발명의명칭:육산화사비소를포함하는암전이� �제용약학 조성물

기술분야

[ 1] 본발명은육산회：사비소 (As ₄ 0 ₆ )를포함하는암전이 억제용약학조성물에

관한것이다.

배경기술

[2] 암전이 (cancer metastasis)는원발암 (primary tumor)세포들이다른기관으로 퍼지는현상으로，암의마지막단계라고할수있 다.전이는암환자사망원인의 90%이상을차지하며，이에 대한해결책을마련하기위해암전이기작에 대한 연구가활발히진행되어왔다.암세포의전이가� �행되고이루어지는데는주위 조직의침윤 (invasion)，혈중유입，혈증에서의 생존，다른조직으로침투및생존, 2차기관에서의새로운암형성등의여러과정을� �쳐야한다 (Obenauf A.C., et al., 2015).특히，세포를둘러싸고있는조직으로침입 해들어가는세포의:

침윤성이필수적이며,이는암세포의특징중하� �이다.침윤성에는세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)과기저막 (basement membrane)을분해하는단백질 분해과정 (proteolysis)과분해된기질 (matrix)을통하여이동하는세포

이동성 (migration)이관여한다.세포외기질을분해하는단 백질분해효소중 대표적인것이 MMP(matrix metalloproteinase)이며，이중특히 MMP-2와

MMP-9이세포침윤성에중요한역할을담당한다고

보고되었다 (Stetler— Stevenson W.G., et al., 1990; Tryggvason K., et al., 1993; Duffy M.J., et al., 2000; Talvensaari-Mattila A., et al., 2003).

[3] 유방암 (breast cancer)은경제적성장에따른생활수준의향상,식� ��활의 변화와 서구화,출산및수유방법의 변화등으로발생를이점차증가하여여성종양중 1위를차지한다 (Kamangar F., et al., 2006).유방암은유방안에머무는양성 종양과달리다른기관으로퍼져 생명을위협할수있는악성종양으로,전이성 유방암에서부터고형종양까지 매우다양한생물학적특성을가지고있어， 다양한치료적선택과예후를가진다.

[4] 유방암은암이기원한세포의종류및침윤정도등 에따라다양하게분류된다. 발생부위에따라유관 (duct)과소엽 (lobule)둥의실질조직에서생기는암과그외 간질조직쎄서 생기는암으로나눌수있으며，유관과소엽에서 발생하는암은 다시암세포의침윤정도에따라침윤성유방암과 비침윤성

유방암 (상피내암)으로나눌수있다.참윤성유방암은유 관이나소엽의기저막을 침범한암으로서비침윤성유방암보다진행한상 태이므로더나쁜예후를 보이게되고,비침윤성유방암은자신의구역내� � 한정되어 있는아주초기의 암이라할수있다. [5J 유방암의 치료법에는여러가지가있으며,이중가장대표� �인것이

항암치료이다. 19세기후반,유방암치료를위하여근치적유방암 절제술을 시행하였으나수술을시행받은환자의 10년생존율은약 12%정도에만 머물렀으며，이러한결과는확대근치적수술과 같은더욱광범위한수술을 시행한경우에도차이가없었다.이에 대해유방암은진단당시에이미 미세전이가존재하며,수술만시행받은유방암� �자의낮은생존율은이러한 미세전이에기인한다고보고된바가있다 (The Korean Breast Cancer Society, 2008).이러한배경을바탕으로수술후보조적항암 요법이등장하였으며 , 항암요법은시행목적에따라수술후에잠재적미 세전이성장을억제하여 암의 재발을막기위한보조요법，수술전암의크기를 최소화하고미세전이를 없애기위한신보강화학요법과전이성환자들에 게서질병의완화및삶의 질 향상을위해시행하는완화화학요법등이 있다 (Lee A.B., et al, 2014).유방암의 경우，최근에는치료의결정에호르몬수용체의 발현과인간상피세포성장인자 수용체 (human epidbrmal growth factor receptor-2, HER-2)유전자의과발현유무가 진단시부터거의 예와없이쓰여짐에따라이들예측인자의발현유 무와조합에 따라화학요법의중요성과의존도가달라진다.

