LAVANDERO GONZÁLEZ, Sergio (Olivos 1007, 00 - Santiago, 38200, CL)
JALIL MILAD, Jorge (Marcoleta 391, 24 - Santiago, 83300, CL)
CHIONG LA Y, Mario (Olivos 1007, 00 - Santiago, 83200, CL)
UNIVERSIDAD DE CHILE (Diagonal Paraguay 265 - Piso 14, 15 - Santiago, 83300, CL)
OCARANZA JERALDINO, María Paz (Marcoleta 391, 24 - Santiago, 83300, CL)
LAVANDERO GONZÁLEZ, Sergio (Olivos 1007, 00 - Santiago, 38200, CL)
JALIL MILAD, Jorge (Marcoleta 391, 24 - Santiago, 83300, CL)
CHIONG LA Y, Mario (Olivos 1007, 00 - Santiago, 83200, CL)
| REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica CARACTERIZADO porque comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. 2. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 1, CARACTERIZADO porque los derivados de angiotensina-(l-9) corresponden a homólogos, análogos y/o equivalentes químicos y/o biológicos de angiotensina-(l-9). 3. Composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 2, CARACTERIZADO porque su forma farmacéutica se encuentra en forma líquida o sólida. 4. Composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3, CARACTERIZADO porque la angiotensina-(l-9) o sus derivados se administran en conjunto con al menos un compuesto farmacéutico. 5. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el compuesto farmacéutico corresponde al menos un compuesto farmacéutico seleccionado de inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina I, antagonista del receptor de angiotensina II (ATl), antagonista de los canales L de calcio, inhibidor de Rho kinasa o diurético. 6. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 5, CARACTERIZADO porque el inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina I es cualquier fármaco seleccionado de lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril; el antagonista del receptor de angiotensina II (ATl) es cualquier fármaco seleccionado de valsartán, telmisartán, losarían, irbesartán, olmesartán, candesartán, eprosartán y saralasina; el antagonista de los canales L de calcio es cualquier fármaco seleccionado de nicardipino, nifedipino, amlodipino, felodipino, nitrendipino, nisoldipino, isradipino, nimodipino, diltiazem, clentiazem, verapamilo, galopamilo, anipamilo, RO5967, falipamilo; el inhibidor de Rho kinasa es cualquier fármaco seleccionado de fasudil, hidroxifasudil, 3-(4-piridil)-lH-indol, (S)-(+)-2-metil-l-[(4-metil-5-isoquinolinií)sulfonil] homopiperazina y N-(4-piridil)-N'- (2,4,6-triclorofenil) urea; y el diurético es cualquier fármaco seleccionado de bendroflumetiazida, benzitiazida, clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, hidrofiumetiazida, indapamida, meticlotiazida, metolazona, politiazida, quinetazona, triclormetiazida, xipamida, furosemida, torasemida, bumetanida, ácido etacrínico, acetazolamida, dorzolamida, amilorida, triamtereno, espironolactona, canrenoato, eplerenona y manitol. 7. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a la 6, CARACTERIZADO porque su vía de administración es inyectable y/o parenteral, por inhaladores, por liberación continua, por bombas de liberación continua, por supositorios, y por vía oral. 8. Composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque se administra en una única dosis, múltiple dosis o administración continúa. 9. Composición farmacéutica de acuerdo con las reivindicaciones 1 a la 8, CARACTERIZADO porque la cantidad efectiva de dicha composición permite elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9) a valores superiores a 10 fmol/g, más especialmente a valores superiores a 20 finol/g, aún más específicamente a valores superiores a 40 fmol/g, y aún más específicamente a valores superiores a 80 fmol/g. 10. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 1 a 9, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral. 11. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 10, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular donde el remodelado cardiovascular comprende fibrosis cardiaca, hipertrofia de los cardiomiocitos y/o proliferación de los fibroblastos. 12. Uso de la composición farmacéutica de acuerdo a las reivindicación 10, CARACTERIZADO porque sirve para preparar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular donde el remodelado cardiovascular comprende fibrosis vascular, proliferación de las células musculares lisas vasculares y/o proliferación de los fibroblastos. 13. Una composición farmacéutica CARACTERIZADO porque comprende un vector que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA2) necesaria para la producción endógena de angiotensina-(l-9) elevando su concentración plasmática y/o tisular de acuerdo a la reivindicación 9. 14. Composición farmacéutica de acuerdo a la reivindicación 13, CARACTERIZADO porque dicho vector que sobreexpresa en gen de la ECA2 es un adenovirus, virus adenoasociado, lentivirus o retro virus. 15. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral. 16. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 15, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos útiles para elevar la concentración de angiotensina-(l-9) o sus derivados en la sangre y/o tejidos, particularmente plasma, corazón, rifión, pulmón, cerebro y/o lecho vascular. 17. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 15 y 16, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos inyectables, de liberación continua, de administración oral o por supositorios. 18. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 15, 16 y 17, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos que eleven la concentración del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados por la sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina I homologa (EC A2). 19. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según la reivindicación 18, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos donde la sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina I homologa (ECA2) se obtiene con un vector seleccionado de adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus o lentivirus. 20. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 15 y 16, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos que eleven la concentración del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados en donde los derivados de angiotensina-(l-9) corresponden a homólogos, análogos y/o equivalentes químicos y/o biológicos de angiotensina-( 1 -9) . 21. Uso del péptido angiotensina-(l-9) o derivados de dicho péptido según las reivindicaciones 15 y 16, CARACTERIZADO porque sirve para elaborar medicamentos que eleven la concentración plasmática y/o tisular del péptido angiotensina-(l-9) a valores superiores a 10 fmol/g, más especialmente a valores superiores a 20 fmol/g, aún más específicamente a valores superiores a 40 fmol/g, y aún más específicamente a valores superiores a 80 fmol/g. |
MEMORIA DESCRIPTIVA
La presente invención está centrada en el campo del péptido angiotensina-(í-9) o sus derivados que son equivalentes químicos o biológicos. En particular, la presente invención se relaciona con composiciones farmacéuticas que contienen angiotensina-(l-9) y/o sus derivados y los efectos anti-remodelado de dichos péptidos, especialmente en el remodelado cardiovascular, cerebral, pulmonar y/o renal, y muy en particular con los efectos antihipertróficos, antihiperplásicos, antifíbróticos, citoprotectores, antiapoptóticos, antinecróticos, antiautofágicos, antioxidantes, antiinflamatorios e inhibidores de la síntesis de colágeno en corazón, pulmón, riñon y en vasos sanguíneos. Además, esta invención incluye el campo de elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) mediante la producción endógena aumentada de angiotensina-(l-9) a través de un vector que expresa EC A2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-
9).
ESTADO DEL ARTE
La mayor activación del sistema renina-angiotensina (SRA), específicamente de la vía clásica con mayor actividad de la enzima convertidora de angiotensina-I (ECA) y niveles elevados de angiotensina II, se han identificado como importantes determinantes de la etiología de la hipertensión arterial (HTA), la insuficiencia cardiaca, en los procesos fisiopatológicos de remodelado cardiovascular, disfunción diastólica y alteraciones en la vasodilatación de arterias de resistencia. La ECA y angiotensina II representan así uno de los principales blancos terapéuticos del tratamiento actual de la HTA (Varagic & Frohlich, J. Mol. CeIl. Cardiol. 34:1435-42, 2002). La cascada del SRA se inicia con la acción de renina sobre el angiotensinógeno circulante de origen hepático. Esta reacción produce angiotensina I la cual es fisiológicamente inactiva. Angiotensina I se transforma al octapéptido biológicamente activo angiotensina II, por acción de la ECA (Okunishi y cois, Jpn J. Pharmacol. 62:207-10, 1993). La ECA es una metalopeptidasa dependiente de zinc que se encuentra predominantemente en el pulmón, pero además en corazón, vasos sanguíneos, riñon y además en el plasma (Campbell, J. Cardiovasc. Pharmacol. 1O:S1-S8, 1987; Johnston y cois, J. Hypertens. Suppl. 10-.S13-26, 1992). En humanos, la angiotensina II tisular es producida además por otras enzimas como quimasa y factor activador de plasminógeno tisular (Reilly y cois, J. Biol. Chem. 257:8619-22, 1982; Gibbons & Dzau, N. Engl. J. Med. 19:1431-8, 1994). La ECA también es responsable del catabolismo e inactivación de vasodilatadores como las bradikininas (BKs). El SRA está involucrado el desarrollo de la HTA (Dzau, J Hypertens Suppl. 6:7-12, 1988; Bader y cois, Exp. Physiol. 85:713-731, 2000; Bader y cois, J Mol Med. 79:76-102, 2001), en aspectos de resistencia a insulina (Yavuz y cois, J. Renin. Angiotensin Aldosterone Syst. 4:197-203, 2003; Henriksen & Jacob, Diabetes Obes. Metab. 5: 214-22, 2003), metabolismo del óxido nítrico (Liu y Person, Hypertension 43:649-53, 2004), estrés oxidativo (Zhou y cois, Am. J. Hypertension 17:167-71, 2004) e hipertrofia cardiaca y del músculo liso vascular (Higashi y cois, Circ. Res. 93:767-75, 2003; Yamakawa y cois, Eur J Pharmacol. 478:39-46, 2003). La angiotensina II ejerce su acción en células blanco a través de receptores acoplados a proteína G, subtipos 1 y 2 (los RATl y RAT2, respectivamente). La activación del RATl produce la mayoría de las acciones cardiovasculares de angiotensina II como vasoconstricción, efectos mitogénicos e hipertróficos, respuesta inflamatoria y retención de agua y sal (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1:151-8, 2000). Estos efectos son mediados vía una compleja interacción de vías de señalización intracelular que involucran diversas fosfolipasas (PLC, PLD, PLA2), estimulación de la NAD(P)H oxidasa y especies reactivas de oxígeno (O 2 " , H 2 O 2 ), activación de la transcripción de genes
