【발명꾀 명칭】

CX-4945를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조 성물

【기술분야】

본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카^복시 산 (5一 [(3一 Chlorophenyl)amino]benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne~8-car boxy 1 i o acid; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[배경기술]

알츠하이머병 (Alzheimer's disease, AD)은 퇴행성 뇌질환으로， 노화의 과정 속에서 뇌조직이 기능을 잃으면서 점차 정신 기능이 쇠퇴하는 병이다. 이 병의 특 징은 기억력과 정서 면에서 심각한 장애를 일으킨다는 것이다. 현대 의학에서는 뚜 렷한 치료법이 없는 '불치의 병'으로 인식되고 있다. 노인에게 주로 나타나는 치매 의 주요 원인 가운데 하나이다. 병리조직학적으로는 뇌의 전반적인 위축, 뇌실의 확장， 신경섬유의 다발성 병변과 초로성 반점 등의 특징을 보인다. 임상적인 특징 은 기억， 판단， 언어능력 등 지적인 기능의 점진적인 감퇴， 일상생활능력, 인견， 행동양상의 장애 등이다. 이와 함께 우울증세， 인격의 황폐, 격한 행동 등의 정신 의학적안 증세도 동반된다. 이러한 증세들이 점진적으로 진행되어 결국은 죽음에 이르게 된다. 발병 후 서서히 죽음에 이르는 기간은 6~8년 정도이지만사람에 따라 20년이 넘는 경우도 있다. 현재 미국에서는 65~74세 인구의 약 3%, 75~84세 인구의 약 19%, 85세 이상 인구의 50%가 이 병을 앓고 있다고 한다. DyrklA (이중 특이성 티로신 인산화 조절 키나아제 -1A, Dual specificity t yr os i ne-phosphory 1 at i on-r egu 1 at ed kinase 1A)는 세린 (serine)/트레오닌 (threonine) 키나아제 (kinase)로 성인 중추신경계 내에서 다양한 역할을 수행 한다. DyrklA의 유전자는 인간의 21번 염색체 다운 증후군 위험 지역 (Down syndrome critical region, DSCR)에 위치해 있으며, DyrklA의 활성 증가는 다운증후군 (down syndrome) , 알츠하이머병 (alzheimer ' s disease), 파킨슨병 (parkinson' s disease) , 헌팅턴병 (huntington's disease) 및 픽병 (pick's disease)과 같은 신경 퇴행성 질 환과 관련되어 있다고 보고되어있다.

인간 또는 쥐의 DyrklA를 과발현하는 형질전환 마우스 모델은 해마에 의존ᅳ 하는 공간학습과 운동신경 결핍 및 발달 지연을 포함하는 다운증후군의 표현형을 보이는데, 이것은 다운증후군과 관련된 정신 지체에 있어서 DyrklA의 중요한 기능 을 암시하고 있다. 특히， 세포 골격 유지에 중요한 미세소관 조립 (microtubule assembly) 안정성은 알츠하이머 질환 및 다운 증후군에서 비정상적인 양상을 보이 는데， 이 과정에서 Tau 단백질은 미세소관의 안정성을 제어하는 중추적인 역할을 한다. 비정상적인 Tau의 발현 및 과인산화는 알츠하이머 및 다운 증후군에서 공통 적으로 나타나는 특징이다. DyrklA는 여러 세포모델에서 Tau 단백질의 다양한 위치 의 인산화에 중요하게 작용한다. 그 중에서도 특히 알츠하이머 질환 환자의 뇌에서 Τέιι의 Thr-212 잔기 (residue)에서 과인산화가 나타나고， 인간의 DyrklA를 형질 전 환한 마우스에서도 Tau의 Thr-212 residue가 과인산화 되어있는 것으로 나타났다. 이러한 결과를 종합해 볼 때 DyrklA가 알츠하이머 질환과 다운 증후군에서 Tau의 과인산화에 의한 병리에 증요한 기여를 할 가능성을 제시하고 있다.

특히， 알츠하이머 환자의 경우 신경 병리학적으로 과인산화된 Tau의 집합체 로 구성된 세포 내 신경 섬유 엉킴 (neurofibrillary tangles)의 형성 외에도 아밀 로이드 베타 펩타이드 (amyloid β peptide)의 불용성 침전물의 세포밖 축적이 나타 나는데， DyrklA는 이와 관련된 amyloid β 전구체 단백질 (Amyloid precursor protein)， 프리세닐린 (preseni l in) 등을 직접 인산화하여 알츠하이머의 중요한 병 리 원인 물질중 하나인 amyloid plaques (노인반) 생성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.

또한， 파키슨병와 병리학적 특징 중 하나인—루이소체 (Lewy bodies)는 알츠 하이머와 다운증후군 환자의 뇌에서도 공통적으로 관찰되는데， DyrklA는 Lewy bodies의 주요 구성성분인 알파-시뉴클린 ( a— Synuc lein)의 인산화를 통해 α - Synuclein의 웅집을 증가시켜 결국은 세포사멸을 초래시키는 것으로 알려져 있다. 또한， DyrklA는 헌팅턴 질병의 발병과 관련된 중요 단백질 HIP-1을 인산화시켜 결 국 세포사멸과 해마신경원 세포의 분화에 관여한다고 밝혀져 있다.

더불어， DyrklA는 cal cineur in/NFAT(nuc lear factor of act ivated T eel I s) 신호를 조절하고 인간의 발달 과정 단계에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려 져 있다. NFATc 전사 인자 (transcr ipt ion factors)는 보통 세포질에서 인산화 ^' 되어 있는 단백질로 존재하다가 세포의 Ca ²⁺ 농도가 올라가게 되면 Ca ²⁺ 의존성 단백질인 인산가수분해 효소 칼시뉴린에 의해서 NFATc가 탈.인산화 되고 NFATc는 핵내로 이동 하게 된다. 핵으로 들어간 NFATc는 파트너 단백질 NFATn와 전사 복합체를 형성하고 표적 유전자의 프토모터에 결합하여 타겟유전자 발현을 유도하게 된다. DyrklA는 NFATc를 인산화시킴으로써 세포질로 다시 이동시키게 하고, 결과적으로 타겟 유전 자의 발현이 억제되게 된다. CX-4945(5-[ (3_클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8—카르복시산，

5- [ (3-Ch lor opheny 1 ) ami no] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid , 실미 타세르티브 (Si lmi tasert ib) )는 인간의 암세포에서 자주 발견되며， 세포의 성장과 자가 사멸과 같은 다양한 세포 활성을 조절하는 단백질인 카제인 키나아제 2(casein kinase 2 , CK2)의 억제제로서 알려져 있다. Adam Siddiqui-Jain 등은 5— [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [(：] -2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0(-4945)이 경구 투여로 생체 이용 가능한 선택적 억제제로서의 활성을 나타내며， CK2의 촉매 서브 유닛 (catalytic subunit)인 CK2 α의 발현 수준을 억제함으로써 암세포의 증식을 억 제하는 것올 보고한바 있다 (Siddiqui-Jain A, et al . Cancer Res. 70(24)： 10288- 10298， 2010). 현재 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘 -8-카르복 시산 (CX-4945)을 CK2 억제제로 사용하기 위하여 임상 연구가 진행되고 있으며， 1차 임상에서 안전성 및 약물학적 효과 (pharmacodynamic property)를 확인하였고， 2차 임상을 통한 임의 약물 흔합 (randomized drug combinat ion)에 대한 추가적 평가에 대한 연구가 진행 중에 있다 (Sean E, Cylene Pharmaceuticals. Accessed 22 Mar 2011).