[6] 인간상피세포성장인자수용체 -2(human epidermal growth factor receptor-2,

HER-2)는인간상피세포성장인자수용체패밀리 (family)중하나로，또다른인간 상피세포성장인자수용체중하나인상피세포성 장인자수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR, HER-1)와마찬가지로수용체티로신키나아제 (receptor tyrosine kinase, RT )활성을지니고있다.수용체티로신키나아제활� ��은 다양한신호전달경로를조절하여 암의발달,진행，증식,분화및전이를 조절한다.특히나, EGFR은암의 전이와관련되어 있다는선행연구결과들이 보고되고있다 (Sirkisoon S.R., et al, 2016; Sasaki Τ·, et al., 2013).이에따라， EGFR 및 HER-2은암치료제개발에 있어서중요한타겟이되고있다.

[7] 비소 (As)는무색，무미,무취의치명적인독극물질로� ��자연계에서는 As ₂ S ₂ , As ₂

S ₃ , KAs0 ₂ 로산재하며 ,특하삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ ),유화비소 (As ₂ S ₃ )는오래전부터 중국에서 백혈병치료를위해사용되어왔으며，우리나라 에서도한방에서 사용되어졌다고보고되고있다.

[8] 삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )의 경우에는，백혈병，식도암,자궁경부암,두경� ��암， 방광암,위암，신경모세포종등의다양한세포� �에서세포사멸을통한

세포독성을유도하는등다양한암에 대한항암활성이보고되어，새로운암 치료제로각광받고있다 (Akao Y., et al., 2000; Wang Z.Y., 2001).

[9] 최근에는육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )가 As ₂ 0 ₃ 와같이 암세포에선택적으로작용하여 암세포의세포사를유도함으로써항암작용을나 타낸다고보고되고있다 (Ahn W.S., et al., 2004; Lee W.S., et al., 2015; Gwak H.S., et al., 2014; Park I.C., et al., 2003).또한， As ₄ 0 ₆ 가 NF-κΒ신호전달과정 (Lee W.S., et al., 2015),

카스파제-의존적사포사멸 (caspase-dependent apoptosis)(Chang H.S., et al., 2007) 및자가탐식 (autophagic cell death)을포함하는다양한신호전이에관여한다는 것이밝혀졌으나,유방암세포에서암세포의침� �및이동과의관련성은 아직까지밝혀지지않았다.

[10] 이에，본발명자는 As ₄ 0 ₆ 와유방암전이와의관련성을연구하는과정 에서， As ₄

O _fi 가유방암세포의침윤및이동을억제하여암 전이를억제하고，이러한억제는 상피세포성장인자 (epidermal growth factor, EGF)에의해활성화된 - EGFR-매개 (EGFR-mediated)및 HER-2-매개에의해나타난다는것을

확인하였다.또한,이러한암전이 억제효과가 As ₂ 0 ₃ 에비해우수함을 확인함으로써본발명을완성할수있었다.

[11] 종래선행기술로서한국등록특허제 0272835호에는육산화사비소를포함하는 항종양치료제및암전이 억제가기재되어 있으나, EGFR매개세포의침윤및 이동억제를통한암전이 억제효과는기재되어 있지않다.또한,미국공개특허 제 2008-0089951호에는삼산화이비소가 EGFR의수용체티로신키나아제활성을 억제함으로써 암의 전이를억제하는효과가기재되어 있으나，본발명의 육산화사비소는전혀기재되어 있지않다.

발명의상세한설명

기술적과제

[12] 본발명의목적은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )를포함하는암전이 억제용약학

조성물을제공하는데있다.

과제해결수단

[13] 본발명은육산회 ^: 사비소 (As ₄ 0 ₆ )를포함하는암전이 억제용약학조성물에 관한것이다.

[14] 상기암전이는상피세포성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor,

EGFR)에의해매개되는암전이 일수있다.

[15] 상기 암전이는상피세포성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor,

EGFR)및인간상피세포성장인자수용체 -2(human epidermal growth factor receptor-2, HER— 2)에의해매개되는암전이 일수있다.

[16] 상기 암은유방암,간암,난소암，대장암，폐암및뇌� ��양으로이루어진군에서 선택되는 1종이상일수있다.바람직하게는유방암이다.

[17] 이하본발명을상세하게설명한다.

