SANTIAGO MORA, Raquel María (Sanidad y Residencias 21, S.A.U.Avda. del Gran Capitá, 2 Córdoba, E-14008, ES)
CASADO DÍAZ, Antonio (Sanidad y Residencias 21, S.A.U.Avda. del Gran Capitá, 2 Córdoba, E-14008, ES)
QUESADA GÓMEZ, José Manuel (Sanidad y Residencias 21, S.A.U.Avda. del Gran Capitá, 2 Córdoba, E-14008, ES)
SANTIAGO MORA, Raquel María (Sanidad y Residencias 21, S.A.U.Avda. del Gran Capitá, 2 Córdoba, E-14008, ES)
CASADO DÍAZ, Antonio (Sanidad y Residencias 21, S.A.U.Avda. del Gran Capitá, 2 Córdoba, E-14008, ES)
| REIVINDICACIONES 1.- Composición farmacéutica que comprende oleuropeina para su utilización en Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis. 2.- Composición farmacéutica que comprende oleuropeina según Ia reivindicación 1 , caracterizada porque Ia composición comprende oleuropeina a una concentración comprendida entre 10~7 M y 10~4 M. 3.- Composición farmacéutica que comprende oleuropeina según las reivindicaciones 1 y 2, para su utilización en Ia formación de células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales. 4.- Composición farmacéutica que comprende oleuropeina según las reivindicaciones 1 y 2, para su utilización en Ia formación de vasos a partir de células endoteliales. 5.- Composición farmacéutica que comprende oleuropeina según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque dicha composición es para administración oral, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intramuscular, intravenosa o para inhalación. 6.- Utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis. 7.- Utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis, caracterizada porque Ia composición comprende oleuropeina a una concentración comprendida entre 10"7 M y 10~4 M. 8.- Utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis, caracterizada porque Ia composición se utiliza en Ia formación de células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales. 9.- Utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis, caracterizada porque Ia composición se utiliza en Ia formación de vasos a partir de células endoteliales. 10.- Utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis, caracterizada porque dicha composición es para administración oral, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intramuscular, intravenosa o para inhalación. |
SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se encuadra dentro del sector médico-farmacéutico y específicamente en el campo técnico de Ia promoción de Ia angiogénesis y vascularización, Ia reparación endotelial y el tratamiento de las heridas y úlceras.
Constituye el objeto de Ia presente invención una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vascularización que comprenda como ingrediente activo a Ia oleuropeina. Dicha capacidad para inducir angiogénesis y vascularización, puede utilizarse en general para preparar composiciones terapéuticas o en aplicaciones concretas en las que se desee promover Ia diferenciación de células madre a células endoteliales progenitoras (EPCs) y/o células endoteliales maduras, junto con Ia inducción de Ia formación de vasos a partir de esas células endoteliales. Entre otras, las enfermedades cardiovasculares, los procesos isquémicos en general, las úlceras y Ia cicatrización de las heridas, son patologías que pueden ser tratadas con esta composición angiogénica e inductora de Ia vascularización tanto en humanos como para uso veterinario.
ESTADO DE LA TÉCNICA Se distinguen tres procesos principales en los que ocurre Ia formación y remodelación de vasos sanguíneos y que son denominados como vasculogénesis, angiogénesis y arteriogénesis Carmeliet, P. (2004). "Manipulating angiogénesis in medicine." J Intern Med 255(5): 538-61 . La vasculogénesis comprende Ia formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de células precursoras endoteliales (EPCs) que migran y se diferencian a células endoteliales en aquellos lugares en donde se inicia Ia vascularización. Su papel es importante en Ia neovascularización postnatal provocada por isquemia, heridas o cáncer. La angiogénesis consiste en Ia formación de nuevas ramificaciones de capilares a partir de vasos sanguíneos existentes. El desarrollo de nuevos capilares es esencial para el desarrollo de distintas situaciones fisiológicas y patológicas como Ia proliferación endometrial, Ia recuperación post-isquemia, cicatrización de heridas y crecimiento tumoral (Risau, W. Mechanisms of angiogénesis. Nature 1997; 386, 671-4). La arteriogénesis por su parte, se refiere al remodelado de una arteria existente como consecuencia de su adaptación al flujo sanguíneo. El mecanismo de Ia arteriogénesis difiere del de Ia angiogénesis, en que Ia primera se produce principalmente como consecuencia de estrés físico (p. ej. Ia rotura u obstrucción de un vaso) y Ia segunda se produce principalmente por hipoxia.