최근 연구에 따르면 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [(：]-2，6-나프티리딘-8- 카르복시산 (CX-4945)은 CK2 외에도 세포 내 pre_mRNA 스플라이싱 조절에서 중요한 역할을 하는 cdc2-like kinase(Clk)에 강력한 억제효과를 보인다. 흥미롭게도 기존 연구에 따르면 TG-003, KH-CB19, Leucettine L ₄ i 등 Clk를 억제한다고 알려진 많은 저분자 물질들은 공통적으로 Dyrk를 저해한다고 알려져 있다. 이는 Clk와 Dyrkl가 비슷한 구조의 ATP 결합 포켓 (ATP-binding pocket)을 가지고 있기 때문이다. CK2, Clk, Dyrk는 모두 CMGC super family kinase에 속한다. 이에， 본 발명자들은 DyrklA에 미치는 5-[(3_클로로페닐)아미노] 벤조 [c]- 2 ,6-나프티라딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 역할에 대해 연구하기 위해 노력한 결과, CK2와 Clk의 강력한 억제물질로 알려진 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나 프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 시험관 내 (in vitro)에서 DyrklA에도 강력한 억 제효과를 나타냄을 확인하였고， ATP와 경쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며， DyrklA를 세포수준에서도 강력하게 억제하여， 신경섬유엉킴과 노인반 유발 요인인 Tau, APP, PS1의 인산화를 억제하고， NFATc의 인산화를 억제시켜서， NFATc의 전사 활성을 증가시키고， 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날개， 눈， 신경계 발달 이상을 뚜렷하게 개선함을 확인하였으며，

DyrklA 과발현 마우스에서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인 함으로써， 일반적으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine , INDY, proINDY에 비해서 높은 억제 효능을 보임으로써， 이러한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나 프티리딘 -8—카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA에 대한 저해효과는 DyrklA와 관련된 퇴 행성 뇌질환의 연구를 위한 유용한 도구를 제공하고， 질환에 대한 새로운 치료 전 략의 발명으로 이어질 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2ᅳ 6-나프티리딘 -8-카 Ξ. Λ] > ( 5- [ ( 3-Ch 1 or opheny 1 ) am i no ] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8 ^~ car boxy 1 i c acid ; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴 행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하기 위한 것이다.

' 【기술적 해결방법]

본 발명의 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [ c ] -2， 6-나프티리딘 -8—카르복시산 ( 5- [ ( 3-Chl or opheny 1 ) ami no] benzo [c]-2 , 6- naphthyr idine-8-carboxyl i c acid ; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염. 을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한 다.

또한, 본 발명은 5-K3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 ( 5_ [ ( 3— Ch 1 or opheny 1 ) am i no ] benzo [ c ]— 2， 6-napht hyr i d i ne—8— c ar boxy 1 i c acid ; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴 행성 뇌질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 또한， 본 발명은 분리된 세포， 무세포 (cell-free) 또는 시험관 내 (in vitro) 에서 5— [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [(]—2，6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[(3- Ch lor opheny 1 ) ami no] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8 ^~ c ar boxy 1 i c acid; CX-4945) '또 ' 는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 Dyrkl 억제 방법 을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 5- [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [ c ] -2， 6-나프티리딘 -8-카르복시산 ( 5— [ ( 3-Ch 1 or opheny Damino] benzo [ c ] -2， 6- napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid; CX-4945)을 퇴행성 뇌질환에 걸린 개체에 투여 하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 치료방법을 제공한다. 또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘 -8—카르복시산 (5-[(3-Chlor이 3henyl)amino]benzo [c]-2,6- naphthyridine-8-carboxylic acid; CX-4945)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용하기 위한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (5-[(3— Chlorophenyl ) ami no] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid; CX—4945)의 용도를 제공한다. 또한， 본 발명은 퇴행성 뇌질환 예방 및 건강기능 식품으로 사용하기 위한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘— 8-카르복시산 (5-[(3- Chlorophenyl) ami no] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid; CX一 4945)의 용도를 제공한다. 이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 ( 5— [ ( 3-Ch 1 oropheny 1 ) am i no ] benzo [ c ] 2， 6 napht hyr idine-8-car boxy lie acid; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 CX-4945는 하기 [화학식 1]로 표기되는 구조를 가지는 것이 바람직하 다;

【화학식 1】

상기 CX 4945는 DyrkKDual specificity tyrosine phosphorylat ion regulated kinase 1)의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 DyrklA의 활성 억제는 CX-4945가 DyrklA의 ATP binding pocket에 결합 하여 발생하는 것을 특징으로 한다. . 상기 CX-4945는 DyrklA 저해를 퉁해 Tau, APP(amyloid precursor protein) 및 PSKpreseniHn 1) 단백질의 인산화를 억제시키고， NFATcl을 탈인산화 시키며， NFATcl의 전사활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 다운증후군 (down syndrome) , 알츠하이머병 (alzheimer ' s disease)， _. 파킨슨병 (parkinson'.s disease) , 헌팅턴병 (hunt ington' s disease) 및 픽병 (pick' s disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 구체적인 실시예에 있어서， 본 발명자들은 CK2 억제제로서 알려 져 있는 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8—카르복시산 (CX-4945) 이 Dyrk에 대해서도 억제 효능이 있는지 확인한 결과， 여러 Dyfk 단백질 중에서도 DyrklA, DyrklB에 대해 가장 강력하고 선택성이 높게 억제작용을 하고, 기존에 알 려진 DyrklA 저해제인 Harmine보다 DyrklA의 저해 효과가 20배 이상 강한 것을 확 인하였으며 (도 3 참조)， 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945)이 ATP 경쟁적인 방식으로 억제함을 생화학적 방법으로 확인하몄 고 (도 4 참조)， 분자 모델링 연구에서도 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6- 나프티리딘 -8-카르복시산 (CX— 4945)아 DyrklA의 ATP 결합 포켓 (ATP binding pocket) 에 수소 결합 (hydrogen bond)을 형성하여 결합하는 것을 확인하였다 (도 5 참조). 또한， 본 발명자들은 세포에서 DyrklA의 대표적인 기질 (substrate)언 Tau의 인산화를 확인한 결과， Tau 단백질만을 과발현하였을 때 나타나지 않던 인산화가 DyrklA를 같이 과발현하였을 때 뚜렷하게 나타나고， 여기에 5-[(3-클로로페닐)아미 노] 벤조 [c]-2,6—나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 농도를 증가시켜 처리함에 따라 Tau의 인산화가 감소함을 확인하였고， 이러한 효과가 Harmine보다 더 강한 것 을 확인하였고 (도 6a 참조), 다른 DyrklA 저해제인 INDY와 proINDY는 5-[(3-클로로 페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 보다 약 10배 낮은 억제 효과를 확인하였으며 (도 6b 참조)， 기존에 잘 알려진 APP myloid precursor protein) 및 PSKpreseni I in 1)의 인산화도 억제하는지를 확인한 결과， Tau 단백질 인산화와 마찬가지로, APP 및 PS1의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다 (도 7 참 조). 또한, 본 발명자들은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리단- 8-카르복시산 (CX-4945)이 DyrklA 관련된 calcineur in/NFAT 신호를 조절할 수 있는 지를 확인한 결과， 이오노마이신 (ionomycin, IM) 처리조건에서 DyrklA 과발현에 의 해서 세포질로 이동하는 Flag-NFATcl 융합 단백질이 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤 조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)처리에 의해서 다시 핵으로 재배치되 는 것을 확인하였고 (도 8 참조)， NFATc 반웅 프로모터 (NFATc-responsive element) 를 포함하는 reporter를 통한 전사활성을 확인한 결과， IM과 PMA(phorbol 12- myri state 13-acetate)를 처리한 경우에 루시퍼라제의 발현이 급격하게 증가되었고 (20배 이상)， 여기에 DyrklA를 과발현하니 루시퍼라제 발현이 1/3(5.4배 증가)로 억제되었고， 이 조건에 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)을 농도별로 처리했을 때 루시퍼라제의 발현이 다시 급격히 증가함 을 확인하였다 (도 9 참조).