[18] 본발명의암전이 억제용조성물은특히，상피세포성장인자 (epidermal growth factor, EGF)에의해상피세포성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR)가인산화 (phosphorylation)되어나타나는암전이 및인간

상피세포성장인자수용체 -2(human epidermal growth factor-2, HER-2)가 인산화되어나타나는암전이를억제하는효과가 있다.

[19] 상기상피세포성장인자수용체 (EGFR)및인간상피세포성장인자

수용체 -2(HER-2)의 인산화는암세포의 침윤 (invasion)및이동 (migration)을 유도함으로써 암전이를일으킬수있다.

[20] 상기 암은제한되지않으나，유방암,간암，난소암� �대장암，폐암및뇌종양으로 이루어진군에서선택되는 1종이상인것이바람직하며，보다바람직하게� � 유방암이다.

[21] 또한,본발명의육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )의 암전이 억제효과를삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )의암전이 억제:효과와비교한결과，본발명의육산화사� �소 0 ₆ )에의한 암전이억제효과가훨씬더우수하다.특히나，� �발명의육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )가유방암의전이억제활성이가장높다.

[22] 또한,본발명은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )를유효성분으로함유하는암전이

억제용약학조성물제공한다.상기 약학조성물은,각각통상의방법에따라 산제，과립제,정제，캡술제,현탁액，에멀견� ��시럽，에어로졸등의 경구형제형， 외용제，좌제및멸균주사용액의 형태로제형화하여사용될수있다.상기 약학 조성물에포함될수있는담체，부형제및희석제 로는락토즈,텍스트로즈， 수크로스,솔비를,만니롤,자일리를，에리스리 롤,말티틀，전분,아카시아고무， 알지네이트,젤라틴，칼슘포스페이트,칼슘실� ��케이트,셀를로스,메틸 셀를로스，미정질셀롤로스，폴리비닐피를리 돈,물，메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트，탈크,마그네슘� �테아레이트및광물유를들수 있다.제제화할.경우에는보통사용하는충진제� ��증량제，결합제,습윤제, 붕해제,계면활성제등의 희석제또는부형제를사용하여조제된다.경구� �여를 위한고형제제에는정제,환제，산제,과립제，� ��술제등이포함되며,이러한 고형제제는본발명의육산화사비소 0 ₆ )에 적어도하나이상의부형제예를 들면，전분，탄산칼슴，수크로스또는락토즈 ，젤라틴등을섞어조제된다.또한 단순한부형제이외에마그네슘스테아레이트,� �크같은윤활제들도사용된다. 경구를위한액상제제로는현탁제，내용액제， 유제，시럽제등이해당되는데 흔히사용되는단순희석제인물，리퀴드파라핀 이외에여러가지부형제,예를 들면습윤제，감미제,방향제,보존제등이포함� ��수있다.비경구투여를위한 제제에는멸균된수용액,비수성용제，현탁제,� ��제，동결건조제제,좌제가 포함된다.비수성용제，현탁제로는프로필렌� �리콜，폴리에틸렌글리콜，올리브 오일과같은식물성기름,에틸올레이트와같은� �사가능한에스테르등이 사용될수있다.좌제의기제로는위템솔 (witepsol),마크로골，트원 (tween) 61， 카카오지,라우린지,글리세로젤라틴등이사용� ��수있다.

[23] 상기 약학조성물의투여량은치료받을대상의연령， 성별，체중과,치료할 특정질환또는병리상태，질환또는병리상태의 심각도,투여경로및처방자의 판단에따라달라질것이다.이러한인자에기초� �투여량결정은당업자의수준 내에 있으며，일반적으로투여량은 0.01mg/kg/일내지 대략 500mg/kg/일의 범위이다.더바람직한투여량은 0.1mg/kg/일내지 100mg/kg/일이다.투여는 하루에한번투여할수도있고，수회나누어투여 할수도있다.상기투여량은 어떠한면으로든본발명의 범위를한정하는것은아니다. [24] 상기 약학조성물은쥐，가축，인간등의포유동물에 다양한경로로투여될수 있다.투여의모든방식은예상될수있는데,예를� ��면，경구,직장또는정맥， 근육,피하，자궁내점막또는뇌혈관내주사에� �해투여될수있다.