(protooncogenes: c-foc, c-jun, c-myc), y activación de tirosinas kinasas (Src, JAK/STAT, FAK, Pyk2, pl30Cas y Pi3-kinasa). Algunas de estas acciones pueden ser mediadas, directamente o indirectamente, por transactivación de receptores de tirosina kinasa (Touyz & Berry, Braz. J. Med. Biol. Res. 35:1001-15, 2002). A diferencia de las acciones mediadas por el RATl, el RAT2 ejerce efectos como apoptosis, natriuresis y vasodilatación mediada por BKs y óxido nítrico (NO) (de Gasparo y cois, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 1:151- 8, 2000). Recientemente, se ha descubierto una vía paralela del SRA iniciada por la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA-2) (Tipnis y cois, J. Biol. Chem. 275: 33238- 43, 2000; Donoghue y cois, Circ. Res. 87:el-9, 2000). Originalmente, esta enzima se encontró en testículo, riñon y corazón, pero estudios posteriores por PCR en tiempo real mostraron que su expresión también se detecta en el tracto gastrointestinal, cerebro, pulmón, aorta e hígado (Harmer y cois, FEBS Lett. 532:107-10, 2002; Ferrario, Hypertension 47:515-21, 2006). A nivel celular, la EC A2 se ha encontrado principalmente en epitelio del túbulo renal, macrófagos, cardiomiocitos, endotelio de pequeñas y grandes arterias y musculatura lisa de estos vasos (Burell y cois, Eur. Heart J. 26:369-75, 2005). La ECA2 presenta un 40% de homología en su dominio catalítico con la ECA y es una ectoenzima, cuyos sitios catalíticos se orientan hacia el espacio extracelular y es, por lo tanto, capaz de hidrolizar péptidos extracelulares. Además, como la ECA, la ECA2 es susceptible de separarse y liberarse de la superficie celular y presenta una topología de una proteína integral de membrana tipo I. A pesar de esta similitud, ECA-2 difiere de la ECA en su especificidad a sustrato y en la ausencia de inhibición por inhibidores clásicos de la ECA. En el SRA, la ECA2 compite con la ECA por la hidrólisis del decapéptido inactivo angiotensina I para formar angiotensina-(l-9) (Donoghue y cois, J. Mol. CeIl Cardiol. 35:1043-53, 2003), por lo tanto disminuye la cantidad de angiotensina I disponible para la generación de angiotensina II por la acción de ECA. Aunque los efectos de angiotensina-(l-9) en corazón y riñon no han sido descritos (Danilczyk & Penninger, Circ. Res. 98:463-71, 2006), existen diversos estudios que muestran que la angiotensina-(l-9) potencia la vasoconstricción mediada por angiotensina II en anillos aórticos de ratas y que tiene efectos vasopresores en ratas concientes (Huang y cois, J. Biol. Chem. 278:15532-40, 2003). Además, se ha encontrado en plasma humanos y de ratas, que los niveles de angiotensina-(l- 9) son mayores a los de angiotensina II (Johnson, Peptides 10:489-92, 1989) y que este péptido se acumula en animales tratados con iECA (Drummer, Biochem. Pharmacol. 39:513- 8, 1990). Otros estudios indican que angiotensina-(l-9) favorece la unión de la bradikinina a su receptor B2 probablemente por cambios conformacionales en el complejo ECA- receptor B2 (Erdos y cois, J. Mol. CeIl. Cardiol. 34:1569-76, 2002).
La ECA2 presenta mayor eficiencia catalítica (400 veces) para hidrolizar la angiotensina II que angiotensina I y formar el péptido vasodilatador angiotensina-(l-7) (Donoghue y cois, Circ. Res. 87: el-9, 2000, Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003; Rice y cois, Biochem. J. 383:45-51, 2004). Este último también se genera por la hidrólisis de la angiotensina I por acción de la endopeptidasa neutra (NEP), prolil endopeptidasas o Ia ECA (Welches y cois, Life Sci. 52:1461-80, 1993; Vickers y cois, J. Biol. Chem. 277: 14838-43, 2003). Por lo tanto, la ECA2 tiene un papel central en el balance de la actividad vasoconstrictora y proliferativa de la angiotensina II vía su RATl al aumentar los niveles de angiotensina-(l-7) (Der Sarkissian y cois, Prog. Biophys. Mol. Biol. 91:163-98, 2005). Sin embargo, no existen antecedentes que indiquen si angiotensina-(l-9) y/o sus derivados tienen efectos que previenen, revierten, inhiben y/o disminuyen el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal. Las angiotensinas corresponden a péptidos derivados del angiotensinógeno que se obtienen por proteólisis. Estos péptidos son: Angiotensinógeno*: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Leu-Val-Tyr-Ser
Angiotensina I: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu
Angiotensina II: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensina III: Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe Angiotensina-IV: Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe
Angiotensina-( 1 -9) : Asp-Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His
Angiotensina-( 1 -7) : Asp-Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro
*E1 primer aminoácido de las secuencias corresponde al extremo amino terminal. R: resto de la secuencia el angiotensinógeno. Se han descrito varias funciones fisiológicas y biológicas para las diversas angiotensinas.
Des-aspartato-angiotensina I ha sido descrita para ser usada en el tratamiento y/o prevención de la hipertrofia cardiaca (US 5.773.415) y formación de la neoíntima o reestenosis (US
6.100.237).
Angiotensina II está involucrada en la hipertrofia cardiaca y formación de la neoíntima. La administración exógena de angiotensina II potencia la hipertrofia cardiaca (Dostal & Baker,
Am. J. Hypertens., 5:276-280, 1991) y formación de neoíntima (Osterrieder y cois,
Hypertension. 18:1160-4, 1991; Daemen y cois, Circ. Res. 68:450-6, 1991).
Angiotensina III media la inducción de natriuresis dependiente del receptor AT2. Induce vasoconstricción y liberación de aldosterona (Fyhrquist & Saijonmaa, J. Intern. Med. 264:224-36, 2008).
Angiotensina IV, un metabolito segundario de angiotensina II, tiene acciones antihipertróficas y también inhibe la formación de neoíntima (EP 1846017).
Angiotensina-(l-7) está involucrada en las acciones opuestas a angiotensina II. Se ha descrito que es un péptido que induce vasodilatación, es antihipertensivo y antifibrótico (Katovich y cois, Curr. Hypertens. Rep. 10:227-32, 2008). Sin embargo, en el estado del arte no existe descrito funciones fisiológicas y/o biológicas para el péptido angiotensina-(l-9), y tampoco existe descritos usos médicos y/o tratamientos médicos que comprendan la administración y/o uso de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en medicina. En la presente invención se relaciona y resuelve el problema de desconocimiento sobre las acciones biológicas y/o fisiológicas de angiotensina-(l-9) y describe los efectos anti- remodelado de este péptido y provee procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9), y nuevos usos y/o composiciones farmacéuticas de angiotensina-(l-9) o sus derivados.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Existen varios procedimientos para elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9). La elevación de los niveles plasmáticos y/o tisular de angiotensina-(l-9) está asociado con fenómenos de reducción del remodelado cardiovascular, renal, pulmonar y cerebral (ver ejemplo 10). En la presente invención describimos que la elevación de la concentración plasmática de angiotensina-(l-9) puede lograrse a través de:
a) Administración del péptido angiotensina-(l-9) a través de composiciones farmacéuticas que lo contienen (ver ejemplo 11). b) Administración de fármacos que elevan los niveles de enzima convertidora de angiotensina I homologa (EC A2), y con ello aumenta la producción endógena de angiotensina-(l-9), provocando una elevación plasmática y/o tisular de dicho péptido (ver ejemplo 10). c) Administración de un gen que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina I homologa (EC A2), enzima responsable de la producción endógena de angiotensina-(l-9) (ver ejemplos 7 y 8). La presente invención corresponde a una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) o sus derivados y al menos un transportador, excipiente, estabilizante, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también describe el uso de dicha composición farmacéutica para la elaboración de medicamentos útiles para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal. Además, la presente invención describe el uso del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados para elaborar medicamentos y/o composiciones farmacéuticas que sirven para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral, especialmente en animales o individuos y más especialmente en pacientes que necesitan tal tratamiento. La presente invención también provee, a través del uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados, de un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral.
Además, esta invención comprende también un método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral o renal que consiste en elevar la concentración en la sangre y/o tejidos del péptido angiotensina-(l-9) o sus derivados mediante una composición farmacéutica que contiene un vector que expresa ECA2, enzima responsable de la producción en forma endógena de angiotensina-(l-9). Estos vectores corresponden a adenovirus, retrovirus, lentivirus o virus adenoasociados que contiene el gen que codifica para ECA2. De acuerdo a la invención, el método para prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral en un individuo o un animal, comprende administrar al paciente una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9). La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende una cantidad efectiva de angiotensina-(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9), y al menos un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La composición es preferentemente para el uso de la prevención, reversión, inhibición y/o disminución del remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral en un individuo o animal que necesita tal tratamiento, y comprende administrar tal composición farmacéutica al paciente. El paciente puede ser humano o animal. El uso de dicho medicamento o composición farmacéutica busca elevar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) y/o al menos uno de sus derivados. Particularmente se busca elevar los niveles de dicho péptidos en el organismo, particularmente en el plasma, corazón, riñon, pulmón, cerebro y/o lecho vascular. El medicamento o composición farmacéutica de la presente invención, que contiene una cantidad efectiva de angiotensina~(l-9) y/o al menos un derivado de angiotensina-(l-9) puede ser aplicado por todas las vías conocidas de administración de medicamentos descritas. En forma particular, dicho medicamento o composición farmacéutica se aplicará por vía inyectable y/o parenteral (por ejemplo, y sin ánimo de excluir ninguna otra vía, intravenoso, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, y por inyección directa a diversos órganos, incluyendo corazón, pulmón, riñon y cerebro), por inhalación, por el uso de composiciones farmacéuticas de liberación continua, por el uso de bombas de liberación continua, por supositorios, y por vía oral. Dicha administración puede ser de una única dosis, múltiple dosis o administración continua.
