Login| Sign Up| Help| Contact|

Patent Searching and Data


Title:
PHARMACEUTICAL COMPOSITION, EXCIPIENT FOR THE COMPOSITION AND USE OF THE COMPOSITION
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2019/153064
Kind Code:
A1
Abstract:
The present invention describes a pharmaceutical composition containing synthetic cannabidiol and the use thereof in obtaining a medicinal product for the treatment of neurological disorders, and also the principal excipients used in the production process, in addition to the process for preparing same on a small, medium and large scale. More specifically, the present invention discloses the use of the composition for the treatment of neurological disorders in the human or animal population, especially in the treatment of Parkinson's disease, in a range of from 300 to 850 mg/day or in daily doses of 100 to 1750 mg for a neuroprotective action. The present invention pertains to the field of pharmacy and medicine.

Inventors:
DONADUZZI LUIZ (BR)
DONADUZZI CARMEN MARIA (BR)
JUNIOR LIBERATO BRUM (BR)
ZIMMERMAN PATRÍCIA MOURA DA ROSA (BR)
WEBLER EMANUELLE (BR)
RECHIA LETÍCIA MELLO (BR)
CRIPPA JOSÉ ALEXANDRE (BR)
HALLAK JAIME EDUARDO CECILIO (BR)
ZUARDI ANTONIO WALDO (BR)
GUIMARÃES FRANCISCO SILVEIRA (BR)
CAMPOS ALLINE CRISTINA DE (BR)
TUMAS VITOR (BR)
GUIMARÃES ELAINE APARECIDA DEL BEL BELLUZ (BR)
Application Number:
PCT/BR2019/050040
Publication Date:
August 15, 2019
Filing Date:
February 11, 2019
Export Citation:
Click for automatic bibliography generation   Help
Assignee:
PRATI DONADUZZI & CIA LTDA (BR)
UNIV DE SAO PAULO (BR)
International Classes:
A61K31/352; A61P25/00; A61P25/08; A61P25/16; A61P25/28
Domestic Patent References:
WO2017045053A12017-03-23
WO2017204986A12017-11-30
WO2018011798A12018-01-18
WO2009020666A12009-02-12
WO2015068052A22015-05-14
Foreign References:
US20160338974A12016-11-24
US7025992B22006-04-11
BR102015024165A22017-03-28
Other References:
CELORRIO MARTA; ROJO-BUSTAMANTE ESTEFANÍA; FERNÁNDEZ-SUÁREZ DIANA; SÁEZ ELENA; ESTELLA-HERMOSO DE MENDOZA ANDER; MÜLLER CHRISTA E;: "GPR55: A therapeutic target for Parkinson's disease?", NEUROPHARMACOLOGY, vol. 125, 30 October 2017 (2017-10-30), pages 319 - 332, XP085184453, ISSN: 0028-3908, DOI: 10.1016/j.neuropharm.2017.08.017
A.J HAMPSON , M GRIMALDI , J AXELROD , D WINK : "Cannabidiol and (-) A9-tetrahydrocannabinol are neuroprotective antioxidants", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES (PNAS), vol. 95, 31 July 1998 (1998-07-31), pages 8268 - 8273, XP002109751, ISSN: 0027-8424, DOI: 10.1073/pnas.95.14.8268
KEITH BAILEY DENISE GAGNÉ: "Distinction of Synthetic Cannabidiol, Cannabichromene, and Cannabivarin by GLC Using On-Column Methylation", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 64, no. 10, 31 October 1975 (1975-10-31), pages 1719 - 1720, XP055729779, DOI: 10.1002/jps.2600641033
CAROL E TURNER , JANIS T HENRY : "Constituents of Cannabis sativa L. IX: Stability of Synthetic and Naturally Occurring Cannabinoids in Chloroform", JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, vol. 64, no. 2, 1 February 1975 (1975-02-01), pages 357 - 359, XP009522905, DOI: 10.1002/jps.2600640244
R MECHOULAM , Y GAONI : "A total synthesis of d1-DELTA1- tetrahydrocannabinol, the active constituent of hashish", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 87, no. 14, 20 July 1965 (1965-07-20), pages 3273 - 3275, XP008128975, ISSN: 0002-7863, DOI: 10.1021/ja01092a065
T PETRZILKA , W HAEFLIGER , C SIKEMEIER : "123 Synthese von Haschisch-Inhaltsstoffen. ", HELVETICA CHIMICA ACTA, vol. 52, no. 4, 1969, pages 1102 - 1134, XP001088716, DOI: 10.1002/hlca.19690520427
ELEONORA BALLERINI , LUCIO MINUTI ,ORIANA PIERMATTI , FERDINANDO PIZZO: "High Pressure Diels-Alder Approach to Hydroxy-Substituted 6a-Cyano-tetrahydro-6H-benzo[c]chromen-6- ones: A Route to A6-Cis-Cannabidiol", THE JOURNAL OF ORGANIC CHEMISTRY, vol. 74, no. 11, 29 April 2009 (2009-04-29), pages 4311 - 4317, XP055729784, ISSN: 0022-3263, DOI: 10.1021/jo9005365
TIZIANA BISOGNO , LUMIA HANUS , LUCIANO DE PETROCELLIS , SUSANNA TCHILIBON , DATA E PONDE , INES BRANDI , ANIELLO SCHIANO MORIELLO: "Molecular targets for cannabidiol and its synthetic analogues: effect on vanilloid VR1 receptors and on the cellular uptake and enzymatic hydrolysis of anandamide", BRITISH JOURNAL OF PHARMACOLOGY, vol. 134, no. 4, 1 January 2001 (2001-01-01), pages 845 - 852, XP002319199, ISSN: 0007-1188, DOI: 10.1038/sj.bjp.0704327
See also references of EP 3750537A4
Attorney, Agent or Firm:
REMER VILLAÇA & NOGUEIRA ASSESSORIA E CONSULTORIA DE PROPRIEDADE INTELECTUAL S/S (BR)
Download PDF:
Claims:
Reivindicações

1. Composição farmacêutica caracterizada por compreender Canabidiol de origem sintética, até 0,06% de Canabinol, até 0,06% de Delta-8-tetra- hidrocanabinol, até 0,06% de Delta-9-tetra-hidrocanabinol, até 0,06% de Éster metílico do ácido canabidiólico, até 0,06% de Mentadienol e até 0,06% de Olivetolato de metila.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada pelo Canabidiol de origem sintética estar na faixa entre 50 a 400 mg.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por estar em formas farmacêuticas orais de cápsula gelatinosa dura, comprimido, comprimido revestido, comprimido orodispersível, comprimido efervescente, pastilha, xarope, suspensão e/ou solução, em especial cápsula gelatinosa mole.

4. Excipiente para a composição, conforme definida na reivindicação 1 , caracterizado por compreender óleo de origem vegetal, animal ou mineral ou combinação dos mesmos.

5. Excipiente, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo óleo ser selecionado do grupo que compreende óleo de semente de uva, óleo de gergelim, óleo de milho, óleo de soja, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de canola, óleo de noz, óleo de linhaça, óleo de abacate, óleo de menta, óleo de amendoim, óleo de castor hidrogenado, óleo de coco, óleo de açaí, óleo de andiroba, óleo de babaçu, óleo de buriti, óleo de castanha do Brasil, óleo de copaíba, óleo de maracujá, óleo de pracaxi, óleo de patauá, triglicerídeos, óleo de prímula, óleo de cártamo, óleo de amêndoas, óleo de borragem, óleo de semente de romã, óleo de espinheira marítima, óleo de alho, óleo de krill, óleo de fígado de bacalhau, óleo de palma, óleo de peixe, óleo de mamona hidrogenado, óleo de macadâmia, óleo de rosa mosqueta, óleo de algodão, ou combinações dos mesmos.

6. Excipiente, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo solvente oleoso compreender o óleo de milho.

7. Uso da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por possuir ação neuroprotetora.

8. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pela administração ser na dose de 100 a 1750 mg/dia.

9. Uso da composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de transtornos neurológicos.

10. Uso da composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelos transtornos neurológicos serem epilepsia refratária, epilepsia, esquizofrenia, distúrbios do sono, transtorno pós-traumático, Alzheimer, ansiedade, depressão, transtorno bipolar, dor neuropática, alívio de dor crónica, autismo, alívio de dor crónica, e doença de Parkinson.

1 1. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo transtorno neurológico ser doença de Parkinson.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela dose de Canabidiol ser entre 300 e 850 mg/dia.

13. Uso, de acordo com as reivindicações 7 ou 9, caracterizado pela dose poder ser dose única ou dividida ao longo do dia.

