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Patent Searching and Data


Title:
PHARMACEUTICAL COMPOSITION, PREPARATION METHOD THEREFOR AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2015/024218
Kind Code:
A1
Abstract:
A pharmaceutical composition is a preparation prepared by the raw materials in parts by weight: 1-300 parts of chlorogenic acid and 1-50 parts of Ganoderma lucidum spores oil. And a preparation method of the pharmaceutical composition. Chlorogenic acid can be used compatibly with Ganoderma lucidum spores oil, and synergistic effect is provided. Inclusion technique is applied to product development to achieve stability of oily liquid material Ganoderma lucidum spores oil and soild material eucommia leaves extract chlorogenic acid. Inclusion by the inclusion technique can make the liquid drugs powder, protect natural products easily oxidized, prevent air from damaging the active ingredient, improve stability and improve taste.

Inventors:
ZHANG, Jie (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
YANG, Huarong (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
TIAN, Chenxu (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
ZHU, Lina (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
HUANG, Wang (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
YAN, Yongjiang (NO.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
Application Number:
CN2013/081970
Publication Date:
February 26, 2015
Filing Date:
August 21, 2013
Export Citation:
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Assignee:
SICHUAN JIUZHANG BIOLOGICAL SCIENCE AND TECHNOLOGY CO., LTD (No.10 South Keyuan Road, High-tech ZoneChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
International Classes:
A61K36/074; A61K9/08; A61K9/20; A61K9/46; A61K9/48; A61K31/216; A61P37/02
Domestic Patent References:
WO2002047703A22002-06-20
Foreign References:
CN102429949A2012-05-02
CN101474236A2009-07-08
CN1875996A2006-12-13
Other References:
See also references of EP 3037099A4
None
Attorney, Agent or Firm:
GAOYUNG INTELLECTUAL PROPERTY AGENCY (The Yiguanmiao Post Office Box A-42, Gaoxin DistrictChengdu, Sichuan 1, 610041, CN)
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Claims:
权 利 要 求 书

1、一种药物组合物, 其特征在于: 它是含有下述重量配比的原料制备而 成的制剂:

绿原酸 1-300份、 灵芝孢子油 1-50份。

2、根据权利要求 1所述的药物组合物, 其特征在于: 它是由下述重量配 比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 1-300份、 灵芝孢子油 1-50份。

3、根据权利要求 2所述的药物组合物, 其特征在于: 它是由下述重量配 比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 100-300份、 灵芝孢子油 10-50份。

4、根据权利要求 3所述的药物组合物, 其特征在于: 它是由下述重量配 比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 100-200份、 灵芝孢子油 10-30份。

5、根据权利要求 4所述的药物组合物, 其特征在于: 它是由下述重量配 比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 160份、 灵芝孢子油 25份。

6、 根据权利要求 1-5任意一项所述的药物组合物, 其特征在于: 所述的 灵芝孢子油中总三萜含量 15%; 甘油三脂总量 60%; 碘值 55%; 酸价 高达 15 mg KOH/g; 水分 2%;砷<0.511¾^8; 铅 <lmg/Kg; 汞 <0.1mg/Kg; 镉 (Cd) 0.5 mg/kg; 细菌总数<1000个 /g; 霉菌总数<50个 /g; 大肠菌群<30 个 /g。

7、 根据权利要求 1-6任意一项所述的药物组合物, 其特征在于: 它是由 绿原酸、 灵芝孢子油为活性成分, 加入药学上可接受的辅料或辅助性成分制 备而成的制剂。

8、根据权利要求 7所述的药物组合物, 其特征在于: 所述的制剂是口含 制剂或口服制剂; 优选地, 所述的口含制剂是口含片、 口腔贴片、 漱口剂; 所述的口服制剂是: 片剂、 泡腾片、 胶囊剂、 口服液、 散剂。

9、根据权利要求 8所述的药物组合物, 其特征在于: 所述的口含片是由 下述重量配比的原料及辅料制备而成:

绿原酸 1-300份、灵芝孢子油 1-50份、赋形剂 1-850份、矫味剂 1-10份、 崩解剂 1-70份、 粘合剂 1-50份、 润滑剂 1-5份。

10、 根据权利要求 9所述的药物组合物, 其特征在于: 所述的填充剂选 自乳糖、 葡萄糖、 山梨糖醇、 甘露糖醇、 麦芽糖醇、 木糖醇中的一种或两种 以上; 所述的矫味剂选自蔗糖、 阿斯巴甜、 甜菊苷、 果糖、 维生素 C、 蛋白 糖、 橙味矫味剂中的一种或两种以上的混合; 所述的稀释剂选自淀粉、 微晶 纤维素、 甘露醇中的一种或多种; 所述的崩解剂选自羟甲基淀粉钠、 交联聚 乙烯吡咯垸酮、 低取代羟丙基纤维素、 微晶纤维素、 预交化淀粉中的一种或 多种; 润滑剂为硬脂酸镁、 硬脂酸钙、 硬脂酸、 滑石粉中的一种。

11、根据权利要求 10所述的药物组合物, 其特征在于: 所述的口含片是 由下述重量配比的原料及辅料制备而成:

绿原酸 160份、 灵芝孢子油 β -环糊精包合物 140份、 甘露醇 390份、 乳糖 365份、 预交化淀粉 100份、羟丙纤维素 70份、橙味矫味剂 5份、 阿斯 巴甜 3份、 聚维酮 Κ30 45份、 硬脂酸镁 3份。

12、一种制备权利要求 9-11任意一项所述的药物组合物的方法, 其特征 在于: 所述的含片是由以下步骤制备:

a、 称取原料及辅料;

b、 先用 β -环糊精将灵芝孢子油制备成包合物;

c、 混合, 制软材, 制粒、 干燥、 整粒、 压片, 即得片剂。

13、权利要求 1-11任意一项所述的药物组合物在制备具有提高机体非特 异性免疫功能和提高机体对氧自由基的清除能力的药物或保健品中的用途。

Description:
说 明 书

一种药物组合物及其制备方法和用途 技术领域

本发明涉及一种药物组合物。

背景技术

绿原酸 (chlorogenic acid) , 是植物在有氧呼吸过程中经桂皮酸途径 (cinnamic acid pathway)所产生的一类苯丙素类化合物, 广泛存在于各种植 物中, 在植物生长过程中起着防腐、 抗菌、 抗病毒的作用, 享有 "植物白血 球" 的美誉。绿原酸是国内外研究用于抗癌、 抗病毒、 抗艾滋病的焦点药物 之一。

杜仲是含绿原酸最高的植物之一,杜仲叶中所 含绿原酸对人体具有抗菌、 抗病毒、 利胆、 保肝、 降压、 兴奋中枢神经系统等作用。 绿原酸对消化系统、 血液系统和生殖系统均有疗效。 具有较广泛的抗菌、 抗病毒、 抗诱变和抗肿 瘤的作用。 另外还有增强小肠蠕动、 增进胆汁分泌、 利胆、 止血、 增高白细 胞、 缩短血凝及出血时间和抗氧化剂活性。 研究证明, 绿原酸的水解产物咖 啡酸亦有利胆、升高白细胞的作用;它对各种 急性细菌感染疾病以及因放疗、 化疗所致的白细胞减少症有显著疗效, 是目前世界上极为关注的单体植物药 之一。

灵芝是中药宝库中的珍品, 是一类极具有保健功能的大型药用真菌。 灵 芝孢子油是以干燥孢子经物理方法破壁后萃取 而得的油状脂质体。 主要含有 三萜类、 醇类等成分, 是灵芝孢子有效成分的集合体。 功效研究表明其具 有增强机体免疫力、 保肝护肝、 抗病毒、 调节血脂以及对神经、 心血管和呼 吸系统有调节改善作用。 此外, 灵芝孢子油能增强免疫细胞的生理活性, 恢 复机体免疫功能, 是一种有效的抗肿瘤和调节免疫功能的物质, 全面增强肿 瘤患者的体质, 延缓或阻止肿瘤并发症的发生; 配合手术、 放化疗, 可促进 术后康复, 用于放疗、 化疗后的辅助治疗; 用于失眠健忘, 体虚神疲, 神经 衰弱; 用于肝病、 心血管疾病、 高血压的辅助治疗和预防。