발명의효과

[25] 본발명은육산화사비소 (ᅀ 0 ₆ )를포함하는암전이 억제용약학조성물에 관한것으로,유방암세포에서八 0 ₆ 가상피세포성장인자수용체 (epidermal growth factor receptor, EGFR)의 인산화및인간상피세포성장인자

수용체 -2(human epidermal growth factor-2, HERᅳ 2)의 인산화를억제하여 암 세포의침윤및이동을억제함으로써암전이를악 쩨한다는것을확인하였다. 또한 As ₄ 0 ₆ 의 암전이 억제활성이 As ₂ 0 ₃ 에비해우수함을확인하였다.

[26] 이를통해，본발명의 As ₄ 0 ₆ 가 EGFR및 HER-2매개암전이를예방또는

억제시키는치료제로유용하게이용될수있을것 으로기대된다.

도면의간단한설명

[27] 도 1은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )의 EGF에의해유도된유방암세포의침윤억제 활성을보여주고있다.유방암세포는 MCF-7세포 (A, C)및 MDA-MB-231 세포 (B, D)를이용하였고，침윤억제활성은침윤된세포� ��염색을통해염색된 세포 (A, B)및침윤되어 있는세포수측정 (C, D)을통해확인하였다.

[28] 도 2는육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )처리에따른 HER-2가과발현된 SKBR3세포의 침윤억제활성을보여주는것으로,매트리젤에� �윤되어 염색된세포 (A)및 침윤되어 있는세포수측정 (B)을통해확인하였다.

[29] 도 3은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )의 EGF에의해유도된유방암세포의이동억제 활성을보여주고있다. (A)는상처부위가채워지는정도를현미경을통해 관찰한것이고, (B).는상처부위가채워지는정도를백분율 (%)로환산하여 그래프로나타내었다.

[30] 도 4는육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )처리에따른 HER— 2가과발현된 SKBR3세포의 이동억제활성을보여주는것으로，상처부위를 채우는세포의 양을현미경올 통해관찰하고 (A),상처부위가채워지는정도를백분율 (%)로환산하여 그래프 (B)로나타내었다.

[31] 도 5는육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )의 EGF에의해유도된 EGFR의인산화 (p-EGFR)및

MMP-9의발현억제활성을보여주고있다.

[32] 도 6은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )처리에따른 HER-2가과발현된 SKBR3

세포에서의 HER-2:매개신호전이관련분자들의발현변화보여 주고았다.

(A)는세포의 이동과침윤에관련되어 있는 MMP-9과 ICAM-1의 mRNA발현 정도를보여주고있고， (B)는 HER-2의신호전이기작에관련되어 있는분자들의 인산화및단백질발현정도를보여주고있다.

[33] 도 7은암전이와관련된세포의 침윤 (A)및이동 (B)에대한육산화사비소 (As ₄ 0

₆ )및삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )의 억제활성을비교한결과를보여주고있다. 발명의실시를위한최선의형태

[34] 이하본발명의 바람직한실시예를상세히설명하기로한다.그� �나，본발명은 여기서설명되는실시예에 한정되지 않고다른형태로구체화될수도있다. ' 오히려,여기서소개되는내용이철저하고완전� �지고，당업자에게본발명의 사상을충분히 전달하기위해제공하는것이다.

[35] <실시예 1.동물세포의 배양>

[36] As ₄ 0 ₆ ^암전이 억제활성을확인하기위해인간유방암세포 (human breast cancer cell)인 MCF-7세포 (비전이성유방암세포)와 MDA-MB-231세포 (전이성 유방암세포), SKBR3세포 (HER-2가과발현되는세포)를이용하였다.

[37] MCF-7세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100units/m£페니실린 (penicillin)및 100 /g/m£스트렙토마이신 (streptomycin)이포함된 MEM배지를이용하여 5% C0 ₂ , 37 ⁰ C조건의세포배양기에서배양하였다. MDA-MB-231세포는 10% FBS, lOOunits/mi페니실린 (penicillin)및 100 g/m£스트랩토마이신 (streptomycin)이 포함된레이보비츠의 L-15배지 (Leibovitz's L-15 medium)를이용하여 일반적인 . 공기상태， 37°C조건의세포배양기에서배양하였다. SKBR3세포는 10% FBS, 100units/m£페니실린 (penicillin)및 100//g/ e스트렙토마이신 (streptomycin)이 포함된 DMEM배지를이용하여 5% C0 ₂ , 3TC조건의세포배양기에서 배양하였다.

