발명의명칭:육산화사비소의결정다형을포함� �는암예방또는 치료용약학조성물

기술분야

[1] 본발명은육산화사비소의결정다형을포함하는 암예방또는치료용약학 조성물에관한것이다.

배경기술

[2] 암은제어되지않은세포성장으로특징지어지며 ,이러한비정상적인

세포성장에의해종양 (tumor)이라고불리는세포덩어리가형성되어주� �의 조직으로침투하고심한경우에는신체의다른기 관으로전이되기도한다. 학문적으로는신생물 (neoplasia)이라고도불린다.암은다양한정도의유 병률로 신체의모든조직및장기에 _: 영향을미친다 Λ

[3] 암의종류는처음암세포가발생한조직및장기에 따라분류하기도하고, 암세포의모양과발생기원에따라분류하기도한 다ᅳ흔히폐암，위암,대장암， 자궁경부암둥은종양이처음생긴장기를가준으 로일컫는다.또한발생기원 측면에서는크게결체조직성종양,상피성종양,� ��암등으로구분되기도한다. 우리나라의경우가장많이발생한암은갑상선암 으로나타났고，이어서위암, 대장암，폐암의순으로발병률이높다. :

[4] 암의치료는장기에고형화된암조직올제거하거 나암세포를죽이는적극적 치료요법과암세포의진행을지연시켜부작용을 최소화하는완화요법으로 구분된다.암발생초기단계의 ¾우수술，항암화학적요법,방사선치료등을 통해종양을제거하거나화학약물및방사선등으 로암세포를죽이는 치료방법을선택할수있다.：그러나말기암환� �와경우적극적인치료요법에 의한부작용이상대적으로크가때문에 암세포의진행을늦추어부작용을 즐이고삶의 질을높이는차료법을선택할수있다.일반적으� �항암제는 적극적인치료요법에속하는항암화학요법을말 하며，암세포를독성물질로 사멸시키는세포독성항암제，암세포및조직주 변의신생：혈관에선택적으로 작용하는표적항암제등을포함한다 (정근영,항암화학요법의소개및치료 동향, BRIC View동향리포트， 2016-T20, 2016).

[5] 대부분의항암제는빠르게성장,분열하는암세� �에작용하여효과를

나타내는약제로서，성장분열이빠른일부정상 세포도공격하여부작용을 일으키고,아직까지완벽하게암을치료할수있� �치료제는개발되지 않았다. 따라서，암의치료와관련하여우수한항암효과 를가진치료제의 개발이 지속적으로요구되고있는실정:이다.

[6] 한편,본발명자들은이미비소가함유된자연산� �석으로부터분리정제

기술을통하여정제된육산화사비소가동물실험 에서암전이 억제효과를 나타냈으며，아을러자궁암,방광암，폐암，� �악동암,신장암등의말기 암환자에게투여하였을때뛰어난항암치료효과 가있다는기술적특징으로 특허등록 (한국특허등록제 272835호,천연화학물질육산화사비소의신규한 항종양치료제로서의용도및그약학적조성물, 2000.08.30.둥록)을받은바 있다.

[7] 본발명자들이:비소에대한지속적인연구결과� �삼기특허등록에개시된

방법과다른신규한제조방법에의해,육산화사� �소의결정다형 a가 99%이상인 육산화사비소를제조할수있고,이러한육산화� �비소를포함하는조성물이 다양한암의성장을억제하여암의 예방또는치료에현저한효과가있음을밝혀 본발명을완성하게되었다.

발명의상세한설명

기술적과제

[8] 본발명의목적은유효성분으로서육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )의결정다형을

포함하는암예방또는치료용약학조성물을제공 하는데있다.

[9] ：본발명의다른목적은유효성분으로서육산화 사비소 (As ₄ 0 ₆ )의결정다형을 포함하는암예방또는치료용약학조성물와제조 방법을제공하는데 있다. 과제해결수단 i

[10] ：본발명은육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ )를포함하는암예방또는치료용약학 ： 조성물로서，상기육산화사비소는육산화사비 소결정다형 a(As ₄ 0 ₆ -a)가 99% 이상인암예방또는치료용약학조성물에관한것 이다.

[11] 상기조성물의육산화사비소는염화나트륨을 100~800°C로가열한；후냉각하는 제 1공정;염화나트륨위에삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )를올려：놓은후밀폐상태에서 100 ^o C에서 1000°C까지가열한후넁각하는제 2공정;승화된비소를포집하는 여과지에서 결정화된결정을분리하는제 3공정；및상기제 3공정에서 얻은 결정을제 2공정의삼산화이비소대신사용하여제 2공정및제 3공정을 4~ 10회 반복해서육산화사비소결정을ᅵ얻는제 ₄ 공정 _;; 을퉁해제 _: 조될수있다.