目前, 尚未见绿原酸和灵芝孢子油复配的相关文献报 道。

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种药物组合物, 它是由绿原酸和灵芝孢子 油复配而成, 本发明的另一技术方案是提供了该药物组合物 的制备方法和用 途。

本发明提供了一种药物组合物, 它是含有下述重量配比的原料制备而成 的制剂:

绿原酸 1-300份、 灵芝孢子油 1-50份。

进一步优选地, 它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 1-300份、 灵芝孢子油 1-50份。

进一步优选地, 它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂:

绿原酸 100-300份、 灵芝孢子油 10-50份。

更进一步优选地, 它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂: 绿原酸 100-200份、 灵芝孢子油 10-30份。

更进一步优选地, 它是由下述重量配比的原料制备而成的制剂: 绿原酸 160份、 灵芝孢子油 25份。

其中, 所使用的灵芝孢子油为二级以上, 金黄色或棕红色半透明油状液 体, 具有灵芝孢子油特有的清香气味。 在低温下有沉淀物产生或凝固, 总三 萜含量 15%; 甘油三脂总量 60%; 碘值 55%; 酸价高达 15 mg KOH/g; 水分 2%。砷<0.511¾/:^8; 铅<111¾/:^8; 汞 <0.1mg/Kg; 镉 (Cd) 0.5 mg/kg。 细菌总数<1000个 /g; 霉菌总数<50个 /g; 大肠菌群<30个 /g; 致病菌不得检 出。

本发明药物组合物是由绿原酸、 灵芝孢子油为活性成分, 加入药学上可 接受的辅料或辅助性成分制备而成的制剂。

所述的制剂是口含制剂或口服制剂;优选地, 所述的口含制剂是口含片、 口腔贴片、 漱口剂; 所述的口服制剂是: 片剂、 泡腾片、 胶囊剂、 口服液、 散剂。

其中, 所述的口含片是由下述重量配比的原料及辅料 制备而成: 绿原酸 1-300份、灵芝孢子油 1-50份、赋形剂 1-850份、矫味剂 1-10份、 崩解剂 1-70份、 粘合剂 1-50份、 润滑剂 1-5份。

其中, 所述的填充剂选自乳糖、 葡萄糖、 山梨糖醇、 甘露糖醇、 麦芽糖 醇、 木糖醇中的一种或两种以上; 所述的矫味剂选自蔗糖、 阿斯巴甜、 甜菊 苷、 果糖、 维生素 C、 蛋白糖、 橙味矫味剂中的一种或两种以上的混合; 所 述的稀释剂选自淀粉、 微晶纤维素、 甘露醇中的一种或多种; 所述的崩解剂 选自羟甲基淀粉钠、 交联聚乙烯吡咯垸酮、 低取代羟丙基纤维素、 微晶纤维 素、 预交化淀粉中的一种或多种; 润滑剂为硬脂酸镁、 硬脂酸钙、 硬脂酸、 滑石粉中的一种。

进一步优选地,所述的口含片是由下述重量配 比的原料及辅料制备而成: 绿原酸 160份、 灵芝孢子油 β -环糊精包合物 140份、 甘露醇 390份、 乳糖 365份、 预交化淀粉 100份、羟丙纤维素 70份、橙味矫味剂 5份、 阿斯 巴甜 3份、 聚维酮 K30 45份、 硬脂酸镁 3份。

其中,所述的橙味矫味剂即苦味矫味剂, 型号: 98AF1415。生产厂家是: 森馨香精色素科技(中国)有限公司, 代理公司是广州市天润药业有限公司。

本发明还提供了一种制备所述的药物组合物的 方法, 其中, 所述的含片 是由以下步骤制备:

a、 称取原料及辅料;

b、 先用 β -环糊精将灵芝孢子油制备成包合物;

c、 混合, 制软材, 制粒、 干燥、 整粒、 压片, 即得片剂。

本发明还提供了该药物组合物在制备具有提高 机体非特异性免疫功能和 提高机体对氧自由基的清除能力的药物或保健 品中的用途。

本发明药物原料中绿原酸和灵芝孢子油配伍使 用,具有协同增效的作用, 在绿原酸和灵芝孢子油组方研究中, 充分考虑原料特性, 将包合技术应用到 产品开发中, 实现油状液体原料灵芝孢子油和固体原料杜仲 叶提取物绿原酸 的稳定共存。 采用包合技术包合后, 使液体药物粉末化, 实现易氧化天然产 物的保护, 防止空气对活性成分的破坏, 可提高其稳定性, 同时可以改善口 感, 为临床提供了一种新的选择。 具体实施方式