Description:
Relatório Descritivo de Patente de Invenção

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, EXCIPIENTE PARA A COMPOSIÇÃO E

USO DA COMPOSIÇÃO

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção revela uma composição e seu uso como medicamento para o tratamento de distúrbios neurológicos a ser administrado preferencialmente em seres humanos, podendo também ser utilizado para o tratamento de animais. A presente invenção situa-se no campo da Farmácia e da Medicina.

Antecedentes da Invenção

[0002] A doença de Parkinson é uma doença crónica, progressiva, que acomete uma em cada mil pessoas e afeta diretamente a qualidade de vida dos portadores. É uma patologia resultante da morte dos neurônios produtores de dopamina da substância negra, apresentando uma etiologia idiopática. Acredita-se que o seu surgimento provém de fatores ambientais e genéticos, podendo interagir e contribuir para o desenvolvimento da neurodegeneração.

[0003] Quando os sinais e sintomas são detectados, provavelmente já ocorreu a perda de aproximadamente 60% dos neurônios dopaminérgicos, e o conteúdo de dopamina no estriado já está cerca de 80% inferior ao normal. Diante disto, o desenvolvimento de medicamentos e pesquisas mais aprofundadas para o tratamento da doença de Parkinson se fazem relevantes.

[0004] Os principais sintomas desta doença são lentidão, rigidez, resistência ao movimento passivo, dificuldade de equilíbrio postural e tremor. Em estágios avançados pode ocorrer demência, comprometimento cognitivo e extensão do processo mórbido cerebral. Qs tratamentos disponíveis no mercado tratam os sintomas, mas não mudam o processo degenerativo. Com o passar do tempo, como o quadro clínico do paciente vai agravando, há maior dificuldade de controlar os sintomas.

[0005] Os principais medicamentos atualmente indicados para a doença de Parkinson são: cloridrato de triexifenidil, levodopa + cloridrato de benserazida, mesilato de rasagilina, levodopa + carbidopa, dentre outros.

[0006] O Canabidiol tem se mostrado uma alternativa promissora para vários transtornos neurológicos, altamente eficaz e desprovido de psicotoxicidade e demais efeitos colaterais. A ação neuroprotetora proposta nesta invenção, que retarde a progressão da doença de Parkinson e de outras doenças neurológicas e minimize o agravamento do quadro clínico do paciente, diminuindo a extensão do processo mórbido relativo sistema dopaminérgico para outras áreas cerebrais, sendo inédita.

[0007] Nos últimos 10 anos observou-se um notável aumento de publicações científicas sobre o Canabidiol, principalmente estimulado pela descoberta dos seus efeitos anti-inflamatório, antioxidativo e neuroprotetor. Estes estudos têm sugerido uma vasta gama de possíveis efeitos terapêuticos do ativo em várias indicações terapêuticas.

[0008] Há dados de estudos pré-clínicos que utilizaram o modelo de lesão estriatal de ratos com a toxina 6-hidróxi-dopamina e o ativo diminuiu a degeneração de neurônios dopaminérgicos e a ativação de células microgliais. Contudo, os mecanismos responsáveis por estes efeitos não estão elucidados.

[0009] Considerando que não existem estudos pré-clínicos suficientes para caracterizar o potencial terapêutico do Canabidiol no tratamento da doença de Parkinson, nem formulação farmacêutica para tal indicação, a presente invenção vai além destes ensinamentos genéricos e preliminares, descrevendo e provando a viabilidade de formulação para tal indicação.

[0010] Análises funcionais motoras e de co-morbidades que usualmente acompanham a doença de Parkinson precisam ser comprovadas com o Canabidiol sintético, Canabidiol de origem vegetal e/ou associação.

[0011] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema: [0012] O documento WO 2009/020666, intitulado “ORAL CANNABINOID LIQUID FORMULATIONS AND METHODS OF TREATMENT’, revela uma composição oral líquida de canabinóides, onde o solvente é aquoso, e possui um perfil de absorção in vivo mais eficiente que as cápsulas gelatinosas comerciais.

[0013] O documento US 7025992, intitulado “ Pharmaceutical formulations” , revela uma formulação de canabinóides na forma de pó, que quando hidratada, tem sua absorção facilitada por meio de um emulsificante.

[0014] O documento WO 2015/068052, intitulado “TERPENE AND CANNABINOID FORMULATIONS’, revela lipossomas compreendendo canabinóides e terpenos.

[0015] O documento BR 10 2015 024165 8, intitulado “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA ORAL COMPREENDENDO CANABINÓIDE, PROCESSO PARA SUA PREPARAÇÃO E SEU USO’, revela composição farmacêutica oral compreendendo canabinóide, processo para seu preparo e seu uso.

[0016] Assim, do que depende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a formulação aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0017] Em suma, notam-se diversas formulações para tratamento de transtornos neurológicos.

Sumário da Invenção

[0018] Dessa forma, a presente invenção descreve duas novas formulações compreendendo canabidiol (CBD) de origem sintética e vegetal, respectivamente, e que possui uma atividade surpreendente neuroprotetora, bem como, para a o tratamento de diversos transtornos neurológicos.

[0019] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica contendo o princípio ativo Canabidiol de origem sintética, e com: até 0,06% de canabinol, até 0,06% de Delta-8-tetra- hidrocanabinol, até 0,06% de Delta-9-tetra-hidrocanabinol, até 0,06% de éster metílico do ácido canabidiólico, até 0,06% de mentadienol e até 0,06% de olivetolato de metila.

[0020] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta excipiente para composição compreendendo óleo de origem vegetal, animal ou mineral ou combinação dos mesmos.

[0021] Em um terceiro objeto, a presente invenção revela o uso da composição farmacêutica com ação neuroprotetora.

[0022] Em um quarto aspecto, a presente invenção apresenta o uso da composição farmacêutica para a preparação de um medicamento para o tratamento de transtornos neurológicos.

[0023] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0024] São apresentadas as seguintes figuras:

[0025] A figura 1 mostra tabela com dados de aparência geral e alterações comportamentais de ratos (machos e fêmeas) tratados agudamente com o CBD-SINT durante as primeiras 8 horas após a administração.

[0026] A figura 2 mostra tabela com dados de aparência geral e alterações comportamentais de camundongos (machos e fêmeas) tratados agudamente com o CBD-SINT durante as primeiras 8 horas após a administração.

[0027] A figura 3 mostra tabela com dados de efeitos do tratamento agudo com o CBD-SINT sobre o peso absoluto (g) e relativo (%) de órgãos e peso corporal final de ratos (machos e fêmeas) após 14 dias de exposição.

[0028] A figura 4 mostra tabela com dados de efeitos do tratamento agudo com o CBD-SINT sobre o peso absoluto (g) e relativo (%) de órgãos e peso corporal final de camundongos (machos e fêmeas) após 14 dias de exposição.

[0029] A figura 5 mostra o número médio de eritrócitos policromáticos micronucleados (EPCMN) entre os diferentes grupos experimentais obtidos durante o teste do micronúcleo.

[0030] A figura 6 mostra os efeitos do tratamento agudo com o CBD-SINT e ciclofosfamida sobre índice de Dano (A e B) e Frequência de Dano (C e D) ao DNA de ratos machos e fêmeas.

[0031] A figura 7 mostra tabela com dados de mutagenicidade do CBD-SINT com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica para duas linhagens de Salmonella typhimurium (TA98 e TA100).

[0032] A figura 8 mostra tabela com dados de razão de mutagenicidade (RM) do CBD-SINT com (+S9) e sem (-S9) ativação metabólica para duas linhagens de Salmonella typhimurium (TA98 e TA100).

[0033] A figura 9 mostra tabela com dados de efeitos do tratamento agudo com o CBD-SINT nos comportamentos e sinais clínicos observados no teste de Irwin modificado.

[0034] A figura 10 mostra tabela com dados de efeitos do tratamento agudo com o CBD-SINT sobre a frequência respiratória, gases, eletrólitos e metabólitos sanguíneos.

[0035] A figura 1 1 mostra eletrocardiogramas representativos e os dados quantitativos para coelhos tratados com o placebo ou CBD-SINT nas doses de 17, 51 e 170 mg/kg.

[0036] A figura 12 mostra os resultados obtidos das pressões arteriais sistólica, diastólica e média registradas em animais do grupo controle.

[0037] A Figura 13 mostra o esquema utilizado nos ensaios de memória (labirinto aquático de Morris) que foram realizados diariamente do dia 1 ao dia 10 após a administração da neurotoxina MPTP.

[0038] A figura 14 mostra o esquema utilizado nos ensaios de memória (labirinto aquático de Morris) que foram realizados diariamente do dia 18 ao dia 28 após a administração da neurotoxina 6-OFIDA.

[0039] A figura 15 mostra o modelo utilizado no teste do campo aberto.

[0040] A figura 16 mostra o modelo utilizado no labirinto aquático de Morris.