또한, 본 발명자들은 세포 실험에서 확인된 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제 효과를 개체 수준에서 확인하기 위해 DyrklA의 초파리 상동인자인 minibrain(mnb) 유전자를 클로닝하여 UAS/Gal4 시스템을 이용하여 확인한 결과， 날개 프로모터 (promoter)인 MS1096-Gal4 라인과 UAS-mimbrain(nmb)을 교배하여 나온 F1 세대에서는 90% 이상의 개체에서 5 번 장축시맥 (L5 vein)의 발생 이상을 보이는 것으로 확인하였고 (도 10a 참조)， 이 러한 minibrain 과발현에 의한 짧은 시맥 표현형이 100 nM 5-[(3-클로로페닐)아미 노] 벤조 [c]_2,6-나프티리딘— 8-카르복시산 (CX-4945)을 먹인 초파리에서 약 30% 억 제되는 것을 확인하였으며， harmine의 경우에는 5 ^: [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 최적 농도의 100배인 10,000 nM 이상에 서 40% 수준의 minibrain 표현형 억제효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 10b). 또한, 본 발명자들은 눈 특이적 프로모터인 GMR-gal4를 이용하여 Tau를 발 현할 경우에 초파리 눈 발생에 변화가 생기고. minibrain 및 Tau를 동시에 발현시 킬 경우에는 이러한 변화가 더 심해지는 것을 확인하였으며, 각각의 경우에 5-[ (3- 클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리단 -8-카르복시산 (CX-4945)을 처리한 경 우에는 minibrain 및 Tau에 의한 변화가 유의하게 억제되는 것을 확인하였고 (도 11a 참조)， mini brain의 과발현에 의해 중추신경계 및 말초신경계의 발생 아상이 확인되었고， 부모 세대에 5-[ (3—클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945)을 7일간 먹인 후 교배를 하여 나온 F1 세대의 배아에서는 minibrain에 의한 신경계 발생 이상이 현저하게 억제되는 것을 확인하였으며 (도 lib 참조) , 신경계 특이적 minibrain 과발현은 신경계 발생 이상으로 70% 이상꾀 성충 치사율을 보이는 데 반해， 5- [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리 딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 처리한 개체는 65% 이상 치사율이 감소하는 것을 확인 하였으므로， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945)이 초파리 DyrklA인 minibrain의 저해제로 작용하는 것을 확인하였다 (도 11c 참조) :

또한， 본 발명자들은 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘- 8-카르복시산 (CX-4945)이 고등동물 수준에서도 DyrklA 억제 효능을 보이는지 확인 하기 위해서 다운증후군을 모방하는 DyrklA 과발현 마우스에서 실험을 수행한 결과, 이미 알려진 것과 마찬가지로 정상 마우스에 비해서 DyrklA 과발현 마우스의 해마 (hippocampus)에 존재하는 Tau 단백질의 T212 위치의 인산화 정도가 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였고， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [(；]-2，6-나프티리딘-8- 카르복시산 (CX-4945)을 75 mg/kg의 농도로 구강 투여한 30분 후에 DyrklA 과발현 마우스의 해마에 존재하는 Tau 단백질의 인산화는 대조군인 vehi c le을 투여한 것에 비해 현저하게 낮게 나타나는 것을 확인하였으며， 이는 정상 마우스에서 나타나는 수준과 비슷한 것을 확인하였다 (도 12 참조) .

따라서， 본 발명의 5-[ (3—클로로페닐)아미노] 벤조 [(：]-2，6-나프티리딘-8- 카르복시산 (CX-4945)은 시험관 내 ( in vi tro)에서 DyrklA에 강력한 억제효과를 나타 냄을 확인하였고， ATP와 경쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며， DyrklA를 세포수준 에서도 강력하게 억제하여， 신경섬유엉킴과 노인반 유발 요인인 Tau, APP, PS1의 인산화를 억제하고， NFATc의 인산화를 억제시켜서， NFATc의 전사활성올 증가시키고 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날개， 눈， 신경계 발달 이상을 뚜렷하게 개선함올 확인하였으며， DyrklA 과발현 마우스에 서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인함으로써， 일반적으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine , INDY, proINDY에 비해서 높은 억제 효능을 보 임으로써， 본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복 시산 (CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 다운증후군， 알츠하이머병， 파킨슨병 등 DyrklA와 관련된 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으 로 유용하게 사용될 수 있다. - 본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며， 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산 ( f ree ac i d)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산， 질산， 인산， 황산， 브름화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트， 페닐-치환된 알카노 에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알¾디오에이트， 방향족 산류， 지방족 및 방 향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트， 피로설페이트， 바이설페이트， 설파이트， 바이설파이트， 니트레 이트， 포스페이트， 모노하이드로겐 포스페이트， 디하이드로겐 포스페이트， 메타포 스페이트， 피로포스페이트 클로라이드， 브로마이드， 아이오다이드， 플루오라이드， 아세테이트 , 프로피오네이트， 데카노에이트， 카프릴레이트， 아크릴레이트 , 포메이 트， 이소부티레이트， 카프레이트， 헵타노에이트， 프로피올레이트， 옥살레이트， 말 로네이트， 석시네이트， 수베레이트， 세바케이트， 푸마레이트， 말리에이트， 부틴- 1， 4-디오에이트， 핵산 -1 , 6-디오에이트， 벤조에이트， 클로로벤조에이트， 메틸벤조에 이트， 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트， 프탈레이트 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트， 를루엔설포네이트， 클로로벤젠설포네이트， 크실 렌설포네이트， 페닐아세테이트， 페닐프로피오네이트， 페닐부티레이트， 시트레이트， 락테이트， β -하이드록시부티레이트， 글리콜레이트， 말레이트， 타트궤이트， 메탄설 포네이트, 프로판설포네이트， 나프탈렌 -1-설포네이트, 나프탈렌 -2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법， 예를 들면， 5-[(3-클로로페닐)아 미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리딘 -8—카르복시산 (CX-4945)을 과량의 산 수용액 중에 용해시키고， 이 염을 수흔화성 유기 용매， 예를 들면 메탄을， 에탄올 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동량의 5-[ (3-클로로페닐)아 미노] 벤조 [c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 및 물 중의 산 또는 알코올 을 가열하고， 이어서 이 흔합물을 증발시켜서 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한， 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알 칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산 화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고， 비용해 화합물 염을 여과 하고， 여액을 증발， 건조시켜 얻는다. 이때， 금속염으로는 나트륨， 칼륨또는 칼슘 염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한， 이에 대웅하는 은 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염^ 적당한 음염 (예， 질산은)과 반웅시켜 얻는다.