Fisiológicamente, el organismo controla Ia angiogénesis a través de una serie de reguladores que actúan como unos interruptores "on" y "ofl". Los interruptores "on" son conocidos como factores de crecimiento angiogénico, mientras que los "ofl" se les conoce como inhibidores angiogénicos endógenos. En condiciones normales, estos dos tipos de factores se encuentran en equilibrio. Sin embargo, cuando ocurre un aumento descontrolado y/o excesivo de Ia angiogénesis pueden desarrollarse patologías como cáncer, aterosclerosis y retinopatía diabética, entre otras. Por otro lado, una disminución de Ia angiogénesis puede favorecer el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, procesos isquémicos en general, úlceras y dificultad en Ia cicatrización de heridas, etc....
Para el tratamiento de las patologías asociadas a una menor angiogénesis se han investigado y probado distintas posibilidades terapéuticas. Así, se ha intentado aplicar directamente factores de crecimiento que promueven Ia formación de vasos, como el factor de crecimiento endotelial (EGF), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento fibroblástico (FGF), entre otros. También se ha intentado liberar estos factores en Ia zona afectada mediante técnicas de terapia génica, utilizando vectores plasmídicos, adenovirales, u otros. Otros factores en los que se está investigando recientemente con el mismo fin, son el factor-1 alfa inducible de hipoxia (HIF- 1 α), FGF-4 y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), entre otros. Como factores angiogénicos también se están evaluando sustancias pleiotrópicas, como Ia péptidasa tejido kallikrein (TK), activadores de los receptores activados por proteinasas (PAR-activadores), Ia trombina, Ia proteína "frizzled-A" y el óxido nítrico [Madeddu, P. (2005). "Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration." Exp Phvsiol 90(3): 315-26]. Además, actualmente, se están probando terapias celulares con Ia aplicación de células madre o EPCs para promover Ia angiogenesis con fines terapéuticos [Tarzami, S. T. and J. P. Singh (2004) "Pharmacological revascularisation in coronar/ and peripheral vascular disease." Expert Opin Investig Drugs 13(10): 1319-26)].
Dentro de las patologías que se caracterizan por angiogenesis deficiente, se encuentra Ia isquemia orgánica, principalmente Ia cardiovascular, Ia cual es una de las causas principales de muerte en el mundo desarrollado. En los procesos de isquemia, Ia oclusión de una arteria de tamaño medio tiene que ser compensada con el aumento de Ia capilaridad y tamaño del lumen de los vasos adyacentes. En el caso de que exista disfunción endotelial, el desarrollo colateral de nuevos vasos es insuficiente para permitir Ia normal perfusión del tejido en riesgo, produciéndose Ia isquemia residual [Pandya, N. M., N. S. Dhalla, et al. (2006). "Angiogenesis a new target for future therapy." Vascul Pharmacol 44(5): 265-74)].