实施例 1本发明药物口含片辅料筛选试验

本品原料含有较多的提取物, 流动性差, 需要制粒后压片, 依据这些特 点进行辅料的筛选。

甘露醇无吸湿性, 溶解时吸热, 口腔有舒服感, 在咀嚼片中最为常用; 乳糖无吸湿性, 可压性好, 性质稳定, 与大多数药物不起化学反应, 成片光 洁美观, 可以改善片剂表面光滑性。 以甘露醇和乳糖作为填充剂, 与拟定每 片用量的原料进行混合, 分别以水、 70%乙醇、 90%乙醇作为黏合剂, 进行黏 合剂的筛选。

本品的辅料筛选预试验配方, 如下:

绿原酸 250g

灵芝孢子油 50g

甘露醇 350g

乳糖 350g

共 1000g, 制成 1000片, 1 g/片

湿法制粒, 根据参考文献用量, 进行粘合剂的筛选, 结果如下: 表 1 粘合剂筛选试验

黏合剂名称 物料性状 水 粘性差, 不易制粒

95%乙醇 粘性差, 不易制粒

5 %淀粉浆 粘性强, 物料易成团块 羧甲基纤维素钠 粘性强, 物料易成团块

5%PVP90%乙醇液 粘性与分散能力较佳 由于灵芝孢子油为液态, 不经预处理直接投料时不易混合均匀, 经测定 灵芝三萜的含量均匀度差, 且长时间暴露于环境中与空气接触易氧化, 出现 酸败的不良气味, 因此, 需将其预处理经 β -环糊精包合后投料。

考虑到绿原酸含有多酚类和酯的不稳定结构, 以及初步预试结果, 选择

PVP90%乙醇液为粘合剂。

本发明拟制备成口腔用片剂, 硬度较大, 以降低脆碎度, 确保产品在运 输, 存放时的完整性。 考虑到目标人群可能采用含化的方式服用本品 , 在其 中加入少量的崩解剂以加快含化和咀嚼时片剂 溶解速度, 因而选择了口感和 可压性较好的羟丙纤维素。羟丙纤维素能和各 种药物配伍,具有良好的惰性, 是固体制剂的粘合剂和崩解剂, 特别适用于 "内加法" , 能明显提高片剂的 硬度, 加速崩解和释放。

配方中主药为从杜仲叶中提取的绿原酸单体, 口感较酸涩, 加入适量的 阿斯巴甜、 橙味矫味剂以掩盖; 加入咀嚼片中常用的硬脂酸镁作为润滑剂, 增加颗粒流动性, 防止粘冲的发生。

灵芝孢子油包合工艺的研究:

采用饱和水溶液法进行包合物的制备。 称取灵芝孢子油, 加入 95%乙醇 中搅匀, 微温使溶解, 滴入 60~70°C的 β -环糊精饱和水溶液中, 搅拌 lh以 上, 停止加热再继续搅拌 3小时, 得白色沉淀.室温静置 12小时, 滤过, 用 无水乙醇洗涤沉淀三次, 至表面无油迹, 将沉淀在 60°C干燥, 过 60 目筛, 即得。

包合率% =包合物 含油量 x =包 总 x l 00

投油量 油中总三帖量 包合物收率% = X

β Q -环糊精实 +投油量 loo 选择灵芝孢子油与 β -环糊精投料比、 β -环糊精与水的投料比、 包合温 度、 搅拌时间 4个主要因索, 以挥发油收得率、 利用率和含有率为指标, 进行 了 L 9 (3 4 )正交试验, 因素水平见表 2 因素水平表