[0041] A figura 17 mostra os tempos de latência para iniciar os movimentos no teste do campo aberto após 24 horas e 10 dias da administração do MPTP.

[0042] A figura 18 mostra as frequências de levantar dentre todos os grupos experimentais tratados com MPTP.

[0043] A figura 19 mostra as frequências de locomoção dentre todos os grupos experimentais tratados com MPTP.

[0044] A figura 20 mostra o tempo de imobilidade obtido do tratamento com MPTP.

[0045] A figura 21 mostra os resultados obtidos do efeito do CBD-SINT sobre a memória com o tratamento com MPTP.

[0046] A figura 22 mostra os valores encontrados para os níveis de dopamina, DOPAC e AVM estriatal dentre os diferentes grupos experimentais tratados com MPTP.

[0047] A figura 23 mostra o tempo de imobilidade dentre todos os grupos experimentais tratados com a toxina 6-OHDA.

[0048] A figura 24 mostra o tempo de latência ao movimento apresentado pelos animais tratados com a toxina 6-OHDA.

[0049] A figura 25 mostra as frequências de locomoção dos diferentes grupos experimentais tratados com a toxina 6-OHDA.

[0050] A figura 26 mostra as frequências de levantar dos diferentes grupos experimentais tratados com a toxina 6-OHDA.

[0051] A Figura 27 mostra o tempo de latência necessário para que os diferentes grupos experimentais tratados com a 6-OHDA e seus respectivos controles encontrem a plataforma no teste do Labirinto Aquático de Morris.

Descrição Detalhada da Invenção

[0052] A presente invenção revela uma composição farmacêutica compreendendo de 50 a 400 mg do princípio ativo Canabidiol de origem sintética, com: até 0,06% de canabinol, até 0,06% de Delta-8-tetra- hidrocanabinol, até 0,06% de Delta-9-tetra-hidrocanabinol, até 0,06% de éster metílico do ácido canabidiólico, até 0,06% de mentadienol e até 0,06% de olivetolato de metila. A presente invenção também revela o uso desta composição na preparação de um medicamento para o tratamento de transtornos neurológicos, devido à sua ação neuroprotetora, tendo sua administração via oral em uma dose entre a faixa de Canabidiol de 100 a 1750 mg/dia.

[0053] A presente invenção revela uma composição para favorecer a biodisponibilidade e/ou modular a sua liberação para redução da administração da dose diária, favorecendo a adesão do paciente ao tratamento.

[0054] A presente invenção revela uma composição para melhorar propriedades organolépticas do(s) pnncípio(s) ativo(s).

[0055] A presente invenção revela a administração oral da composição nas formas farmacêuticas orais cápsula gelatinosa dura, cápsula mole, comprimido, comprimido revestido, comprimido orodispersível, comprimido efervescente, pastilha, xarope, suspensão e/ou solução.

[0056] A presente invenção é indicada para o tratamento de distúrbios neurológicos, como epilepsia refratária, epilepsia, esquizofrenia, distúrbios do sono, transtorno pós-traumático, dor neuropática, alívio de dor crónica e autismo, preferencialmente para a indicação terapêutica relacionada ao tratamento da doença de Parkinson, sendo indicada preferencialmente para tratamento de seres humanos, podendo ser indicada para patologias envolvendo animais de pequeno, médio e grande porte.

[0057] A presente descrição visa aprofundar o detalhamento sobre o conceito inventivo, prover exemplos que facilitem a cognição/compreensão do mesmo e fornecer dados técnicos precisos sobre algumas das formas de concretizar o conceito inventivo da criação. A descrição detalhada também visa evitar a repetição, por terceiros, da extensa experimentação, investimentos financeiros, de tempo e de atividade intelectual que os inventores/depositante fizeram para resolver os problemas técnicos ora resolvidos.

Processo de Obtenção do Canabidiol sintético

[0058] Em um processo de obtenção do Canabidiol sintético compreende-se as seguintes etapas:

a. Reação de condensação, partindo dos compostos mentadienol e olivetolato de metila, para o obtenção do éster metílico do ácido canabidióico. b. Reações de saponificação de descarboxilação, partindo do éster metílico do ácido canabidióico obtido anteriormente, para a obtenção do Canabidiol sintético bruto.

c. Filtração do Canabidiol bruto obtido.

d. Cristalização do Canabidiol bruto obtido.

e. Recristalização do Canabidiol bruto obtido.

f. Secagem do do Canabidiol bruto obtido.

[0059] Considera-se como escopo da presente invenção, o desenvolvimento de composição compreendendo Canabidiol sintético, que é um canabinóide sintético e Canabidiol fitofármaco que é um canabidiol de origem vegetal.

[0060] Para fins desta invenção, canabinóides sintéticos são os compostos capazes de interagir com os receptores canabinóides e que não são encontrados nem de forma endógena, nem nas plantas.

[0061] Também está no escopo da presente invenção os sais e ácidos farmaceuticamente do(s) composto(s) mencionado(s) acima, bem como sua mistura com outros canabinóides.

[0062] A dose terapêutica da administração oral da formulação a base de Canabidiol varia de 100 a 1750 mg/dia, preferencialmente entre 300 e 850 mg/dia em dose única ou divididos ao longo do dia.

[0063] As composições orais da presente invenção apresentam concentração de Canabidiol dentro das especificações estabelecidas na metodologia analítica objeto desta patente, permanecendo estáveis por longos períodos de tempo, incluindo o período de armazenamento e validade, sem surgimento considerável de degradações como o Delta-9-tetra-hidrocanabinol ou outro composto psicoativo.

[0064] Os excipientes utilizados na composição da presente invenção são os excipientes comumente encontrados no estado da técnica e conhecidos por especialistas da área farmacêutica. Exemplos não limitantes incluem antioxidantes, edulcorantes, conservantes, opacificantes, lubrificantes, desintegrantes, diluentes e combinações dos mesmos.

[0065] O antioxidante pode ser selecionado a partir de acetilcisteína tocoferóis, a-tocoferol, d-a-tocoferol, DL-a-tocoferol, palmitato de ascorbila, butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), lecitina, cisteína, cloridrato de cisteína, gaiato de propila, ácido ascórbico, ácido isoascórbico, tioglicerol, ácido cítrico, ácido tartárico, EDTA e seus sais, sulfato de hidroxiquinolina, ácido fosfórico, metabissulfito de sódio e citrato de sódio, f-butil-hidroquinona (TBHQ) e combinações dos mesmos.

[0066] Os agentes edulcorantes podem ser selecionados a partir de sucralose, sacarina, sacarina sódica, ciclamato de sódio, sorbitol, xilitol, sacarose, glicerol, neohesperidina, aspartame e combinações dos mesmos.

[0067] Os conservantes podem ser selecionados a partir de benzoato de sódio, sorbato de potássio, álcool benzílico, ésteres de parabenos (ácidos phidroxibenzóico) tais como metilparabeno, etilparabeno, propilparabeno, butilparabeno e semelhantes, e combinações dos mesmos.

[0068] Os desintegrantes podem ser selecionados dentre crospovidona, croscarmelose, amido glicolato, polacrilina potássica, hidroxipropilcelulose, celulose microcristalina ou combinação dos mesmos.

[0069] Os lubrificantes podem ser selecionados dentre estearato de magnésio, estearil fumarato de sódio, ácido esteárico, citrato de sódio ou combinação dos mesmos.

[0070] Os diluentes podem ser selecionados dentre polióis diversos (e.g. maltitol, manitol e xilitol), celulose microcristalina, amido, talco, maltodextrina, sacarose e dextrose, óleos de origem vegetal, animal ou mineral ou combinação dos mesmos.

[0071] Os solventes oleosos podem ser escolhidos do grupo que compreende óleo de semente de uva, óleo de gergelim, óleo de milho, óleo de soja, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de canola, óleo de noz, óleo de linhaça, óleo de abacate, óleo de menta, óleo de amendoim, óleo de castor hidrogenado, óleo de coco, óleo de açaí, óleo de andiroba, óleo de babaçu, óleo de buriti, óleo de castanha do Brasil, óleo de copaíba, óleo de maracujá, óleo de pracaxi, óleo de patauá, triglicerídeos, óleo de prímula, óleo de cártamo, óleo de amêndoas, óleo de borragem, óleo de semente de romã, óleo de espinheira marítima, óleo de alho, óleo de krill, óleo de fígado de bacalhau, óleo de palma, óleo de peixe, óleo de mamona hidrogenado, óleo de macadâmia, óleo de rosa mosqueta, óleo de algodão, e combinações dos mesmos.

[0072] Preferencialmente, o solvente oleoso é o óleo de milho.