[12] 상기조성물은:육산화사비소의결정다형 b(As ₄ 0 ₆ -b)가 1 %미만으로포함할수 있다.

[13] 상기육산화사비소는순도가 99.9%이상일수있다.

[14] 상기 As ₄ 0 ₆ -a및 As ₄ 0 ₆ -b는:하기 (i)내지 (iii)의특성을갖는것일수있다:

[15] [표 1]

상기 As ₄ 0 ₆ -a는 X-선분말회절분광도에서，광원파장이 1.5406A일때，회절각 2Θ 10 ^ο ~50 ^ο 범위에서 Wmin의속도 (scan step 0.02°)로표시된피크가 13.84, 27.88, 32.32, 35.3, 39.84, 42.38, 46.34, 48.6，및 49.34로나타나는것을특징으로하는 결정형이다 (도 1참조).또한， 2Θ값 13.8과 27.9에서나타나는주피크의 비율이 1:1.3인것을특징으로한다.

[17] 상기 As ₄ 0 ₆ -b는 X-선분말회절분광도에서,광원파장이 1.5406A일때，회절각 2Θ 10°~50°범위에서 l ⁰ /min의속도 (scan step 0.02。)로표시된피크가 13.86， 27.92, 32.36, 35.34, 39.9, 42.44, 46.4, 48.66，및 49.4로나타나는것을특징으로하는 결정형이다 (도 1참조).또한, 2Θ값 13.8과 27.9에서나타나는주피크의비율이 ； 1:2.5인것을특징으로한다.

[18] 상기 암은폐암，식도암，위암，대장암，전립선암 ,췌장암，자궁경부암，난소암및 자궁내막암으로이루어진군에서선택될수있다 .

[19] 이하，본발명을더상세하게설명한다.

[20] 본발명은유효성분으로서육산화사비소 (ᅀ 0 ₆ )를포함하는암예방또는

치료용약학조성물로서,상기육산화사비소는� �산화사비소의결정다형 a(As ₄ 0 6-a)가 99%이상인약학조성물에관한것이다.

[21] 본발명의다른양태에따르면,유효성분으로서� �산화사바소 (As ₄ 0 ₆ )의

결정다형을포함하는암예방또는치료용약학조 성물의제조방법으로서, 염화나트륨을 100~800°C로가열한후냉각하는제 1공정 ;염화나트륨위에 삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )를올려놓은후밀폐상태에서 100 ^o C에서 1000°C까지 가열한후냉각하는제 2공정;승화된비소를포집하는여과지에서결정� ��된 결정을분리하는제 3공정；；및상기제 3공정에서 얻은결정을 _. 제 2공정의 삼산화이비소대신사용하여제 2공정및제 3공정을 4~10회반복해서

육산화사비소결정을얻는제 4공정;을포함하는방법으로제조되며:,상기 제 4공정에서 얻은육산화사비소결정이육산화사비소의결정 다형 a(As ₄ 0 ₆ -a)를 99%이상:포함하는암예방또는치료용약학조성� �의제조방법에관한것이다.

[22] 고령토재질의합성반웅기，및합성반웅기의상 부에필터를장착할수있는 클램프를준비하고，합성반웅기내에 염화나트륨을올려놓고가열및넁각을 ： 진행한다.본발명의쎄조방법에서 염화나트륨을사용하는이유는,제 2공정에서 삼산화이비소를:염화나트 위에올려놓고가열함으로써비소화합물에 열이 골고루전달되면서비소화합물이승화하는데에 도 이되기때문이며， 저 U공정을;통해이러한염화나트륨의불순물및수� ��을제거하기위해

100~800 ^o C로 2~6시간동안가열한다.제 1공정에 있어서염화나트륨을가열한후 실온에서 3~10시간동안냉각한다. _.

[23] 다음으로,염화나트륨위에삼산화이비소 (As ₂ 0 ₃ )를올려놓은후밀폐상태에서

100°C에서 ΙΟΟΟ 까지가열하고,이후냉각하는제 2공정을진행한다.여기서, 삼산화이비소를올려놓은 _: 후클램프에승화되는비소를포집할수있는 필터 (여과지 )를각필터와필터사이의간격이 2mm~6mm가되도록 3~6개 .

장착한다.이때사용되는필터는，평량 (basic weight) 70-100g/m ^! ,두께 (thickness) 0.17~0.25mm,여과속도 (filtration speed) 22~30s/100ral,및보류입자경 (retention rate)

5~10 인것을사용하는것이바람직하다.

