试剂

乙腈：色谱纯；三氟醋酸：分析纯；水：超纯 水或二次蒸馏水。

[0040] 相对分子质量校正曲线所用标准品：细胞色素 C (cyyochrome,層 12500)；抑酞酶 (aprotinin, W6500)；杆菌酶（bacitracin, MW1450)；乙氨酸一乙氨酸―酪氨酸—精氨酸 (丽 451 )；乙氨酸一乙氨酸一乙氨酸（購 189)。

[0041] 3. 3仪器和设备

高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有 GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪； 流动相真空抽滤脱气装置；超声波振荡器；分 析天平：感量 0. 0001g。

[0042] 3. 4色谱条件与系统适应性实验

色谱柱： TSKgel G2000 SWXL 300画 X 7. 8議或性能与此相近的同类型其他适用于测 定蛋白质和多肽的凝胶柱；流动相：乙腈：水 ：三氟乙酸， 45: 55 : 0. 1 (体积比）检测波长： UV220nm；流速：0. 5ml/min；柱温：30°C；进样体积：10 μ 1。

[0043] 为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱 条件下,凝胶色谱柱的柱效即理论 塔板数（Ν)按三肽标准品（乙氨酸一乙氨酸一 乙氨酸）峰计算不低于 5000,低聚肽的分配系 数（Kd)应在 0〜 1之间。

[0044] 3. 5相对分子质量校正曲线制作

分别用流动相配制成 0. 1% (W/V)的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液� ��用孔径为 0. 2-0. 5 μ m聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后分别进样,得� ��系列标准品的色谱图。 以相对 分子质量的对数（IgMW)对保留时间作图或作线� ��回归得到相对分子质量校正曲线及其方 程。

[0045] 3. 6样品制备

称取样品 20. Omg于 10mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，超声振� � lOmin，使样品充分 溶解混匀，用孔径为 0. 2-0. 5 μ πι聚四氟乙烯或尼龙过滤膜过滤后,上机进样� ��

[0046] 3. 7相对分子质量的计算

将 3. 6 制备的样品溶液在上述色谱条件下分析。 然后用 GPC数据处理软件,将样品 的色谱数据代入校正曲线方程中进行计算，即 可得到样品中肽的相对分子质量及其分布范 围。用峰面积归一化法计算相对分子质量范围 在 1000以下的肽的峰面积相对百分比之和。

[0047] 3. 8测定结果

甲鱼低聚肽分子量分布范围测定结果见表 8

表 8甲鱼低聚肽结果

以上结果表明，甲鱼低聚肽分子量主要集中在 140-1000，占 70%以上。

[0048] 实施例 2

甲鱼肽制法：

一、甲鱼肽的制备方法，其步骤如下：

1. 以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼 100kg,搅碎,煎煮 lh；

2. 冷却至 40° C,按原料甲鱼的重量的 0. 2%的比率加入碱性蛋白酶， 60°C恒温酶解 lh,再分别按原料甲鱼重量的 0. 05%的风味蛋白酶，60°C恒温酶解 0. 2h，将得到的酶解液升 温至 85° C，灭酶 lOmin ;

3. 将酶解液离心后过滤，上清液经过膜截留分子 量为 0. 5万道尔顿的卷式膜精制分 离，进口压力为 1. 2bar，出口压力 lbar，龍解液温度为 20° C进行超滤分离，薄膜浓缩，喷 雾干燥即得到 15. 6kg甲鱼肽成品。

[0049] 二、甲鱼肽含量测定：

甲鱼肽含量测定：

按照实施例 1的方法，甲鱼低聚肽分子量主要集中在 140-2000，占 50%以上。

[0050] 实施例 3

一、 甲鱼肽的制备方法,其步骤如下：

1. 以中华鳖为原料,选用鲜活甲鱼 100kg，搅碎，煎煮 4h；

2. 冷却至 40° C,按原料甲鱼的重量的 5%的比率加入碱性蛋白酶， 40°C恒温酵解 10h，或加入原料甲鱼重量的 2%的中性蛋白酶，40'C恒温酶解 4h,将得到的酶解液升温至 120° C，灭酶 60mi _n ;过滤,滤液浓缩，喷雾干燥即得。

[0051] 二、甲鱼肽含量测定：

按照实施例 1的方法，甲鱼肽分子量主要集中在 10000以下，占 95%以上。

[0052] 实施例 4

一、 甲鱼低聚肽的制备方法,其步骤如下：

1. 以中华鳖为原料，选用鲜活甲鱼 100kg，搅碎，煎煮 3h

2. 冷却至 62° C,按原料甲鱼的重量的 3%的比率加入碱性蛋白酶, 62°C恒温 解 4h, 再分别按原料甲鱼重量的 1%的风味蛋白酶，55Ό恒温搅拌酶解 2h,将得到的酶解液升温至 110° C，灭酶 40min ;

3.将酶解液离心后过滤,上清液经过膜截留分子 量为 10万道尔顿的中空超滤膜精制 分离，进口压力为 2. 8bar，出口压力 2bar,酶解液温度为 30° C进行超滤分离，薄膜浓縮， 喷雾干燥即得到 12. 6kg甲鱼低聚肽成品。

[0053] 二、甲鱼低聚肽含量测定：

按照实施例 1的方法，甲鱼低聚肽分子量主要集中在 300-700，占 30%以上。