La angiotensina-(l-9) y/o sus derivados, composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) y o medicamentos que lo(s) contiene(n) de acuerdo con la presente invención pueden ser sólidos o líquidos, incluyendo tabletas, obleas, grageas, comprimidos, cápsulas, suspensiones, o soluciones, que contiene al menos un excipiente, transportador, diluyente, estabilizante y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Excipientes, transportadores, diluyentes, estabilizantes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables para la preparación de composiciones farmacéuticas o medicamentos de la invención son muy bien conocidos en el estado del arte, y pueden ser de naturaleza sólida, líquida o mezclas de ambos. De esta manera las composiciones farmacéuticas o medicamentos pueden tomar forma de tabletas, pildoras, pastillas, cápsulas, grageas, obleas, polvo, formulaciones recubiertas, formulaciones de liberación sostenida, formulaciones erodibles, aparatos implantados o componentes derivados de dichos aparatos, formulaciones de microesferas, soluciones, suspensiones, elíxires, aerosoles y similares, entre otros. Se prefiere como transportadores, diluyentes y/o excipientes líquidos a agua, solución salina, solución de dextrosa y solución de glicoles, especialmente cuando se utiliza la vía parenteral y/o de inyección como vía de administración. El transportador y/o diluyente, puede ser también un aceite, como por ejemplo aquellos derivados del petróleo, aceites de origen animal y/o vegetal o aceites sintéticos. Ejemplos particulares de aceites preferidos en la invención incluyen a aceite de maní, aceite de soya, aceite mineral, aceite de sésamo, aceite de maíz, aceite de maravilla, entre otros. Entre los excipientes preferidos por la invención se incluyen al almidón, celulosa, talco, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, sílica gel, estearato de magnesio, estearato de sodio, glicerol monoestearato, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilénglicol, agua, etanol, entre otros. Otros transportadores, diluyentes, estabilizantes, excipientes y/o adyuvantes, que no están nombrados aquí, son obvios para un experto en el estado del arte. La composición o el medicamento de la presente invención puede ser sujeto a procesos farmacéuticos convencionales, tales como esterilización, y puede contener otros aditivos farmacéuticos convencionales tales como preservantes, estabilizantes, agentes emulsifícantes, agentes humectantes, sales para ajustar la presión osmótica, amortiguadores o tampones para regular el pH, entre otros. Transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes y sus formulaciones pueden encontrarse en Martin, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15" Ed.; Mack Publishing Co., Easton (1975); ver por ejemplo las páginas 1405-1412 y 1461-1487. Tales composiciones contienen, en general, una cantidad efectiva del compuesto activo junto a una cantidad adecuada de uno o varios transportadores, estabilizantes, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes, de tal manera que permita preparar la dosis y la forma adecuada para la administración apropiada de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados al paciente. En la práctica de los métodos de tratamiento de la invención, la dosificación particular de una composición farmacéutica o medicamento a ser administrado al sujeto dependerá de muchas variables incluyendo el estado de la enfermedad, la severidad de la enfermedad, el esquema de administración, la edad, las características físicas del sujeto, etc. Las dosis apropiadas pueden establecerse usando aproximaciones clínicas según los entendidos en el campo.
Además, la angiotensina-(l-9) y/o al menos uno de sus derivados, el medicamento o la composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrado en conjunto con al menos un compuesto farmacéutico. El "al menos un compuesto farmacéutico" es un inhibidor de la enzima convertidora de angiotensina-I, un antagonista del receptor de angiotensina II (ATl), un antagonista de los canales L de calcio, un inhibidor de Rho kinasa, y/o un diurético. La administración de cualquiera de estos compuestos farmacéuticos son capaces per se de elevar la concentración plasmática de angiotensina-(l-9). En el ejemplo 10 se describe que la administración de un inhibidor de enzima convertidora (enalapril) o la administración de un antagonista del receptor de angiotensina II (candesartan) aumentan los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) y que dicho aumento está asociado con una disminución del remodelado cardiovascular, renal, pulmonar y cerebral.
Ejemplos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA) son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. Ejemplos de antagoniastas del receptor de angiotensina II (ATl) son valsarían, telmisartán, losarían, irbesartán, olmesartán, candesartan, eprosaríán y saralasina. Ejemplos de anlagonisías de los canales L de calcio son las dihidropiridinas (nicardipino, nifedipino, amlodipino, felodipino, niírendipino, nisoldipino, isradipino, nimodipino), las benzoíiazepinas (diltiazem, clentiazem) y las fenilalquilaminas (verapamilo, galopamilo, anipamilo, RO5967, falipamilo). Ejemplos de inhibidores de Rho kinasa son fasudil, hidroxifasudil, 3 -(4-piridil)- lH-indol, (S)-(+)-2-meíil-l-[(4-metil-5-isoquinolinil)sulfonil] homopiperazina,
N-(4-piridil)-N'- (2,4,6-triclorofenil) urea. Ejemplo de diuréticos son los diuréticos tiazídicos (bendroflumetiazida, benzitiazida, clorotiazida, clortalidona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, indapamida, meticlotiazida, metolazona, politiazida, quinetazona, triclormetiazida, xipamida), los diuréticos de asa (fürosemida, torasemida, bumetanida, ácido etacrínico), los diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica (acetazolamida, dorzolamida), los diuréticos ahorradores de potasio que son inhibidores de los canales de sodio (amilorida, triamtereno), los diuréticos ahorradores de potasio que son antagonistas de la aldosterona (espironolactona, canrenoato, eplerenona) y los diuréticos osmóticos (manitol). La presente invención también considera como parte del invento aumentar los niveles plasmáticos y/o tisulares de angiotensina-(l-9) a través de un aumento de su producción y/o inhibición de su degradación. También la presente invención involucra la exacerbación, activación y/o inducción de las señales transduccionales intracelulares activadas por angiotensina-(l-9) y/o sus derivados.
El aumento de la producción de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados se puede obtener a través del aumento o sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina I homologa (EC A2). El aumento de la actividad de la EC A2 puede lograrse a través de la inhibición de la enzima convertidora de angiotensina I (ECA), específicamente con el uso de inhibidores de esta enzima, particularmente fármacos ya conocidos en el estado del arte como son el lisinopril, enalapril, captopril, zofenopril, ramipril, quinapril, perindopril, benazepril y fosinopril. La sobreexpresión de la ECA2 se puede lograr a través de la introducción dentro del organismo una o varias copias del gen que codifica para EC A2. La introducción del gen que codifica para ECA2 al organismo se logra a través de técnicas ya descrita en el estado del arte e incluyen el uso de DNA desnudo, liposomas (particularmente liposomas catiónicos) y por el uso de vectores virales. En la presente invención se describe muy particularmente, y sin ánimo de excluir cualquiera otro vector viral, el uso de vectores adenovirales, retrovirales, lentivirales y virus adenoasociados que contienen dentro de su material genético el gen que codifica para EC A2. Es también conocido en el estado del arte que dicho gen para ser activo requiere que su expresión esté comandado por un promotor y el gen termine en un terminador.
Los vectores mencionados en esta patente incluyen flanqueando al gen que codifica a la ECA2 a un promotor y un terminador. También es parte de la presente invención que los vectores que contiene el gen que codifica para ECA2 contenga secuencias de DNA que son importante para aumentar la estabilidad del mRNA, así como de secuencias que permitan la normal traducción del mRNA en proteína. Asimismo, es muy bien conocido en el estado del arte diversas estructuras de promotores que permiten lograr la expresión constitutiva o regulada de los genes de interés. La presente invención también considera que el promotor que regula la expresión del gen que codifica para la ECA2 sea de naturaleza constitutiva o de naturaleza regulada por medio de inducción o represión génica.
En la presente invención se utiliza angiotensina-(l-9) como un ejemplo de angiotensina-(l-9) y/o sus derivados. Además se utiliza rata como un ejemplo de mamífero al cual se puede aplicar el método de tratamiento y ensayar el uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados en forma de medicamento y/o composición farmacéutica. Modelos animales para estudiar remodelado cardiovascular, pulmonar, cerebral y/o renal, incluyendo a mamíferos pequeños tales como a la rata son muy bien aceptados en el estado del arte (Everettey cois, Hypertension, 23:587-593, 1994; lndolfi y cois, Circulation, 92:1230-1235, 1995). El uso del modelo de rata no excluye su uso en humanos u otro tipo de animal que requiera dicho tratamiento. En la presente invención se entiende por remodelado al complejo cambio que sufren los órganos cuando son sometidos a condiciones de estrés. Los órganos que son de particular interés en esta invención para prevenir el remodelado mediante el uso de angiotensina-(l-9) o sus derivados corresponden al corazón, a los vasos sanguíneos, al riñon, al cerebro y al pulmón, sin excluir otros órganos que pudieran sufrir remodelado y que pudieran tratarse con angiotensina-(l-9) o sus derivados. El remodelado debe comprenderse en su forma más amplia posible e involucran numerosos procesos celulares, bioquímicos y/o fisiológicos, los cuales comprende uno o todos de los procesos seleccionados entre hipertrofia de los cardiomiocitos, formación de neoíntima, restenosis, hiperplasia de fibroblastos, hiperplasia de células musculares lisas, citoprotección, fibrosis, depósito de colágeno, inflamación, apoptosis, necrosis y/o autofagia, oxidación. La hipertrofia de los cardiomiocitos corresponde al agrandamiento de los cardiomiocitos, con aumento del contenido de proteínas intracelulares, especialmente aquellas asociadas con la maquinaria contráctil, y con reexpresión de proteínas fetales como la cadena pesada de la 0-miosina (D-MHC) y el factor natriurético auricular (ANF). La hipertrofia de los cardiomiocitos está asociada a la hipertrofia cardiaca. La hipertrofia cardiaca corresponde al crecimiento que se observa en el corazón en atletas de alta competición (hipertrofia fisiológica o benigna) o en personas con hipertensión o posterior a un infarto al miocardio (hipertrofia patológica). Formación de la neoíntima corresponde a la formación de tejido nuevo indiferenciado o de diversos tipos en los vasos sanguíneos debido a daño o por cualquier otra causa, incluyendo la reestenosis. La reestenosis es el re-estrechamiento de cualquier vaso sanguíneo, por ejemplo el re-estrechamiento de una arteria coronaria después de una angioplastía. La reestenosis puede ser causada por muchas otras patologías y causas. La hiperplasia de los fibroblastos corresponde a un aumento en el número de los fibroblastos debido a un aumento en la proliferación. La hiperplasia de células musculares lisas corresponde a un aumento en el número de las células musculares lisas debido a un aumento en la proliferación. Se entiende por citoprotección a todos los fenómenos, procesos o mecanismos involucrados en la reducción del dafio o reducción de la muerte de células. Se entiende por fibrosis a un aumento el contenido de matriz extracelular en un tejido por acumulación de proteínas como colágeno, fibronectina, elastina, entre otras. Apoptosis, necrosis y autofagia corresponden a diferentes tipos de muerte celular. Se entiende por estrés oxidativo a un aumento de las especies reactivas de oxígeno y es provocado por un desbalance entre la síntesis y la degradación de las especies reactivas de oxígeno. Las especies reactivas del oxígeno corresponden a anión superóxido (O 2 - " ), peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ), radical hidroxilo (OH-) y/o a productos de estas especies con otras moléculas generando por ejemplo peroxinitrito (NOO-). La síntesis de las especies reactivas del oxígeno puede ser sintetizados en la cadena transportadora del oxígeno de la mitocondria, NADPH oxidasa, xantina oxidasa, NO sintasa, por reacciones inorgánicas como por ejemplo la reacción de Fenton y la reacción de Haber-Fenton, entre otros. Los mecanismos de degradación de las especies reactivas del oxígeno incluyen antioxidantes naturales (por ejemplo vitamina C, alfa-tocoferol, ácido úrico, manitol) y a sistemas enzimáticos (por ejemplo superóxido dismutasa, catalasa, glutatión peroxidasa, entre otros). En esta invención, los términos hipertrofia, formación de neoíntima, restenosis, hiperplasia, citoprotección, fibrosis, depósito de colágeno, inflamación, estrés oxidativo, apoptosis, necrosis y autofagia deben entenderse en su contexto lo más amplio posible.
