ARTERIAL Y DISFUNCIÓN VASCULAR

MEMORIA DESCRIPTIVA

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a una combinación farmacéutica, útil para el tratamiento y prevención de la hipertensión arterial y disfunción vascular que comprende los componentes activos ácido 2 (S)- amino-6-boronohexanoico (ABH) y N-acetilcisteína (NAC). Y al método de tratamiento o prevención para la hipertensión arterial y/o la disfunción vascular con dicha combinación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La hipertensión arterial es el principal factor de riesgo cardiovascular en la población adulta mundial, con una alta prevalencia (40%). A pesar del desarrollo de fármacos, la efectividad de los tratamientos actuales es limitada. En un 50% de los pacientes, el tratamiento farmacológico no logra controlarla.

Existen programas de prevención primaria de hipertensión arterial que tratan de reducir los factores de riesgo modificables, como el estilo de vida. Sin embargo, la gran mayoría de los pacientes requieren el uso de fármacos para regularizar la presión arterial. Una vez diagnostica la hipertensión, esta se clasifica de acuerdo a los valores de presión y se determinan factores de riesgo (edad, sexo, tabaquismo, obesidad, entre otros). Esto permite estimar el factor de riesgo cardiovascular (F CV) e iniciar el tratamiento antihipertensivo, que tiene como fin normalizar la presión arterial a niveles < 140/90 mm Hg.

El tratamiento farmacológico se aplica generalmente a pacientes que presentan un FRCV de moderado en adelante, optando en el caso de aquellos que presentan un FRCV bajo a intervenciones en el estilo de vida. Existen varias familias de fármacos hipotensores, las de uso más frecuente son los antagonistas del receptor de angiotensina II (ARAN), los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECA), los bloqueadores de canales del calcio, los diuréticos, los β -bloqueadores y los bloqueadores a- adrenérgicos. Es pacientes hipertensos menores de 55 años, las familias de fármacos de primera línea corresponden principalmente a los ARAN e IECA, y en menor grado a β - bloqueadores. En pacientes mayores de 55 años se opta además por el uso de diuréticos y bloqueadores de los canales de calcio.

Cabe destacar que la monoterapia es efectiva en sólo un 20-30% de los casos, y esto ocurre principalmente en individuos con un F CV bajo o moderado. Por lo tanto, la mayoría de los pacientes terminan siendo tratados con una combinación de al menos 2 fármacos, destacando el uso preferente de la combinación de un IECA (o ARAN) con algún otro fármaco. Actualmente un gran porcentaje del mercado de fármacos antihipertensivos a nivel mundial es dominado por los ARAN o IECA y por los β - bloqueadores, los que presentan un número considerable de efectos adversos. Por esto la búsqueda de alternativas terapéuticas para el tratamiento de la hipertensión es aún un desafío.

El principal aporte de esta invención es proponer un nuevo tratamiento antihipertensivo, el cual busca intervenir de manera simultánea, sobre los mecanismos preponderantes en la patología hipertensiva (déficit de vasodilatadores como el óxido nítrico (NO), aumento del estrés oxidativo y remodelamiento vascular). Basándose principalmente en la normalización de los mecanismos antihipertensivos endógenos, más que en la exacerbación de éstos o el bloqueo de los prohipertensores. De este modo se apunta a prevenir o tratar episodios de hipertensión y, como comentaremos a continuación, de disfunción endotelial.

La disfunción endotelial, caracterizada por una menor capacidad de síntesis del vasodilatador NO, representa un mecanismo común y temprano en el desarrollo de la hipertensión arterial. Los niveles de NO vasculares están fuertemente determinados por la disponibilidad del sustrato L-arginina y del estrés oxidativo, que produce peroxinitrito a partir del NO y superóxido. Dado la alta inestabilidad del NO y los efectos de resistencia que genera el tratamiento con fármacos donantes de NO, cualquier intervención farmacológica que apunte a mantener una disponibilidad fisiológica de la NO in situ, representa una potente aproximación para revertir la disfunción vascular. Aumentar las dosis de los antioxidantes no ha mostrado ser efectivo, por lo que es necesario combinar el antioxidante con un inhibidor de la arginasa, para intervenir en los mecanismos de señalización pro-oxidante, manteniendo la biodisponibilidad del NO en el sistema vascular.