Processo de Preparo da Composição Farmacêutica

[0073] O processo de produção utiliza equipamentos usuais à preparação de formas farmacêuticas sólidas, como por exemplo: Peneiras vibratórias, misturadores farmacêuticos (Misturador em “V”, Misturador Duplo-Cone, Misturador BIN e/ou misturador High shear mixer), leito fluidizado, estufa, rolo- compactador, compressoras e encapsuladoras farmacêuticas tipo rotativas, revestidoras (tacho perfurado e drageadeiras), agitadores e moinho coloidal/ultra turrax.

[0074] O processo de produção utiliza equipamentos usuais à preparação de péletes, como por exemplo: Peneiras vibratórias, fundidores, tanques de preparo, misturadores farmacêuticos, leitos fluidizados top e bottom spray, extrusores, esferonizadores e encapsuladoras.

[0075] O processo de produção utiliza equipamentos usuais à preparação de cápsulas moles, como por exemplo: Peneiras vibratórias, misturadores farmacêuticos, reatores, tanques agitadores, moinho coloidal, encapsuladoras, túneis de secagem, estufas e câmaras climatizadas. Este processo produtivo consiste basicamente de 4 passos: 1. Preparo da massa de gelatina fundida; 2. Preparo do enchimento com o ativo; 3. Encapsulamento; e 4. Secagem das cápsulas. As quantidades necessárias de material em cada etapa são proporcionais ao número de capsulas a ser preparado.

[0076] Um processo para o preparo de uma composição da presente invenção compreende as etapas de:

a. Dissolução do(s) ativo(s) em solvente ou em co-solvente, seguido de adição dos demais adjuvantes e homogeneização, com ou sem aquecimento, e/ou

b. Dissolução do(s) ativo(s) em solvente ou em co-solvente, seguido de adição dos demais adjuvantes e homogeneização e incorporação a suporte para administração transdérmica, e/ou

c. Dissolução ou suspensão do(s) ativo(s) em solvente ou em co- solvente, seguido de adição dos demais adjuvantes e homogeneização e incorporação a suporte para administração nasal e/ou pulmonar, e/ou

d. Adição do(s) ativo(s) e excipientes, homogeneização e encapsulamento, e/ou.

e. Adição do(s) ativo(s) e excipientes, microesferonização, homogeneização e encapsulamento.

f. Adição do(s) ativo(s) e excipientes, microesferonização, homogeneização e compressão, e/ou

g. Adição do(s) ativo(s) e excipientes, homogeneização, compressão e revestimento, e/ou.

h. Adição do(s) ativo(s) e excipientes, homogeneização, granulação e compressão.

i. Incorporação do ativo em sistemas lipossomais, nanopartículas e/ou nanocápsulas.

[0077] É um adicional objeto da presente invenção um processo de preparo empregando nanotecnologia, lipossomas, péletes, microemulsões e adesivos.

[0078] As formulações propostas devem apresentar reprodutibilidade adequada, através de processo produtivo em larga escala devidamente validado.

[0079] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta uma composição farmacêutica contendo o princípio ativo Canabidiol de origem sintética, e com: até 0,06% de canabinol, até 0,06% de Delta-8-tetra- hidrocanabinol, até 0,06% de Delta-9-tetra-hidrocanabinol, até 0,06% de éster metílico do ácido canabidiólico, até 0,06% de mentadienol e até 0,06% de olivetolato de metila.

[0080] Em uma concretização da composição, ela se apresenta uma faixa de Canabidiol de origem sintética entre 50 a 400 mg.

[0081] Em uma concretização da composição, ela apresenta formas farmacêuticas orais de cápsula gelatinosa dura, comprimido, comprimido revestido, comprimido orodispersível, comprimido efervescente, pastilha, xarope, suspensão e/ou solução, em especial cápsula gelatinosa mole.

[0082] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta excipiente para composição compreendendo óleo de origem vegetal, animal ou mineral ou combinação dos mesmos.

[0083] Em uma concretização do excipiente, o óleo pode ser selecionado do grupo que compreende óleo de semente de uva, óleo de gergelim, óleo de milho, óleo de soja, azeite de oliva, óleo de girassol, óleo de canola, óleo de noz, óleo de linhaça, óleo de abacate, óleo de menta, óleo de amendoim, óleo de castor hidrogenado, óleo de coco, óleo de açaí, óleo de andiroba, óleo de babaçu, óleo de buriti, óleo de castanha do Brasil, óleo de copaíba, óleo de maracujá, óleo de pracaxi, óleo de patauá, triglicerídeos, óleo de prímula, óleo de cártamo, óleo de amêndoas, óleo de borragem, óleo de semente de romã, óleo de espinheira marítima, óleo de alho, óleo de krill, óleo de fígado de bacalhau, óleo de palma, óleo de peixe, óleo de mamona hidrogenado, óleo de macadâmia, óleo de rosa mosqueta, óleo de algodão, ou combinações dos mesmos.

[0084] Em uma concretização do excipiente, o óleo selecionado é o óleo de milho.

[0085] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta o uso da composição farmacêutica com ação neuroprotetora.

[0086] Em uma concretização da ação neuroprotetora, ela é administrada na dose entre 100 a 1750 mg/dia. [0087] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta o uso da composição farmacêutica para a preparação de um medicamento para o tratamento de transtornos neurológicos.

[0088] Em uma concretização dos transtornos neurológicos, eles podem ser - epilepsia refratária, epilepsia, esquizofrenia, distúrbios do sono, transtorno pós- traumático, Alzheimer, ansiedade, depressão, transtorno bipolar, dor neuropática, alívio de dor crónica, autismo, alívio de dor crónica, e doença de Parkinson.

[0089] Em uma concretização do transtorno neurológico, ele é preferivelmente a doença de Parkinson.

[0090] Em uma concretização da dose de Canabidiol, ela está na faixa entre 300 a 850 mg/dia, preferivelmente.

[0091] Em uma concretização da dose de Canabidiol, ela pode ser uma dose única ou dividida ao longo do dia.

[0092] Na presente invenção, entende-se por:

[0093] Atividade neuroprotetora: como aqui usado, o termo atividade “neuroprotetora” refere-se à neuroproteção, isto é, mecanismos e estratégias usados para a proteção dos neurônios contra danos decorrentes de enfermidades que afetam o Sistema Nervoso Central.

[0094] Transtornos neurológicos: como aqui usado, o termo “transtornos neurológicos” refere-se à doenças que afetam a região cerebral, da coluna vertebral e seus respectivos nervos que as conectam. Alguns exemplos incluem: epilepsia refratária, epilepsia, esquizofrenia, distúrbios do sono, transtorno pós-traumático, Alzheimer, ansiedade, depressão, transtorno bipolar, dor neuropática, alívio de dor crónica, autismo e doença de Parkinson.

[0095] Estudo de toxicidade de dose única (aguda): como aqui usado, o termo “estudo de toxicidade de dose única (aguda)” refere-se a um teste para a avaliação da segurança a curto prazo da administração de um determinado composto sobre um animal.

[0096] Estudo de genotoxicidade: como aqui usado, o termo “estudo de genotoxicidade” refere-se a um estudo da ação de qualquer agente físico, químico ou biológico que produz efeitos tóxicos e genotóxicos, sobre o material genético.

[0097] Teste de micronúcleo: como aqui usado, o termo“teste de micronúcleo” refere-se a um teste citogenético de biomonitoramento de dano genotóxico.

[0098] Ensaio cometa: como aqui usado, o termo“ensaio cometa” refere-se a um teste citogenético de biomonitoramento de dano genotóxico.

[0099] Teste de AMES: como aqui usado, o termo“teste de AMES” refere-se a um ensaio de mutagênese de curto tempo que visa à identificação de substâncias com potencial para induzir mutações genéticas.

[0100] Teste do campo aberto: como aqui usado, o termo“teste do campo aberto” refere-se a um teste para a avaliação da atividade motora de um determinado animal.

[0101] Labirinto aquático de Morris (cued test)\ como aqui usado, o termo “labirinto aquático de Morris ( cued test )” refere-se a um teste visando a avaliação do hipocampo relacionado à aprendizagem e memória.

EXEMPLOS

[0102] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Exemplo 1. Estudo de toxicidade de dose única (aguda) em ratos e camundongos

[0103] O estudo de toxicidade de dose única (aguda) foi realizado com diferentes grupos de ratos e camundongos (machos e fêmeas) e de acordo com os procedimentos recomendados pela OECD (2001 ) e ANVISA (2013).

[0104] Após um período de jejum de 6 h, o peso corporal dos animais foi determinado e a dose do CDB sintético foi calculada. Duas doses únicas (1000 e 2000 mg/kg) do CBD sintético foram administradas pela via oral (com auxílio de uma sonda de gavagem) e intraperitoneal em diferentes grupos de ratos e camundongos (machos e fêmeas). Outros diferentes grupos de roedores foram tratados com o placebo e foram considerados como grupos controle.