또한， 본 발명의 5- [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c ]-2 , 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945)은 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라， 통상의 방법에 의해 제 조될 수 있는 모든 염， 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.

본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며， 예를 들면 5- [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [ c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 수흔화 성 유기용매 , 예를 들면 아세톤, 메탄을， 에탄을， 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액을가한 후 침전시키거나 결정화시켜 서 제조할 수 있다. 이어서 이 흔합물에서 용매나 과량의 산올 증발시킨 후 건조시 켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우， 5- [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능 한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경 구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아 니다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제， 환제， 경 /연질 캅셀제， 액제， 현 탁제， 유화제, 시럽제， 과립제， 엘릭시르제 등이 있는데， 이들 제형은 유효성분 이 외에 회석제 (예: 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈， 만니를， 솔비를， 셀를로즈 및 / 또 는 글리신)， 활택제 (예: 실라카， 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 /또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실 리케이트， 전분 페이스트， 젤라틴, 메틸셀를로즈， 나트륨 카복시메틸셀를로즈 및 / 또는 폴리비닐피를리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며， 경우에 따라 전분， 한 천， 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 흔합물 및 /또는 흡수제， 착색제， 향미제， 및 감미제를 함유할 수 있다.

본 발명의 5- [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX— 4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학 적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며， 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사， 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다. 이때， 비경구 투여용 제형 으로 제제화하기 위하여 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [ c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염올 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 흔합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 , 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다 . 상기 조성물은 멸균되고 /되거나 방부제， 안정화제， 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 /또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 았 으며, 통상적인 방법인 흔합， 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다. 또한， 본 발명의 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이， 몸무게， 성 별 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 몸무게가 60 kg인 성인 환자를 기준으로 할 때， 일반적으로 0.001 ~ 1 , 000 mg/일이며, 바람직하게는 0.01 - 500 mg/일이며， 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.

또한， 본 발명은 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6—나프티리딘 -8-카 ―^" ^Λ 1 ^： ( 5- [ ( 3-Ch 1 or opheny Γ ) am i no ] benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid ; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴 행성 뇌질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 CX-4945는 상기 [화학식 1]로 표기되는 구조를 가지는 것이 바람직하 ^' 다ᅳ

상기 CX-4945는 Dyrkl의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 DyrklA의 활성 억제는 CX-4945가 DyrklA의 ATP binding pocket에 결합 하여 발생하는 것을 특징으로 한다.

상기 CX— 4945는 DyrklA 저해를 통해 Tau , APP 및 PS1 단백질의 인산화를 억 제시키고， NFATc를 탈인산화 시키며， NFATc의 전사활성을 증가시키는 것을 특징으 로 한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 다운증후군， 알츠하이머병， 파킨슨병, 헌팅턴병， 및으로 픽병으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한 정되지 않는다. 본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 ,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)은 시험관 내 ( in vi tro)에서 DyrklA에도 강력한 억제효과를 나타냄을 확인하였고， ATP와 경.쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며, DyrklA를 세포수준에서도 강력하게 억제하여， 신경섬유엉킴과 노인반 유발 요인인 Tau, APP, PS1의 인산화를 억제하고， NFATc의 인산화를 억제시켜서 , NFATc의 전사활성을 증가시키고, 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날개， 눈， 신 경계 발달 이상을 뚜렷하게 개선함을 확인하였으며, DyrklA 과발현 마우스에서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인함으로써， 일반적으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine , INDY, proINDY에 비해서 높은 억제 효능을 보임으로써， 본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 퇴행성 뇌질환 예방 및 개선용 건강 기능식품의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리단 -8-카르복시 산 (CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염이 상기와 같은 퇴행성 뇌질환 예방 및 개선을 위해 이용되기 위해서는， 식품학 또는 약제학적 분야에서 ^' 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있으껴 그 자체 또는 식품학적으로 허용되는 담체, 부형제， 희석제 등과 흔합하여 경구로 섭취할 수 있는 어떤 식품 형태로도 제조될 수 있다. 바람직하게는 음료， 환, 과립， 정제 또는 캅셀 형태이다. 본 발명의 건강 기능 식품은， 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되고 식품학 적으로 허용되는 성분을 더 포함할 수 있다. 예컨대， 음료수로 제조되는 경우에는 본 발명의 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 이외에 구연산, 액상과당， 설탕， 포도 당， 초산， 사과산， 과즙 등에서 하나 이상의 성분을 추가로 포함시킬 수 있다.

본 발명에 따른 건강 기능 식품의 유효성분으로 포함될 수 있는 양은 퇴행 성 뇌질환 예방 및 개선을 원하는 사람의 연령， 성별, 체중 상태， 질병의 증상에 따라 적절히 선택될 수 있으며， 바람직하게는 성인기준 1일 0.01 g 내지 10.0 g 정 도로 포함되는 것이 좋으며， 이러한 함량을 갖는 건강 기능 식품을 섭취함으로써 퇴행성 뇌질환 예방 및 개선 효과를 얻을 수 있다. 또한， 본 발명은 분리된 세포， 무세포 (cel l-free) 또는 시험관 내 ( in vi tro) 에서 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]— 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(5-[ (3— Chlorᄋphenyl )amino]benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid ; CX-4945) 또 는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 처리하는 단계를 포함하는 Dyrkl 억제 방법 을 제공한다.

상기 CX-4945는 상기 [화학식 1]로 표기되는 구조를 가지는 것이 바람직하 ^' ：나 이에 한정하지 않는다.

상기 CX-4945는 Dyrkl의 활성을 억제하는 것을 특징으로 한다.

상기 DyrklA의 활성 억제는 CX-4945가 DyrklA의 ATP binding pocket에 결합 하여 발생하는 것을 특징으로 한다.

상기 CX-4945는 DyrklA 저해를 통해 Tau 단백질의 인산화를 억제시키고， NFATc를 탈인산화 시키며， NFATc의 전사활성을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 5— [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)은 시험관 내 (in vi tro)에서 DyrklA에도 강력한 억제효과를 나타냄을 확인하였고， ATP와 경쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며， DyrklA를 세포수준에서도 강력하게 억제하여， 신경섬유엉킴과 노인반 유발 요인인 Tau , APP , PS1의 인산화를 억제하고， NFATc의 인산화를 억제시켜서， NFATc의 전사활성을 증가시키고， 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날개， 눈， 신 경계 발달 이상을 뚜렷하게 개선함을 확인하였으며， DyrklA 과발현 마우스에서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인함으로써， 일반적으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine, INDY, proINDY에 비해서 높은 억제 효능을 보임으로써 본 발명의 5— [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945) ≤E는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 Dyrkl과 관련된 생물학적 연구를 위 한 Dyrkl 억제 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조

[ c ] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 ( 5- [ ( 3-Ch 1 or opheny 1 ) ami no] benzo [c]-2,6- naphthyridine-8-carboxylic acid; CX—4945)을 퇴행성 뇌질환에 걸린 개체에 투여 하는 단계를 포함하는 퇴행성 놔질환 치료방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 5- [(3-클로로페닐)아미노] 벤조