La disfunción endotelial juega un papel primordial en el desarrollo de la hipertensión. Uno de los factores que determinan la disfunción vascular y desarrollo de enfermedades vasculares es la reducción de la disponibilidad del principal vasodilatador; el NO. Dentro de los factores que pueden disminuir la disponibilidad del NO en los vasos se encuentra el estrés oxidativo. Por otra parte, también puede afectarse la concentración de NO al aumentar la expresión y/o actividad de la arginasa, una enzima que compite por el sustrato L-arginina, con la eNOS, la enzima que sintetiza el NO.

Considerando estos dos factores, los inventores desarrollaron una combinación farmacológica para proteger el NO, y su función combinando un inhibidor de la enzima arginasa, el ácido 2(S)-amino-6- boronohexanoico (ABH) y el antioxidante N-acetilcisteína (NAC).

Preferentemente, el ácido 2(S)-amino-6-boronohexanoico (ABH) puede ser sintetizado con el método protegido en la solicitud CL 201402403 o su presentación internacional PCT/CI 2015/050035, del Dr. Marcelo Preite.

En el estado de la técnica se ha sugerido estrategias similares, pero no se ha anticipado la combinación específica de la invención, cuyas propiedades muestran efectos sorprendentes respecto de otras terapias conocidas. Por ejemplo, la patente US6387890 Bl, divulga el uso de ABH como inhibidor de la actividad de arginasa, y como agente terapéutico para desórdenes relacionados con la actividad de esta enzima. El US6387890 Bl indica que es posible combinar la composición con agentes antioxidantes, no obstante, no hay ejemplos específicos de estos compuestos, por lo que este documento no anticipa la invención.

Adicionalmente, la patente US7537785 B2 divulga composiciones para el tratamiento de enfermedades vasculares relacionadas con insuficiencia de NO, donde se protege el uso de un antioxidante en combinación con compuestos que liberan NO, donde el antioxidante es un compuesto de hidralazina, tal como clorhidrato de hidralazina, donde no se menciona NAC como alternativa de antioxidante. Adicionalmente, se indica como alternativa que se podrían utilizar además inhibidores de arginasa, tales como BHA. Este documento no anticipa entonces la combinación de la invención, de NAC y BHA.

De este modo, la invención se distingue de lo conocido hasta ahora, encontrándose además un efecto sinérgico entre ambos componentes en la reducción de la hipertensión y la disfunción arterial, especialmente en la normalización de la reactividad vascular, por ejemplo en la respuesta a acetil colina (ver figuras 6 y 7) , sumado a la normalización de la presión arterial, a reestablecer la estructura y funcionalidad de los vasos sanguíneos y a la reducción del estrés oxidativo. Todo lo cual hace que esta nueva combinación farmacológica sea superior a tratamientos habituales para la hipertensión, efecto que también se demuestra en los ejemplos comparativos (ver ejemplo 2). BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Efecto hipotensor de la administración de NAC (barra blanca) sobre el alza de presión evocada por hipoxia intermitente crónica (CIH, barra llena). La hipoxia intermitente consiste en someter a las ratas a ciclos de 5-6% 02, 12 veces por hora al día, por 8 horas. Se administró NAC (100 mg/día por rata) en el agua de bebida a partir de los 14 días de exposición a CIH. La administración de NAC redujo la hipertensión en las ratas despiertas, (n = 6). * p < 0.05, ANOVA una vía. Media ± SEM. MABP, presión arterial media. Los registros de presión arterial se realizaron con un sistema telemétrico en ratas despiertas.

Figura 2. Efecto de la administración de ABH (400 μg/día por rata, barra blanca) sobre el alza de presión arterial producido por CIH. La administración de ABH, mediante bombas osmóticas, efectivamente redujo la presión arterial. Media ± SEM. (n= 6).

Figura 3. Efecto hipotensor de la combinación ABH y NAC en ratas hipertensas. ABH (400 μg/día por rata, barra blanca) administrada en bombas osmóticas y de NAC (100 mg/día por rata) administrada en el agua de bebida. Media ± SEM. (n= 6).