Una cantidad efectiva se refiere a la dosis y al período de tiempo necesario para alcanzar el resultado terapéutico necesario, es decir, prevenir, revertir, inhibir y/o disminuir el remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y/o cerebral. La cantidad efectiva puede depender de muchos factores, tales como el estado de avance de la enfermedad, la edad, el sexo, el peso del individuo, la presencia de otras enfermedades, de la ingesta de otros medicamentos en forma simultánea, de raza, entre otras cosas. En esta patente, la invención busca elevar la concentración plasmática y/o tisular de angiotensina-(l-9) a valores superiores a 10 fmol/g, más especialmente a valores superiores a 20 fmol/g, aún más específicamente a valores superiores a 40 fmol/g, y aún más específicamente a valores superiores a 80 fmol/g.
Un derivado de angiotensina-(l-9) se refiere a cualquier mutación, fragmento, parte o porción de la angiotensina-(l-9) que incluye moléculas con sustitución, deleción y/o inserción de uno o más aminoácidos a la angiotensina-(l-9) con el objetivo de imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su receptor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica. Los derivados de angiotensina-(l-9) obtenidos por sustitución de aminoácidos corresponden a la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido o bien por otra molécula que puede corresponder a un derivado de aminoácido. En este caso se busca obtener un derivado que sea funcionalmente, estructuralmente o estereoquímicamente similar u homólogo a angiotensina-(l-9). Un derivado de angiotensina-(l-9) también incluye a mimótopos, o péptidos, o análogos miméticos e incluyen moléculas que contienen aminoácidos no naturales así como moléculas que no corresponden a aminoácidos pero se comportan o tienen funciones y/o actividades similares a los aminoácidos. Los derivados de angiotensina-(l-9) también incluyen modificaciones como glicosilaciones, amidaciones, acetilaciones, hidroxilaciones, metilaciones, etilaciones, esterificaciones, entre otros, que en general son modificaciones de las cadenas laterales de los aminoácidos o moléculas que forman parte de la angiotensina-(l-9) o sus derivados. También están considerados como parte de un derivado de angiotensina-(l-9) a la introducción de moléculas entrecruzadoras que permitan unir este péptido a una estructura más grande que ayude con sus propiedades fisicoquímicas y/o farmacéuticas. La molécula entrecruzadora puede tener distintos largos de cadena de manera tal de acercar o alejar a la angiotensina-(l-9) o sus derivados de la molécula mayor. Los entrecruzadores pueden ser homo o bifuncionales, tales como los imido esteres bifuncionales que tienen grupo metilo como espaciadores entre n=l a 6 de largo de cadena, glutaraldehído, esteres de N-hidroxisuccinimida y reactivos hétero-bifuncionales que habitualmente contienen una parte amino-reactiva tal como la N-hidroxisuccinimida y otra parte que es reactiva específicamente a otro o al mismo grupo funcional. Los derivados de angiotensina-(l-9) también pueden corresponder a derivados modificados químicamente que ayuden a estabilizar una estructura tridimensional que sea más favorable para imitar su efecto biológico y/o fisiológico, potenciar su efecto biológico y/o fisiológico, elevar su efecto biológico y/o fisiológico, incrementar su biodisponibilidad, incrementar su estabilidad, incrementar su absorción, incrementar su vida media plasmática y/o tisular, alterar su unión a proteínas plasmáticas, aumentar su afinidad con su recetor, disminuir su degradación, o cualquier otra propiedad biológica, fisiológica, farmacológica y/o farmacéutica que sea de interés para mejorar su acción terapéutica.
Ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados los cuales pueden ser incorporados durante Ia síntesis de los péptidos incluyen el uso de, pero no están limitados a, norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4-amino-3-hidroxi-5-fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino-3-hidroxi-6-metilheptanoico, 2-tienil alanina y/o D-isómeros de los aminoácidos. Otros ejemplos de aminoácidos no convencionales o no naturales y/o sus derivados son: ácido D-amino-D-metilbutirato, ciclopentilalanina, ácido aminociclopropano-carboxílico, ciclohexilalanina, ácido aminoisobutírico, ácido aminonorbornil-carboxílico, D-alanina, D-arginina, ácido D-aspártico, D-cisteina, D-glutamina, ácido D-glutámico, D-histidina, D-isoleucina, D-leucina, D-lisina, D-metionina, D-ornitina, D-fenilalanina, D-prolina, L-N-metilalanina, L-N-metilarginina, L-N-metilasparagina, ácido L-N-metilaspártico, L-N-metilcisteina, L-N-metilglutamina, ácido L-N-metilglutámico, ciclohexil L-N-metilhistidina, L-N-metilisoleucina, L-N-metilleucina, L-N-metillisina,
L-N-metilmetionina, L-N-metilnorleucina, L-N-metilnorvalina, L-N-metilornitina, L-N-metilfenilalanina, L-N-metilprolina, L-N-metilserina, L-N-metiltreonina, L-N-metiltriptofano, L-N-metiltirosina, L-N-metilvalina, L-N-metiletilglicina, D-serina, D-treonina, D-triptofano, D-tirosina, D-valina, D-D-metilalanina, D-D-metilarginina, D-D-metilasparagina, D-D-metilaspartato, D-D-metllcIsteina, D-D-metilglutamina, D-D-metilhistidina, D-D-metilisoleucina, D-D-metilleucina, D-D-metillisina, D-D-metilmetionina, D-D-metiloraitina, D-D-metilfenilalanina, D-O-metilprolina, D-D-metilserina, D-D-metiltreonina, D-D-metiltriptofano, D-D-metiltirosina, D-D-metilvalina, D-N-metilalanina, D-N-metilarginina, D-N-met lasparagina,
D-N-metilaspartato, D-N-metilcisteina, D-N-metilglutamina, D-N-metilglutamato, D-N-metilhistidina, D-N-metilisoleucina, D-N-metilleucina, L-N-metil-í-butilglicina, L-norleucina, L-norvalina, D-metil-aminoisobutirato, D-metil-D-aminobutirato, D-metilciclohexilalanina, D-metilciclopentilalanina, O-metil-D-nañilalanina, D- metilpenicillamina, N-(4-aminobutil)glicina, N-(2-aminoetií)gíicina,
N-(3-aminopropil)glicina, N-amino-D-metilbutirato, D-naftilalanina, N-bencilglicina, N-(2-carbamiletil)glicina, N-(carbamilmetil)glicina, N-(2-carboxietil)glicina,
N-(carboximetil)glicina, N-ciclobutilglicina, N-cicloheptilglicina, N-ciclohexilglicina, N-ciclodecilglicina, N-ciclododecilglicina, N-ciclooctilglicina, N-ciclopropilglicina, N-cicloundecilglicina, N-(2,2-difeniletil)glicina, N-(3,3-difenilpropil)glicina,
N-(3-guanidinopropil)glicina, N-(l-hidroxietil)glicina, N-(hidroxietil)glicina,
N-(imidazoliletil))glicina, N-(3-indolilietil)glicina, D-N-metillisina, N-metilciclohexilalanina, D-N-metilornitina, N-metilglicina, N-metilaminoisobutirato, N-(l-metilpropil)glicina, N-(2- metilpropil)glicina, D-N-metiltriptofano, D-N-metiltirosina, D-N-metilvalina, ácido D- aminobutírico, L-í-butilglicina, L-etilglicina, L-homofenilalanina, L- -metilarginina, L- metilaspartato, L-metilcisteina, L-metilglutamina, L-metilhistidina, L-metilisoleucina, L- metilleucina, L-metilmetionina, L-metilnorvalina, L-metilfenilalanina, L-metilserina, L-metiltriptofano, L-metilvalina, N-(N-(2,2-difeniletil) carbamilmetil)glicina, 1-carboxi-l- (2,2-difenil-etilamino)ciclopropano, N-metil-D-aminobutirato, D-N-metilmetionina, N- metilciclopentilalanina, D-N-metilfenilalanina, D-N-metilprolina, D-N-metilserina, D-N- metiltreonina, N-(l-metiletil)glicina, N-metil- D-naftilalanina, N-metilpenicillamina, N-(p-hidroxifenil)glicina, N-(tiometil)glicina, penicillamina, L-D-metilalanina, L-D-metilasparagina, L-D-metil-í-butilglicina, L-metiletilglicina, L-D-metilglutamato, L-D-metilhomofenilalanina, N-(2-metiltioetil)glicina, L-D-metillisina, L-D-metilnorleucina, L-D-metilornitina, L-D-metilprolina, L-D-metiltreonina, L-D-metiltirosiha,
L-N-metilhomofenilalanina, y N-(N-(3,3-difenilpropil) carbamilmetil)glicina. Un equivalente, análogo y/o homólogo químico de angiotensina-(l-9) como se describió más arriba, comparte similitudes conformacionales y/o funcionales con angiotensina-(l-9), pero no necesariamente deriva de angiotensina-(l-9). De esta manera se puede diseñar un equivalente químico que imite ciertas propiedades biológicas y/o fisiológicas de la angiotensina-(l-9). Aunque en la presente invención está ejemplificado en forma particular el uso de Ia angiotensina-(l-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) en rata, se entiende que la presente invención se extiende al uso de la angiotensina-(l-9) y/o sus derivados y medicamentos o composiciones farmacéuticas que lo(s) contiene(n) de acuerdo a la invención a cualquier mamífero, por ejemplo, y sin ánimo de limitarlos a, humanos, ratón, conejos, primates, perros, gatos, mascotas en general, animales de granja, etc.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Diseño experimental y animales.