[24] 필터를장착하고나서 밀폐시킨후합성반웅기하부에 100 ^o C에서 1000°C까지 단계적으로올려주면서 3시간〜 10시간동안:가열해서 여과지의최상부중심부의 은도는 150° tl00°C유지되도록하며，여과지를통과하면서� �산화사비소가 결정화되도록한다.그리고나서상은에서 5시간이상，바람직하게는

5시간〜 10시간동안넁각한다.

[25] 다음으로，이격하여적층 _: 으로설치된 3~6개의여과지에포집된백색결정을 분리하는 3공정을수행한다.

[26] 합성반응기의 염화나트륨위에잔류하는미량의삼산화이비소 를제거한후 상기포질된백색결정을올려놓은후제 2공정및제 3공정을동일조건으로

4~10회 반복해서 최종적으로육산화사비소결정을수득한다.본� �명의 제조방법에따라얻어진결정구조를확인한결과 대부분 As ₄ 0 ₆ -a였으며， As ₄ 0 ₆

-a가 99%이상인것으로확인되었다. ：

[27] 상기 암은폐암,식도암，위암，대장암,전립선암，� ��장암，자궁경부암,난소암및 자궁내막암으로;이루어진군에사선택될수있� �.

[28] 본발명의육산화사비소의결정다형을포함하는 약학조성물은암의 예방또는 치료에유용하게사용될수:있다. ^:

[29] ^발명의 약학조성물은각각퉁상의방법에따라산제，과 립제，정제，캡슐제， 현탁액，에멀젼，:시¾에어로졸등의경구형제 형,외용제，좌제및멸균 주사용액의형태로제형화하여사용될수있다.� �기 약학조성물에포함될수 있는담체,부형제및:회석제로는 _: 락토즈，텍스트로즈，수크로스，솔비롤 ,만니롤， 자일리톨，에리스리를，말티롤，전분,아카� �아고무,알지네이트，젤라틴，칼슘 포스페이트,칼슘실리케이트,셀를로스,메틸셀 를로스,：미정질셀를로스，:

폴리비닐피롤리돈，물，메틸히드록시벤조에 이트，프로필히드록시벤조에이트, 탈크，마그네슘스테아레이트및광물유를들수 있다.제제화할경우에는보통 사용하는충진제，증량제，결합제,습윤제，� �해제，계면활성제등의회석제또는 부형제를사용하여조제된다.경구투여를위한� �형제제에는정제,환제，산제, 과립제，캡슐제등이포함되쪄,이러한고형제� �논본발명의육산화사바소에 적어도하나이상의부형제 _: 예를들면，전분，탄산 _. 칼슘，수크로스또는락토즈， 젤라틴등을섞어조제된다：또한단순한부형제 이외에마그네슘스테아레이트， 탈크같은윤활제들도사용된다.경구를위한액� �제제로는현탁제，내용액제, 유제，시럽제등이해당되 데흔히사용되는단순희석제인물,리퀴드파라� � 이외에여러가지부형제，예를들면습윤제,감� �제,방향제，보존제등이포함될 수있다.비경구투여를위한제제에는멸균된수� �액,비수성용제,현탁제：，유제， 동결건조제제,좌제가포함된다.비수성용제,현 탁제로는프로필렌글리콜， 폴리에틸렌글리콜，올리브오일과같은식물성 기름，에 1올레이트와같은주사 가능한에스테르등이:사용될수있다.좌제의기� ��로는위텝솔 (witepsol), 마크로골，트원 (tween) 61,카카오지，라우린지，글리세로젤라틴등이 사용될수 있다.

[30] 상기 약학조성물의투여량은치료받을대상의 연령,성별,체중과,치료할

특정질환또는병리상태，질환또는병리상태의 심각도,투여경로및처.방자의 판단에따라달라질것이다.이러한인자에 기초한투여량결정은당업자의수준 내에 있으며,일반적으로투여량은 0.01mg/kg/일내지 대략 500mg/kg/일의 범위이다.더바람직한투아량은 0.1mg/kg/일내지 100mg/kg/일이다.투여는 하루에한번투여할수도있고,수회나누어투여� �수도있다.상기투여량은 . 어떠한면으로든본발명의범위를한정하는 _: 것은아니다.

[31] 상기 약학조성물은쥐 ,가축，인간등의포유동물에다양한경로로투� �될수 있다.투여의모든방식은예상될수있는데,예를 _: 들면，경구,직장또는정맥， 근육，피하，자궁내점막또는뇌혈관내.주사� �의해투여될수있다ᅳ

발명의효과

[32] 본발명의암예방또는치료용약학조성물은，육 산화사비소의결정다형 a가 99%이상인육산화사비소를포함함으로써 ,우수한항암:효과를갖는다.

도면의간단한설명

[33] 도 1은 As ₄ 0 ₆ -a;및 As ₄ 0 ₆ -b의 X-선분말회절분광도이다.