Figura 4. Panel izquierdo. Sección transversal de una arteria carótida externa obtenida de una rata expuestas a CIH y tratada con ABH (400 mg/día por rata) a lOx. Panel derecho, aumento a lOOx. En estas arterias se midió el grosor interno, la capa media y se registraron las respuestas contráctiles.

Figura 5. Registros con un miógrafo de alambre de máxima fuerza contráctil en respuesta a KCI 125 mM en arterias carótidas de ratas controles y ratas hipertensas (CIH), y tratadas con ABH (400 μg/rata por día), NAC (100 mg/rata por día), o la combinación de ambos en dosis bajas (ABH 200 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día) y altas (ABH 400 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control; * *p < 0.01 vs control, ANOVA, seguida por comparaciones múltiples Tukey. (n = 6-8 por grupo).

Figura 6. Curva de relajación en respuesta a concentraciones acumulativas de acetilcolina (ACh) en arterias carótidas pre-contraídas con KCL 125 mM, de ratas controles, ratas hipertensas (CIH) no tratadas, o tratadas con ABH (400 μg/rata por día), NAC (100 mg/rata por día), y la combinación de ambos en bajas concentraciones (ABH 200 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día) y altas concentraciones (ABH 400 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control; **p < 0.01 vs control, ANOVA, seguida por comparaciones múltiples Tukey. (n = 6-8 por grupo). Figura 7. Máxima respuesta de relajación (panel superior) y de sensibilidad (pD2, panel inferior) en respuesta a acetilcolina (ACh) en arterias carótidas de ratas controles, de ratas hipertensas CI H no tratadas, o tratadas con ABH (400 μg/rata por día), NAC (100 mg/rata por día), y la combinación de ambos en bajas (ABH 200 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día) y altas (ABH 400 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control, ANOVA, seguida por comparaciones múltiples Tukey. (n = 6-8 por grupo).

Figura 8. Estrés sistémico medido con el método de TBA S en plasma de ratas controles, ratas hipertensas (CIH) no tratadas o tratadas con ABH (400 μg/rata por día), NAC (100 mg/rata por día), y la combinación de ambos en bajas (ABH 200 μg/rata por día/NAC 100 mg/rata por día) y altas (ABH 400 μg/rata por día/NAC 100 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control, ANOVA, seguida por comparaciones múltiples Tukey. (n = 6-8 por grupo).

Figura 9. La administración de Losarían redujo significativamente la hipertensión en ratas despiertas sometidas a CIH. * p < 0.05 vs control, ANOVA una vía, seguida por Tukey (Media ± SEM n = 8 ratas).

Figura 10. Diámetro interno medido en arterias carótidas externas de ratas controles, ratas sometidas a CIH, CIH +ABH (400 CIH ABH (400 μg/día) +NAC (100 mg/día), CIH+ NAC (100 mg/día) y CIH Losatran (3 mg/día). *p < 0.05 vs. CI H, ANOVA seguida por Tukey (n = 6-8 ratas por grupo).

Figura 11. Máxima fuerza contráctil en respuesta a KCI 125 mM en arterias carótidas externas ratas controles y de ratas hipertensas CIH-no tratadas, CIH tratadas con la combinación ABH (400ug/rata por día) + NAC (100 mg/rata por día) y CIH tratadas con Losarían (LOS 3 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control, ANOVA seguida por Tukey (n = 6-8 ratas por grupo).

Figura 12. Curva de relajación en respuesta a concentraciones acumulativas de acetilcolina (ACh) en arterias carótidas pre-contraídas con KCI, de ratas controles y ratas hipertensas (CIH) no tratadas, y ratas CIH tratadas con la combinación ABH (400 μg/día) +NAC (100 mg/día) y ratas-CIH tratadas con Losarían (3 mg/día). ***p < 0.001 vs control; **p < 0.01 vs control, *p < 0.05 vs control. ANOVA seguido por Tukey. (n = 6-8 ratas por grupo).

Figura 13. Máxima respuesta de relajación (panel superior) y sensibilidad (PD2, panel inferior) en respuesta a acetilcolina (ACh) en arterias carótidas pre-contraídas con KCI 125 mM, de ratas controles y de ratas hipertensas CIH-no tratadas, CIH tratadas con la combinación ABH (400ug/rata por día) + NAC (100 mg/rata por día) y CIH tratadas con Losartan (3 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control, ANOVA seguida por Tukey (n = 6-8 ratas por grupo).