Ratas macho Sprague Dawley se mantuvieron en jaulas con acceso a alimento y agua ad libitum. Este trabajo está de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio publicado por "U.S. National Institutes of Health" (NIH publication N°85-23, revised 1985) y fue aprobado por nuestro Comité de Ética Institucional. Para los estudios con enalapril y candesartan, 71 ratas adulta normotensas, se dividieron al azar en dos grupos, y se sometieron a una operación sham (cirugía sin ligación de la arteria coronaria, n=34) o a infarto al miocardio mediante una cirugía con ligación de la arteria coronaria izquierda (infarto, n=37) según lo descrito previamente (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Brevemente, la arteria coronaria izquierda se ligó entre la salida de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda con una sutura de seda 7-0 bajo condiciones asépticas en ratas anestesiadas con ketamina-HCl/xilazina (35/7 mg/kg intraperitoneal, respectivamente). Las ratas sham fueron sometidas a la misma cirugía, excepto que la sutura no se colocó alrededor de la arteria coronaria izquierda. El infarto al miocardio se confirmó por electrocardiografía 24 h después de la cirugía. El infarto al miocardio por ligación de la arteria coronaria izquierda produjo 25% de mortalidad dentro de las primeras 48 h seguidas de la oclusión. El tamaño del infarto en los sobrevivientes se determinó por planimetría de la circunferencia endocárdica del ventrículo izquierdo en secciones histológicas. Las ratas sham e infartadas se randomizaron para recibir vehículo, candesartan (10 mg/kg de peso corporal por día) o enalapril (10 mg/kg de peso corporal por día) por gavage por 8 semanas, comenzando 48 h después del infarto.
Para los estudios con angiotensina-(l-9) 28 ratas se distribuyeron al azar en dos grupos, y se sometieron a cirugía sham (n=8) o a infarto por ligación de la arteria coronaria izquierda (n=20). Las ratas infartadas se randomizaron para recibir vehículo, angiotensina-(l-9) (463 ng/kg de peso corporal/min, por 14 días) o angiotensina-(l-9) más A779 (463 ng de angiotensina-(l-9)/kg de peso corporal/min y 100 ng de A779/kg/min por 14 días) por medio de minibombas osmóticas (ALZET) implantadas en la yugular bajo sedación con ketamina- HCl/xilazina (35/7 mg/kg intraperitoneal, respectivamente).
Ejemplo 2. Estudios hemodinámicos y funcionales.
La presión arterial sistólica (SBP) se determinó usando el método "tail-cuff por investigadores que eran ciegos al grupo de tratamiento. La función del ventrículo izquierdo se determinó por ecocardiografía bidimensional trans-torácica usando un Sonos 5000 equipado con un transductor Philips S12 con ultrabanda electrónica sectorial de 5-12 MHz. Se determinaron los siguientes parámetros ecocardiográficos: diámetro del ventrículo izquierdo en fin de sístole (LVESD), diámetro del ventrículo izquierdo en fin de diástole (LVEDD), fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo (LVFS), espesor de la pared infartada anterior del ventrículo izquierdo (LVAWT) y espesor de la pared infartada posterior del ventrículo izquierdo (LLVWT).
Ejemplo 3. Evaluación del remodelado cardiovascular, renal, pulmonar o cerebral. El remodelado cardiovascular, pulmonar, renal y cerebral se determinó en cortes histológicos de estos tejidos el contenido de colágeno, el contenido de fibroblastos, la tasa de proliferación celular, la infiltración de macrófagos (inflamación), y los niveles de muerte celular (apoptosis, necrosis y autofagia). En el caso del remodelado cardíaco, además se determinó hipertrofia cardiaca, análisis morfológico y morfométrico cardiaco. En el caso del remodelado de vasos sanguíneos, se determinó además hipertrofia de los vasos sanguíneos. Evaluación de la hipertrofia cardiaca. El grado de hipertrofia del ventrículo izquierdo se cuantificó por la relación entre el peso del ventrículo izquierdo (LVW), el peso corporal (BW), niveles relativos de mRNA del factor natriurético auricular (ANF), contenido de proteína del ventrículo izquierdo (LVP), y niveles proteicos de la cadena pesada de la D-miosina (D-MHC) según lo descrito (Ocaranza y cois,
Hypertension 48:572-8, 2006).
Análisis morfológico y morfométrico del tejido cardiaco.
Rodelas transversales del ventrículo medio (10 Dm) de los corazones se embebieron en parafína, tiñeron con hematoxilina y eosina, y se examinaron por microscopía de luz (x20). El tamaño de los cardiomiocitos se determinó como lo descrito por Nakamura y cois (Circulation 98:794-9, 1998). Brevemente, las imágenes de las células, visualizadas con un video cámara fijada al microscopio, se proyectaron en un monitor y se trazaron. El área y el perímetro se determinó utilizando el software Image J. Todas las mediciones se hicieron por un observador ciego. Se midieron por lo menos 70 células por animal. Evaluación de la hipertrofia de los vasos sanguíneos.
Se siguió la técnica descrita por Igase y cois (Am. J. Physiol. 289:H1013-9, 2005). Brevemente, las áreas de lumen y media se determinaron midiendo la longitud de la lámina elástica interna (LEI) y la longitud de la lámina elástica externa (LEE) por imágenes digitalizadas. Los valores de pixeles entre las láminas se convirtieron en área calculando su razón. El área de la media se obtuvo por LEI-LEE. El área del lumen estuvo representada por el área limitada por la LEI. La razón lumen-media se calculó de la razón área lumen/área media. El grosor de la media se calculó por (diámetro LEE - diámetro LEI)/2. Evaluación del contenido de colágeno. El colágeno se determinó realizando un análisis morfométrico de colágeno. En secciones de ventrículo izquierdo, riñon, vasos sanguíneos y/o cerebro de 5 Dm de grosor se cortaron y se tiñeron con rojo picrosirio, tal como se describe en Jalil y cois (Circ. Res. 64:1041-50, 1989). Los cortes se observaron a través de un microscopio de luz conectado a un computador, en el cual se capturaron las imágenes por medio del programa Video Player con un aumento de 20Ox y el resultado se cuantificó en forma semi automática por un sofware construido en nuestro laboratorio en Math Lab y validado previamente (Ocaranza y cois, J. Cardiovasc.
Pharmacol. 40:246-54, 2002).
Evaluación del contenido de fibroblastos y determinación de proliferación celular.
Los vasos sanguíneos, riñon, pulmón, cerebro y/o corazón se deshidrataron a temperatura ambiente y se embebieron en parafina. Secciones de 5 Dm se inmunotiñieron con anticuerpos contra antígeno nuclear de células en proliferación KI-67 (Ocaranza y cois, Am. J. Physiol. 286:H498-506, 2004). Para la determinación del tipo de células con tinción positiva se realizaron cortes seriados y se tiñeron con anticuerpos anti vimentina (fibroblastos), anti G- actina esquelética (SKA, miocitos), anti factor Von Willebrand (células endoteliales) y anti vimentina, anti D-actina de músculo liso (células musculares lisas). Para la reacción de detección se usaron anticuerpos biotinilados conjugados a peroxidasa y los cortes se contratifieron con hematoxilina.
Evaluación de la citoprotección, apoptosis, necrosis y autofagia.
La apoptosis se determinó por fragmentación del DNA. Esta se realizó por la técnica TÚNEL y por análisis en geles de agarosa al 2% de DNA purificado. Se utilizaron los procedimientos descritos (Galvez y cois, CeIl Tissue Res. 304:279-85, 2001; Ibe y cois Eur. J. Heart Fail. 9:160-7, 2007). Un mayor apoptosis se evidenció por un mayor número de células teñidas (positivas) bajo el microscopio en la técnica TÚNEL mientras que en los geles de agarosa se observó una mayor cantidad de fragmentos de DNA entre 200 y 1000 bp que los controles. La necrosis se determinó por liberación de la láctico deshidrogenasa al medio extracelular (Parra y cois, Cardiovasc. Res. 77:387-97, 2008). La autofagia se determinó por la fragmentación de la proteína LC3 y por la presencia de vesículas autofágicas (Wohlgemuth y cois, Rejuvenation Res. 10:281-92, 2007). La citoprotección se determinó por análisis morfométrico de los tejidos teñidos con eosina y visualizados por microscopía de luz. Evaluación de la inflamación. Los vasos sanguíneos, riñon, pulmón, cerebro y/o corazón se deshidrataron a temperatura ambiente y se embebieron en parafina. Secciones de 5 Dm se inmunotiñieron con anticuerpos contra ED-I, un marcador de macrófagos/monocitos. Paralelamente se determinó los niveles de mRNA de MCP-I en los distintos tejidos. El KNA se aisló por el método del TRJZOL y la concentración y pureza se determinó por espectrometría UV. La integridad del RNA se evaluó a través de las bandas 18 y 28S del rRNA. Los niveles de mRNAs para MCP-I se cuantifícaron por RT-PCR (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Ejemplo 4. Determinación de los niveles de mRNA y de proteína de la enzima convertidora de angiotensina-I (ECA) y de la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA-2).
