【발명의 명칭】

락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

【기술분야】

본원 발명은 유산균인 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococa/s chungangensis)^ 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물에 관한 발명으로, 구 체적으로， 본 발명에 따른 조성물은 대식세포로부터 Ni tr i c oxi de 및 염증성 사이 토카인의 방출을 억제하며， 비만세포로부터 히스타민 또는 알레르기를 유발하는 사 이토카인의 발현을 억제하여 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 치료에 사용될 수 있다. 또한， 본 발명에 ΐ다른 조성물은 아토피 피부염의 2차 감염 등을 유발하는 미생물인 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균력을 나타내 세균 감염의 치료에 사용될 수 있다.

【배경기술】

본 출원은 2015년 3월 27일에 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2015-0043602 호를 우선권으로 주장하고， 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다. 염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질， 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 대하여 국소적으로 나타 나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상조직 과 이동하는 세포 (migrat ing cel l s)로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 와하여 촉발되며， 이들 화학매개인자들은 염증과정의 형태에 따라 다양한 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증반응을 통하여 발병 요인을 중화시키거나 제거 하고 상한 조직을 재생시켜서 정상적인 구조와 기능을 회복시키지만， 그렇지 못한 경우에는 만성 염증과 같은 질병 상태로 진행되기도 한다. 또한， 꽃가루와 같이 무 해한 물질이나 천식， 류마티스성 관절염과 같은 자가면역반웅에 의해 부적절하게 염증이 촉발되는 경우에는 방어반웅 자체가 오히려 조직을 손상시키므로 염증성 질 환 예방 또는 치료용제가 필요하게 된다. 거의 모든 임상질환에서 염증반웅을 관찰 할 수 있고, 이들 염증 질환 중에는 항생제 투여로 원인적 치료가 가능한 세균성 질환도 있지만, 대부분은 그 발병이 자가면역반응에 의한 조직손상에 기인하므로 특이적 치료법이 없는 난치병으로 알려져 있다. 이러한 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치 료용제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용제로 구분되며， 이중 대부분의 합성 염증성 질환 예방 또는 치료용제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많은 단점이 있다 . 즉， 염증 질환을 치료하기 위하여 적당한 비스테로이드성 염증성 질환 예방 또는 치료용 약물 (NSAIDs)을 사용 하여 염증을 완화시키며， 염증이 심하거나 NSAIDs의 효능이 없으면 스테로이드 제 제를 사용하며， 난치성인 경우 면역 억제제나 수술요법을 실시하게 된다. 이 경우 사용되는 NSAIDs는 주로 사이클로옥시제나제 (cyclooxygenase ; COX)를 억제하여 염 증반응에 관여하는 프로스타글란딘 (prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 염증성 질환 예방 또는 치료용 작용을 나타내지만， 위장 장애， 간장애， 신장기능 장애 등 의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어려운 문제점이 있다. 한편， 알레르기란 광범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반웅에 근거 한 생체의 전신적 또는 국소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전 에 따라 I， Π , m 및 IV형으로 분류되며, 이 중에서 즉시형 과민반응에 속하는 I형 알레르기가 임상에 있어서 중요한 부분을 차지하고 있으며， 아토피성 피부염 , 알레르기성 비염， 기관지 천식， 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다.