[0105] Os animais foram cuidadosamente observados quanto a quaisquer indícios de toxicidade dentro das primeiras oito horas após o tratamento, e diariamente durante um período de 14 dias. No 15° dia todos os animais foram eutanasiados e as respectivas investigações anatomopatológicas foram realizadas no 15° dia após os tratamentos.

[0106] Os efeitos da administração aguda do CBD-SINT em ratos e camundongos sobre a aparência geral e alterações comportamentais estão apresentados nas Figuras 1 e 2.

[0107] Durante as primeiras 8 horas de observação, os animais tratados com o CBD-SINT nas doses de 1000 mg/kg e 2000 mg/kg pela via intraperitoneal apresentaram uma redução expressiva de sua atividade. Além disso, contorções abdominais eventuais também foram observadas. Após este período (8 h), todos os animais mostraram-se ativos e com comportamento dentro da normalidade. Não foram observadas quaisquer alterações significativas na aparência ou no padrão de comportamento geral até o final dos 14 dias de observação. A DL50 do CBD-SINT não foi estipulada porque nenhuma morte foi observada nos animais tratados com doses de até 2000 mg/kg por via oral ou intraperitoneal.

[0108] O peso corporal final de ratos e camundongos, machos e fêmeas, tratados pelas vias oral e intraperitoneal, com diferentes doses do CBD, estão apresentados nas Figuras 3 e 4, respectivamente.

[0109] O peso corporal final e os ganhos de peso corporal, ao longo de todo o período de tratamento, foram semelhantes entre os grupos que receberam o placebo ou o CBD-SINT. Além disso, não houve alteração do consumo diário de ração e água em comparação com o placebo.

[0110] Não houve diferenças significativas no peso absoluto (g) ou relativo (%) de todos os órgãos isolados de ratos e camundongos tratados com o CBD ou com placebo após 14 dias do tratamento (Figuras 3 e 4).

[0111] O exame macroscópico dos órgãos vitais não revelou nenhuma anormalidade entre todos os grupos experimentais. Não foram observados quaisquer sinais de inflamação, hemorragia, acúmulo de líquido ou outras alterações sugestivas de lesões em todos os tecidos estudados. Nas análises histopatológicas nenhuma alteração significativa foi identificada, sugerindo ausência de toxicidade aguda para o CBD-SINT nas doses utilizadas.

Exemplo 2. Estudo de qenotoxicidade em ratos

[0112] As doses do CBD utilizadas foram determinadas a partir do Guia para a Condução de Estudos Não Clínicos de Toxicologia e Segurança Farmacológica necessários ao Desenvolvimento de Medicamentos (ANVISA, 2013; Versão 1.2) - protocolos de curta duração. Os seguintes testes foram realizados:

Teste do micronúcleo

[0113] Para a realização do teste do micronúcleo (Schmid, 1976), diferentes grupos de ratos (machos e fêmeas; n=10) receberam, pela via oral, três doses do CBD (500, 1000 e 2000 mg/kg). O grupo controle negativo recebeu o placebo por gavagem e o controle positivo foi tratado com ciclofosfamida monohidratada (20 mg/kg - Sigma- Aldrich) pela via intraperitoneal. Após 24 (ciclofosfamida) e 48 horas (CBD-SINT e veículo) do término dos tratamentos, os animais foram eutanasiados por decapitação. Os fémures foram removidos, a epífise proximal foi retirada para expor o canal medular e, com o auxílio de uma agulha 13 x 4,5 mm e 3 mL de solução de NaCI (150 mM), a medula foi retirada, lavando-se o canal medular com solução de NaCI. O material foi transferido para tubos de vidro e centrifugados a 1000 rpm/5 min. Após a centrifugação, descartou-se o sobrenadante, e o sedimento foi ressuspenso com solução de formaldeído 4% e levemente homogeneizado com o auxílio de uma pipeta Pasteur. Uma gota desta suspensão celular foi colocada em uma lâmina limpa e seca, e depois, realizou-se o esfregaço. As lâminas foram secas à temperatura ambiente e, após 24 horas, coradas com Leishman eosina-azul de metileno e submetidas à análise microscópica. Para determinação do número de micronúcleos foram contados 2000 eritrócitos policromáticos por animal (1000 em cada lâmina) utilizando-se microscópio óptico, no aumento de 400x. A análise das lâminas foi cega e realizada por um único avaliador.

Ensaio cometa

[0114] Para a realização do ensaio cometa, diferentes grupos de ratos (machos e fêmeas; n=10) receberam, pela via oral, três doses do CBD-SINT (500, 1000 e 2000 mmg/kg). O grupo controle negativo recebeu o placebo por gavagem e o controle positivo foi tratado com ciclofosfamida monohidratada (20 mg/kg - Sigma-Aldrich) pela via intraperitoneal. Após 24 (ciclofosfamida) e 48 horas (CBD-SINT e veículo) do término dos tratamentos amostras de sangue periférico foram coletadas previamente a eutanásia dos animais. A obtenção das lâminas com as células corridas em gel de eletroforese para a avaliação de danos ao DNA foi realizada de acordo com a técnica descrita por Klaude et al. (1996). Um total de 10 pL da suspensão celular obtida pela mistura com 120 pl_ de agarose LMP 5% a 37°C, foi depositada sobre uma lâmina pré-coberta com agarose normal (1 ,5%) e levada para refrigeração a 4°C por 10min (cobertas com lamínula) para endurecimento da agarose. Após a adição das células na lâmina foi evitada a exposição à luz direta (irradiação) para prevenção de danos adicionais no DNA. As lamínulas foram retiradas cuidadosamente e as lâminas acondicionadas na solução de lise em refrigerador (4°C) durante 1 hora. Após o tempo da lise, as lâminas foram removidas e colocadas na cuba horizontal de eletroforese, o tampão alcalino de eletroforese foi adicionado de modo a cobrir as mesmas, em seguida a cuba foi mergulhada em um recipiente com gelo (4°C), durante 25 minutos para desnaturação do DNA. Então, foi iniciada a corrida de eletroforese com 25 volts e 300 miliamper. O tempo de corrida foi de aproximadamente 25 minutos. Após eletroforese as lâminas foram retiradas e neutralizadas com 5 ml de solução tampão durante 5 minutos, este procedimento foi repetido mais duas vezes. Após a secagem as lâminas, estas foram fixadas com etanol durante 5 minutos e estocadas na geladeira até a análise. Para análise, as lâminas foram coradas com 100 mI_ de brometo de etídio, cobertas com lamínula, e analisadas após aproximadamente 5 minutos. Para visualização dos danos ao DNA, as lâminas foram observadas em aumento de 400x usando microscópio de fluorescência equipado com filtro de excitação de 515-560 nm e um filtro de barreira de 590 nm. Foram analisadas 100 células de cada animal.

Teste de AMES

[0115] Para o teste de AMES, foram utilizadas as linhagens TA 100 e TA 98 de Salmonella typhimurium. A linhagem TA 100, que detecta mutágenos causadores da substituição de pares de bases no DNA, contém uma mutação no gene hisG (hisG46), que codifica para a primeira enzima da biossíntese da histidina, tendo o par CG como ponto preferencial para a reversão. A cepa TA 98 apresenta mutação no gene hisD para a reversão oito resíduos repetitivos de GC e detecta compostos mutagênicos que causam deslocamento do quadro de leitura do DNA. De acordo com a metodologia de incorporação direta em placas, desenvolvida por Maron e Ames (1983), diferentes concentrações do CBD-SINT (375, 250, 125 e 62,5 pg/placa) foram misturados a 0,1 ml da cultura de bactérias e 2 ml de ágar superfície (top agar), suplementado com traços de histidina e biotina. Para os ensaios com ativação metabólica, foram adicionados também 0,5 ml da fração microssomal S9 homogeneizada de fígado de rato (fração pós-mitocondrial, suplementada com um cofator, preparada a partir de fígado de roedores tratados com um agente indutor enzimático, arocloror 1254) (MOLTOX - Molecular Toxicology, USA). Como controle negativo foi utilizado a água bidestilada (veículo). Utilizou-se como controle positivo para a TA98, a 4-nirofenilenodiamina (NPD) dissolvida em DMSO, numa concentração de 10 pg/placa. Para a cepa TA100, utilizou-se azida sódica, dissolvida em água bidestilada, numa concentração de 1 ,25 pg/placa, em ensaios sem ativação metabólica. Nos ensaios com ativação metabólica foi usada 2-antramina (2-ANTR) como mutágeno, numa concentração de 3 pg/placa para TA100 e TA98. O conteúdo de cada tubo foi levemente homogeneizado e vertido sobre a superfície de uma placa contendo ágar mínimo glicosilado. Após a solidificação do top agar, as placas foram incubadas por 48 horas, a 37 °C. Após esse período, procedeu-se a contagem do número de colónias revertentes por placa. O ensaio foi realizado em triplicata.