Se aisló RNA total (1.5Dg) de un área del ventrículo izquierdo no infartado usando el reactivo de Trizol y se trató con DNAasa, y se cuantificó por espectrofotometría ultravioleta. La reacción de la transcriptasa reversa acoplada a la reacción de polimerización en cadena (RT- PCR) se realizó usando los partidores para la ECA y ECA-2 ya descritos (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Las condiciones de amplificación para los cDNAs para ECA y ECA-2 fueron los descritos previamente (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006). Después del PCR, los productos de amplificación se fraccionaron en geles de agarosa 1,5% (p/p) y se visualizaron por tinción con bromuro de etidio. Las intensidades de las bandas se cuantificaron por densitometría y se normalizaron con respecto al RNA 18S. Expresión de proteínas de la ECA y ECA-2.
Las muestras de ventrículos se trataron con 4% formalina, fijados por 24 h, embebidos en parafina, y cortados en secciones de 5 Dm. Las secciones se immunodetectaron para ECA con un anticuerpo monoclonal IgG (1/100, Chemicon) o ECA-2 con un anticuerpo policlonal (1/500, Millenium Pharmaceuticals) y con anticuerpo IgG anti-ratón o anti-conejo biotinilado (Dako). Las secciones se desarrollaron usando fucsina (Dako) como el cromógeno, contrateñido con hematoxilina, y evaluados por microscopía. Ejemplo 5. Determinación de los niveles plasmáticos de angiotensinas y bradikininas. Los niveles de angiotensinas y bradikininas plasmáticos se determinaron según lo descrito (Ocaranza y cois, Hypertension 48:572-8, 2006; Ocaranza y cois, Life Sci. 78:1535-42, 2005; Campbell y cois, J. Mol. CeIl. Cardiol. 27:1545-60, 1995). Brevemente, las ratas se anestesiaron con una combinación de ketamina (125 mg/kg) y xilazina (12,5 mg/kg) administrado por inyección intraperitoneal. La sangre se colectó desde la vena cava inferior directamente en una jeringa que contiene 5 mL de guanidinio isotiocianato 4 M usando una aguja 25G. Los plasmas se almacenaron a -80 0 C hasta su extracción con catridges de C18 Sep-Pak y los péptidos fueron acetilados. Angiotensina II, angiotensina I, angiotensina-(l-7), angiotensina-(l-9), bradikinina-(l-7) y bradikinina-(l-9) acetiladas se separaron por cromatografía líquida en alta resolución (HPLC) y se detectaron por radioinmunoensayo. Ejemplo 6. Hipertrofia de cardiomiocitos en cultivo. Condiciones del ensayo.
Los cardiomiocitos se aislaron de ratas neonatas Sprague-Dawley según lo descrito (Foncea y cois, J. Biol. Chem. 272:19115-24, 1997). Todos los estudios están de acuerdo con la guía para el cuidado y uso de los animales de laboratorio publicado por "U.S. National Institutes of Health" (NIH publication N°85-23, revised 1985) y fue aprobado por nuestro Comité de Ética Institucional. Los cultivos celulares eran >95% puros. Los cardiomiocitos se plaquearon a 70% de densidad final en placas cubiertas con gelatina y se mantuvieron a 37 0 C en un atmósfera humidificada de 5% CO 2 /95% aire por 24 h en DMEM/M199 (4:1) conteniendo 10% suero fetal bovino and 5% suero de ternera. El suero se suprimió 24 h antes de que las células fueran preincubadas con 10 or 100 μM angiotensina-(l-9) por 1 h antes de la incubación con 100 μM norepinefrina (Sigma) or 10 nM IGF-I (Austral Biological) por 24 h. Ensayos de sarcomerización y determinación del tamaño de los cardiomiocitos. Las células se crecieron sobre portaobjetivos y se incubaron con un buffer que confiere estabilidad al citoesqueleto (10 mM MES pH 6,0, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 3% sacarosa, 5 mM MgCl 2 ) por 5 min. Luego, las células se fijaron y permeabilizaron con metanol por 10 min. Los sitios de unión no específicos fueron bloqueados por 1 h con buffer fosfato salino (PBS) suplementado con 3% seroalbúmina de bovino. Los cardiomiocitos se lavaron con PBS y se incubaron a temperatura ambiente por 45 min con faloidina rodamina 1 :400 (para teñir F- actina, rojo). Los portaobjetivos se lavaron y se montaron en "DakoCytomation Fluorescent Mounting Médium". La tinción celular se evaluó en un miscroscopio confocal (Cari Zeiss Axiovert 135, LSM Microsystems). El tamaño de los cardiomiocitos se determinó en células fijadas con 4% paraformaldehido por 10 min y permeabilizadas con metanol por 10 min. Las células, entonces, se incubaron toda la noche a temperatura ambiente con un anticuerpo anti D-MHC (1:80). Se determinó el tamaño de a lo menos 100 células de campos seleccionados al azar usando el software Image J (NIH).
Ejemplo 7. Obtención de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (EC A-2).
Obtención de un adenovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano código de accesso Genebank: NM 021804; rata código de acceso Genebank: NM 001012006) en el plasmidio adeno viral pDC316 (Microbix Byosystem Inc). Los clones positivos se confirmaron por secuenciación.
Posteriormente, el plasmidio pDC316 conteniendo el gen para EC A2 se cotrasfectó con el plasmidio adenoviral pBHGlox(delta)El,3Cre en células HEK293. El adenovirus recombinante se obtuvo por recombinación homologa entre los dos plasmidios según el procedimiento descrito por Hardy y cois (J. Virol. 71:1842-9, 1997). La confirmación de que el adenovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el adenovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2. En la Figura 1 se observa la sobreexpresión de ECA2 en cardiomiocitos en cultivo usando distintas multiplicidades de infección (MOI) con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2. Basalmente, no es posible detectar la presencia de ECA-2 en cardiomiocitos en cultivo, pero mediante la expresión e ECA-2 usando un adenovirus es posible elevar varios cientos de veces los niveles de ECA-2 (Figura 1).
Obtención de un Ientivirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank: NM_021804; rata= código de acceso Genebank: NM_001012006) en el plasmidio lentiviral PHAGE-PGK. Los Ientivirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector lentiviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pCMVdeltaR8.9 y pHCMV-G según el procedimiento descrito por Zufferey y cois (J Virol. 72:9873-80, 1998). La confirmación de que el Ientivirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el Ientivirus que expresa EC A2. La sobreexpresión de EC A2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western Blot, y por actividad enzimática de la ECA2.
Obtención de un retrovirus que sobreexpresa la enzima convertidora de angiotensina-I homologa. Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank: NM_021804; rata= código de acceso Genebank: NM_001012006) en el plasmidio retroviral pCnBgSN (o cualquier otro plasmidio retroviral). Los retrovirus se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector retroviral conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pHIT60 (para gal-pol) y pCVG (para VSV-G) según el procedimiento descrito por Yu & Kwon (Methods in Molecular Biology, vol. 433: Volume 1: Production and In Vivo Applications, Edited by: J. M. Le Doux © Humana Press, Totowa, NJ, páginas 1-16). La confirmación de que el retrovirus producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el retrovirus que expresa ECA2. La sobreexpresión de EC A2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2. Obtención de un virus adenoasociado que sobreexpresa Ia enzima convertidora de angiotensina-I homologa.
Inicialmente se subclonó el gen de la ECA2 (humano= código de acceso Genebank: NM_021804; rata= código de acceso Genebank: NMJ)Ol 012006) en el plasmidio del virus adenoasociado pAAV-MCS (Stratagene). Los virus adenoasociados se fabricaron en células HEK293T por cotransfección simultánea del vector del virus adenoasociado conteniendo el cDNA para ECA2 y los vectores pAAV-RC (pAAV-helper o pRC, que contiene los genes rep y cap) y pAdV-Helper (o pHelper, que porta los genes E2A, E4 y VA-RNAs) según el procedimiento descrito por Stratagene. La confirmación de que el virus adenoasociado producido sobreexpresaba ECA2 se realizó por transducción de cardiomiocitos de rata neonata en cultivo con distintas multiplicidades de infección (MOI) con el virus adenoasociado que expresa ECA2. La sobreexpresión de ECA2 se verificó mediante la determinación de los niveles proteicos de ECA2 por Western blot y por actividad enzimática de la ECA2.
Ejemplo 8. Administración intracardiaca y en vasos sanguíneos de vectores virales que sobreexpresan la enzima convertidora de angiotensina-1 homologa (ECA-2). La infección de los animales se llevó a cabo según la técnica descrita por Coleman y cois (Physiol Genomics 12:221-8, 2003). Brevemente, ratas macho de 150 D 10 g de peso se anestesiaron con ketamina y xilazina en dosis de 50 mg/Kg/peso y 10 mg/Kg/peso respectivamente, por vía intraperitoneal, tras lo cual se les intubó por vía laríngea mediante un catéter blando 18-gauge, y se ventiló con un volumen corriente de aproximadamente 2 mL a 60 ciclos/min (ventilador mecánico SAR-830 para animales pequeños). Se realizó una toracotomía a nivel del quinto espacio intercostal izquierdo, y se introdujo un catéter 24- gauge con 30 μL de solución adeno viral, lentiviral o virus adenoasociado estéril en la cámara ventricular izquierda. Después de la instalación de un tubo de drenaje para la remoción de aire y sangre, se cerró la incisión, se permitió la recuperación de los animales y se les devolvió a sus respectivas jaulas. La mortalidad de esta cirugía bordeó el 20 % y ha sido establecida para la transferencia génica a largo plazo del tejido miocárdico (para detalles ver Methods in Molecular Biology, vol. 219: Cardiac CeIl and Gene Transfer, Edited by: J. M. Metzger © Humana Press Inc., Totowa, NJ). Ejemplo 9. Efecto de la administración de angiotensina-(l-9) sobre parámetros hemodinámicos.