[c]-2,6-나프티뫼딘 -8-카르복시산 (5-[(3-Chlorophenyl)amino]benzo [c;卜 2，6- naphthyridine-8-carboxylic acid; CX—4945)을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방 방법을 제공한다ᅳ 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또 는 위험 비율로 질환을 치료하기에 층분한 양을 의머하며， 이는 개체의 질환의 종 류, 중증도， 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 투여시간， 투여 경로 및 배출비율， 치료기간， 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요 소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)은 시험관 내 (in vitro)에서 DyrklA에도 강력한 억제효과를 나타냄을 확인하였고， ATP와 경쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며， DyrklA를 세포수준에서도 강력하게 억제하여， 신경섬유엉킴과 노인반 유발 요인인 Tau, APP, PS1의 인산화를 억제하고, NFATc의 인산화를 억제시켜서， NFATc의 전사활성을 증가시키고， 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날개， 눈， 신 경계 발달 이상을 뚜렷하게 개선함을 확인하였으며， DyrklA 과발현 마우스에서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인함으로써, 일반적으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine, INDY, proINDY에 비해서 높은 억게 효능을 보임으로싸， 본 발명의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 퇴행성 뇌질환에 대한 강력한 효과 를 나타내므로， 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료방법에 유용하게 사용될 수 있다.

【유리한 효과】

본 발명은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 -¾： ( 5- [ ( 3-Ch 1 or opheny 1 ) am i no ] benzo [ c ] -2 , 6^napht hyr i d i ne-8-c ar boxy 1 i c acid; CX-4945) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로， CK2와 Cdc2-like kinase(Clk) 의 강력한억제물질로 알려진 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘- 8-카르복시산 (CX-4945)이 시험관 내 (in vitro)에서 DyrklA에도 강력한 억제효과를 나타냄을 확인하였고， ATP와 경쟁적인 방식으로 억제 작용을 하며， DyrklA를 세포 수준에서도 강력하게 억제하예 미세소관 (microtubule) 관련 단백질인 Tau, APP, PS1의 인산화를 억제하고， NFATc를 탈인산화 시키며， NFATc의 전사활성을 증가시키 고, 초파리 모델에서도 초파리 DyrklA인 minibrain이 과발현되었을 때 나타나는 날 개 ^' ， 눈， 신경계 발달 이상을 유의적으로 개선함을 확인하였으며， DyrklA 과발현 마 우스에서도 Tau 단백질의 인산화가 현저하게 낮아지는 것을 확인함으로써 , 일반적 으로 DyrklA 저해제로 사용되는 Harmine, INDY, proINDY에 비해서 높은 억제 효능 을 보임으로써， 상기 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8—카르복 시산 (CX-4945)을 DyrklA와 관련된 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료용 조성물로 유용하 게 사용할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】 도 1은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (5-[(3-Chlorophenyl )amino]benzo [ c ] -2 , 6-napht hyr i d i ne-8-car boxy 1 i c acid; CXᅳ 4945)의 구조를 나타낸 도이다.

도 2는 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]—2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 및 기존에 DyrklA의 가장 강력한 억제물질로 알려진 Harmine, INDY 및 proINDY의 구조를 나타낸 도이다.

도 3은 인산화효소 프로파일링 (kinase profiling) 분석을 수행하여 Dyrk에 대한 억제 효과를 나타낸 도이다:

(A)는 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티뫼딘 -8-카르복시산 (CX— 4945) 의 Dyrk에 대한 억제 효과를 나타낸 도이고， (B)는 Harmine의 Dyrk에 대한 억제 효 과를 나타낸 도이다.

도 4는 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 ATP 경쟁적 DyrklA 억제효과를 나타낸 도이다.

도 5의 (A)는 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복 시산 (CX-4945)과 DyrklA의 분자모델링 결과를 나타내며， (B)는 5-[(3_클로로페닐) 아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)과 DyrklA의 결합 구조를 나타낸 도이다.

도 6a의 (A)는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)의 Tau 단백질의 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 (western blotting) 실험을 수행하여 확인한 도이고， (B)는 (A)의 결과를 정량화하여 그래프 로 나타낸 도이며， (C)는 Harmine의 Tau 단백질의 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 확인한 도이고, (D)는 (C)의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.

도 6b의 (A)는 INDY의 Tau 단백질의 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 실험 을 수행하여 확인한 도이고， (B)는 (A)의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이 며， (C)는 proINDY의 Tau 단백질의 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 실험을 수행하 여 확인한 도이고, (D)는 (C)와 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.

도 7의 (A)는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6—나프티리딘 -8-카르복 시산 (CX-4945)의 APP myloid precursor protein) 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 확인한 도이고， (B)는 (A)의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이며， (C)는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티라딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 PSKpreseni l in 1) 인산화 억제 효과를 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 확인한 도이고， (D)는 (C)의 결과를 정량화하여 그래프로 나타낸 도이다.

도 8은 여러가지 조건에서의 Flag-NFATcl 단백질와 세포 내 위치를 나타낸 도이다: 왼쪽 위는 control (대조군)로 아무 처리를 하지 않은 상태에서의 Flag-NFATcl 단백 질의 위치를 나타내고， 오른쪽 위는 이오노마이신 ( ionomycin, IM)을 처리한 후 Flag-NFATcl 단백질의 위치를 나타내고， 왼쪽 가운데는 DyrklA를 과발현시킨 후 Flag-NFATcl 단백질의 위치를 나타내고， 오른쪽 아래는 IM을 처리한 후 DyrklA를 과발현시킨 후 Flag-NFATcl 단백질의 위치를 나타내며， 왼쪽 아래는 IM을 처리한 후 DyrklA를 과발현시킨 후 5-[(3_클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6_나프티리딘 -8- 카르복시산 (CX-4945)을 처리한 후 Flag-NFATcl 단백질의 위치를 나타낸다.

도 9는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제효과를 NFATc의 전사활성을 통해 측정하여 나타낸 도이다. 도 10a는 날개 특이적 minibrain(mnb) 과발현에 의한 표현형을 나타낸 도이 다.

도 10b의 (A)는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)의 농도에 따른 mini brain 과발현 초파리 개체의 표현형 억제 효과 를 확인한 도이고， (B)는 Ha ine의 농도에 따른 minibrain 과발현 초파리 개체의 표현형 억제 효과를 확인한 도이다. 도 11a는 초파리 눈 특이적인 minibrain 과발현에 의한 표현형 및 Tau 과발 현에 의한 표현형에 대한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945)의 억제 효과를 확인한 도이다.

도 lib는 초파리 신경계 특이적인 minibrain 과발현에 의한 신경 발생 이상 표현형에 대한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 억제 효과를 확인한 도이다.

도 11c는 초파리 신경계 특이적인 minibrain 과발현에 의한 성충 치사율에 대한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]— 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0(-4945)의 억제 효과를 확인한 도이다.