El VEGF se ha utilizado en el tratamiento de las isquemias, pero no está aún bien establecido si es capaz de inducir el crecimiento de grandes vasos. Por otra parte el VEGF produce hipotensión y edemas tisulares, Io que limita su aplicación sistemática y dificulta su dosificación adecuada, que además debería de ser combinada con otros agentes que indujeran Ia formación de grandes vasos. El HIF se considera que puede tener un potencial mayor que el VEGF debido a que al tratarse de un factor de transcripción que modula distintos genes angiogénicos, induce una respuesta mayor [Simons, M. and J. A. Ware (2003). "Therapeutic angiogenesis in cardiovascular disease." Nat Rev Druq Discov 2(11 ): 863-71]. El modo aparentemente más efectivo para Ia liberación de una sustancia angiogénica en un tejido afectado por isquemia es por transferencia genética a través de un vector viral. Sin embargo, Ia inmunidad a los adenovirus, que son los vectores utilizados más frecuentemente, difiere ampliamente en Ia población, por Io que el impacto terapéutico de esta estrategia terapéutica se reduce significativamente [Madeddu, P. (2005). "Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration." Exp Phvsiol 90(3): 315-26]. Otra aproximación terapéutica para el tratamiento de las isquemias consiste en Ia aplicación de células madre. Éstas, debido a su plasticidad, pueden diferenciarse en elementos vasculares y no vasculares, por Io que pueden regenerar Ia parte dañada por Ia isquemia. Así, por ejemplo, en el caso de infarto de miocardio, dichas células, pueden, además, diferenciarse en miocitos, recuperando el tejido dañado.
La estrategia de Ia utilización de terapia celular parece prometedora, pero existe el problema de Ia pérdida de funcionalidad de las EPCs pocas horas después del transplante. Para combatir este fenómeno se ha propuesto: 1 ) que Ia liberación de las células sea local en lugar de sistémica, 2) La administración de quimioquinas para promover Ia movilización de las EPCs, 3) enriquecimiento y expansión de los cultivos de EPCs y 4) aumento de Ia funcionalidad de las EPCs por modificación genética [Madeddu, P. (2005). "Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for tissue regeneration." Exp Phvsiol 90(3): 315-26].
Otras enfermedades en las que se detecta una inadecuada neovascularización son por ejemplo Ia diabetes o Ia hipercolesterolemia. En estas patologías no sólo se da una disminución de Ia producción de factores angiogénicos, sino que se observan también alteraciones en Ia proliferación y viabilidad de las EPCs [Van BeIIe E, Rivard A, Chen D, Silver M, Bunting S, Ferrara Neí al. (1997) Hypercholesterolemia attenuates angiogenesis but does not preclude augmentation by angiogenic cytokines. Circulation 96, 2667-2674]; [Rivard A, Silver M, Chen D, Kearney M, Magner M, Annex B et al. (1999) Rescue of diabetes-related impairment of angiogenesis by intramuscular gene therapy with adeno-VEGF. Am J Pathol 154, 355-363]. La disfunción endotelial también afecta a Ia disminución de Ia capacidad angiogénica que ocurre con el envejecimiento, y además se ha correlacionado inversamente el número y Ia capacidad migratoria de las EPCs, con el riesgo de padecer enfermedades coronarias.
De una correcta angiogenesis también depende Ia alveolarización pulmonar [Jakkula, M., Le Cras. DT. , Gebb. S., Hirth. K.P., Tuder, R.M., 2000. Inhibition of angiogenesis decreases alveolarization in the developing rat lung. Am. J.