因素

水平 A B C D

灵芝孢子油: β-环糊精 g:g 包合温度 /°c 包合时间 /h β-环糊精:水 /g:ml

1 1:4 80 1 1:4

2 1:6 60 3 1:7

3 1:8 40 6 1:10

表 3 灵芝孢子油 β_ 环糊精包合的正交试验结果

按照设计, 共进行了 9组试验, 试验结果见表 3, 对包合工艺因素影响大 小为 D〉A〉C〉B, 经直观分析, 最佳组合为 A2B2C3Di。 经极差比较, C2与 C3 的包合率和包合物收率 k值差异较小,表明包合时间 3h与 6h对包合结果影响不 大,综合考虑时间因素,因此选择 C2水平。确定条件为 A2B2C2D1,即孢子油: β_ 环糊精(g:g)=l:6, 温度 /°C=60, 时间 /h=3, β_环糊精:水 /g:ml=l:4。 包合工艺的验证 按照确定的优化条件, 对包合工艺进行三批产品验证。

称取灵芝孢子油 0. 5kg, 加入 95%乙醇 3L中搅匀, 微温使溶解, 缓缓加 入 60~70°C的含 β -环糊精 3kg的 12L水溶液中, 搅拌 3h, 停止加热再继续 搅拌 3小时, 得白色沉淀, 室温静置 12小时, 滤过, 用无水乙醇洗涤沉淀三 次, 至表面无油迹, 将沉淀在 60°C干燥, 过 60目筛, 即得。

表 4 三批样品验证

由表 4验证结果可以看出,该工艺稳定性良好,适 于灵芝孢子油包合。 片剂处方筛选及工艺研究

因绿原酸对光、 热、 湿较敏感, 在处方中用能增加稳定性的甘露醇以及 还原糖乳糖为赋形剂, 以聚维酮 K30的乙醇溶液为粘合剂, 羟丙基纤维素为 崩解剂, 达到缩短制粒时间、 制粒温度低、 降低烘干温度、 烘干时间短、 片 子崩解迅速的效果。

称取原辅料分别过 60目筛混合均匀, 加入 10%聚维酮 K30的 85%乙醇溶 液, 制软材, 20目筛制粒, 60°C干燥, 使水分在以外观、 口感和硬度为考察 指标。 结果见表 5。

填充剂筛选设计的 4个处方

由结果可知, 处方 1完全以甘露醇为赋形剂, 物料涩冲, 片子表面粗糙, 且硬度较大。处方 2在处方 1基础上以甘露醇 -乳糖 (1 : 1)为赋形剂, 片子外观 光滑完整, 硬度适中, 口感较甜。 处方 3根据处方 2结果进行微调, 减少甘 露醇用量, 添加少量预交化淀粉, 片子外观较好, 但硬度略小, 口尝有沙砾 感。 处方 4在处方 3基础上调整乳糖与甘露醇比例, 片子外观、 口感良好, 硬度适中, 制粒过程中。 上述 4个处方片重差异大, 应与流动性、 可压性较 差的绿原酸加入量相关, 需适当调整加入量。

在初步筛选的处方 4基础上, 原料与赋形剂比例、 赋形剂中乳糖与甘露 醇比例、 粘合剂浓度进一步优化, 因素水平表见表 6。

因素水平表

因素

水平 A B C D

绿原酸:包合物 (g:g) 原料:赋形剂 (g:g) 甘露醇:乳糖 (g:g) 黏合剂浓度 (B)

1 150: 150 300: 600 300: 300 4%

2 160: 140 300: 700 300: 280 7%

3 180: 120 300: 850 300: 220 10%

按照表 6正交因素水平表设定各实验中原辅料用量, 混合, 加入相应浓 度的黏合剂, 制软材, 以 "轻捏成团, 轻压即碎"作为软材判断方法, 记录 黏合剂使用体积; 将软材于 60°C鼓风干燥箱中进行干燥, 至水分含量为 3% 时, 过 2号筛整粒即得到干燥后颗粒, 混入 0. 3%的润滑剂, 压片即得。

采用干燥后颗粒休止角、 颗粒收率、 片外观和硬度作为评价指标, 对各 水平因素实验进行评分, 将上述四项指标得分相加得到各水平因素实验 的总 分进行评价, 以考察各因素对片剂成型的影响。 正交试验结果见表 7。

SPSS设计正交试验结果

序号 A B C D 总分

1 3 2 3 1 5. 89

2 3 3 1 2 10. 22

3 2 1 3 2 12. 87

4 2 3 2 1 18. 88

5 2 2 1 3 14. 94

6 1 3 3 3 13. 89

7 1 1 1 1 8. 20

8 3 1 2 3 14. 65

9 1 2 2 2 12. 70

10 3 2 3 1 8. 64

11 3 3 1 2 14. 37

12 2 1 3 2 14. 39

13 2 3 2 1 16. 31

14 2 2 1 3 16. 42

15 1 3 3 3 16. 0 16 1 1 1 1 9. 0

17 3 1 2 3 14. 75

18 1 2 2 2 9. 62 采用 SPSS软件进行统计分析, 结果如下表。

表 8 正交统计分析试验结果

III 型

源 df 均方 F Sig.