도 12는 DyrklA 과발현 마우스에서 5_[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-

2， 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 억제 효과를 확인한 도이다:

(A)는 정상 마우스 (normal )와 DyrklA 과발현 마우스의 해마에서 나타나는 Tau 단백 질의 인산화를 웨스턴 블롯 실험을 수행하여 확인한 도이고， (B)는 DyrklA 과발현 마우스에 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX- 4945)올 투여한 후 해마에서 나타나는 Tau단백질의 인산화 감소 효과를 웨스턴 블 롯 실험올 수행하여 확인한 도이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)의 Dyrkl 억제효능

TG-003 , KH-CB19 , Leucett ine L ₄₁ 등 Cdc2-l ike kinase(Clk)를 억제한다고 알려진 많은 저분자 물질들은 대부분 Dyrk를 저해한다고 알려져 있다. 이는 Clk와 Dyrkl이 비슷한 서열과 구조의 인산화 효소영역 (kinase domain)을 가지고 있기 때 문이다. 이에， 본 발명자들은 최근 연구에서 도 1에 개시된 5-[ (3-클로로페닐)아미 노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)라는 물질이 Clk에 대해서 강 력한 억제효능을 가지고 있음을 규명하였고， 연장선상에서 Clk와 구조적으로 유사 한 Dyrkl (Dual speci f ic i ty tyr os i ne-phosphory 1 at i on-r egu 1 at ed kinase 1)에 대해 서도 비슷한 효능을 가질 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한 도 2에 개시된 구조 를 가진 기존에 널리 이용되고 있는 현재까지 가장 강력한 DyrklA 저해제로 알려진 하민 (Harmine) 및 기존 연구에서 또 다른 DyrklA의 억제물질로 알려진 INDY와 proINDY를 실험에 사용하였다.

구체적으로， 여러 가지 농도의 5-[ (3-클로로페날)아미노] 벤조 [d]-2, 6-나 프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 분리정제된 DyrklA, DyrklB, Dyrk3 및 Dyrk4와 반웅시킨 다음, 형광-기반의 면역분석법 ( f luorescence-based immunoassay)을 사용 하는 인산화효소 프로파일러 서비스 (Kinase Prof i ler service ! 인비트로젠 사 제공) 를 사용하여 인산화효소 프로파일링 (kinase prof i l ing) 분석을 수행하여 DyrklA, DyrklB , Dyrk3 및 Dyrk4에 대한 5_[ (3ᅳ클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6_나프티리 딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 억제 효과를 0.001 , 0.01， 0. 1， 1 및 10 μ Μ의 CX- 4945 농도 및 각각 단백질의 인산화 효소활성에 적합한 ATP 농도 (ATP에 대한 Km값 과 동일한 ATP 농도)에서 측정하고 프리즘 프로그램을 이용해서 IC ₅₀ 값을 결정하여 각각의 인산화효소에 대한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [(：]-2，6-나프티리딘-8- 카르복시산 (CX-4945)의 억제효과를 비교하였다. 대조군으로 Hantiine의 억제 효과를 상기와 동일한 방법으로 확인하였다.

그 결과 도 3에 나타낸 바와 같이， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_ 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0(-4945)은 여러 Dyrk 단백질 중에서도 DyrklA, DyrklB에 대해 가장 강력하고 선택성이 높게 ( IC ₅₀ 6.4~6.8 nM) 억제작용하는 것을 확인하였다. 또한, Harmine과 비교해 볼 때 5_[(3_클로로페닐)아미노] 벤조 [c] ^~ 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0 -4945)의 DyrklA의 저해효과가 20배 이상 훨씬 강 한것을 확인하였다 (도 3) .

상기 결과 및 구조를 분석하였올,때， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]- 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0(-4945)은 Harmine과 매우 유사한 구조를 가지고 있 으나， 벤질링 (benzyl r ing)을 추가적으로 가지고 있는데 (도 2)， 이 차이가 DyrklA 억제효능의 차이에 중요한 요인으로 작용한 것으로 추정되고, INDY와 proINDY가 Harmine보다 약간 낮은 DyrklA 억제 효능을 가지는 것을 고려하면, 5-[ (3-클로로페 닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 가장 강력한 DyrklA 억제물질암을 확인하였다.

<실시예 2> 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시 산 (CX-4945)의 ATP 경쟁적 억제 효능

5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 이 ATP와 경쟁하는 방식으로 DyrklA를 억제하는지 확인하기 위해서 여러 농도의 5- [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]— 2,6-나프티라딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 처리 조 건에서 ATP의 농도를 달리하여 DyrklA 활성을 측정하고 그 값들을 이용해서 Lineweaver-Burk 그래프를 그려서 확인하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이， 전형적인 ATP 경쟁적 방식의 억제패턴이 나타났다 (도 4) . 또한， 실제로 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c] -2 , 6-나프티리딘 -8-카르복 시산 (CX-4945)이 DyrklA의 ATP 결합부위에 잘 들어맞는지를 확인하기 위해 컴퓨터 시물레이션을 통한 분자 모델링 연구를 수행하였다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 5-[(3 클로로페닐)아미노] 벤조 [c]- 2，6-나프티리딘_8-카르복시산(0(-4945)이 DyrklA의 ATP binding pocket에 잘 들어 맞는 것을 확인하였고 (도 5A), DyrklA의 L241의 질소 (nitrogen)와 5-[(3-클로로페 닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 카복실기 (carboxyl group) 사이에 두 개의 수소결합이 예측되고， D307의 질소와 5-[(3-클로로페닐)아 미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘— 8-카르복시산 (CX-4945)의 트리사이클 (tricyclic) 질소 사이에 1개의 수소결합이 예측되었다 (도 5B). ,

이러한 결합 형태는 기존 연구에서 DyrklA와 harmine, INDY, proINDY 사이 의 Co— crystal 구조를 통해서 밝혀진 것과 매우 유사한 형태이며， 이러한 결과들을 토대로 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 이 DyrklA의 ATP 결합부위에 경쟁적으로 결합함으로써， 억제 효능을 보이는 것을 확인하였다.

<실시예 3>세포수준에서의 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티 리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA억제 효과

<3-1> 5- [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산

(CX-4945)의 Tau 인산화 억제 효과

세포수준에서 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리단 -8-카르복 시산 (CX-4945)이 DyrklA를 억제할 수 있는지를 테스트하기 위해 포유동물 세포인 293T 세포에서 DyrklA의 대표적인 기질 (substrate)인 Tau의 인산화를 확인하였다. Tau는 미세소관 관련 단백질로 DyrklA는 Tau 단백질의 Thr212를 주로 인산화하고， 이러한 인산화는 DyrklA가 과발현된 다운증후군 모델 마우스의 해마조직에서 뚜렷 하게 관찰된바 있다..