1953년경 I형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 일어나며, 이러한 비만 세포의 과립에는 염증반웅의 매개체인 히스타민 (histamine)이 다량 함유되어 있음 이 알려졌다. 알레르기 반응이 일어날 때 비만세포에서 히스타민이 방출되는 현상 이 발견된 후에 이 기전을 규명하던 중， 이시자까 ( Ishizaka)의 immunoglobul in E(IgE)의 발견은 비만세포가 즉시형 알레르기 반웅에 관여함을 밝히는 중요한 계기 가 되었다. 즉, 비만세포 표면에는 IgE 고친화성 수용체가 있으며， 이 수용체에 IgE가 결합한 후 다시 항원이 결합하여 가교가 형성되면 탈과립반응이 유발되어 과 립 내용물인 히스타민， 세로토닌 (serotonin) , 브라드키닌 (bradykinin) 등과 같은 합성되어 저장되어 있던 매개물질 (preformed mediator)과, 프로테아제 (protease)， 프로테오글리칸 (proteoglycan) 등이 」동시에 방출되는 것이다 ( Ishizaka, Hosp Pract .； 12(1)：57-67, 1977) . I형 알레르기는 비만세포의 활성화에 의해 방출되는 과립내용물인 활성아민 류와 프로테아제 (protease)류, 세포막 인지질에서 생성되는 지질성 매개체, 면역반 응의 조절인자로 잘 알려진 IL-3(비만세포 증식인자)， IL-4, IL-5과 같은 사이토카 인 (cytokine)인 등이 관련되어 일어나는 생체의 자연스러운 현상이라고 종합할 수 있다 (Gal l i SJ et al . , Curr Opin I誦 unol . ； 3(6) :865-872， 1991； Br adding P et al . , J Immunol . ; 151(7) :3853-3865， 1993) . 또한, 알레르기 항원에 피부가 노출되면 랑게르한스 세포의 표면에 있는 IgE 수용체에 항원 특이 IgE가 결합하고， 이 항원의 표면에 있는 T세포에 전달되어 T세 포가 활성화 된다. 이 경우 정상과 달리 알레르기성 피부질환， 특히， 아토피 피부 염에서는 Th2가 활성화되어 IL-4, IL-5, IL-6 , IL-8, IL-10 및 IL-13 등의 사이토 카인이 분비되고, 그 결과 B 세포에서 IgE의 생성이 촉진되고， 활성화되어있는 비 만세포의 탈과립을 촉진시켜 사이토카인과 히스타민이 유리된다 (Baruah C. C. et al .， Pharmacol Res .； 38 (6) :487-92, 1998； Karadag C. H. et al . ,Braz J Med Biol Res . ;33(3) :327-330, 2000； Paol ini R. et al . , Nature . ;353(6347) :855-858, 1991) . 현재 임상적으로 사용되고 있는 알레르기 치료 약물은 작용기전에 따라 탈과 립저해제, 화학전달물질 작용억제제, 화학전달물질 합성저해제 등으로 대별할 수 있다. 이들 약물들 중 화학전달물질 작용억제제와 화학전달물질 합성저해제의 경우 약물작용점이 비교적 확실하지만， 탈과립저해제의 경우 그 작용기전이 불분명한 상 태이며, 또한 이들 약물들은 장기간 투여에 의해 여러 가지 부작용을 초래할 수 있 다. 이에 따라 I형 알레르기의 치료를 위해 비만세포에서 이들 생리활성 물질의 생 산 및 유리에 대한 작용기전을 밝히고， 장기복용에 따른 부작용을 최소화할 수 있 는 물질의 개발이 대단히 중요하다고 할 수 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

이에 본 발명의 발명자들은 유산균인 락토코커스 중앙젠시스로부터 치료효과 가 높으면서도 부작용이 적은 염증성 질환 또는 알레르기성 질환의 치료제를 찾고 자 연구하던 중, 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스가 염증 또는 알레르기와 관계된 사이토카인 및 케모카인의 생성을 현저히 억제하고 염증 주요 인자인 Nitric oxide 및 Prostaglandin E ₂ 의 분비를 억제하는 효과가 뛰어나며， 알레르기 주요 인자인 β

-hexosaminidase 및 Hi stamine의 분비를 억제하는 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 아 토피 유발 동물모델에 적용하였올 때 기존에 사용되어오던 공지의 치료제와 동일한 수준으로 치료효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 따라서， 본 발명의 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( sc oraca/s chungangensis, 기탁번호: KCTC 12684BP)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물올 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococ /s chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ac ococras chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 화장료 조성물을 제공하는 것이 다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococci/s chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 피부 외용제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococa/s chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococcz/s chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 화장료 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococa/s chungangensis) 를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 피부 외용제를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensi s) 의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangens i s ) 를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제 공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangens i s ) 의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세균 감염의 치료 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangens i s ) 를 유효성분으로 포함하는 세균 감염의 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공 하는 것이다.