[0116] Com relação ao teste do micronúcleo, todos os animais (machos e fêmeas) que receberam o CBD-SINT (500, 1000 e 2000 mg/kg) apresentaram o número de EPCMN de maneira similar ao encontrado para os animais tratados apenas com o placebo (C-). Por outro lado, os animais tratados com a ciclofosfamida (C+) apresentaram um expressivo aumento no número médio de EPCMN, mostrando o potencial mutagênico desta substância.

[0117] De forma similar aos dados supracitados, a relação de eritrócitos policromáticos/normocromáticos (relação EPC/ENC) foi expressivamente alterada pelo tratamento com a ciclofosfamida em todos os grupos experimentais (machos e fêmeas). Assim, o tratamento com o CBD-SINT não acarretou quaisquer alteração significativa neste parâmetro quando comparado aos animais tratados apenas com o placebo (Figura 5).

[0118] Com relação ao ensaio cometa, nenhuma das doses testadas do CBD- SINT induziu qualquer alteração significativa quando comparado aos animais tratados com o controle negativo (placebo). Por outro lado, a ciclofosfamida foi capaz de induzir um aumento de aproximadamente 100 % no índice e na frequência de dano em todos os grupos testados (Figura 6).

[0119] Com relação ao teste de AMES, a Figura 7 apresenta os resultados obtidos, indicando média e desvio padrão do número de revertentes his+/placa, para os grupos controles (C+ e C-) e CBD, nas diferentes concentrações testadas, com linhagens de Salmonella typhimurium TA98 e TA 100, na presença e ausência de ativação metabólica.

[0120] A Figura 8 apresenta as razões de mutagenicidade (RM). Verifica-se que não ocorreu aumento na frequência de mutantes revertentes com o aumento da concentração do CBD-SINT e as razões de mutagenicidade foram todas menores que 2, indicando ausência de atividade mutagênica.

Exemplo 3. Ensaios de segurança farmacológica sobre os sistemas nervoso central, respiratório e cardiovascular

[0121] Para os ensaios de segurança farmacológica foram utilizados coelhos machos da linhagem Nova Zelândia (n=6 por grupo). Todos os ensaios foram realizados pela via oral (via recomendada para humanos) e os parâmetros investigados foram determinados após uma única administração do CBD-SINT. As doses do CBD-SINT foram determinadas por extrapolação alométrica a partir da dose média utilizada em pacientes humanos (25 mg/kg).

[0122] Foi utilizada a dose de 51 mg/kg como a intermediária, estipulando uma dose maior e outra menor. Foram utilizados 3 intervalos de dose de acordo com o Guia para a Condução de Estudos Não Clínicos de Toxicologia e Segurança Farmacológica Necessários ao Desenvolvimento de Medicamentos (ANVISA, 2013; Versão 1.2). Assim, as doses utilizadas foram de 17, 51 e 170 mg/kg de CBD-SINT.

[0123] Foram avaliados os efeitos sobre três sistemas:

Efeitos sobre o sistema nervoso central

[0124] Os efeitos sobre o sistema nervoso central foram avaliados em coelhos machos de acordo com o teste de Irwin modificado (Roux et al., 2005).

[0125] Após jejum de 6 h, três doses do CBD (17, 51 e 170 mg/kg) foram administradas em diferentes grupos de coelhos machos por gavagem. O placebo foi administrado no grupo controle (1 ml/kg). A dieta sólida foi liberada aos animais 1 hora após os tratamentos.

[0126] Os efeitos clínicos e comportamentais foram avaliados em 0-15 min, 15, 30, 60, 120 e 180 min e 24 h após as administrações.

[0127] Para observar possíveis alterações comportamentais e fisiológicas foram registrados os seguintes parâmetros: convulsões, tremores, atividade locomotora, saltos, comportamento relacionado ao medo, reatividade ao toque, agressividade, contrações no pescoço, estereotipias (movimentos da cabeça, mastigação, cheirar, coçar), catalepsia, acinesia, marcha, coordenação motora, tração, contorções abdominais, analgesia, ptose, exoftalmia, miose, midríase, piloereção, defecação, diarréia, salivação, lacrimejamento, respiração e temperatura corporal.

Efeitos sobre o sistema respiratório

[0128] Após jejum de 6 h, três doses do CBD-SINT (17, 51 e 170 mg/kg) foram administradas em diferentes grupos de coelhos machos por gavagem. O placebo foi administrado no grupo controle (1 ml/kg). Uma hora após os tratamentos, todos os coelhos permaneceram conscientes na posição de decúbito ventral. A taxa respiratória foi determinada usando um respirômetro Kofranyi-Michaelis (Murphy, 2002). Para análise da gasometria arterial, amostras de sangue arterial foram obtidas da artéria central da orelha e imediatamente processadas. Todos os parâmetros abaixo foram determinados em um analisador multiparamétrico para medição de gases no sangue Cobas b 221 (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Suíça): pH, PC02 (mm Hg), P02 (mm Hg), S02 (%), Htc (%), tHb (g / dl), Na+ (mmol/l), K+ (mmol/L), Ca2+ (mmol/L), Cl- (mmol/L), glucose (mg/dl), lactato (mmol/L), 02Hb (%) , HHb (%), P50 (mm Hg), H+ (nmol/L), BE (nmol/L), BEecf (nmol/L), BB (mmol/L), cHC03 (mmol/L), ctC02 (B) (mmol/L), ctC02 (P) (mmol/L) e ct02 (% em volume).

Efeitos sobre o sistema cardiovascular

[0129] Os efeitos sobre o sistema cardiovascular foi avaliado através de dois exames:

[0130] a) Eletrocardiografia, onde após jejum de 6 h, três doses do CBD (17, 51 e 170 mg/kg) foram administradas em diferentes grupos de coelhos machos por gavagem. O placebo foi administrado no grupo controle (1 ml/kg). Uma hora após os tratamentos todos os coelhos permaneceram conscientes na posição de decúbito dorsal. Quatro eletrodos (RL, RA, LL e LA) foram posicionados nas dobras de ambos os cotovelos e de ambos os joelhos. O eletrodo V1 foi posicionado no 4o espaço intercostal à direita do esterno. O eletrodo V2 foi posicionado no 4o espaço intercostal à esquerda do esterno. O eletrodo V3 foi posicionado a meio caminho entre os eletrodos V 2 e V4. O eletrodo V4 foi posicionado no 5o espaço intercostal na linha hemiclavicular. O eletrodo V5 foi posicionado dentro da linha axilar no mesmo nível do eletrodo V4. O eletrodo V6 foi posicionado na linha axilar média no mesmo nível dos eletrodos V4 e V5. Uma pequena quantidade de álcool em gel a 70% foi aplicada em cada interface dos eletrodos visando menor interferência e melhor condução elétrica. Um tempo de aclimatização de 5 min foi aguardado, e em seguida, as ondas elétricas cardiográficas foram gravadas por 5 min. A eletrocardiografia foi gravada com um gravador de ECG (WinCardio, Micromed, Brasília, Brasil).

[0131] b) Medida da pressão arterial, onde após jejum de 6 h, três doses do CBD-SINT (17, 51 e 170 mg/kg) foram administradas em diferentes grupos de coelhos machos por gavagem. O placebo foi administrado no grupo controle (1 ml/kg). 40 minutos após os tratamentos todos os coelhos foram anestesiados por via intramuscular com 10 mg/kg de diazepam associado a 1 15 mg/kg de cetamina. Em seguida, os animais receberam subcutaneamente uma injeção em bolus de heparina (50 UI). A traqueostomia foi realizada para permitir que os animais respirassem espontaneamente. Depois, a artéria carótida esquerda foi isolada, canulada e conectada a um transdutor de pressão acoplado a um sistema de registro PowerLab (Chart 5.0, ADI Instruments, Castle Hill, Austrália). Após 15 minutos para a estabilização hemodinâmica, a pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD) e a pressão arterial média (PAM) foram registradas por mais 20 min.

[0132] Com relação aos efeitos sobre o sistema nervoso central, os resultados obtidos em coelhos machos são mostrados na Figura 9.

[0133] Durante todo período de observação (24 h) nenhum dos animais experimentais estava inativo ou se recusou a consumir alimentos ou água. Além disso, nenhuma alteração significativa no comportamento ou estado fisiológico dos animais foi observada até o final das 24 h.

[0134] Com relação aos efeitos sobrea a frequência respiratória e análise de gasometria arterial, os resultados obtidos são mostrados na Figura 10.