구체적으로， 293T 세포를 6 웰 플레이트에 5xl0 ⁵ 세포수로 12시간 배양한 후 Tau 및 DyrklA 발현 DNA 각각 1 을 공동형질전환하였다. 이를 24시간 배양한 후 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 0.001, 0.01， 0.1 및 1 μΜ 처리하여 6시간 배양한 후， 세포를 수득하고 파쇄하여 293Τ 세포의 전체 단백질을 포함하는 세포 추출물을 수득하였다. 그런 다음， SDS- PAGE로 상기 전체 단백질을 전개하고, 0.45 의 폴리비닐이딘 플루오라이드 이동 막 (Polyvinyl idene fluoride transfer membrane; GE 헬스케어 사, 미국)에 이동하 여 5% 스킴 밀크 (skim mi lk)로 차단한 후， 1차 항체로 항 -Tau 항체 (써모 사)， 항- pTau(T212) 항체 (인비트로젠 사) 및 항— Dyrkla 항체 (산타크루즈 사)를 5> 스킴 밀 크를 포함하는 트리스완충식염수 트€_20(tris buffered saline tween-20, TBST)로 1:1000으로 희석하고, 상기 차단한 이동 막에 처리하여 밤새 반웅시켰다. 그런 다 음， TBST로 각각 10 분간 4 회 씻어준 뒤， 2차 항쎄를 반웅시켰다. 반웅 후， TBST 로 각각 10 분간 4 회 씻어준 뒤， 상기 이동 막 위의 단백질을 WEST-Z0L 플러스 웨 스턴블럿팅 검출 시스템 (WEST-ZOL plus western blotting detection system; 인트 론 생명공학사， 미국) 및 LAS— 4000 영상화 분석기 (LAS-4000 Image analyzer; 후지 필름 사， 일본)을 사용해 단백질의 인산화 수준을 검출하였다. 대조군으로 5-[(3- 클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6—나프티리딘 -8—카르복시산 (CX-4945) 대신 다른 DyrklA 저해제인 Harmine, INDY 또는 proINDY를 사용하여 상기와 동일한 방법을 수 행하였다. 발현양을 비교하기 위한 대조군으로는 1차 항체로 항 -hnRNP AKanti- hnRNA Al, Gideon Dreyfuss, 펜실베니아대， 미국) 항체 및 항—GAPDH 항체를 사용하 여 상기와 동일한 방법으로 hnRNPAl 및 GAPDH 발현 여부를 확인하였다.

그 결과 도 6a 내지 도 6b에 나타낸 바와 같이， 293T 세포에서 Tau 단백질 만을 과발현하였을 때 나타나지 않던 인산화가 DyrklA를 같이 과발현하였을 때 뚜 렷하게 나타나는 것을 확인할 수 있었고， 여기에 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 농도를 증가시켜 처리함에 따라 Tau 의 인산화가 감소함을 확인하였으며， 이러한 결과는 세포수준에서 5-[(3_클로로페 닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 DyrklA의 강력한 억 제 효과가 있음을 보여준다. 또한， 세포수준에서의 5- [(3-클로로꿰닐)아미노] 벤조 [c]_2 ,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 Tau 단백질 인산화 억제효과는 Harmine보다 더 강한 것을 확인하였다 (도 6a) . 또한， 5— [ (3-클로로페닐)아미노] 벤 조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 Tau 단백질 ^' 인산화 억제효과는 IC ₅₀ 이 대략 100—200 nM이고， Harmine은 300-500 nM로 약간 낮았고, 다른 DyrklA 저해제인 INDY와 proINDY는 약 2 , 000 nM로 확인되어， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤 조 [c]_2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 보다 약 10배 낮은 억제 효과를 확 인하였다 (도 6b) .

이러한 결과는 상기 <실시예 1>과 마찬가지로， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 가장 강력한 DyrklA 억제 물질 임을 확인하였다.

<3-2> 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 APP(amyloid precursor protein) , PSKpreseni 1 in 1) 인산화 억제 효과

5-[ (3-클로로페닐)아머노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945) 이 DyrklA를 억제함으로써 Tau의 인산화 외에도기존에 잘알려진 APP 및 PS1의 인 산화도 억제하는지를 확인하였다.

구체적으로， 상기 실시예 <3-1>과 동일한 방법으로 APP 및 DyrklA, PS1 및 DyrklA를 과발현시킨 후， 5_[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2, 6-나프티리딘 -8-카 르복시산 (CX-4945)을 농도별로 처리한 후 세포 추출물을 수득하여， 1차 항체로 항- APP 항체 , 항 -pAPP(T668) 항체 및 항 -Dyrkla 항체 또는 항 -PS1 항체 및 항 -Dyrkla 항체를 사용하여 단백질의 인산화 수준을 검출하였다. 발현양을 비교하기 위한 대 조군으로는 1차 항체로 항 -hnRNP A1 항체 및 항 -GAPDH 항체를 사용하여 상기와 동 일한 방법으로 hnRNPAl 및 GAPDH 발현 여부를 확인하였다.

그 결과 도 7에 나타낸 바와 같이， Tau 단백질 인산화와 마찬가지로, APP 및 PS1의 인산화가 감소하는 것을 확인하였다 (도 7) . 상기 결과들은 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티라딘ᅳ 8-카르 복시산 (CX-4945)와 DyrklA 억제를 명확히 보여주는 결과이고, 퇴행성 뇌질환에서 공통적으로 나타나는 신경병리인 노인반 (Amyloid plaque)과 신경섬유엉킴 (Neurofibrillary tangle)의 형성에 핵심적인 Tau, APP, PS1의 과인산화를 5-[(3- 클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6_나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 억제할 수 있음을 보여주는 중요한 결과이다.

<실시예 4> 칼시뉴린 /엔팻 (calcineurin/NFAT) 신호에서 5-[(3-클로로페닐) 아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA억제 효과 검중 본 발명자들은 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)이 DyrklA와 관련되어 다운증후군, 알츠하이머병의 발병에서 증요 한 역할을 하는 calcineurin/NFAT신호를 조절할수 있는지를 확인해 보았다.

구체적으로， Flag-NFATcl 융합 단백질을 발현하는 293T 세포를 Slied 8 웰 (ibidi)에 2X10 ⁴ 세포수로 배양하여 12시간 동안 배양한 뒤， 4% 파라포름알데하이 드 (paraformaldehyde) 용액으로 20분 동안 세포들을 고정시킨 후， PBS로 3회 플레 이트를 씻어준 뒤， 0.5%'Triton X-100 용액으로 5분 동안 반웅시키고 PBS로 3회 씻 어주었다. 그 후 2¾ BSA로 20분 동안 반웅시켜 다른 항체들이 결합하지 못하게 한 후 일차항체 (anti-Flag ： 시그마사)를 반웅한 후 다시 이차항체 (ant i mouse-Alexa fluor 488 ： 인비트로젠 사)를 반웅시킨 후, PBS로 3회 세척한 뒤 형광 현미경으로 확인하였다.

그 결과 도 8에 나타낸 바와 같이， 293T 세포에서 발현된 Flag-NFATcl 융합 단백질의 위치를 확인하면 주로 세포질에 머물러 있는 것을 볼 수 있다 (도 8 왼쪽 맨위). 이때, 세포에 칼슘 이온 운반체인 이오노마이신 (ionomycin, IM)을 처리하면 Flag-NFATcl는 핵에 축적한다 (도 ^' 8 오른쪽 위). 또한, DyrklA를 과발현시키면 Flag-NFATcl의 핵 축적을 차단하여 세포질에 머물러 있고 (도 8 왼쪽 가운데)， — DyrklA를 과발현시킨 후 IM을 처리하면 Flag-NFATcl는 세포질에 여전히 머물러 있 으며 (도 8 오른쪽 아래)， 이는 DyrklA의 calcineur in/NFAT 경로의 음성 조절자 (negat ive regulator)로써의 역할과 일치하는 결과이다. 또한， DyrklA를 과발현시 킨 후 IM을 처리한 후 5-[(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)을 처리하게 되면 DyrklA가 존재함에도 불구하고 Flag-NFATcl가 다 시 핵으로 재배치되는 것을 확인하였다 (도 8 왼쪽 아래) . 이러한 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘— 8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제효과는 NFATc의 전사활성을 통해서도 확인하였는데， 이를 위해 NFATc의 전사활성을 측정하는데 유용한 NFAT-reponsive element (NFAT-RE)를 포함하는 루시퍼라제 리포터를 사용하였다. NFAT-RE-루시퍼라제 리포터와 DyrklA를 293T 세포에서 과발현한 후 IM과 PMA(phorbol 12-myr i state 13-acetate)를 처리해 세포내 Ca ²⁺ 농도를 증가시키고， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리 딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 농도별 처리하였다.