平方和

校正模型 185.643 9 20.627 7.396 .005 截距 2983.524 1 2983.524 1069.776 .000 绿原酸:包合物(A) 68.652 2 34.326 12.308 .004 原料:赋形剂 (B) 41.245 2 20.623 7.394 .015 甘露醇:乳糖 (C) 23.525 2 11.763 4.218 .056 黏合剂浓度 (D) 49.293 2 24.646 8.837 .009 重复实验 2.928 1 2.928 1.050 .336 误差 22.311 8 2.789

总计 3191.478 18

校正的总计 207.954 17

a. R方 =0 .893 (调整 R方 =0 .772 )

结果显示, 绿原酸与包合物比例 (A)和黏合剂浓度 (D)有极显著性差异, 为影响片剂成型的主要影响因素; 原料与赋形剂比例 (B)的不同有显著性差 异, 为影响片剂成型的次要影响因素。

表 9和表 10结果显示,绿原酸与包合物比例为 160: 140优于其他两个比 例; 10%的黏合剂浓度优于其他两个浓度的黏合剂。

表 9 绿原酸与包合物比例的均值估计表

黏合剂浓度的均值估计表

对原料与赋形剂的均值估计, 结果显示, 原料与赋形剂比例为 300:850 时优于其他两个比例,

原料与赋形剂比例的均值估计表

在甘露醇与乳糖比例的均值估计中, 甘露醇与乳糖比例为 300:280时优 于其他两个比例。 结果见下表。

表 12 甘露醇与乳糖比例均值估计

因此, 通过方差分析各因素对片剂成型的影响, 以绿原酸:包合物

=160: 140、 黏合剂浓度为 10% , 原料:赋形剂 =300:850, 甘露醇:乳糖 =300:280 为最佳选择。

综合正交试验结果, 确定本品的最终配方, 如下:

绿原酸 160g

灵芝孢子油 β -环糊精包合物 140g

甘露醇 390g

乳糖 365g

预交化淀粉 100g

羟丙纤维素 70g

橙味矫味剂 5g

阿斯巴甜 3g

硬脂酸镁 3g

聚维酮 Κ30 45g

经制粒压片共制成 1000片 稳定性考察

按优化后的处方取物料, 灵芝孢子油制备成 β -环糊精包合物, 其余固体 物料均过 60目筛。 原辅料混合均匀后, 加入 10 %聚维酮 Κ30的 85%乙醇溶 液制软材,然后将软材用强制挤压的方式通过 20目的筛孔制粒,将制得的湿 颗粒在 60°C干燥 3h, 将干颗粒过 20目筛整粒, 加入硬脂酸镁进行压片。

将制得的 3批样品置于温度 38°C±1 °C,相对湿度 75%的恒温恒湿箱中进 行加速稳定性试验, 结果见表 13。

表 13 加速稳定性试验结果

批 号

项 目 1 2 3

0月 1月 2月 3月 0月 1月 2月 3月 0月 1月 2月 3月 绿原酸 7(g/ioog) 12. 7 12. 2 12. 5 12. 4 12. 4 12. 5 12. 0 20. 1 12. 3 12. 2 12. 4 12. 1 总三萜(以齐墩果酸

353 350 330 326 321 318 315 313 320 322 318 321 计) / (mg/100g) 试验证实按此工艺制得的绿原酸口含片质量稳 定, 工艺合理。 以下通过具体药效学试验证明本发明的有益效 果。