[0135] A frequência respiratória média dos coelhos tratados apenas com o placebo foi de 57 ± 6,01 bpm. Nenhum aumento ou diminuição na frequência respiratória foi observada após administração aguda do CBD-SINT (17 mg/kg: 55 ± 6,48; 51 mg/kg: 57 ± 5,43; 170 mg/kg: 56 ± 5,66). A análise da gasometria arterial revelou que nenhuma das doses do CBD-SINT alterou o pH, PC02 (mm Hg), P02 (mm Hg), S02 (%), Htc (%), tHb (g / dl), Na+ (mmol/l), K+ (mmol/L), Ca2+ (mmol/L), Cl- (mmol/L), glucose (mg/dl), lactato (mmol/L), 02Hb (%) , HHb (%), P50 (mm Hg), H+ (nmol/L), BE (nmol/L), BEecf (nmol/L), BB (mmol/L), cHC03 (mmol/L), ctC02 (B) (mmol/L), ctC02 (P) (mmol/L) ou o ct02 (% em volume) quando comparado com animais tratados apenas com o placebo.

[0136] Com relação aos efeitos na eletrocardiografia, não foi observado quaisquer alterações significativas nos segmentos PR, QRS ou QT entre os diferentes grupos experimentais. Além disso, nenhuma alteração foi encontrada nas amplitudes das ondas P, R ou T quando comparado com os animais tratados apenas com o placebo (Figura 1 1 ).

[0137] Com relação aos efeitos na pressão arterial, as pressões arteriais sistólica, diastólica e média registradas em animais do grupo controle (tratados com o placebo) após o período de estabilização (15 minutos) foram de 101 ± 6,7 mm Hg, 61 ± 3,9 mm Hg e 72 ± 3,9 mm Hg, respectivamente (Figura 12).

[0138] A administração oral do CBD-SINT (17, 51 ou 170 mg/kg) não alterou significativamente os níveis pressóricos em comparação com o grupo controle (Figura 12A-C). De forma semelhante, a frequência cardíaca não foi significativamente diferente entre os grupos experimentais. Os valores médios nos grupos controle negativo (placebo) e CBD-SINT (17, 51 e 170 mg/kg) foram 270 ± 15 bpm, 285 ± 18 bpm, 279 ± 20 bpm e 275 ± 17 bpm, respectivamente (Figura 12D).

Exemplo 4. Estudos de neuroprotecão frente alterações comportamentais induzidas pela administração da 1-metil-4-fenil-1.2.3.6-tetrahropiridina e 6- OHDA

[0139] O número de animais por grupo foi de 10 (dez) indivíduos. Este número foi estimado com base em protocolos reconhecidos internacionalmente e validados cientificamente. As doses da formulação CBD-SINT foram determinadas por extrapolação alométrica a partir da dose média utilizada em pacientes humanos (600 mg/dia, que em um indivíduo de 70 Kg representa aproximadamente 9 mg/Kg), obtendo uma dose média de ~36 mg/kg de CBD em ratos.

[0140] Para o cálculo das três doses, foi utilizado como referência a dose intermediária, e depois, estipulada uma dose maior e outra menor em uma escala logarítmica. Para estipular a dose menor, utilizou-se 1/3 da dose mediana. Para a dose maior, utilizou-se um fator de segurança de 10 vezes a dose inferior. Assim, as doses de CBD-SINT utilizadas nesse ensaio foram de: 12, 36 e 120mg/kg

[0141] Para os experimentos com a MPTP (neuroproteção), os animais foram divididos nos seguintes grupos experimentais:

- MPTP + placebo

- MPTP + CBD-SINT 12 mg/Kg

- MPTP + CBD-SINT 36 mg/Kg

- MPTP + CBD-SINT 120 mg/Kg

- Sham + placebo

- Naive

[0142] O CBD-SINT e o placebo foram administrados pela via oral (gavagem) por 18 dias previamente a administração da neurotoxina por cirurgia estereotáxica, e por mais 10 dias após a cirurgia. Após a administração da neurotoxina os parâmetros comportamentais (atividade locomotora) e bioquímicos (dosagem de dopamina cerebral) foram avaliados após 24 horas e depois de 10 dias. Os ensaios de memória (labirinto aquático de Morris) foram realizados diariamente do dia 1 ao dia 10 após a administração da neurotoxina (Figura 13).

[0143] Para os experimentos com a 6-OHDA, os animais foram divididos nos seguintes grupos:

- 6-OHDA + placebo

- 6-OHDA + CBD-SINT 12 mg/Kg

- 6-OHDA + CBD-SINT 36 mg/Kg

- 6-OHDA + CBD-SINT 120 mg/Kg

- Sham + placebo

- Naive

[0144] Após a cirurgia estereotáxica para a administração da 6-OHDA, os ratos tiveram um período de recuperação de sete dias até o início dos tratamentos.

[0145] Após o período de recuperação, o CBD-SINT e o placebo foram administrados pela via oral (gavagem) durante 28 dias. Os testes de atividade locomotora foram realizados apenas no final dos tratamentos (dia 28). Os ensaios de memória (labirinto aquático de Morris) foram realizados diariamente do dia 18 ao dia 28 (Figura 14).

[0146] Os animais submetidos à cirurgia estereotáxica foram inicialmente anestesiados com uma associação de quetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) administradas pela via intraperitoneal. Após a anestesia foi administrado 0,10 ml_ de penicilina G-procaína (20.000 U/0,05 ml_ - i.m.), sulfato de atropina, (0,4 mg/kg - i.p.) e lidocaína (0,2 ml_ com 2% de vasoconstritor - s.c.) na derme que recobre o crânio dos animais.

[0147] Os ratos foram submetidos à cirurgia estereotáxica (estereotáxico - David Kopf, modelo 957L) e receberam a microinfusão bilateral de MPTP ou 6- OHDA (diferentes grupos de ratos) diretamente na substância nigra. Para a cirurgia foram utilizadas as seguintes coordenadas estereotáxicas: anteroposterior: 5.0 mm a partir do bregma; médio-lateral: ± 2.1 mm a partir da linha média e dorsoventral: -7.7 mm a partir da calota craniana (Paxinos e Watson, 1986). Em seguida, foram injetados 100 pg de MPTP (diluído em 1 pl de solução salina, com um fluxo de 0,33 mI/min) ou 8 pg de 6-OHDA (diluído em 2 mI_ de solução salina com 0.2 pg/pL de ácido ascórbico, com um fluxo de 0,33 mI/min). As microinfusões foram realizadas com auxílio de uma agulha (30 gauge) conectada a um tubo de polietileno adaptado a uma micro-seringa de 10 ml_ (Hamilton, EUA), que por sua vez, é encaixada em uma bomba de infusão (Harvard Apparatus, EUA). Após o término da microinfusão a agulha foi mantida no local por mais 2 minutos para evitar refluxo das neurotoxinas. Em seguida, o escalpo foi suturado e os animais retirados do estereotáxico. Os ratos foram então colocados em suas gaiolas de origem. Os animais dos grupos Sham foram submetidos ao mesmo procedimento cirúrgico, porém, sem receber as neurotoxinas, sendo somente introduzida à agulha nas mesmas coordenadas estereotáxicas. Os ratos dos grupos naive não foram submetidos à cirurgia estereotáxica, mas foram retirados da gaiola de moradia para manuseio durante algumas horas.

[0148] Para realizar as observações comportamentais, os animais foram submetidos a três testes:

a) Teste do campo aberto (atividade motora)

[0149] Os animais foram colocados sobre o círculo central do campo aberto e seu comportamento avaliado durante 5 minutos. Essa avaliação incluiu a frequência de locomoção (penetrar em uma divisão com as quatro patas), levantar (apoio somente nas patas traseiras, com o tronco perpendicular ao chão da arena), duração de imobilidade (sem atividade motora, paralisado completamente) e tempo de latência (tempo que o animal leva para iniciar o movimento após ter sido colocado no círculo central da arena). Cada animal foi avaliado individualmente e o aparelho foi limpo entre um animal e outro com solução de álcool a 5% (Figura 15).

b) Labirinto aquático de Morris (versão cued test/memória)

[0150] Todos os grupos experimentais foram testados no labirinto aquático de Morris.

[0151] O labirinto é constituído por um tanque circular de cor preta, com 170 cm de diâmetro e 50 cm de altura, preenchido com água em uma profundidade de 32 cm. As temperaturas da água e da sala são controladas e em torno de 22 ±2 °C. De início foram estabelecidas quatro posições que serviram como ponto de partida para os ratos, estas são: norte, sul, leste e oeste; permitindo desta forma, a divisão da superfície em quatro quadrantes iguais: nordeste, sudeste, noroeste e sudoeste. Na sala onde os experimentos foram realizados existem dicas visuais ao redor do tanque, como por exemplo: figuras fixadas nas paredes, janela e porta, para auxiliar os animais durante os testes.