Physio!., Lung CeI!. Mo!. Physio!. 279. L600-L607]. En pacientes con enfisema pulmonar inducido por tabaquismo, se produce un bloqueo del receptor de! VEGF que provoca Ia apoptosis de las células alveolares. Por eüo. los tratamientos que favorezcan Ia angiogenesis pueden contribuir a corregir las hipoplasías pulmonares [Pandya, N. M., N. S. Dhalla, et al. (2006) "Angiogenesis~a new target for future therapy." Vascul Pharmacol. 44(5): 265- 74]. En cuanto a Ia implicación en Ia cicatrización de heridas, este proceso comprende distintas etapas, como angiogénesis, depósito de colágeno, formación de tejido granular, epitelización y contracción de Ia herida. También aquí, las células que intervienen en el proceso de angiogénesis son las EPCs [Eming, S.A., Smola, H. Krieg, T. Treatment of chronic wounds: state of the art and future concepts. CeIIs Tissues Organs 2002; 172, 105-17]. Estas células se han aislado de sangre humana y pueden contribuir a Ia reparación del endotelio dañado y a Ia formación de nuevos vasos sanguíneos. Las células progenitoras endoteliales de Ia sangre derivan de células madre endoteliales/angioblásticas localizadas en Ia médula ósea [Hristov M, Weber C. Endothelial progenitor cells: characterization, patho-physiology, and possible clinical relevance. J CeII Mol Med 2004; 8, 498-508]; [Iwami Y, Masuda H, Asahara T. Endothelial progenitor cells: past, state of the art, and future. J CeII Mol Med 2004; 8:488-97]. La alta concentración de factores de crecimiento, como por ejemplo el factor de crecimiento endotelial (FGF) liberado tanto por Ia matriz extracelular como por las células dañadas del parénquima, supone una importante contribución en las fases iniciales de Ia respuesta angiogénica [Risau, W. Mechanisms of angiogénesis. Nature 1997; 386, 671-4] En fases posteriores de Ia curación de Ia herida, se induce una angiogénesis adicional a través del incremento de VEGF en el tejido dañado, que presenta un pico varios días tras el daño [Karayiannakis AJ, Zbar A, Polychronidis A, Simopoulos C. Serum and drainage fluid vascular endothelial growth factor levéis in early surgical wounds. Eur Surg Res 2003; 35, 492-6]. De Ia misma manera, Ia presencia del factor VEGF, en determinadas concentraciones, en el medio de cultivo de células madre mesenquimales (MSCs) es Ia causa de Ia diferenciación de estas células hacia células del endotelio [Liu, JW, Dunoyer- Geindre S, Serre-Beinier V, Mai G, Lambert JF, Fish RJ, Pernod G, Buehler L, Bounameaux H, Kruithof EK. Characterization of endothelial-like cells derived from human mesenchymal stem cells. J Thromb Haemost 2007; 5: 826-34]. La reparación tisular mediada por VEGF se produce a través de dos mecanismos de acción: 1 ) aumento de Ia permeabilidad vascular, Io que permite el acceso de células inflamatorias al lugar de Ia herida. 2) incremento de Ia migración y proliferación de células endoteliales. El más abundante y activo de los factores VEGF es el VEGF-A que se une a diferentes receptores de Ia familia VEGF/tirosínquinasa, aunque Ia señal de transducción está mediada principalmente por el VEGFR2.
Recientemente se está considerando un nuevo uso de los factores angiogénicos sobre los tumores basado en las peculiaridades de su sistema vascular. Ya que entre otras anormalidades, presentan alteraciones de Ia permeabilidad, vaso dilatación, estructuras tortuosas, descenso de Ia cobertura de peridocitos e irregularidades en las estructuras de membrana subyacentes. Este caos del sistema vascular provoca que el aporte sanguíneo en el tumor sea inadecuado Io que a su vez provoca una disminución de Ia eficacia de quimio- y radioterapias [Jain, R. K. (2005). "Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy." Science 307(5706): 58-62]. En un principio se planteó el uso de agentes antiangiogénicos sobre el sistema vascular tumoral, pero actualmente las terapias más innovadoras contra el cáncer están utilizando Ia acción combinada de agentes anti y proangiogénicos para revertir Ia anormalidad del sistema vascular en el tumor [Ellis, L. M. and D. J. Hicklin (2008). "VEGF-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity." Nat Rev Cáncer 8(8): 579-91]. Estos tratamientos parece que están siendo efectivos, permitiendo que Ia normalización vascular provocada aumente Ia eficacia de las terapias antitumorales [Fukumura, D. and R. K. Jain (2007). "Tumor microvasculature and microenvironment: targets for anti-angiogenesis and normalization." Microvasc Res 74(2-3): 72-84].
Actualmente, una gran cantidad de compuestos antioxidantes procedentes de especies vegetales, están siendo estudiados además de por su actividad antioxidante, por su influencia en distintos procesos fisiológicos como Ia inflamación, Ia diferenciación celular, Ia tumorogénesis, etc. Uno de estos compuestos, con una importante actividad biológica es Ia oleuropeína, biofenol de Ia familia de los secoiridoides, que se encuentra principalmente en Ia hoja del olivo, en su fruto y en el aceite de oliva.