La administración continua de angiotensina-(l-9) a través minibombas osmóticas (ALZET) (ver ejemplo 1) no altera la presión arterial de los animales tratados (tabla 1). Sin embargo, se observa una reducción significativa en el peso del ventrículo izquierdo (LVW) (tabla 1).
TABLA 1. Efectos de la administración de angiotensina-(l-9) sobre parámetros hemodinámicos.
Parámetro S IAM IAM-Ang-(l-9) IAM-Ang-(l-9)-A779
N 8 8 6 6
BW (g) 255±6 264± 6 274± 24 277±4
SBP (mm Hg) 115± 4 110± 3 112±2 117±9
LVW (mg) 830±20 910±20* 810±7 # 823±31 #
LVW/BW (MV/100 g BW) 325±9 355±10* 310±16 # 305±19 #
CPVI (mg) 8,2±0,4 9,8±0,3* 8,0±0,3 # 8,4±0,2 #
FC (latidos/min) 276±14 271±7 259±14 260±10 Los valores son el promedio ± SEM. Abreviaturas: IAM: infarto al miocardio; N: número de animales; BW: peso corporal; SBP: presión arterial sistólica, LVW: peso del ventrículo izquierdo; FC: frecuencia cardiaca. *p<0.05 vs sham, #p < 0,05 vs IAM (después de un ANOVA significativo).
Ejemplo 10. Los efectos anti-remodelado del inhibidor de enzima convertidora 1 (ECA) y del antagonista del receptor de angiotensina II (ATl) son mediados por un aumento en los niveles de angiotensina-(l-9). Con el objetivo de demostrar que angiotensina-(l-9) está involucrado en los efectos farmacológicos de drogas cardiovasculares que actúan sobre el sistema renina-angiotensina, y que este péptido es un nuevo factor antihipertrófico, comparamos los efectos del inhibidor clásico de la ECA enalapril on aquellos obtenidos con el antagonista del receptor ATl candesartan en un modelo de infarto al miocardio. La hipertrofia ventricular izquierda (LVH) se evaluó por ecocardiografía, peso relativo del ventrículo izquierdo (RLVW, mg peso ventrículo izquierdo (LVW)/peso corporal (BW)), niveles relativos del mRNA del factor natriurético auricular (ANF), contenido de proteínas del ventrículo izquierdo (LVP) y contenido de Ia cadena pesada de Ia Dmiosina (D-MHC) se describen en el ejemplo 1. El tamaño promedio del infarto fue similar en todas las ratas infartadas tratadas y no tratadas. Los cuatro marcadores de hipertrofia (razón LVW/BW ratio, contenido de LVP, mRNA de ANF y niveles de DMHC) aumentaron significativamente a la semana 8 después de la ligación de la arteria coronaria descendente y se redujeron por la administración de candesartan o enalapril. Ambas drogas previnieron significativamente la dilatación del ventrículo izquierdo, mientras que sólo candesartan redujo el espesor de la pared infartada del ventrículo izquierdo (LLVWT) en ratas infartadas (Tabla 2). TABLA 2. Efectos del antagonista del receptor ATl candesartan y el inhibidor de ECA enalapril sobre la presión arterial, morfometría y función del ventrículo izquierdo inducido por ligación de la arteria coronaria.
Parámetro S MI C-S C-MI E-S E-MI
N 11 12 13 13 10 12
BW (g) 380±8 372+10 343±11 *# 357±10* # 350±7* # 345±4* #
SBP (mm Hg) 123+2 117+2 84±4 * ^ 88±4 *Λ 113+2* # 110+3* #
Tamaño infarto VI NA 29 ± 1 NA 30+1 NA 31+2
(%)
LVW/BW (mg/g) 3,0+0,1 3,6+0,1* 2,7±0,l * ' # 2,8±0,l * ' # 2,7+0,2* 2,9±0,3* # mRNA ANF (veces) 1,0+0,1 l,7±0,2 * 0,7±0,2 l,l±0,2 #lí 0,9±0,l 1,6+0,1
Contenido LVP (mg) 11,1+0,3 30,^3,3 * 11,6+1,1 12,3+1,4* 12,4±0,8 12,8+0,5*
D-MHC (veces) 1,0+0,2 2,2+0,2 * l,l±0,2 l,0±0,l* l,3±0,2 1,2+0, 1*
LVESD (mm) 5,2+0,1 6,9±0,3* 5,1+0,1 5,9±0,4 # 5,2+0,1 5,4±0,3*
LVEDD (mm) 7,4+0,2 8,8+0,2* 7,7+0,2 8,0+0,3* 7,5±0,3 7,1+0,2*
LVFS (%) 29+2 22+3 * 30+2 22+2 30+1 21+1 =
LVAWT (mm) 1,5+0,1 l,0±0,l * 1,1+0,4 0,9±0,4* l,3±0,2 0,9+0,1*
LLVWT (mm) 1,4+0,1 1,6+0,1 * 1,1+0,0 1,2+0,0** 1,4+0,0 1,5+0,1
Los valores son el promedio ± SEM. Abreviaturas: S: sham; MI: infarto al miocardio; C: candesartan; E: enalapril; N: número de animales; BW: peso corporal; SBP: presión sistólica; LVW: peso del ventrículo izquierdo; ANF : factor natriurético auricular ; LVP: contenido de proteína del ventrículo izquierdo; D-MHC: cadena pesada de la D-miosina; LVESD: diámetro de fin de sístole del ventrículo izquierdo; LVEDD: diámetro de fin de diástole del ventrículo izquierdo; LVFS: fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo; LVAWT: espesor de la pared infartada anterior del ventrículo izquierdo; LLVWT: espesor de la pared infartada posterior del ventrículo izquierdo; NA: no aplicable. * p<0,05 vs S; *p<0,05 vs MI, ^0,05 vs E-MI (después de un ANOVA significativo).
Los niveles plasmáticos de angiotensinas y bradikininas (BK) se determinaron por cromatografía líquida de alta resolución y radioinmunoensayo según lo descrito en el ejemplo N°2. Los niveles de angiotensina-I son más bajos en el grupo de ratas infartadas, asociados con mayores niveles de angiotensina-II. Sin embargo, los niveles plasmáticos de angiotensina- (1-7) y angiotensina-(l,9) fueron similares en las ratas sham y las ratas infartadas. El enalapril y el candesartan aumentaron tanto los niveles circulantes de angiotensina-(l-9) como las razones angiotensina-(l-7)/angiotensina-II y angiotensina-(l-9)/angiotensina-I en ambos grupos experimentales. Los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-7) se incrementaron por candesartan y los niveles de bradikinina-(l-9) se incrementaron por enalapril tanto en ratas infartadas como en ratas sham (Tablas 3 y 4).
TABLA 3. Efectos del antagonista del receptor ATl candesartan y del inhibidor de ECA enalapril sobre los niveles circulantes de angiotensina-I, angiotensina-II, angiotensina-(l-7) y angiotensina-(l-9) post-ligación de la arteria coronaria.
Parámetro S MI C-S C-MI E-S E-MI
_ _ _ _ _ _ _
Ang l (fmol/g) 29,8 + 4,0 13,1 + 1,6 * 22,6 +5,3 30,7 ± 1,9* 30,7±l,0 32,4+0,8 #
Ang-(l-7) 4,3 ± 1,1 2,9 + 0,5 10,9 ± 1,6 *A 14,4 ± 2,7 *A1 4,1+0,5 3,8+0,6
(fmol/g)
Ang-(l-9) 5,3 + 0,8 5,7 ± 0,9 36,2 ± 4,1 * - 43,8 ± 2,9 * ^ 1 25+5* 29±3* #
(fmol/g) *
Ang II (finol/g) 24,3 + 3,0 33,0 ± 2,5 * 38,6 ± 7,2 * 34,6 ± 4,2 *Λ 15,4+3,8* 23,3±5,4 #
Ang lI/Ang l 0,86 ± 2,83 ± 3,3±0,9 * 4,5± 0,6 *A1 0,45+0,05 0,72+0, 1*-*
0,08 0,11 * * Ang-(l-9)/Ang I 0,18 + 0,42 ± 2,6+0,7 * 2.8±l,l ' ' f 0,75±0,03 0,89+0,02*,
0,02 0,06 * * #
Ang-(l-7)/Ang II 0,16 + 0,10 + 0,49+0,15 * 1,02 + 0,25+0,07 0,26+0,02*'*
0,02 0,01 * 0,06 * ' #Λ
Los valores son el promedio + SEM. Abreviaturas: S: sham; MI: infarto al miocardio; C: Candesartan; E: enalapril; N: número de animales; Ang: angiotensina. * p<0,05 vs S; # p<0,05 vs MI; ^0,05 vs E-MI (después de un ANOVA significativo).
TABLA 4. Efectos del antagonista del receptor ATl candesartan y el inhibidor de ECA enalapril sobre los niveles circulantes de bradikinina-(l-7) y bradikinina-(l-9) post-ligación de la arteria coronaria.
Parámetro S MI C-S C-MI E-S E-MI
" Ñ 10 9 12 Tí 10 10
Bk-(l-7) (fmol/g) 3,16+0,84 2,80±0,54 4,41+1,5 5,44+1,60 l,48±0,46*' # l,40±0,17*' # Bk-(l-9) (fmol/g) 3,89+1,12 4,25+1,00 4,30+1,36 4, 08±l,43^ 9,53±2,99* 7,89±l,22*- # Bk-(l-7)/Bk-(l-9) 1,09+0,85 0,75±0,42 1,69+0,51 1,18+0,21^ 0,19+0,04*'* 0,17±0,06*' # Los valores corresponden a la media + SEM. Abreviaturas: S: sham; MI: infarto al miocardio; C: Candesartan; E: enalapril; N: número de animales; Bk: bradikinina. *p<0,05 vs S; *p<0,05 vs MI; ^0,05 vs E-MI (después de ANOVA significativo).
En los grupos experimentales sólo los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-9) pero no angiotensina-II o angiotensina-(l-7) correlacionaron significativamente con LVH y los niveles proteicos (r=-0,35, F=8,44, p<0,01, n=62, r=-0,35, F=7,25, p<0,01, respectivamente, Figuras 2a-b). Estos resultados indican que tanto el inhibidor de ECA como el antagonista del receptor ATl aumentan los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-9) y este efecto estaba asociado con la atenuación de la hipertrofia del ventrículo izquierdo y el remodelado del ventrículo izquierdo.