Figura 14. Estrés oxidativo sistémico en ratas controles, CIH, y ratas CIH tratadas con NAC (400 y 200 mg/rata por día), ABH (400 μg/rata por día), y con la combinación de ambos en diferentes dosis (ABH 400 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día; ABH 200 μg/rata por día + NAC 200 mg/rata por día; ABH 200 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día) y Losartan (LOS 3 mg/rata por día). *p < 0.05 vs control, ANOVA, seguida por comparaciones múltiples Tukey. (n = 6-8 por grupo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La invención se refiere a una nueva combinación farmacéutica, que es útil en el tratamiento y prevención de la hipertensión arterial y la disfunción vascular. Esta combinación comprende como componentes activos el ácido 2 (S)-amino-6-boronohexanoico (ABH) y la N-acetilcisteína (NAC). La invención también se refiere al método de tratamiento para la hipertensión arterial y/o la disfunción vascular con dicha combinación de compuestos activos.

La invención propone que una nueva terapia farmacológica para el tratamiento y prevención de la hipertensión arterial y disfunción vascular que incluye como estrategia la inhibición de la enzima arginasa, combinado con un antioxidante que disminuye el estrés oxidativo y que previene los efectos deletéreos de las especies reactivas de oxígeno, contribuyen a mantener la biodisponibilidad del NO.

Como se verá en los ejemplos, al atacar el problema hipertensivo conjuntamente desde los frentes propuestos, síntesis y estabilidad del NO, y estrés oxidativo, se obtiene un efecto importante sobre el control de la presión arterial y la disfunción endotelial en un modelo experimental de hipertensión, pues la combinación farmacológica de la invención permite intervenir en los mecanismos claves implicados en la disfunción vascular.

Los inventores han encontrado que la combinación ABH+NAC no sólo regulariza el aumento de presión arterial en un modelo de ratas sometidas a hipoxia intermitente, sino que regulariza la función endotelia, revierte el remodelamiento de la pared arterial y reduce el estrés oxidativo, siendo más efectiva que un medicamento habitual para el tratamiento de hipertensión arterial, Losarían, produciendo una corrección integral del problema.

Como indicamos, la invención apunta a una combinación farmacéutica de los componentes activos ácido 2 (S)-amino-6-boronohexanoico (ABH) o sus sales farmacéuticamente aceptables y N- acetilcisteína (NAC). Donde los componentes activos se proveen juntos o por separado en formas farmacéuticas apropiadas, las que obviamente también comprenden portadores y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, de modo de proveer la combinación en forma de una tableta, cápsula, jarabe, gragea, solución inyectable, supositorio, o cualquier otra forma farmacéutica existente en la técnica. Esta combinación farmacéutica sirve para preparar un medicamento útil para el tratamiento de la hipertensión arterial y disfunción vascular.

La invención también apunta a un método de tratamiento o prevención de la hipertensión arterial y disfunción vascular que comprende administrar a una persona o animal simultáneamente o por separado ambos compuestos activos de la invención de modo de que actúen simultáneamente en el cuerpo de la persona o animal que sufre hipertensión o disfunción vascular. Las dosis de administración de cada uno de estos compuestos varían entre 1 μ§ a 100 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de ABH, y entre 0,1 a 100 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de NAC. La dosis exacta a administrar en cada caso depende de muchos factores, incluyendo entre otros del tipo de desorden a tratar, la edad, otras patologías presentes, la vía de administración, etc. Preferentemente, las dosis varían entre 10 μg a 10 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de ABH, y entre 1 a 50 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de NAC. Y aún más preferentemente, las dosis varían entre 100 μg a 5 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de ABH, y entre 5 a 30 mg por kilo de peso del animal o persona en el caso de NAC.