La oleuropeína presenta tanto actividad antioxidante como antimicrobiana [Waterman E, Lockwood B. Active components and clinical applications of olive oil. Altern Med Rev 2007; 12, 331-42]; [Manna C, Migliardi V, Golino P, Scognamiglio A, Galletti P, Chiariello M, Zappia V. Oleuropein prevenís oxidative myocardial injury induced by ischemia and reperfusion. J Nutr Biochem 2004; 15, 461-6]; [Micol, V., Caturla, N., Perez-Fons, L., Mas, V., Pérez, L. and Estepa, A. (2005) The olive leaf extract exhibits antiviral activity against viral haemorrhagic septicaemia rhabdovirus (VHSV). Antiviral Res 66, 129-36]; [Turner, R., Etienne, N., Alonso, M. G., de Pascual-Teresa, S., Minihane, A. M., Weinberg, P. D. and Rimbach, G. Antioxidant and anti- atherogenic activities of olive oil phenolics. lnt J Vitam Nutr Res 2005; 75, 61- 70], y además se ha propuesto su utilización para el tratamiento de enfermedades del sistema vascular periférico, particularmente en insuficiencia venosa (WO 2007/051829). La oleuropeina captura los aniones superóxido y los radicales hidroxilo e inhibe los radicales ácidos derivados del proceso respiratorio de los neutrófilos [Visioli F, Bellomo G, GaIIi C. Free radical-scavenging properties of olive oil polyphenols. Biochem Biophys Res Commun 1998; 247, 60-4] Además, Ia oleuropeina reduce Ia cantidad de proteína oxidada, a través del incremento en Ia tasa de degradación mediada por proteosoma.
En Ia presente invención se presenta una nueva propiedad que hasta el momento no se Ie había atribuido a Ia oleuropeína, Ia de promover Ia diferenciación endotelial y Ia angiogénesis. Este compuesto natural, por Io tanto, puede ser utilizado sólo, en combinación con otros compuestos o con células madre, para el tratamiento de patologías en las que sea necesaria Ia inducción de neovascularización.
Existen extractos naturales que tienen capacidad de promover Ia angiogénesis. Así por ejemplo Ia patente WO 2005/105127 describe Ia utilización de un extracto de piel de frutas cítricas con capacidad de acelerar Ia cicatrización de heridas en ratas y promover Ia angiogénesis.
Sin embargo, los extractos vegetales consisten en mezclas de compuestos que pueden variar según las condiciones ambientales en las que se encuentren las plantas, tales como composición del suelo, presencia de plagas, disponibilidad de agua, nutrientes, etc. Por ello, aunque fáciles de obtener, su efectividad puede verse comprometida en determinadas condiciones. Por Io tanto, parece más útil Ia utilización de principios activos, como Ia oleuropeina, Ia cuál puede ser utilizada a las concentraciones deseadas.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
Constituye un objeto de Ia presente invención una composición farmacéutica que comprende oleuropeina para su utilización en Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis. La oleuropeina se encuentra en dicha composición a una concentración comprendida entre 10 "7 M y 10 ~4 M.
Específicamente, Ia composición que comprende oleuropeina puede utilizarse en Ia formación de células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales y también en Ia formación de vasos a partir de células endoteliales.
La composición se prepara para administración oral, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intramuscular, intravenosa o para inhalación.
Constituye igualmente un objeto de Ia presente invención Ia utilización de oleuropeina en Ia preparación de una composición farmacéutica para Ia inducción de angiogénesis y vasculogénesis. La oleuropeina se encuentra en dicha composición farmacéutica a una concentración comprendida entre 10 ~7 M y 10 "4 M.
Específicamente, Ia composición que comprende oleuropeina puede utilizarse en Ia formación de células endoteliales derivadas de células madre mesenquimales y también en Ia formación de vasos a partir de células endoteliales.