[38] <실시예 2.八 0 ₆ 에 의한유방암세포침윤억제확인 >

[39] 심시예 2-1. EGFR매개세포침윤억제확

[40] As ₄ 0 ₆ 의 EGFR매개유방암세포의 침윤억제를확인하기위해트랜스웰침윤 어세이 (transwell invasion assay)를수행하였다 .

[41] 6웰플레이트에상기실시예 1의 MCF-7세포또는 MDA-MB-231세포를웰당 5x 10 ⁵ 개가되도록넣은후하룻밤 (overnight)동안배양하였다.다음날세포에 하기표 1의조건에따라각각와물질을처리한후 48시간동안배양하였다. .이때， EGF와 As ₄ 0 ₆ 는 FBS가포함되어 있지않은배지를이용해세포에 처리하였다. 48시간후에세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 3회세척하고， 1% BSA(bovine serum albumin)이포함된트립신 (trypsin)으로세포를현탁하였다. 상위 챔버의멤브레인을매트리젤 (matrigel)로코팅한후현탁한세포 를 넣고，하위챔버 (lower chamber)에는 10% FBS가포함된배지 를넣은후 37°C에서 48시간동안배양하였다.배양후에세포를제거하 고상위챔버의 멤브레인표면을면봉으로닦아내고매트리젤이 코팅된멤브레인에침윤되어 있는세포를메탄올로고정시킨후 0.1%크리스탈바이올렛 (crystal violet)을 15-20분동안처리하여세포를염색하였다.현미경 을이용해염색된세포를 확인하고,염색된세포수를측정하여그결과를� � 1에나타내었다. [42] [표 1J

[43] 도 1의현미경을통해침윤세포를확인한결과 (Α, Β)및세포수를측정한 결과 (C, D)에서보여주듯이,인간유방암세포인 MCF-7세포 (A, C)및

MDA-MB-231세포 (B, D)모두아무것도처리하지않은대조군에 비해 As ₄ 0 ₆ 만을처리한실험군 1에서는세포침윤이억제되는것을확인하였다.� ��한， EGF만을처리한실험군 2에서는대조군에비해세포침윤이증가되는반� �에, EGF와 As ₄ 0 ₆ 를동시쎄처리한실험군 3에서는 EGF처리에의해증가된세포 침윤이 억제되는것을확인하였다.

[44] 이를통해,본발명의 As ₄ 0 ₆ 가 EGFR매개에의한유방암세포의 침윤활성을 억제시킨다는것을알수있었다.또한,본발명의 As ₄ 0 ₆ 가전이성유방암세포인 MCF-7세포보다전이성유방암세포인 MDA-MB-231세포에처리시 훨씬더 우수한침윤억제활성을나타내는것으로확인되 었다.

[45] 심시예 2-2. HER-2매개세포침윤억제확이

[46] As ₄ 0 ₆ 의 HER-2매개유방암세포의 침윤억제를확인하기위해트랜스웰침윤 어세이 (transwdl invasion assay)를수행하였다 . 6웰플레이트에상기실시예 1의 SKBR3세포를웰당 5xl0 ⁵ 개가되도록넣은후하룻밤 (overnight)동안 배양하였다.다음날세포에 As ₄ 0 ₆ 를각각 0， 0.5, 1， 1.5, 2, 3uM이되도록처리한 후 48시간동안배양하였다. 48시간후에세포를 PBS(phosphate buffer saline)로 3회세척하고, l ^< ¾ BSA(bovine serum albumin)가포함된트립신 (trypsin)으로 세포를현탁하였다.상위챔버의멤브레인을.매� ��리젤로코팅한후현탁한세포 200 ^를넣고,하위챔버 (lower chamber)에는 10% FBS가포함된배지 600 를 넣은후 37°C에서 48시간동안배양하였다.배양후에세포를제거하 고상위 챔버의멤브레인표면을면봉으로닦아내고매트 리젤이코팅된멤브레인에 침윤되아있는세포를메탄올로고정시킨후 0.1%크리스탈바이을렛 (crystal violet)을 15-20분동안처리하여세포를염색하였다.현미경 을이용해염색된 세포를확인하고，염색된세포수를측정하여그 결과를도 2에나타내었다.