[34] 도 2는폐암세포주인 NCL-H226에실시예 1,및비교예: 1내지 3흘처리하고

48시:간 (도 2A)및 72시 _: 간 (도 2B)동안배양한후세포증식억제효과를평가한 결과그래 _: 프이다.

[35] 도 3는폐암세포주인 NCL-H226및 SK-MES-1에 10uM의실시예 1을처리하고， 처리시간에따른폐암세포의증식 억:제효과를평가한결과그래프이다.

[36] 도 4는식도암：세포주인 KYSE-150및 TE-1에 10uM의실시예 1을처리하고， 처리시간에따른 (도 4A)식도암세포의증식 _: 억제효과및 TE-1에실시예 ᄂ및 비교예 1내지 3을처리하고 72시간 (도 4B)동안배양한후세포증식 억제 효과를평가한결과그래프이다.

[37] 도 5는위암세포주인 AGS에처리한실시예 1의농도및처 _: 리시간에따른 (도 5A)위암세포와증식 억제효과및 AGS에실시예 1，및비교예 1내지 3을 처리하고 .72시간 (도 5B)동안배양한후세포증식 억제효과를평가한결과 그래프이다.

[38] 도 6은대장암세포주인 HT29및 HCT116에 lOuM의실시예 1을처리하고，처리 시간에따른 (도 6A)대장암세포의증식 억제효과및 HT29에실시예 1，및 . 비교예 1내지 3을처리하고 72시간 (도 6B)동안배양한후세포증식 억제 효과를평가한결과그래프이다. :

[39] 도 7은전립선암세포주인 PC-3에실시예 1，및비교예 1내지 3을처리하고

48시간 (도 7A)및 72시간 (도 7B).동안배양한후세포증식 억제효과를평가한 결과그래프이다. [40] 도 8은췌장암세포주인 BxPC-3에실시예 1，및비교예 1내지 3을처리하고 72시간 (도 8A)동안배양한후세포증식 억제효과및췌장암세포주인 BxPC-3 및 PANC-1에실시예 1을농도별로처리하여 72시간 (도 8B)동안배양한후세포 증식 억제효과를평가한결과그래프이다.

[41] 도 9는실시예 1，및비교예 1내지 3을난소암세포주인 SK-OV-3(도 9A), 자궁경부암세포주인 HeLa (도 9B)및자궁내막암세포주인 HEC-1B (도 9C)에 처리하고 72시간동안배양한후세포증식 억제를평가한결과그래프이다.

[42] 도 10는실시예 1의 인간폐암，식도암，위암，대장암,전립선암� �췌장암，

자궁경부암，난소암및자궁내막암세포주에서 와세포증식 억제정도를 _: IC ₅₀ 값으로비교한결과그래프이다.

발명의실시를위한최선의형태

[43] 이하본발명의바람직한실시예를상세하설명한 다.하지만본발명은여기서 설명되는실시예에 한정되지 않으며,다른형태로구체화될수도있다.오히려, 여기서소개되는내용이철저하고완전해지며， 당업자에게본발명의사상을 층분히전달하기위해제공하는것이다.

[44] 실시예 1:본발명의육산화사비소제조

[45] 고령토로특수제작된합성반웅기 (높이 100mm，지름 190mm)와， 3~6개의 필터를장착할수있는클램프를준비한다.클램� �는합성반웅기로부터 50mm 떨어.져서 _: 1차클 _; 램프를설치하고，상기 1차클램프로부터 2~6mm간격으로그 상부에 2차〜 6차클램;프를설치하며,이때각클램프의규격은 지름 210mm및 두께 10mm이다:

[46] 칭량한굵은소금 (수분함량 10%이하) 400g~600g을합성반움기에투입하여 20mm내외로두께를고르게펴서:다져주고 100 ^o C~800 ^o C에서 3시간동안열을 서서히가열하면서 반웅기내부의소금표면온도가 290±30°C가되도록연속 가열：하여수분및불순물을쎄거하고실온에서 5시간동안냉각시킨다.