La composición se prepara para administración oral, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intramuscular, intravenosa o para inhalación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 A y B compara dos imágenes de microscopía óptica de células madre mesenquimales. Las células tratadas con oleuropeina, imagen B, forma estructuras tubulares típicas del proceso angiogénico. Esas mismas células sin el tratamiento de oleuropeina no son capaces de formar dichas estructuras, imagen A.
Figura 2 compara Ia variación en el tiempo de los marcadores de membrana CD144 y VEGFR2, característicos de las fases intermedias de Ia diferenciación de células madre mesenquimales a células endoteliales. Estas células madre mesenquimales fueron tratadas con oleuropeina, VEGF o no tratadas (control). La presencia de estos marcadores endoteliales en las células mesenquimales tratadas a los 3 y 11 días de tratamiento con oleuropeina es mayor que en el cultivo control, y equiparable al porcentaje de estos marcadores encontrados en el cultivo celular tratado con VEGF. Ello indica que las células madre mesenquimales tratadas con oleuropeina se están diferenciando a células endoteliales.
Figura 3 se muestra variación de Ia expresión de genes relacionados con Ia angiogénesis en el tiempo, en cultivos de células madres mesenquimales tratadas con oleuropeina, VEGF o sin tratamiento (control). El tratamiento con oleuropeina provoca que Ia expresión de estos genes aumente con respecto al control incluso con respecto a los cultivos tratados con VEGF
Figura 4 comparación de Ia capacidad de formar estructuras tubulares entre células HUVECs tratadas conl VEGF (figura 4 C y D) y oleuropeina (figura E y F) sobre matrigel. Como control (figura 4 A y B) se utilizó medio sin VEGF ni oleuropeina. Las figuras A, C y E corresponde a imágenes obtenidas con microspio óptico, mientras que las figuras B, D y F corresponde a los mismos cultivos pero obtenida Ia imagen con microscopía de fluorescencia. En este último caso se marcaron las estructuras tubulares mediante un anticuerpo específico suministrado en el kit de matrigel utilizado. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La actividad de Ia oleuropeina como factor angiogénico queda demostrada por:
1) Evidencias fenotípicas: tras 15-20 días de cultivo de células madre mesenquimales con oleuropeina se forman estructuras típicas de células endoteliales tales como microvasos.
2) Evidencias de expresión de marcadores de membrana: El tratamiento con oleuropeina provoca un aumento de células con marcadores de superficie CD144 y VEGFR2.
3) Evidencias de expresión de genes implicados en Ia diferenciación endotelial: VEGF, PCAM, PDGFR y VEGFRl
Estas evidencias se han puesto de manifiesto mediante Ia siguiente metodología:
Cultivo de células madre mesenquimales
Las células madres mesenquimales obtenidas de médula ósea humana fueron expandidas y crecidas en medio esencial mínimo modificación alfa (α-MEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 2mM Ultraglutamina y con antibióticos. Cuando las células estaban cerca de Ia confluencia se iniciaron los siguientes tres tratamientos:
1. Oleuropeina 10 "6 , 10 "5 y 10 "4 M,
2. Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) 10μg.mL 3. Control, sin tratamiento
Las células fueron incubadas a 37 0 C con 5% de CO2 y los medios fueron cambiados cada 3 días a Io largo de todo experimento.
Células endoteliales La línea establecida de células endoteliales obtenidas de vena umbilical humana (HUVE) fue suministrada por Lonza Group, Ltd. Switzerland, estas células fueron expandidas en frasco con medio básico endotelial (EBM, Lonza) suplementado con antibióticos y suero fetal bovino. Cuando las células llegaron a Ia confluencia fueron subcultivadas. El medio fue cambiado cada 3 días. Para llevar a cabo estos experimentos se utilizaron las células del 2 o y 3er pase. Los tratamientos que recibieron estas células fueron: 1.- Oleuropeina 10 ~6 M 2.- VEGF 10 μg/mL 3.- Control, sin tratamiento
Estudios de citometría de flujo y anticuerpos monoclonales
Para el estudio y análisis de los marcadores celulares de membrana se realizaron ensayos de citometría de flujo. Las células fueron lavadas con PBS + 3% suero fetal bovino, los anticuerpos monoclonales anti-humano conjugados, CD144-FITC y VEGFR2-PE fueron incubados durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células marcadas fueron lavadas tres veces, resuspendidas en 0.5 mi de PBS y analizado el mareaje con un citómetro de flujo FACScan Caliber (Benton-Dickinson).