Sólo un porcentaje muy reducido de pacientes con hipertensión tienen una causa conocida para su enfermedad. En efecto, en la gran mayoría de los pacientes (85-90%) no se conoce el origen de la enfermedad. Existe limitada información respecto de los mecanismos patogénicos que llevan a la hipertensión arterial esencial en humanos, debido en parte a las consideraciones éticas que limitan los estudios invasivos y a la alta recurrencia de co-morbilidades que presentan los pacientes. En respuesta a este escenario, se han desarrollado modelos experimentales en roedores que desarrollan hipertensión debido a intervenciones como: selección de genes implicados en la fisiopatología hipertensiva, limitaciones del flujo renal, y la hipoxia intermitente que es la característica principal de la apnea del sueño. En este estudio, el efecto antihipertensivo y anti remodelamiento vascular de la combinación ABH+NAC se determinó en un modelo animal de hipertensión por hipoxia intermitente crónica (CIH). En ratas despiertas se midió la presión arterial usando sensores telemétricos. Esta tecnología de punta permitió medir variables fisiológicas en tiempo real sin perturbar a los animales. En el ámbito de la fisiología vascular, se midió los efectos de ABH+NAC sobre los cambios de reactividad vascular en arterias de ratas hipertensas mediante miografía de alambre. Esta técnica es el "gold standard" para estudiar los mecanismos que subyacen a la función vascular, así como la farmacología de las vías que componen esta función. Esta metodología permite determinar con detalle los efectos del tratamiento ABH+NAC sobre la reactividad y el remodelamiento vascular.

De este modo, en un modelo de hipertensión en ratas, inducido por hipoxia intermitente crónica, de aquí en adelante simplemente CIH, se evaluó el efecto de la combinación de la invención, ABH+NAC, sobre la presión arterial, el estrés oxidativo, la función renal y hepática, el remodelamiento vascular y las respuestas vasoactivas en arterias de resistencia. Se encontró que ABH y NAC administrados independientemente son igualmente efectivos que la administración de la combinación ABH+NAC para reducir la presión arterial, pero que sólo la combinación ABH+NAC revierte el aumento de tensión y la reducción diámetro en arterias de resistencia producido por CIH. Sorprendentemente, además la combinación ABH+NAC normalizó los valores máximos de relajación y de sensibilidad en respuesta a Acetilcolina (ACh) en el modelo estudiado. Se sabe que CIH también produce estrés oxidativo sistémico, que no fue reducido por ABH, pero si por ABH+NAC. Estos resultados demuestran que esta combinación específica de compuestos activos tiene resultados superiores a la suma de cada uno de ellos por separado.

Los resultados experimentales muestran que la combinación ABH+NAC reduce la presión arterial elevada, revierte la reducción del diámetro interno de los vasos y regulariza la función endotelial y contráctil en las arterias de ratas hipertensas.

También se comparó la efectividad de la combinación de la invención ABH+NAC contra Losartan, un bloqueador del receptor ATI a angiotensina II, que es el tratamiento estándar contra la hipertensión. Losartan produce una disminución de la presión arterial elevada por CIH, pero no reduce el aumento de tensión contráctil en arterias de ratas-CIH, mientras que ABH+NAC si lo hace. Además, ABH+NAC demostró ser más efectivo para reducir el efecto vasoconstrictor y para regularizar la vasodilatación inducida por ACh a valores similares a los encontrados en ratas controles. Por otra parte, Losartan no normaliza la respuesta a NO exógeno y no reduce el estrés oxidativo sistémico producido por CIH, mientras que la combinación ABH+NAC si lo hace. Por lo tanto, aunque Losartan es efectivo para reducir la presión arterial elevada, no normaliza la disfunción endotelial ni el estrés oxidativo sistémico, y mantiene respuestas vasodilatadoras exageradas a ACh.

EJEMPLOS. Ejemplo 1. Estudio de efecto de ABH, NAC y de la combinación ABH+NAC

Se estudió la combinación ABH+NAC, determinando sus efectos de sobre 1) Hipertensión 2) Estrés oxidativo 3) Remodelamiento vascular y 4) Reactividad vascular en el modelo de hipertensión por hipoxia intermitente en ratas.

Se indujo hipertensión en ratas por hipoxia intermitente crónica, donde se somete a los animales progresivamente a hipoxia del 7% de 0 ₂ el primer día, hasta llegar a 5% de 0 ₂ el tercer día lo que se mantuvo durante el estudio, manteniendo a las ratas en cámaras hipóxicas. La presión arterial de los animales subió aproximadamente 10 mm Hg al tercer o cuarto día.