[47] 원료물질인 As ₂ 0 ₃ (순도 98%이상，제조사 YUNNAN WENSHAN JINCHI

ARSENIC CO., LTD.) lOOg을합성반응기내의굵은소금위에넣어주고� � 합성기의상부에위치한승화되는비소를포집할 수있는필터 (여과지 )를각 필터와필터사이의간격이 2~6隱가되도록 3~6개클램프를장착한다.이때 사용되는필터는，평량 (basic weight) 70~100g/m ^! ,두께 (thickness) 0.17-0.25 mm, 여과속도 (filtration speed) 22~30s/100ml,및보류입자경 (retention rate) 5~10um인 것을사용하는것이바람직하다 _;

[48] 클램프을이용하여필터를고정시키고합성반웅 기하부에열을가하여

100°C에서 l,000 ^o C까지단계적으로온도를을려준다.먼저합� ��반응기 하부의 외부온도를 350°C±100 ^o C정도가되도록 1시간동안가열하고,이후에 합성반웅기하부의외부온도를 600~650 ^o C,및 700ᅳ 1,000°C정도가되도록 가열하여,총 5시간에서 10시간동안가열하여필터의최상부여과지의 중심부온도가 150°C±100 ^o C를유지하도록한후,상온에서 5~7시간정도 냉각한다.이과정에서합성반웅기의소금위에� �려진분말 As ₂ 0 ₃ 는합성반응기 내부에서기체로변하여상승하다가，합성반응 기외부의상부온도가

상대적으로낮기 때문에 액체로변하고이후고체로결정화되어필터상에 백색결정체가생성된다.

[49] 채취한백색결정체를합성반웅기의굵은소금위 에 넣고다시가열및

냉각하고,결정을채취하는공정을다시 4회반복해서최종적으로결정 12.0g을 얻었다.얻어진비소화합물결정의구조를확인� �결과대부분 As ₄ 0 ₆ -a였으며 As 40 ₆ -a가 99중량 %이상이며 As ₄ 0 ₆ -b가 1증량 <¾미만인것으로확인되었다.

[50] DSC (시차주사열분석)값이승온속도가 10 ^o C/min일때, As ₄ 0 ₆ -a는 282.67°C인 점에서흡열피크 (융점)가나타나는것으로확인되었으며， As ₄ 0 ₆ -b는 286.77 ⁰ C인 . 점에서흡열피크 (융점)가나타나는것은로확인되었다. ：

[51] As ₄ 0 ₆ -a .및 As ₄ 0 ₆ _b의분말 X선회절분광도를도 1에도시하였고， As ₄ 0 ₆ -a및 As 40 ₆ -b의회절데이터는다음의표 2와같다.

[52] [표 2]

[53] 나는 주피크의비율이 1 :1.3이고, As ₄ 0 ₆ -b는 2Θ값 13.8과 27.9에서나타나는주피크의 비율이 1:2.5인것을특징으로한다.제조된화합물의 DSC분석，구조결정 및 X선 회절분석은다음과같은방법으로수행하였다.

[54] (l) DSC분석

[55] DSC장비 (SDT Q600 V20.9 Build 20)에서， N ₂ lOOmLAnin을홀려주면서

10°C/min승은속도로 310 ^o C까지상승시키면서시료 20.0mg을분삭하였다.

[56] (¾ X선결정학

[57] 육산화사비소 (As ₄ 0 ₆ , MW=395.6)의단결정을 glass fiber위에올린후， X-ray beam을 2여회절되어나오는사진무늬와회절데이터의 체계성의 .유무를 관찰하여공간군 (space group)을결점하고,단위세포상수 (cell parameter)를 결정한다.회절세기는 10 ^ο <2θ<50°범위에서수집한다.이 데이터를구조결정 프로그램 (SHELXTL프로그램)을사용하여증원자방법 (Patterson방법)으로 As ₄ 0 6와결정구조를확인한다. [58] (3) X선회절분석법

[59] 수득한결정을분쇄하여 l O/ar卜 30/ (-325메시)의 입자로만들고 X-선회절 분석용유리홀더 (20mmxl6mmxlmm)에층진시킨후，유리슬라이드등으 로 압착시키고검체면과홀더면이평행을이루도록 매끈하게하여시료를 준비하였다. XRD의 Cu Κα, (1.54060 A)을이용하여 2Θ 10°~50。범위에서 1° /min의속도 (scan step 0.02 ^ϋ )로결정의 X-선회절분광도를그린다.

[60] 비교예 1:육산화사비소제조

[61] 고령토로특수:제작된합성반웅기 (높이 100mm,지름 190mm)와, 3~6개의

필터를장착할수있는클램프를준비한다.클램� �는.합성반웅기:로부터 50mm 떨어져서 1차클램프를설치하고,상기 1차클램프로부터 2~6mm간격으로그 상부에 2차〜 6차 _: 클램;프를설치하며，이때각클램프의규� �은지름 210mm및 두께 10mm이다,

[62] 칭량한굵은소금 (수분함량 10%이하) 400g~600g을합성반움기에투입하여 20mm내외로두께를고르게펴서다져주고 100 ^o C~800°C 3시간동안열을 서서히가열하면서반응기내부의소금표면온도 가 290±30 ^o C가되도록연속 가열하여수분및불순물을:제거하고실온에서 5시간동안냉각시킨다.