试验例 1 本发明药物组合物中绿原酸-灵芝孢子油配伍 单用对免 能的影响对比

实验分组及剂量设计

单用组 1 绿原酸 300 15 单用组 2 灵芝孢子油 300 15 配伍组 1 绿原酸 -灵芝孢子油(100 : 10) 300 15 配伍组 2 绿原酸 -灵芝孢子油(200: 30) 300 15 配伍组 3 绿原酸 -灵芝孢子油(300: 50) 300 15 阴性对照组 生理盐水

阳性对照组 甘露聚糖肽 20 1

1)鸡红细胞吞噬试验 取昆明小鼠依性别体重随机分成 7组,每组 12只。 以上各组均按设计剂 量 0. 4ml/20g每日灌胃给药一次, 连续 4周, 每周称两次体重, 以此调整给 药量。于末次给药后 30分钟,各组各鼠腹腔注射 5%鸡红细胞悬液 1. 0ml/只。 注射后 6小时, 将动物脱颈椎处死, 经腹膜注入生理盐水 2ml, 并轻揉小鼠 腹部, 然后于腹膜中央剪一小孔, 吸取腹腔洗液, 滴于载玻片上, 置 37°C孵 箱中温育 30 分钟, 以生理盐水冲洗, 甲醇固定, 姬姆萨染色, 油镜下观察 100个巨噬细胞吞噬鸡红细胞数。并以下列公式 计算吞噬百分率及吞噬指数 ( 试验结果见表 15。 百分率% -吞鶴红细胞的 賺数 xl oo %

100个巨噬细胞 被巨噬细胞吞噬的红细胞总数

吞噬指数

100个巨噬细胞

表 15 鸡红细胞吞噬试验结果

组 别 名称 吞噬百分率(%, X ±SD) 吞噬指数(X ±SD) 单用组 1 绿原酸 36.58 ±4.50" 0.52 ±0.07" 单用组 2 灵芝孢子油 35.87 ±3.27" 0.49 ±0.04" 配伍组 1 绿原酸 -灵芝孢子油(100 :10) 38.68 ±3.56™ Λ 0.56 ±0.03* WA 配伍组 2 绿原酸 -灵芝孢子油(200: 30) 38.25±3.47™ Δ 0.56 ±0.04* WA 配伍组 3 绿原酸 -灵芝孢子油(300: 50) 38.05 ±4.22™ Λ 0.55 ±0.06* WA 阴性对照组 生理盐水 31.56±2.62 0.44 ±0.04 阳性对照组 甘露聚糖肽 40.32 ±2.25*" ΛΛ 0.57±0.05* WAA 与阴性组比 "Ρ<0.01 "P<0.001; 与单用组比 Δ Ρ<0.05, ΔΔ Ρ<0.01。

结果表明, 单用组与阴性组比较, 有极显著性差异 (Ρ<0.01) ; 配伍组与 阴性组比较, 有极显著性差异 (Ρ<0.001),与单用组比较有显著性差异 (Ρ< 0.05)。

2) 碳粒廓清试验

取昆明小鼠依性别体重随机分成 7组, 每组 10只。 以上各组均按表 14 设计剂量 0.4ml/20g每日给药一次, 连续 4周, 每周称两次体重, 以此调整 给药量。于末次给药 lh后,各组小鼠尾静脉注射印度墨汁(1:4)0. lml-lOg" 1 , 分别于注射后 lmin(t^ 5min(t 2 )眼眶取血 20 μ 1,加入盛有 4ml 0. l%Na 2 C0 3 溶液中, 在 400-700nm处扫描, 于最大吸收波长(576nm)处比色。 动物脱颈 椎处死后, 取肝、 脾称重, 计算吞噬指数 K= (logOD!-logO^) / (t 2 - , 校正吞噬指数。=[体重/(肝重+脾重)] !( 1/3 。 试验结果见表 16。

表 16 碳粒廓清试验的结果

组别 名称 K值 (X ±SD) 值 (X ±SD) 单用组 1 绿原酸 0.019±0.011 3.94±1.05 单用组 2 灵芝孢子油 0.018±0.013 3.57±1.28 配伍组 1 绿原酸 -灵芝孢子油(100 :10) 0.024±0.012* 4.37±0.91** 配伍组 2 绿原酸 -灵芝孢子油(200: 30) 0.026±0.017* 4.14±1.17** 配伍组 3 绿原酸 -灵芝孢子油(300: 50) 0.026±0.014* 4.26±0.92** 阴性对照组 生理盐水 0.008 ±0.007 2.51±1.45 阳性对照组 甘露聚糖肽 0.019±0.013 4.43 ±1.06** 与阴性对照组相比, *P<0.05, **P<0.01 结果表明, 配伍组与阴性组比较, K值有显著性差异?<0.05, α 值有极 显著性差异 (P<0.01); 单用组与阴性组比较无显著性差异。