Reacción en cadena de Ia polimerasa en tiempo real (RT-PCR)
Para analizar Ia expresión de marcadores génicos angiogénicos se utilizó Ia PCR en tiempo real. El RNA total de las células fue obtenido utilizando el reactivo Tri Reagent (Sigma Aldrich) y siguiendo las instrucciones del fabricante. El cDNA fue sintetizado a partir de un microgramo de RNA total, que previamente había sido tratado con DNAsal (Sigma Aldrich), utilizando el kit iSCript TMcDNA Síntesis Kit de Biorad, La PCR en tiempo real utilizada para cuantificar los mRNA analizados fue llevada a cabo en un sistema Light-Cycler (Roche) utilizando SYBR®Green. Estas reacciones fueron realizadas en un volumen final de 10 μL con 1 μl_ de cDNA, 10pmol de cada primer y Quantitec® SYBR®Green master mix (Qiagen). Las condiciones para el Light-Cycler fueron 95 0 C durante 15min, 40 ciclos de 95 0 C durante 3Os, 6O 0 C durante 15s y 72 0 C durante 3Os y 72 0 C durante 1 min. El ciclo umbral (Ct) del gen diana fue estandarizado con el correspondiente del gen constitutivo pGAPDH.
Angiogénesis
Para llevar a cabo los ensayos de angiogénesis In Vitro se utilizó el kit Endothelial Tube Formation Assay, CeII Biolab Inc. Las condiciones del ensayo son las que se indicaban en las instrucciones del proveedor. Los medios utilizados fueron medio endotelial básico suplementado sin tratar (control negativo) y tratado con VEGF (control positivo) o con oleuropeína. Las estructuras formadas fueron marcadas mediante un anticuerpo conjugado con calcein AM suministrado en el kit, específico para los túbulos.
Resultados obtenidos en Ia diferenciación de células madre mesenquimales a células endoteliales
La capacidad de Ia oleuropeína para promover Ia angiogénesis en células madres se pone de manifiesto en Ia Figura 1 , donde pueden observarse las estructuras tubulares, característica de células endoteliales obtenidas por diferenciación de células madre mesenquimales tratadas con oleuropeína. El análisis por citometría de los marcadores de superficie característicos de células endoteliales, como son el CD144 y VEGFR2 mostró que estos se encuentran en MSCs tratadas con oleuropeína (Figura 2) y en todos los casos analizados el porcentaje de estos marcadores endoteliales en las células tratadas con oleuropeína muestran diferencias significativas con respecto al cultivo control.
Los resultados mostrados en Ia Figura 3 permiten analizar Ia expresión génica de diferentes genes involucrados en Ia diferenciación endotelial. En el gen VEGF se observó un aumento de Ia expresión cuando las células son tratadas con oleuropeína, superior al que se observa en células tratadas con VEGF exógeno a partir del día 11 de tratamiento. Desde el inicio, además Ia expresión es superior a Ia del cultivo control sin tratar. En el gen PCAM los niveles de expresión son superiores en los cultivos tratados con oleuropeina que con VEGF, aunque estos valores sólo son superiores a los cultivos controles en el día 34 del tratamiento. El gen PDGFR en células tratadas con oleuropeina presenta un aumento de expresión en el tiempo. La expresión es superior en todos los tiempos al compararla con Ia expresión en células control y a partir del día 11 de tratamiento si se compara con las tratadas con VEGF. En Ia expresión del gen VEGFR1 existe un aumento de Ia expresión en el tiempo en las células que han sido tratadas con oleuropeina. Este incremento es mayor que el de las células control a partir del día 11 y con respecto a las células tratadas con VEGF exógeno, Ia expresión en todos los tiempos es superior, principalmente a los 34 días.