[63] 원료물질인 As ₂ 0 ₃ (순도 98%이상，제조사 YUNNAN WENSHAN JINCHI ARSENIC CO., LTD.) lOOg을합성반웅기내의굵은소금위에넣어주고, .

합성기의상부에위치한승화되는비소를포집할 수있는필터 (여과지)를각 필터와필:터사이의간격이 2~6卿가되도록 3~6개클램프를장착한다.이때 사용되는필터는，평량 (basic weight) 70~100g/n ,두께 (thickness) .0.17 0.25薩, 여과속도 (filtration speed) 22~30s/100ml,및보류입자경 (retention rate) 5~10/itn인 것을사용하는것이바람직하다. :

[64] 클램프을이용하아필터를고정:시키고합성반� �기하부에 열을가하여.

10Q°C에서 1,000°C까지단계적으로온도를올려준다.먼저합 성반웅기하부의 외부온도를 350°C±100 ^o C정도가되도록 1시간동안가열하고，이후에 합성반웅기하부의외부온도를 600~650°C,및 700~1,000°C정도가되도록 가열하여 총 5시간에서 10시간동안가열하여필터의최상부여과지의 증심부온도가 150 ^o C±100 ^o C를유지하도록한후，상온에서 5~7시간정도 냉각한다.이과정에서합상반응기와소금위에� �려진분말 As ₂ 0 ₃ 는합성반웅기 내부에서 기체로변하여상승하다가，합성반웅기외부의 상부온도가 상대적으로낮기때문에 액체로변하고이후고체로결정화되,어필터상� � 백색결정체가생성된다.필터로부터 48.5g의결정을채취하였다.채취한 비소화합물의결정구조를확인한결과 99중량 %이상이 As ₄ 0 ₆ -b인것으로 확인되었다.

[65] 비교예 2내지 4:육산화사비소제조

[66] 실시예 1(결정다형 As ₄ 0 ₆ -a가 99%아상인조성물)과비교예 1(결정다형 As ₄ 0 ₆ -b가 99%이상인조성물)을각각 4:1ᅳ및 1: 1로흔합하여,각각비교예 2및비교예 3으로하였다.

[67] 심험예 1: ?1？ >암세포 (cancer cell)증식 억제효과심험

[68] (1)실험재료및세포배양

[69] 소태아혈청 (FBS)과세포배양배지를준비하였고 (Hyclone사),디메틸

설폭사이드 (DMSO), 3-(4,5-디메될-티아졸 -2일) -2,5-디페닐테트라졸륨

브로마이드 (3-(4,5-dimetyl-thiazol-2yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)를 준비하였다 (Amresco LLC, USC).

[70] 인간의암세포주로서，인간폐암세포주 (human lung cancer cell)인 NCL-H226 및 SK-MES-l,인간식도암세포주 (human esophageal cancer cell)인 KYSE-150및 TE- 1 ,인간위암세포주 (human gastric cancer cell)인 AGS,인간대장암

세포주 (human colon cancer cell)인 HT29및 HCT116，인간전립선암; ： 세포주 (human prostate cancer cell)인 PC-3,인간췌장암세포주 (human pancreatic cancer cell)인 BxPC-3및 PANC—1,인간자궁경부암세포주 (human cervical cancer cell)인 SiHa및 HeLa,인간난소암세포주 (human ovarian cancer cell)인

SK-OV-3와인¾자궁내막암세포주 (human endometrial cancer cell)인: Ishikawa, HEC-1A및 HEC-1B세포를 _: 증국과학아카데미의상하이세포.은행으� �부터 _. 분양받았고,세포는 10% FBS, 50UM페니실린,및 _: 50,«g/m£스트렙토마이신이 포함된각세포배양에적합한배지 (RPMI-1640(NCL-H226, TE-1, BxPC-3, Ishikawa), MEM(SK-MES-1, SiHa, HeLa, HEC-1B), Ham's F-12K(AGS), Ham's F-12(PC-3), McCOY's 5A(HT29, HCT116, SK-OV-3, HEC-1A), RPMI- 1640: Ham's F-12=l : l(v:v)(KYSE-150), DMEM(PAN ))를이용하여 5% C0 ₂ 및 95%공기와 습기가있는상태의배양거에서：세포를배양하 였다.배지는 3일마다

교체하였다.