Se estudió el efecto sobre la presión en grupos de 6 ratas por serie de experimentos. A cada rata se le implantó sensores telemétricos TA11PA-C40 (Data Science International, USA) para registrar la presión arterial en la arteria femoral en animales despiertos. Se evaluaron distintas condiciones:

• Serie Control

• Serie CIH

• Serie CIH+ NAC (100 mg/día por rata, SIGMA, USA) agua bebida.

• Serie CIH + ABH (400 μg/día rata) bomba osmótica

• Serie CIH + ABH (200 μg/día rata) bomba osmótica + NAC (100 mg/día por rata) agua bebida)

• Serie CIH +ABH (200 μg/día rata) bomba osmótica + NAC (200 mg/día por rata) agua bebida

• Serie CIH +ABH (200 μg/día rata bomba osmótica + NAC (100 mg/día por rata) agua bebida

En paralelo se realizaron series de pruebas en animales sin telémetros (CONTROL, CIH, CIH+NAC, CIH + ABH bomba osmótica, CIH +ABH bomba osmótica + NAC) para obtener muestras de arterias, de sangre, para realizar los estudios de remodelamiento, de contracción vascular y estrés oxidativo.

1.1 Hipertensión.

La Figura 1 ilustra el efecto hipotensor de NAC en ratas hipertensas. En esta serie experimental se procedió a administrar NAC (100 mg/día por rata, SIGMA, USA) en el agua de bebida a partir de los 14 días de exposición a CIH. La administración de NAC redujo la hipertensión en las ratas despiertas (n = 6 ratas). Este resultado constituye la primera evidencia que un antioxidante es capaz de reducir el alza de presión en este modelo. La Figura 2 ilustra el efecto hipotensor de ABH, suministrado por bombas osmóticas de 2 mi (Alzet, USA) implantadas en la espalda bajo condiciones quirúrgicas asépticas en las ratas hipóxicas. Se observa que la administración de ABH (400 μg/día por rata), en las bombas osmóticas, efectivamente redujo la presión arterial.

Finalmente, la Figura 3 muestra el efecto hipotensor de la combinación ABH y NAC en ratas hipertensas. ABH se administró en bombas osmóticas, (400 μg/día por rata) y NAC (100 mg/día por rata) se administró en el agua de bebida. Se ve que la combinación de la invención reduce la presión arterial a valores similares a los obtenidos por cada uno de los componentes por sí mismos.

1.2 Remodelamiento vascular.

Medimos el diámetro interno y la capa media de arterias carotideas externas obtenidas de los animales sometidos a CIH y tratados con ABH, ABH +NAC, y NAC. La Figura 4 muestra ejemplos de cortes transversales de arterias carotideas externas.

El análisis morfométrico realizado en arterias carótidas externas de ratas tratadas con CIH, mostró que la hipoxia intermitente causa una disminución significativa de 30% en el diámetro interno de las arterias carótidas, sin cambios en el grosor de la capa media. Estos cambios fueron acompañados por una mayor fuerza contráctil en respuesta a KCI 125 mM y un menor diámetro óptimo, determinados ex vivo por miografía de alambre, resultados que confirman la presencia de cambios en la estructura y funcionalidad de vasos sanguíneos en este modelo. Los tratamientos ABH (400 μg/día por rata), ABH (400 μg/día por rata) + NAC (100 mg/día por rata) y NAC (100 mg/día por rata) aumentaron el diámetro interno por encima del valor control.

1.3 Reactividad vascular.

Se estudió la reactividad vascular en segmentos de arterias carotideas externas de 2 mm. De manera similar a los resultados del análisis morfométrico, el diámetro interno funcional de las arterias carótidas externas, determinadas por la miografía de alambre, se redujo significativamente en ratas expuestas a CIH (775 ± 22 μιτι) en comparación con las ratas control (883 ± 38 μιτι).