[47] 도 2의 현미경을통해침윤된세포를확인한결과 (A)및침윤된세포수를 측정한결과 (B)에서보여주듯이， HER-2가과발현된유방암세포인 SKBR3 세포에아무것처리하지않은대조군에비해 As ₄ 0 ₆ 을처리한경우에 As ₄ 0 ₆ 처리 농도의존적으로세포의침윤이 억제되는것을확인하였다.

[48] 이를통해，본발명의八 0 ₆ 가 HER-2매개에의한유방암세포의침윤활성을 억제시킨다는것을알수있었다.

[49] <실시예 3.八 0 ₆ 에의한유방암세포이동억제확인 > [50] 심시예 3-1. EGFR매개세포이동억제확이

[51] 八 0 ₆ 의 EGFR매개유방암세포의이동억제여부를확인하� � 위해상처 치유 이동어세이 (wound healing migration assay)를수행히 ^ᅵ 였다. 6웰플레이트에상기 실시예 1의 MDA-MB-231세포를웰당 5xl0 ⁵ 개가되도록넣은후

하툿밤 (overnight)동안배양하였다.다음날 10/ 의 멸균된피펫팁을이용해 플레이트에배양증인세포에상처 (wound)를낸후 PBS(phosphate buffer saline)로 3회세척하였다.세포세척후상기표 1의조건에따라각각의물질을처리한후 0, 24， 48시간에현미경을이용해세포이동정도를관찰� ��였고，그결과를도 3에 나타내었다.세포이동정도는상처 낸면적이채워지는정도를백분율 (%)로 환산한수치를그래프로나타내었다.

[52] 도 3의현미경을통한세포의 이동정도를확인한결과 (A)및세포이동정도를 수치화하여그래프로나타낸결과 (B)에서보여주듯이,대조군에비해 As ₄ 0 ₆ 만을처리한실험군 1에서는세포의 이동이 억제되어상처를낸부위가 채워지지않았다. EGF만을처리한실험군 2에서는대조군에비해세포이동이 증가하여상처부위가거의채워진반면에， EGF와 ^ ₄ 0 ₆ 를동시에처리한 실험군 3에서는 EGF에의해증가되었던세포이동아억제된것을확 인하였다.

[53] 이를통해，본원발명의 As ₄ 0 ₆ 가 EGFR매개에의한유방암세포의 이동활성을 억제시킨다는것을알수있었다.

[54] 심시예 3-2. HER-2매개세포이동억제 ¾j]

[55] As ₄ 0 ₆ 의 HER-2매개유방암세포의 이동억제여부를확인하기위해상처치유 이동어세이 (wound healing migration assay)를수행하였다.

[56] 상처치유이동어세이는상기실시예 3- 1과동일한방법으로수행하였고, 이때，세포는 SKBR3세포를이용하였고, As ₄ 0 ₆ 를각각 0, 0.5, 1, 1.5, 2， 3uM이 되도록처리한후， 0, 24, 48, 72시간에 현미경을이용해세포이동정도를 관찰하였고,상처 낸면적이채워지는정도를백분율 ( ^< ¾)로환산한세포이동 정도결과를도 4에나타내었다.

[57] 도 4의현미경을통한세포의 이동정도를확인한결과 (A)및세포이동정도를 수치화하여그래프로나타낸결과 (B)에서보여주듯이, HER-2가과발현되어 있는 SKBR3세포의 이동이 As ₄ 0 ₆ 처리농도및시간의존적으로억제되는것을 확인하였다.

[58] 이를통해，본원발명의 As ₄ 0 ₆ 가 HER-2매개에의한유방암세포의 이동활성을 억제시킨다는것을알수있었다.