[71] (2)세포증식어세이 (MTT어세이)

[72] 실시예 1,및비교예 1내지 3의세포증식에 대한 _: 효과를 MTT어세이를이용해 평가하였다. MTT어세이는 MTT에 대해살아있는세포가불용성 암청색포마잔 반웅물을생성하는능력에기반:한다.트립신을� ��리하여세포들을배지에 부유시켜모은후， 4xl0 ³ 세포 /웰 (cells/well)의밀도로 96-웰배양디쉬 (Costar, Cambridge, MA, USA)에분주된다. 24시간후에，실시예 1,및비교예 1내지 3 각각을 0, 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10， 20, 40또는 80μΜ이 되도록 10% FBS를포함하는 배지가들어가：있는세포에처리하여 배양하였다.이때,실시예 1,및비교예 1 내지 3은 1M수산화나트륨에 5x10-%!농도로용해시킨저장용액을이용하였다. 세포증식에 대한 ΜΤΤ어세이를수행하기위해，시료처리후 24시간， 48시간및 72시간동안배양한세포에서상등액을:제거하고 웰 (well)당 5mg/m MTT용액을 20 ^씩 첨자하고나서포마잔결정을형성하기위해 37 ⁰ C에서 4시간:동안： 인큐베이션하였다.인큐베이션후에，상등액� �다시제거하고, DMSO를모든 웰에 100 씩 첨가하고,암청색결정을완전히용해하도록흔� �하였다. . 실온에서 15분동안방치하여모든결정이완전히용해되도� ��하고， 570nm(A _570n „ )파장에서마이크로-플레이트기로흡광도를측� ��하였다.

[73] (3)통계분석

[74] ^' 시료를처리하지않은대조군의흡광도값을 100으로계산하고,상기 대조군 대비시료를처리한처리군의흡광도값을교정 (calibration)하였고,세포증식 - 억제율을하기식에따라계산하였다.

[75] 세포증식 억제율 (%) = ((대조군세포의평균흡광도-처리군세포의평균

흡광도 )/대조군세포의평균흡광도) X 100 .

[76] 모든데이터는평균±표준오차 (means±SEM)으로표현된다.일원배치

분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA)후 .던넷의사후검증 (Dunnett's post-test)예의해다중비교를수행하였다.유의수� ��은 p<0.05였고，각실험은 3번씩반복되었다.

[77] (4)폐암세포주의증식 억제확인결과

[78] 실시예 1,및비교예 1내지 3을인간폐암세포주인 NCL-H226및 SK-MES-1에 처리하고나서， 24시간， 48시간및 72시간동안배양하고 MTT어세이를 수행하였고， NCL-H226을이용하여 얻은결과를도 2및도 3에나타내었다.

[79] 실시예 1및비교예； 1내지 ; 3을. NCL-H226에처리한후 48시간 (도 2A)및

72시간 (도 2B)둥안배양한실험결과모두에서，비교예 1내지 3을처리한경우에 비해실시예 1을처리한경우가폐암세포주인 NCL-H226의증식 억제율이높은 것으로확인되었다.

[80] 또한, lOuM의실시예 1을 NCL-H226및 SK-MES-1에처리하고，처리시간에 따른암세포증식 억:제를확인한결과 (도 3),폐암세포주인 NCL-H226및 . SK-MES-1모두，；처리시간에따라세포의증식 억제율이증가되는것으로 확인되었다.

[81] (S)식도암세포주의：증식 억제확인결과

[82] 실시예 1,및비교예 1내지 3을인간식도암세포주인 KYSE-150및 TE-1에 처리하고：나서， 24시간， 48시간및 72시간동안배양하고 MTT어세이를 수행하였고，도 4에나타내었다.

[83] lOuM의 :실시예 1을 KYSE-150및 TE-1에처리하고，처리시간에따른암세포 증식 억제를확인한결과 (£ 4A),식도암세포주인 TE-1은처리시간에따라세포 증식 억제율이증가되었고， KYSE-150의경우에는 24시간및 48시간에서세포 증식 억제:율이 차이가없었으나, 72시간에서세포증식 억제율이크게증가된 것으로확인되었다.

[84] 또한,실시예 1;및비교예 1내지: 3을 TE-1에처리한후 72시간 (도 4B)동안

배양한실험결과모두에서，비교예 1내지 3을처라한경우에 비해실시예 1을 처리한경우가식도암세포주인 TE-1의증식 억제율이높은것으로확인되었다.

[85] (6)위암세포주의증식 억제확인결과

[86] 실시예 1，및비교예 1내지 3을인간위암세포주인 AGS에:처리하고나서, 24시간, 48시간및 72시간동안배양하고 ΜΊΤ어세이를수행하였고，도 5에 나타내었다.

[87] 실시예 1을위암세포주인 AGS에농도별로처리하고처리시간에따른암세포 증식 억제를확인한결과 (도 5A),각처리농도에서처리시간에따라세포증식 억제가증가되었고， 48시간만처리하더라도위암세포의증식 억제율이높게 나타나는것으로확인되었다.