La Figura 5 muestra el efecto de los tratamientos sobre la respuesta contráctil máxima inducida por KCI (125 mM). Claramente, la tensión máxima producida por KCI en arterias carótidas de ratas tratadas con CIH es significativamente mayor en comparación a la respuesta en animales control. El tratamiento con ABH (400 μg/rata por día) redujo el aumento de tensión generado por CIH, sugiriendo un efecto anti-remodelante del tratamiento con la combinación farmacológica. Las combinaciones ABH+NAC, en dosis bajas (ABH 200 μ§/Γ3ΐ8 por día + NAC 100 mg/rata por día) y altas (ABH 400 μ§/Γ8ΐ8 por día) + NAC 100 mg/rata por día), revierte el aumento de la tensión máxima producida por CIH. Sin embargo, NAC (100 mg/rata por día) por sí solo no es capaz de revertir el aumento de tensión.

La Figura 6 muestra la curva de relajación inducida por acetilcolina (ACh) en arterias carótidas externas de ratas normales, CIH y CIH tratadas con ABH, NAC y ABH+NAC. La relajación en respuesta a ACh en arterias carótidas externas fue menor en ratas CIH, y ratas CIH tratadas con NAC comparado con las respuestas controles. Por otra parte, el tratamiento con ABH (400 μg/rata por día), aumentó exageradamente las respuestas vasodilatadoras a acetilcolina por sobre el nivel control. Sólo la combinación ABH+NAC tanto a bajas concentraciones (ABH 200 μg/rata por día+ NAC 100 mg/rata por día) y como a altas concentraciones (ABH 400 μg/rata por día + NAC 100 mg/rata por día) normalizó el efecto vasodilatador de acetilcolina (Figura 7 panel superior) y potenció la sensibilidad a este agente (Figura 7 panel inferior). Por lo tanto, sólo la combinación ABH y NAC fue capaz de normalizar en términos de efecto vasodilatador la respuesta a acetilcolina. Este resultado es importante ya que demuestra que la combinación de la invención logra un resultado que no es logrado por ninguno de sus componentes por sí solos, y que la combinación de la invención lo logra incluso en bajas concentraciones de ABH (200 mg). Por lo tanto, se requiere de ambos componentes (ABH y NAC) para restablecer la respuesta normal vasodilatadora de ACh.

1.4 Estrés oxidativo.

CIH aumento el estrés oxidativo sistémico medido por la per oxidación de lípidos en el plasma (TBA S MDA). El tratamiento con ABH no redujo el estrés oxidativo. La combinación CIH y AC (200 y 400 μg/día por rata) y ABH + NAC (todas las dosis estudiadas) como se aprecia en la Figura 8.

De este modo se observa que en la combinación de la invención se mantienen los beneficios terapéuticos farmacológicos de cada uno de los componentes ABH y NAC por sí mismos, los que son aditivos en la combinación de la invención, es decir, que al usar esta combinación se obtienen los beneficios de ambos componentes, sin observarse una merma de ellos, como podría producirse en algunos casos de interacción negativa, y adicionalmente hay un resultado sinérgico entre ambos componentes, por lo que la combinación de la invención ataca todos los factores asociados a la hipertensión arterial y disfunción vascular. La combinación de la invención reduce la presión arterial, revierte la reducción del diámetro interno y regulariza la función endotelial y contráctil en las arterias sometidas a CIH.

Ejemplo 2. Estudio comparativo de la combinación de la invención ABH+NAC contra Losarían

Se compararon los efectos de Losarían -tratamiento gold-standard para la hipertensión, con la combinación de la invención ABH+NAC sobre los distintos indicadores: 1) Hipertensión, 2) Reactividad vascular, 3) Remodelamiento vascular y 4) Estrés oxidativo; en el modelo de hipertensión por hipoxia intermitente en ratas.

Se realizaron dos series experimentales:

Una serie experimental para medir el efecto de Losarían sobre la presión arterial elevada y sobre la contractilidad de arterias carótidas externas, en ratas sometidas a hipoxia intermitente crónica (n = 8 ratas)

Una serie para experimental para medir el efecto de Losarían sobre la contractilidad de arterias carótidas externas, morfometría de arterias carótidas externas y estrés oxidativo en ratas sometidas a hipoxia intermitente crónica (n = 8 ratas)

2.1 Hipertensión.

La Figura 9 muestra el efecto de Losarían (3 mg/día, administrado medíanle bombas osmóticas subcutáneas), sobre el aumento de presión arterial media inducido por la hipoxia intermitente crónica en ratas. La presión arterial media en medida en las 8 ratas subió de 98,9± 1,8 mmHg a 105,1±1,7 mmHg (p < 0,05). La administración de Losarían redujo la presión media bajo los niveles básales previos 88,2±2,4 mmHg (p< 0,05, medida los días 22-25).