[59] <실시예 4. As ₄ 0 ₆ 의 EGFR매개유방암세포전이억제기작확인〉

[60] 6웰플레이트에상기실시예 1의 MDA-MB-231세포를웰당 5xl0 ⁵ 개가되도록 넣은후하룻밤 (overnight)동안배양하였다.다음날세포에상기표 1의조건에 따라각각의물질을처리한후 48시간동안배양하였다.이때， EGF와 As ₄ 0 ₆ 는 FBS가포함되어 있지않은배지를이용해세포에처리하였다. 48시간후에 세포를수집한후차가운 PBS로세척한후단백질가수분해효소억제제 혼합용액 (protease inhibitor cocktail)이포함된 RIPA용해버퍼 (RIPA lysis buffer)(25mM Tris-HCl pH 7.6， 150mM NaCl, 1 % NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS)를이용하여세포를용해시킨후원심분리하� �세포상층액을 확보하였고， BCA단백질정량 (BCA protein determination)방법을이용해세포 상층액의단백질을정량하였다.세포상층액을� �용해동일한양의단백질이 되도록샘플을만든후 SDS-PAGE겔전기영동 (sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을통해각각의단백질을크기별로 분리한후, PVDF멤브레인 (polyvinylidene fluoride membrane)으로이동시켰다. 멤브레인을상온에서 1시간동안 0.05%트원 20(tween 20)및 2% BSA가포함된 TBS(Tris-buffered saline)로블로킹시킨후，확인하고자하는물질� � 대항하는 1차항체 (MMP-9, EGFR, p-EGFPR)를처리하여 4 ⁰ C에서하룻밤동안

반웅시켰다.이때,로딩 대조군으로 β-액틴 (β-actin)에대항하는항체를같이 처리하였다. 1차항체처리후멤브레인을 PBS로세척시킨후형광이붙어 있는 2차항체를상온에서 1시간동안처리하였다. 2차항체처리후멤브레인을 PBS로세척하고 800nm파장에서멤브레인의형광을검출하였고,그 결과를도 5에나타내었다.

[61 J 도 5에서보여주듯이,세포의 이동및침윤에관련되어 있는 MMP-9(matrix metallopeptidase-9)단백질의 발현정도를확인한결과， EGF를처리한경우에는 MMP-9의 발현이증가한반면에 , EGF와 As ₄ 0 ₆ 를동시에처리한경우에는 MMP-9의발현이감소되는것을알수있었다.또한 EGFR의 인산화 (p-EGFR)를 확인한결과에서 , EGF처리에의해 p-EGFR이증가한반면에 , EGF와 As ₄ 0 ₆ 를 동시에처리한경우에는 EGF에：의해증가한 p-EGFR이 As ₄ 0 ₆ 에의해감소되는 것을확인하였다.

[62] 이를통해，본발명의 As ₄ 0 ₆ 가 EGF에의해유도된 EGFR의활성화를

억제함으로써암세포의침윤및이동을억제함을 알수있었고,이는 As ₄ 0 ₆ 가 EGFR매개암세포의전이를억제한다는것을의미� �다.

[63] <실시예 5. As ₄ 0 ₆ 의 HER-2매개유방암세포전이 억제기작확인 >

[64] _. 심시예 5-1.세포의침유및이동과과려되어 있는분자돌의 mRNA발혀정도 확이

[65] As ₄ 0 ₆ ≤l HER-2매개유방암세포전이억제기작을확인하기� ��해，세포의침윤 및이동과관련되어 있는 MMP-9및 ICAM-l(interacellular adhesion molecule- 1)의 mRNA발현정도를확인하였다.

[66] 6웰플레이트에상기실시예 1의 SKBR3세포를웰당 5xl0 ⁵ 개가되도록넣은 후하룻밤 (overnight)동안배양하였다.다음날세포에 As ₄ 0 ₆ 를각각 0， 0.5, 1, 1.5, 2， 3uM이되도록처리한후， 48시간동안배양하였다. 48시간후에세포를수집한 후차가운 PBS로세척 한후，트리졸시약 (Trizol reagent, TaKaRa사, Japan)을 이용하여，제조사에서제공하는방법에따라총 RNA(total RNA)를분리하고， 260醒파장에서흡광도를측정하여농도를확인하 였다. [67] 분리한총 RNA중 500ng을주형으로하고， AMV reverse transcription kit(TaKaRa 사)를이용하여 cDNA를합성하였고ᅳ합성한 cDNA중 5 를주형으로하고， 하기표 2의프라이머세트및 TaKaRa사의 Taq DNA polymerase를이용하여 PCR(polymerase chain reaction)을수행하였다.이때, β-액틴 (β-actin)은로딩 대조군으로이용하였다. PCR수행후얻은 PCR산물을 1.5%아가로스 겔 (agarose gel)에 전기 영동하여 mRNA발현정도를비교하였고，그결과를도 6(A)에나타내었다.