[88] 또한，실시예 1및비교예 1내지 3을 AGS에처리한후 72시간 (도 5B)동안

배양한실.험결과모두에서，비교예 1내지 3을처리한경우에비해실시예 1을 처리한경우가위암세포주인 AGS의증식 억제율이높은것으로확인되었다.

[89] (7)대장암세포주의증식 억제확인결과

[90] 실시예 1, ^: 및비교예 1내지 3을인간대장암세포주인 HT29및 HCT116에

처리하고나서 , 24시간, 48시간및 72시간동안배양하고 MTT.어세이를 수행하였고，도 6에나타내었다. ：

[91] lOuM의실시예 1을 HT29 ¾ HCT116에처리하고，처라시간에따른암세포 중식 억제를확인한결과 (도 6A):, HT29및 HCT116세포모두처리시간에따라 세포의증식억제율이증가된것으로확인되었다 .

[92] 또한,실시예 1및비교예 1내지 3을 HT29에처리한후 72시간 (도 6B)동안

배양한실험결과모두에서: /비 ¾예 1내지 3을처리한경우에비해실시예 1을 처리한경우가대장암세포주인 HT29의증삭억제율이높은것으로확인되었다.

[93] (8)전립선암세포주의증식 억제확인：결과

[94] 실시예 1,및비교예 1내지 3을인간전립선암세포주인 PC-3에처리하고나서， 48시간및 72시간동안배양하고 MTT어세이를수행하였고，도 7에나타내었다.

[95] 실시예 1및비교예 1내지 3올 PC-3에처리한후 48시간 (도 7A)및 72시간 (도 7) 동안배양한실험결과모두에서，비교예 1내지 3을처리한경우에 비해실시예 1을처리한경우가전립선암세포주인 PC-3의증식 억제율이높은것으로 확인되었다.

[96] (9)췌장암세포주의증식 억제확인결과

[97] 실시예 1，및비교예 1내지 3을인간췌장암:세포주인 BxPC-3및 PANC-1에 처리하고나서 , 24시간， 48시간및. 72시간동안배양하고 MTT어세이를 수행하였고，도 S에나타내었다. _:

[98] 실시예 1및비교예 1내지: 3을 BxPC-3에처리한후 72시간 (도 8A)동안배양한 실험결과모두에서，비교예 _: 1내지 3을처리한경우에비해실시예 1을처리한 경우가췌장암세포주인 BxPC-3의증식 억제율이높은것으로확인되었다.

[99] 또한,췌장암세포주인 BxPC-3및 PANC-1;에실시예 1을농도별로처리하여

72시간동안배양한실험결과 (도 8B)에서,양:세포모두실시예 1의농도 _.

의존적으로세포증식억제율이증가되는것으로 확인돠었다.

[100] (10)난소암，자궁경부암및자궁내막암세포증� �억제확인결과

[101] 실시예 1,및비교예 1내지 3을인간난소암세포주인 SK-0V-3,인간

자궁경부암세포주인 SiHa및 HeLa와인간자궁내막암세포주인 Ishikawa, HEC-IA및 HEC-1B에처리하고나서 , 72시간동안배양하고 MTT어세이를 수행한결과를도 9에나타내었다.

[102] 실시예 1및비교예 1내지 3을인간난소암세포주인 SK-OV-3(도 9A),인간 자궁경부암세포주인 HeLa (도 9B)및인간자궁내막암세포주인 HEC-1B (도 9C)에처리한후 72시간동안배양한실험결과모두에서,비교예 1내지 3을 처리한경:우에 비해실시예 1올처리한경우가난소암세:포주，자궁경부암 세포주및자궁내막암세 S주의증식 억제율이높은것으로확인돠었다. _:

[103] (11)다양한암세포주에서의세포증식 억제활성 비교

[104] 상기 인간폐암,식도암,위암，대장암,전립선암，췌 장 ^{01 "} ，난소암，자궁경부암및 자궁내막암세포의증식 억제실험을통해얻은결과에서실시예 1을 72시간 처리한결과를바탕으로실시예 1의 IC ₅ 。값을분석하였고，표 3및도 _. 10에그 결과를나타내었다.

[105] [표 3]

[106] 상기표 3및도 10을통해알수있듯이 ,암세포증식 억제활성과관련된

실시예 1의 IC ₅₀ 값이모든암에서낮은농도로나타나는것을 확인하였다.

[107] 또한，본발명에서보여주지않았으나,본발명� �육산화사비소가놔암,유방암， 간암,피부암등다양한암:세포의증식을억제하� ��것을확인하였다;.

[108] 이를통해,실시예 1이폐암,식도암,위암，대장암，전립선암，췌 장암，

자궁경부암,난소암및자궁내막암과같이다양� �암에서，암세포의성장을 억제함으로써우수한항암효과를나타낸다는것 을알수있었다.