Ejemplo 11. La administración de angiotensina-(l-9) inhibe el remodelado.***
A continuación evaluamos los efectos de la administración crónica de angiotensina-(l-9) por dos semanas a ratas con infarto al miocardio con minibombas osmóticas Alzet (ver ejemplo 3) sin observar cambios en el peso corporal, presión arterial sistólica o frecuencia cardiaca en los grupos experimentales (Tabla 4).
En estos experimentos, se determinaron el área y el perímetro de los cardiomiocitos del corazón de ratas sham, infartadas e infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) (Figura 3a-b). En ratas infartadas, el área celular aumentó en un 69% comparado con ratas sham (p<0,01), mientras que la administración de angiotensina-(l-9) previno el aumento del área celular comparado con ratas infartadas (p<0,01, Figura 3b). El perímetro de los cardiomiocitos siguió la misma tendencia que el área celular y aumentó en un 28% en ratas infartadas respecto a ratas sham (p<0,01) y disminuyó en 31% por la administración de angiotensina-(l-9) respecto a ratas infartadas (p<0,01, Figura 3b). Los genes fetales están normalmente activados durante el desarrollo embrionario y se reprimen en la adultez. Sin embargo, en condiciones patológicas estos genes se sobreexpresan, y tradicionalmente, se consideran como marcadores moleculares de la hipertrofia cardiaca patológica (Schneider y cois, Basic Res. Cardiol. 87 Suppl 2:33-48, 1992; van Bilsen & Chien, Cardiovasc. Res. 27:1140-9, 1993). Tanto la expresión del mRNA del factor natriurético auricular (ANF) y los niveles proteicos de D- MHC se determinaron por RT-PCR y Western blot, respectivamente (ver ejemplo 4). Las ratas infartadas mostraron un 310% de aumento en los niveles de mRNA de ANF respecto a ratas sham (p<0,01, Figura 4a-b) y una reducción del 81 % en las ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) respecto a ratas infartadas (p<0.01, Figura 4b). Los niveles proteicos de D-MHC en el ventrículo izquierdo (Figura 5a-b) aumentó en un 90 % en ratas infartadas respecto a ratas sham (p<0,01, Figura 5b) y disminuyó en un 48 % en ratas infartadas tratadas con angiotensina-(l-9) respecto a ratas infartadas (p<0,01). En conjunto, estos resultados indican que la administración de angiotensina-(l-9) previene el remodelado cardiaco después de un infarto al miocardio. Ya que angiotensina-(l-9) se puede hidrolizar por ECA para formar angiotensina-(l-7), nosotros probamos esta hipótesis por la coadministración de A799, el antagonista descrito para el receptor de angiotensina-(l-7) (Lara y cois, Regul. Pept. 103:17-22, 2002), con angiotensina-(l-9) a ratas infartadas por dos semanas. A799 no modificó los efectos preventivos de angiotensina-(l-9) sobre los aumentos del área y perímetro de los cardiomiocitos inducidos después del infarto al miocardio (Figura 3a). El efecto de A779 se corroboró midiendo los niveles circulantes de angiotensina-(l-7) en las ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) y A779 y en ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9). A779 aumentó los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-9), siendo los niveles de 9,26 ± 1,25 vs 6,8 ± 0,8 fmoles/g (ratas con infarto al miocardio y tratadas vs infartadas no tratadas con A779, respectivamente, p<0,01). En conjunto, estos datos indican que los efectos anti-remodelado in vivo de angiotensina-(l-9) en el tejido cardiaco no es mediado por angiotensina-(l-7).
Ejemplo 12. Angiotensina-(l-9) inhibe Ia hipertrofia del cardiomiocito en cultivos primarios.
Estos efectos anti-hipertróficos in vivo de angiotensina-(l-9) se confirmaron por experimentos in vitro usando cultivos de cardiomiocitos neonatos. La hipertrofia de los cardiomiocitos en cultivo se realizó por administración de norepinefrina (NE) y factor de crecimiento análogo a insulina-1 (IGF-I). Como se muestra en la Figura 6, los aumentos del área de los cardiomiocitos inducidos por NE (10 DM) o IGF-I (10 nM) se previnieron en forma significativa por la co-adición de 10 o 100 DM de angiotensina-(l-9). Efectos similares se observaron en el perímetro y sarcomerización de cardiomiocitos con angiotensina-(l-9).
Leyendas de las Figuras.
Figura 1. Sobreexpresión de la enzima convertidora de angiotensina-I homologa (ECA-2) por transducción adenoviral en cardiomiocitos en cultivo. Cardiomiocitos en cultivo se transdujeron con un adenovirus que sobreexpresa ECA-2, usando distintas multiplicidades de infección (MOI). Los MOIs utilizados fueron, carril 1: MOI=O, carril 2: MOI=IOOO, carril 3: MOI=2000, carril 4: MOI=3000; carril 5: MOI=4000. Después de 48 h de incubación a 37 0 C en un incubador con 5% CO 2 /95% aire, las células se Usaron y se sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS y posterior Western blot, usando un anticuerpo policlonal anti-ECA2.
Figura 2. Correlación de los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-9), angiotensina-II o angiotensina-(l-7) con la hipertrofia ventricular izquierda (LVH) y los niveles proteicos.
En los modelos animales descritos en el ejemplo 1, se determinaron los niveles plasmáticos de angiotensina-(l-9) [Ang-(l-9)] 5 angiotensina-(l-7) [Ang-(l-7)] y angiotensina II [Ang II] según lo descrito en el ejemplo 5. Paralelamente, la hipertrofia ventricular izquierda se determinó mediante el cuociente entre el peso el ventrículo izquierdo [LVW] y el peso corporal [BW], o por el contenido total de proteínas del ventrículo izquierdo (ver ejemplo 3). En el panel A) se muestran las correlaciones entre el cuociente LVW/BW y los niveles plasmáticos de Ang II, Ang-(l-7) y Ang-(l-9). En el panel B) se muestra la correlación entre el contenido de proteína total del ventrículo izquierdo y los niveles plasmáticos de Ang-(l-9). El análisis estadístico se realizó mediante una correlación de Pearson. Figura 3. La angiotensina-(l~9) previene el desarrollo de hipertrofia cardiaca determinado por el área y el perímetro de los cardiomiocitos. En los modelos animales descrito en el ejemplo 1, se les extrajo el corazón, se les realizaron cortes histológicos y se realizó un análisis morfológico y morfométrico del tejido cardíaco según el procedimiento descrito en el ejemplo 3. En el panel A) se muestran figuras representativas de cortes histológicos correspondientes a ratas sham (S), ratas infartadas (MI), ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) (Ang-(l-9)-MI) y ratas infartadas y tratadas con angiotensina- (1-9) y A778 (Ang-(l-9)-A779-MI). En el panel B) se muestra la cuantifícación. **p<0,01 vs sham; ## p<0 > °l vs MI.
Figura 4. La angiotensina-(l-9) previene el desarrollo de hipertrofia cardiaca determinado por los niveles de mRNA del factor natriurétrico auricular (ANF). En los modelos animales descrito en el ejemplo 1, se les extrajo el corazón, y se purificó RNA según el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Posteriormente, se determinó la cantidad de mRNA para ANF a través de transcripción reversa seguido de una reacción de polimerización en cadena (RT-PCR) (ver ejemplo 3). En el panel A) se muestra un gel de agarosa representativo correspondiente al amplificado de un RT-PCR para ANF de RNA obtenido de ventrículo izquierdo de ratas sham (S), ratas infartadas (MI) y ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) (Ang-(l-9)-MI) y los respectivos controles de carga con el RNA ribosomal 18S. En el panel B) se muestra la cuantificación de los RT-PCRs. ** p<0,01 vs sham; ## p<0,01 vs MI.
Figura 5. La angiotensina-(l-9) previene el desarrollo de hipertrofia cardiaca determinado por los niveles de la cadena pesada de la D-miosina (D-MHC). En los modelos animales descrito en el ejemplo 1, se les extrajo el corazón y se obtuvo proteína total según el procedimiento descrito en el ejemplo 3. Posteriormente, las proteínas se resolvieron por electroforesis en poliacrilamida-SDS y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. El
D-MHC se determinó usando anticuerpos específicos según lo descrito en el ejemplo 3. En el panel A) se muestra un Western blot representativo de los niveles de D-MHC en los ventrículos izquierdo de ratas sham (S), ratas infartadas (MI) y ratas infartadas y tratadas con angiotensina-(l-9) (Ang-(l-9)-MI). Además se muestran los respectivos controles de carga con D-actina. En el panel B) se muestra la cuantifϊcación de los western blots. **p<0,01 vs sham; ## p<0,01 vs MI.
Figura 6. Angiotensina-(l-9) antagoniza el desarrollo de hipertrofia de los cardiomiocitos en cultivo inducida por IGF-I y norepinefrina. Cardiomiocitos en cultivo recién obtenidos se dejaron adherir a la placa, incubándolos 24 h en medio de cultivo
(DME:M199=4:1) suplementado con 5% suero fetal bovino más 10 % suero de ternero.
Luego, se les reemplazó el medio por medio de cultivo sin suero y se los incubó por 18 h más.
Posteriormente, las células se preincubaron con angiotensina-(l-9) (10 y 100 DM) por 1 h, y luego se les agregó norepinefrina (NE, 10 DM final) o factor de crecimiento análogo a insulina- 1 (IGF-I, 10 nM final) o factor de crecimiento análogo a insulina- 1 (IGF-I, 1OnM final) y se incubó por 48 h más. Las células se fijaron con formal dehido 4%, se permeabilizaron con tritón X-100 0,2% en PBS por 6 min, y se bloquearon con BSA 3% en
PBS por 1 h.. El citoesqueleto de actina se reveló con faloidina-rodamina (1:400, color rojo) y el núcleo se tifió con Hoescht (1:1000, color azul) por 1,5 h. Las células se visualizaron usando un microscopio de epifluorescencia. Las figuras son representativas de 3 experimentos independientes. La barra corresponde a 50.μM.