그 결과 도 9에 나타낸 바와 같이， IM과 PMA를 처리한 경우에 루시퍼라제의 발현이 급격하게 증가되었고 (20배 이상)， 여기에 DyrklA를 과발현하니 루시퍼라제 발현이 1/3로 (5.4배 증가)로 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 이 조건에 5-[ (3-클 로로쩨닐)아미노] 벤조 [c]-2 ,6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 농도별로 처 리했을 때 루시퍼라제의 발현이 다시 급격히 증가함을 확인하였다. 심지어 10 uM을 처리하였을 경우 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 처리하지 않은 경우에 비해 7배 정도로 그 활성이 증가하는 것을 확인 하였다 (도 9) .

상기 결과들로 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]— 2 ,6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제 효능을 다시 한번 확인하였고， 다운증후군， 알츠하 이머병의 발병과 관련되는 NFAT신호 전달을 조절할 수 있음을 보여준다. <실시예 5> Minibrain 과발현 초파리 모델에서 5- [(3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2,6-나프티라딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA먹제 효능검증

상기 세포 실험에서 확인된 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티 리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제 효과를 개체 수준에서 확인하기 위해 DyrklA의 초파리 상동인자인 minibrain(mnb) 유전자를 클로닝하여 UAS/Gal4 시스템 을 이용한 조직특이적 유전자 과발현 유도를 실시하였다.

구체적으로, UAS-minibrain 형질전환 초파리를 조직 특이적으로 발현시키는 Gal4 형질전환 초파리와 교배하여 F1 세대의 배아를 모아 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리단 -8-카르복시산 (CX-4945)이 각각 1， 10， 100， 1000， 10000 , 25000 nM이 포함된 초파리 표준배지 (덱스트로으스 7.0% , 이스트 5.0%, 옥수수전분 3.5% , 한천아가 0.5%， propioni c acid 0.5%, Tegosept 0.7%)에서 배양한 후， 성층 의 날개의 표현형을 기준으로 CX-4945의 효과를 분석하였다.

그 결과 도 10a 내지 10b에 나타낸 바와 같이， 초파리 날개에 특이적으로 minibrain의 과발현을 유도하기 위해 날개 프로모터 (promoter )인 MS1096-Gal4 라인 과 UAS-minibrain(mnb)올 교배하여 나온 F1 세대에서는 90% 이상의 개체에서 5번 장축시맥 (L5 vein)의 발생 이상을 보이는 것으로 확인하였고 (도 10a) , 이러한 minibrain 과발현에 의한 짧은 시맥 표현형이 100 nM 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤 조 [c]-2 , 6-나프티리단 -8-카르복시산 (CX-4945)을 먹인 초파리에서 약 30% 억제되는 것을 확인하였으며， harmine의 경우에는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]_2 , 6_ 나프티리딘 -8-카르복시산 (CX— 4945) 최적 농도의 100배인 10000 nM 이상에서 40% 수 준의 minibrain 표현형 억제효과를 보이는 것을 확인하였다 (도 10b) . 또한， 상기 DyrklA의 Tau 단백질 인산화 촉진 및 5ᅳ[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 인산화 활성 억제 효과 를 개체수준에서 확인하기 위해， UAS/Gal4 시스템을 이용하여 초파리 눈 특이적 프 로모터인 GMR-gal4를 이용하여 minibrain 또는 Tau 단독으로 과별현 시키거나， minibrain과 Tau를 함께 과발현시킨 초파리를 5— [ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]- 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0 -4945)이 포함된 배지에서 키운 후에 초파리 성충 의 눈을 해부현미경 하에서 표현형을 분석하였다.

그 결과 도 11a에 나타낸 바와 같이， minibrain 또는 Tau를 발현할 경우에 는 초파리 눈 발생이 변화가 생기고ᅳ minibrain 및 Tau를 동시에 발현시킬 경우에 는 이러한 변화가 더 심해지는 것을 확인하였으며， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 처리한 경우에는 minibrain 및 Tau에 의한 변화가 유의하게 억제되는 갓을 확인하였다 (도 11a) . 또한， 신경계 특이적인 elav-Gal4 프로모터 라인을 이용하여 신경계에 minibrain을 과발현 시킨 후， 1령기 유충으로 깨어나기 전인 24시간 이내의 F1 세 대 배아를 모아서 « 포르말린으로 고정 후에， 신경계 구조를 확인할 수 있는 형광 단백질인 synaptobrevin-GFP를 함께 발현시켜 형광공초점현미경 하에서 관찰하여 신경계 구조 및 형태를 분석하였다. 또한， 신경계 특이적으로 mininbrain을 과발현 시킨 후， 성층이 깨어나기까지 10일 이상 배양 후에 깨어난 성층을 개수하여 성충 의 치사율을 확인하였다.

그 결과 도 lib 내지 도 11c에 나타낸 바와 같이， minibrain의 과발현에 의 해 중추신경계 및 말초신경계의 발생 이상이 확인되었고， 부모 세대에 5-[ (3-클로 로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)올 7일간 먹인 후 교배를 하여 나은 F1 세대의 배아에서는 minibrain에 의한 신경계 발생 이상이 현 저하게 억제되는 것을 확인하였으며 (도 lib) , 신경계 특이적 minibrain 과발현은 신경계 발생 이상으로 70% 이상의 성충 치사율을 보이는 데 반해, 5- [ (3-클로로페 닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 처리한 개체는 65% 이상 치사율이 감소하는 것을 확인하였으므로， 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)이 초파리 DyrklA인 minibrain의 저해제 로 작용하는 것을 확인하였다 (도 11c) . <실시예 6> DyrklA 과발현 마우스에서 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-

2, 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)의 DyrklA 억제 효능 검증

5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]— 2，6-나프티리딘-8-카르복시산(0(-4945) 이 고등동물 수준에서도 DyrklA 억제 효능을 보이는지 확인하기 위해서 다운증후군 을 모방하는 DyrklA 과발현 마우스를 기촌에 알려진 방법 (Ahn et al .， 2006 Neurobiol Di s)으로 제조하여 실험을 수행하였다.

그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이， 이미 알려진 것과 마찬가지로 정상 마 우스에 비해서 DyrklA 과발현 마우스의 해마 (hippocampus)에 존재하는 Tau 단백질 의 T212 위치의 인산화 정도가 현저히 높게 나타나는 것을 확인하였고， 5-[ (3-클로 로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르복시산 (CX-4945)을 75 mg/kg 농도 로 구강 투여한 30분 후 DyrklA 과발현 마우스의 해마에 존재하는 Tau 단백질의 인 산화는 대조군인 vehicle을 투여한 것에 비해 현저하게 낮게 나타나는 것올 확인하 였으며， 이는 정상 마우스에서 나타나는 수준과 비슷한 것을 확인하였다 (도 12) . 이러한 결과는 5-[ (3-클로로페닐)아미노] 벤조 [c]-2 , 6-나프티리딘 -8-카르 복시산 (CX-4945)이 마우스 모델에서 혈액뇌관문 (blood-brain barr ier ; BBB)를 효과 적으로 통과해서 DyrklA을 억제하는 것을 보여준다.