[0152] Para os testes foi utilizada uma plataforma acrílica transparente (1 1 x14x29 cm) com uma esfera com a metade superior pintada de preto e a inferior branca, de 7 cm de diâmetro fixada sobre um plataforma acrílica (Figura 16).

[0153] Durante o experimento a plataforma foi mantida submersa a 2 cm abaixo da superfície da água, enquanto que a esfera permaneceu visível aos ratos. Nos dias de teste a plataforma com a esfera foi fixada em um dos quatro quadrantes: nordeste, sudeste, noroeste e sudoeste, respectivamente, enquanto que o animal era solto para nadar até encontrar a plataforma em um dos quatro pontos de partida: sul, leste, norte e oeste, respectivamente. O animal deveria encontrar a plataforma em um tempo máximo de 60 s. Quando o tempo máximo era atingido, os animais foram gentilmente conduzidos pelo experimentador até a plataforma com a esfera (dica visual). Após os ratos encontrarem a dica, eles permaneceram sobre a esfera por 20 s, após esse tempo os animais foram retirados da plataforma e colocados durante 30 s na gaiola de moradia fora do labirinto aquático. Neste período a plataforma foi trocada de posição pelo experimentador.

[0154] Os animais foram submetidos ao mesmo procedimento até que se completem os quatro pontos de partida. As posições de partida e da plataforma foram planejadas de forma que as distâncias proximais e distais fossem alternadas. A latência (tempo que os animais levam para encontrar a plataforma), e a velocidade dos animais foram quantificados pelo software 2020 Plus Tracking System. c) Determinação dos níveis de dopamina e seus metabólitos ácido 3,4- diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA)

[0155] Após o último conjunto de experimentos, os animais provenientes do tratamento nigroestriatal com o MPTP e seus respectivos controles foram eutanasiados por decapitação. Os níveis de dopamina (DA) e seus metabólitos ácido 3,4-diidroxifenilacético (DOPAC) e ácido homovanílico (HVA) foram determinados por cromatografia líquida de alta eficiência com um detector eletroquímico (HPLC-ECD) segundo Luo et al. (2009).

[0156] Resumidamente, o estriado foi dissecado, pesado e homogeneizado em 0,2 M de ácido perclórico gelado. A amostra foi então centrifugada duas vezes a 14.000 g durante 15 min a 4°C. O sobrenadante foi coletado e filtrado através de um filtro Millipore de 0,22 pm e injetado no sistema de HPLC para análise.

[0157] Com relação aos efeitos neuroprotetores do CBD-SINT sobre as alterações comportamentais induzidas pela administração da MPTP, foram obtidos resultados considerando três fatores:

d) Efeitos do CBD-SINT sobre a atividade locomotora (MPTP)

[0158] Os resultados mostraram que 24 h após a infusão do MPTP, o grupo controle negativo (C-: MPTP + placebo) exibiu significativo aumento na latência para o início dos movimentos. De fato, a atividade locomotora encontrou-se significativamente reduzida para este grupo em comparação aos grupos naive e Sham, demonstrando que o modelo MPTP em ratos produziu redução de atividade dos animais como esperado para o modelo.

[0159] Os dados demonstram que 24 h após a lesão o grupo controle negativo apresentou uma diminuição significante da frequência de levantar em relação aos grupos naive e Sham. Aos 10 dias o grupo MPTP + placebo (C-) exibiu um aumento significativo na frequência de levantar quando comparado aos grupos naive ou Sham.

[0160] Após 24 horas os animais do controle negativo (C-: MPTP + placebo) apresentaram uma expressiva redução na frequência de locomoção, com valores significativamente menores aos encontrados nos ratos dos grupos naive ou Sham.

[0161] Por outro lado, a frequência de locomoção observada nos animais do grupo controle negativo 10 dias após a administração da MPTP foi bastante divergente da observada após 24 horas. Se após 24 horas, a atividade locomotora estava significativamente reduzida, após 10 dias os resultados foram bastante diferentes.

[0162] O tempo de imobilidade mostrou que 24 h após a cirurgia o grupo MPTP + placebo não diferiu estatisticamente de nenhum dos outros grupos experimentais. Por outro lado, aos dez dias, o grupo controle negativo exibiu uma diminuição significativa da imobilidade quando comparado aos grupos naive e Sham.

[0163] Com relação ao efeito causado pela aplicação do CBD-SINT nos animais, observou-se que nas doses de 36 mg/kg e 120 mg/kg, o CBD-SINT apresentou valores semelhantes aos animais do grupo naive ou Sham, em todos os fatores observados acima, com efeito surpreendente nos fatores de tempo de latência e frequência de levantar, onde uma concentração menor teve um resultado mais efetivo em comparação com o efeito de um CBD-FITO, isto é, orgânico, em uma mesma concentração (Figuras 17-20).

[0164] Os dados supracitados, em conjunto com os resultados obtidos nesse exemplo, permite conjecturar que o CBD-SINT possui feitos neuroprotetores significativos frente a esse modelo experimental, abrindo perspectivas para a utilização desses compostos no controle dos sintomas da doença de Parkinson.

e) Efeitos do CBD-SINT sobre a memória (MPTP)

[0165] Como mostrado na Figura 21 (A e B), os ratos do grupo MPTP + placebo (controle negativo; C-) apresentaram um aumento significante no tempo de latência para encontrar a plataforma quando comparados com o grupo de animais naive ou Sham. Essas alterações começaram no 5o dia de treino e prolongaram-se até o 10°dia.

[0166] O tratamento com o CBD-SINT nas doses de 36 e 120 mg/kg preveniu esse déficit, mantendo o tempo de latência em valores estatisticamente semelhantes aos dos animais que não receberam a MPTP, assim como observado em um CBD-FITO em uma mesma concentração.

f) Efeitos do CBD-SINT sobre os níveis estriatais de dopamina, DOPAC e AVM (MPTP)

[0167] Os valores encontrados para os níveis de dopamina, DOPAC e AVM estriatal dentre os diferentes grupos experimentais estão apresentados na Figura 22.

[0168] A administração intranigral da toxina MPTP acarretou uma redução significativa nos níveis de todos os marcadores mensurados quando comparados com os grupos naive ou Sham. Por outro lado, o tratamento com CBD-SINT na dose de 12 mg/kg foi capaz de elevar significativamente os níveis de dopamina e DOPAC, enquanto as doses de 36 e 120 mg/kg elevaram a concentração estriatal de todos os marcadores avaliados.

[0169] Apesar dos níveis de todos os marcadores terem se elevado após os tratamentos com o CBD-SINT, o valores encontrados foram estatisticamente menores dos identificados nos animais dos grupos naive e Sham.

[0170] Com relação aos efeitos do CBD-SINT sobre as alterações comportamentais induzidas pela administração da 6-OFIDA, foram considerados os efeitos sobre três fatores:

g) Efeitos do CBD-SINT sobre a atividade locomotora (6-OFIDA)

[0171] Os dados demonstram que 35 dias após a lesão o grupo controle negativo apresentou um aumento significante deste parâmetro em relação aos grupos naive e Sham.

[0172] Os animais do grupo controle negativo (C-: 6-OFIDA + placebo) apresentaram um significativo aumento na latência para os movimentos quanto comparados com os grupos naive ou Sham.

[0173] Os animais do grupo controle negativo apresentaram uma expressiva redução na locomoção após 35 dias da administração da 6-OFIDA,

[0174] Dentre todos os grupos experimentais, os animais do controle negativo (C-: 6-OHDA + placebo) mg/kg apresentam uma frequência de levantar, significativamente menor que os grupos naive, Sham.

[0175] Com relação ao efeito causado pela aplicação do CBD-SINT nos animais, observou-se que nas doses de 36 mg/kg e 120 mg/kg, o CBD-SINT apresentou valores semelhantes aos animais do grupo naive ou Sham, em todos os fatores observados acima, com efeito surpreendente no fator de tempo de imobilidade (Figuras 23-26).

h) Efeitos do CBD-SINT sobre a memória (6-OHDA)

[0176] A Figura 27 mostra o tempo de latência necessário para que os diferentes grupos experimentais tratados com a 6-OFIDA e seus respectivos controles encontrem a plataforma no teste do Labirinto Aquático de Morris.

[0177] Todos os animais do grupo controle negativo (6-OFIDA + placebo: C-) apresentaram um aumento significante no tempo de latência para encontrar a plataforma de segurança, mostrando um importante déficit de memória do 5° ao 10° dia de teste.

[0178] De forma surpreendente, todos os grupos tratados com o CBD-SINT nas doses de 36 ou 120 mg/kg não apresentaram esse déficit, mostrando um período de latência semelhante aos animais dos grupos naive ou Sham.