[68] [표 2]

[69] 도 6(A)에서보여주듯이 , SKBR3세포에 As ₄ 0 ₆ 를처리함에따라，처리농도 의존적으로 EGFR, HER-2, MMP-9및 ICAM-1의 mRNA양이감소되는것을 확인하였다.

[70] 이를통해， As ₄ 0 ₆ 가암세포의 EGFR, HER-2, MMP-9및 ICAM-1의

전사 (tmnsciption)를억제시킨다는것을알수있다.

[71] 심시예 5-2.웨스터블랏음통하세포의침 ^및이동과과련되어 있는분자및 HER-2시호저이기작과려분자돌의 ?1산화확이

[72] As ₄ 0 ₆ ≤] HER-2매개유방암세포전이 억제기작을확인하기위해 ,세포의침윤 및이동과관련되어 있는 MMP-9및 ICAM-1의단백질발현정도및 HER-2의 신호전이 기작에관련되어 있는분자들의 인산화정도를웨스턴블랏 (Western blot)을통해확인하였다.

[73] 6웰플레이트에상기실시예 1의 SKBR3세포를웰당 5xl0 ⁵ 개가되도록넣은 후하룻밤 (overnight)동안배양하였다.다음날세포에 As ₄ 0 ₆ 를각각 0, 0.5, 1, 1.5, 2， 3uM이되도록처리한후, 48시간동안배양하였다. 48시간후에세포를 이용하여상기실시예 4와동일한방법으로웨스턴블랏을수행하였고� �그 결과를도 6(B)에나타내었다.

[74] 도 6(B)에서보여주듯이， HER-2, EGFR및 Akt의 경우， As ₄ 0 ₆ 처리농도에따라 인산화된 HER-2(p-HER2), EGFR(p-EGFR)및 Akt(p-Akt)의양이감소하는 반면에 , mTOR의 경우에는 As ₄ 0 ₆ 를처리했음에도불구하고인산화된 mTOR(p-mTOR)의 양이 변화가없음을확인하였다.또한, MMP-9및 ICAM-1의 경우에는, Α 0 ₆ 처리에의해 ΜΜΡ-9및 ICAM-1의단백질발현량이감소된것을 확인하였다.

[75] 이를통해，본발명의 As ₄ 0 ₆ 는 HER-2및 EGFR의상위신호기전에 영향을주어 HER-2및 EGFR의인산화를억제함으로써, HER-2및 EGFR의하위신호기전에 있는 Akt에영향을주고， MMP-9및 ICAM-1의 발현을억제시킨다는것을알수 있다.즉，본발명의 As ₄ 0 ₆ 는 HER-2및 EGFR매개에 의한암전이를억제함을알 수있다.

[76] <실시예 6. As ₄ 0 ₆ 와 As ₂ 0 ₃ 의 암세포전이 억제정도비교>

[77] 본발명의 As ₄ 0 ₆ 와 As ₂ 0 ₃ 의 EGFR매개암전이억제효과를비교하였다.

[78] 암전이 억제효과를확인하기위해，상기실시예 2의유방암세포침윤억제및 실시예 3의유방암세포이동억제를확인한방법과동일� �게수행하였으며, 이때,세포는유방암세포주인 MDA— MB-231세포를이용하였고,ᅀ¾0 ₆ 와 As ₂ 0 ₃ 의최종농도가 1.2 g/mg이되도록각각처리하여 억제활성을비교하였고，그 결과를도 7에나타내었다.

[79] 도 7에서보여주듯이，유방암세포주인 MDA-MB-231세포의침윤 (A)및

이동 (B)억제를확인한결과, As ₂ 0 ₃ 와대비하여 As ₄ 0 ₆ 에의한세포침윤및이동 억제정도가더크다는것을알수있었다.

[80] 이를통해，본발명의八 0 ₆ 가 As ₂ 0 ₃ 보다암전이 억제효과가현저히우수함을 알수있다.