Resultados obtenidos en Ia inducción de angiogénesis en células endoteliales
La capacidad de Ia oleuropeína para promover Ia angiogénesis en células endoteliales fue probada y evaluada mediante experimentos celulares en sustrato de matrigel. Las células endoteliales tratadas con oleuropeína presentaron una capacidad equiparable al VEGF de promover Ia formación de estructuras tubulares típicas de Ia formación de vasos sanguíneos (Figura 4).
Comparación de los resultados con el estado de Ia técnica.
Como ya se ha hecho referencia en apartados anteriores de este documento, Ia angiogénesis comienza con un daño tisular Io que provoca Ia activación de Ia proliferación de las células endoteliales y el ensamblaje de las misma en estructuras tubulares alrededor de las cuales se formaran las nuevas paredes del vaso [Karamysheva AF. Mechanisms of angiogénesis 2008 Biochemistry]; Los resultados aquí presentados con Ia oleuropeína permiten proponer Ia aplicación de este principio activo como factor angiogénico, capaz no sólo de promover Ia formación de las estructuras tubulares sino también de diferenciar células madre hasta células endoteliales capaces de formar dichas estructuras. Los resultados obtenidos con Ia oleuropeína como promotor de angiogénesis son equiparables o superiores a los del VEGF. Este factor es uno de los más importante agentes angiogénicos, y está involucrado en estudios actuales cuyo objetivo es hallar terapias para patologías relacionadas con Ia angiogénesis como son las isquemias, o Ia cicatrización de heridas entre otras. En los resultados presentados los efectos mostrados por Ia oleuropeína son similares o superiores a los mostrados por el VEGF Io que respalda el gran potencial de aplicación de Ia oleuropeína como agente angiogénico [Jabbarzadeh, E. Induction of angiogénesis in tissue-engineered scaffolds designed for bone repair: a combined gene therapy-cell transplantation approach. PNAS 2008]; [Guerrero, M., K. Athota, et al. (2008). "Vascular endothelial growth factor-165 gene therapy promotes cardiomyogenesis in reperfused myocardial infarction." J Interv Cardiol 21 (3): 242-51]; [Michaels, J. T., M. Dobryansky, et al. (2005). "Topical vascular endothelial growth factor reverses delayed wound healing secondary to angiogénesis inhibitor administration." Wound Repair Regen 13(5): 506-12]; [Galiano, R. D., O. M. Tepper, et al. (2004). "Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogénesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells." Am J Pathol 164(6): 1935-47]. Los resultados descritos también evidencian Ia capacidad de Ia oleuropeína para inducir Ia diferenciación de las células precursoras endoteliales. El tratamiento de este polifenol sobre células madre mesenquimales humanas ha propiciado Ia diferenciación de estas células hasta células endoteliales, y más aún hasta células que han sido capaces de formar las estructuras tubulares requeridas en todo proceso angiogénico y vasculogénico. Esto se encuentra en consonancia con Io descrito por Alviano et al, entre otros, quienes han mostrado el potencial de diferenciación de células madre mesenquimales a células endoteliales, bajo Ia influencia de factores angiogénicos como el VEGF [Alviano, F., V. Fossati, et al. (2007). "Term Amniotic membrane is a high throughput source for multipotent Mesenchymal Stem CeIIs with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro." BMC Dev Biol 7: 11].
Los resultados obtenidos tanto en Ia expresión génica de marcadores endoteliales como en el análisis de los marcadores de superficie de las células madre mesenquimales diferenciadas a endoteliales con oleuropeína y VEGF pone de manifiesto que el efecto inductor que tiene Ia oleuropeína sobre las misma es equiparable al del VEGF, reconocido inductor de Ia diferenciación de estas células a endoteliales.