表 15, 16结果表明, 在鸡红细胞吞噬试验中, 单用组与配伍组均可非常 显著地增加小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞 噬百分率及吞噬指数; 在碳粒 廓清试验中, 配伍组可明显提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数 K和效正吞噬指数 α。 试验结果说明绿原酸及灵芝孢子油, 尤其是二者的配伍, 可增加巨噬细 胞的吞噬功能, 增强小鼠的非特异性免疫功能。

2.配伍与单用对体内氧自由基代谢的影响

实验分组及剂量设计

表 17 实验分组与剂量设置表

剂量 浓度 组别 名称

(mg/kg) (mg/ml) 单用组 1 绿原酸 300 15 单用组 2 灵芝孢子油 300 15 配伍组 1 绿原酸 -灵芝孢子油(100: 10) 300 15 配伍组 2 绿原酸 -灵芝孢子油(200: 30) 300 15 配伍组 3 绿原酸 -灵芝孢子油(300: 50) 300 15 阴性对照组 生理盐水

阳性对照组 IFNa-2b 300万 IU 15万 IU f 1+

试验方法: C 57 BL/6小鼠按体重随机分 8组, 每组 10只。 按表 14设计剂量 0.4ml/20g每日灌胃给药一次, 连续 4周, 每周称两次体重, 以此调整给药量。 于试验最后一日对动物实施股动脉取血,离心 收集血清。采用 TBA比色法和黄 嘌呤氧化酶法,按试剂盒说明书操作加样,在 UV2300紫外分光光度仪测定 532nm及 550nm波长处测吸光度值,计算 MDA含量和 SOD活力。

试验结果见表 18

表 18 氧自由基代谢试验结果 (x±s)

SOD (U/L)

组别 名称

(x±s)

单用组 1 绿原酸 218.73±25.32* 27.14±3.41 单用组 2 灵芝孢子油 213.32±31.43* 28.45±7.97 配伍组 1 绿原酸 -灵芝孢子油(100: 10) 253.48±26.90***Δ 25.63±2.02* 配伍组 2 绿原酸 -灵芝孢子油(200: 30) 252.71±31.61***Δ 25.11±4.42* 配伍组 3 绿原酸 -灵芝孢子油(300: 50) 249.26±13.81***Δ 24.86±9.66* 阴性对照组 生理盐水 188.78±11.64 34.29±6.87 阳性对照组 IFNa-2b 220.36±30.56* 28.25±8.92 与阴性组比较 *p<0. 05, ***p<0. 001 ; 与空白组比较 Δρ<0. 001 ;

结果表明: ①单用组与阴性组比较, SOD 活性显著升高, 有统计学差异 (P< 0. 05); 配伍组与阴性组比较 SOD 的活性显著升高, 有统计学差异 (P< 0. 001),能提高机体对氧自由基的清除能力; 干扰素组与模型组比较, SOD 的 活性也有一定程度的升高, 有统计学差异 (P< 0. 05),但作用弱于配伍组, 与 单用组相当。 ②配伍组与阴性组比较, 血清中 MDA的含量明显下降, 有统计 学差异 (P< 0. 05),表明配伍组能通过提高 SOD等氧自由基代谢酶的活性,清 除氧自由基, 抑制脂质过氧化反应, 降低小鼠血清中 MDA的含量。

以上试验证实, 配伍组具有提高机体非特异性免疫功能和提高 机体对氧 自由基的清除能力, 优于单用组, 且以绿原酸与灵芝孢子油的比例在 100-200 : 10-30为佳。 工业应用性

本发明组合物对易氧化天然产物具有很好的保 护作用, 能防止空气对其 活性成分的破坏, 提高其稳定性, 同时可以改善口感, 具有极好的临床应用 和工业化前景。