2.2 Remodelamiento vascular.

La Figura 10 muestran los análisis morfométricos realizados en arterias carótidas externas. CIH produce una reducción del diámetro interno, pero no aumenta significativamente el grosor de la capa íntima. Los tratamientos con ABH, NAC ABH+NAC y Losarían en ratas con CIH aumenían el diámeíro iníerno de las arterias esíudiadas.

2.3 Reactividad vascular.

Se comparó la respuesía vasoacíiva in vitro de arterias caróíidas exíernas de raías CIH íraíadas con Losarían con las respuesías arteriales de raías íraíadas con ABH (400 μg/día) + NAC (100 mg/día). Evaluamos la respuesta contráctil inducida por KCI como un índice del remodelamiento vascular, la respuesta a acetilcolina como indicador de la función endotelial y respuesta producida por nitroprusiato de sodio, un generador de NO.

Al comprar los efectos de la combinación ABH (400 μg/día) +NAC (100 mg/día) sobre la función endotelial y vascular de carótidas en ratas sometidas a CIH, encontramos que Losarían no revierte el aumento en la fuerza contráctil inducido por CIH, ver Figura 11, presentando una mayor fuerza contráctil comparado con los controles y ratas-CIH tratadas con la combinación ABH+NAC.

Por el contrario, la respuesta a acetilcolina fue mayor en ratas-CIH tratadas con Losarían en términos del efecto máximo y la sensibilidad, comparados con ratas controles y ratas-CIH tratadas con ABH+NAC, ver la Figura 12 y la Figura 13. Estos resultados sugieren que el efecto antihipertensivo de Losarían mejoran la función endotelial, pero no revierte el aumento de la fuerza contráctil inducido por la CIH, reforzando la idea que la combinación ABH+NAC es el normalizador de la función vascular. Este efecto antiremodelante exclusivo de la combinación frente a Losarían, estarían dados por los mecanismos a mediano y largo plazo acíivados por niveles de NO endógenos (derivados de la acíividad de eNOS), el cual acíúa como un regulador negaíivo de la proliferación del músculo liso vascular, así como la ausencia de esírés oxidaíivo.

2.4 Estrés oxidativo sistémico.

Tal como esperábamos, la exposición a CIH produjo esírés oxidaíivo sisíémico medido por la peroxidación de lípidos en el plasma (MDA). El íraíamienío con Losarían o con ABH no redujo el esírés oxidaíivo, mieníras que la combinación CIH y NAC (200 y 400 μg/día por raía) y ABH + NAC (íodas las dosis esíudiadas) fueron efecíivas para disminuir el esírés oxidaíivo inducido por CIH, los resulíados se grafican en la Figura 14

De esíos esíudios se puede concluir que, por una parte, el íraíamienío con Losarían es más efecíivo para bajar la presión arterial en raías someíidas a CIH, en relación a los íraíamieníos con ABH, NAC, y a la combinación ABH+NAC. Sin embargo, Losarían no reduce el aumenío de íensión conírácíil evocado por KCI en raías CIH, mieníras que la combinación ABH +NAC si lo hace. Adicionalmeníe el íraíamienío con ABH+NAC es el más efecíivo para reducir el efecío vasoconsíricíor inducido por KCI en vasos arteriales in viíro y para regularizar la vasodilaíación inducida por Aceíilcolina a valores similares a los enconírados en las raías coníroles. Losartan no reduce el estrés oxidativo sistémico (TBARS) producido por CIH, mientras que las ratas CIH tratadas con NAC o con la combinación ABH+NAC presentan valores similares a los controles. Por lo tanto, se concluye que, aunque Losartan es el mejor agente para reducir la presión arterial elevada, no normaliza la disfunción endotelial ni el estrés oxidativo sistémico, y presenta respuestas vasodilatadores exageradas a ACh y más sensibles a SNP. Estos resultados sugieren que el NO esta reducido en los vasos sanguíneos durante CIH, y que Losartan no mejoría su biodisponibilidad.