【기술적 해결방법】

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 Lactococcus chungangens i s , 기탁번호: KCTC 12684BP)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococ /s chungangens is)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 식품 조성물을 제 공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 증앙젠시스 ( ac ococ /s chungangens is ^ 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 ( ac coc /s chungangens is)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 피부 외용제를 제 공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 Lactococcus chungangensis)를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 약학적 조성물을 제공 한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 ( ac coca/s chungangensis)를 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 식품 조성물을 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ca/s chungangensis)^ 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 화장료 조성물을 제공 한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococays chungangensis)^ 유효성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 피부 외용제를 제공한 다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 염증 성 질환의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세균 감염의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis)를 유효성분으로 포함하는 세균 감염의 치료용 제제를 제조하기 위 한 용도를 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 ( scfococa s chungangensis)를: 유효성분으 로 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 또한， 본 발명은 상기 락토코커스 중앙젠시스 ( ac oa^cws chungangens i s~ ^ 기탁번호가 KCTC 12684BP 인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 상기 본 발명의 균주인 락토코커스 중앙젠시스는 폐수처리장의 폐수에서 분 리된 균주로서， 분류학적으로 그람 -양성 구균에 해당하는 균주이다. 본 균주는 본 발명의 발명자가 새로이 발견한 신균주로서 세포 형태학적 및 생화학적 시험 결과 락토코커스 ( oa¾ ;s)속에 속하는 균주로 동정이 되었으며， 2008년에 한국 미생 물자원센터에 기탁되었다 (기탁번호: KCTC 12684BP) . 또한， 락토코커스 중앙젠시스 는 그람-양성구균으로 포자와 균사체를 형성하지 않으며， 짧은 체인 형태 또는 불 규칙한 클러스터의 형태로 단독 또는 쌍으로 발생하는 특징이 있으며, 본 균주에 대한 보다 구체적인 설명은 " Internat ional Journal of Systemat i c and Evolut ionary Mi crobiol ogy (2008)， 58， 18441849" 를 통해 확인할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 락토코커스 중앙젠시스 균주를 비롯하여， 균주의 배양액 또는 배양 상등액도 염증성 질환에 그 효과를 나타내므로， 상기 균주， 이의 배양액 또는 배양 상등액을 포함하는 염증성 질환의 치료용 약학적 조성물을 권리 범위로 포함한다. 상기 배양액에서 락토코커스 중앙젠시스를 제거할 수 있고， 바람 직한 배양액은 원심 분리 후 상층액이다. 배양액은 배양액의 농축액 및 상기 배양 액의 건조물을 모두 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 락토코커스 중앙젠 시스 생균, 파쇄된 세포벽 분획， 사균 또는 건조균을 유효성분으로 포함할 수 있으 며, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 배양하는 방법은 특별히 한정되지 않고， 정규적안 방법으로 할 수 있다. 예컨대， 미생물이 증식가능한 배지에서 배양하고, 원심 분리 등의 수단을 이용하여.균체를 회수할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면， 대식세포인 RAW264.7 세포에 락토코커스 중앙젠 시스를 처리한 후 24시간 동안 배양하였더니， LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 Nitric oxide(NO)의 생성량이 현저하게 줄어들고, 프로스타글란딘 E ₂ (PGE ₂ ) 생성량 역시 같은 양상을 보이는 것을 확인한 바， 락토코커스 중앙젠시스가 염증반웅을 억 제하는 효과가 있음올 알 수 있었다 (실시예 2-2) . 또한， 본 발명의 다른 실시예에 따르면， DNCB의 처리에 의해 유도된 아토피 성 동물모델에서， 락토코커스 중앙젠시스를 10 ⁹ eel ls/mouse로 주 2회， 총 4주간 경구 투여 또는 피부도포한 결과， 염증반응과 관계된 사이토카인인 IL-4, IL-5, IL-12, IFN- γ， TNF- α 및 TARC 의 혈중농도가 현저히 감소하는 것을 확인한 바， 락토코커 스 중앙젠시스가 염증성 질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있었 다 (실시예 4-5) . 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며， 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분， 젤라틴화 전분, 미결정셀를로오스, 유 당, 포비돈， 콜로이달실리콘디옥사이드， 인산수소칼슘， 락토스， 만니를， 엿, 。라 비아고무， 전호화전분， 옥수수전분, 분말셀를로오스， 히드록시프로필셀를로오스， 오파드라이， 전분글리콜산나트륨， 카르나우바 납， 합성규산알루미늄， 스테아린산， 스테아린산마그네슘， 스테아린산알루마늄, 스테아린산칼슘， 백당， 덱스트로스, 소 르비를 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1-90 중량부로 포함되는 것이 바람직하나 이에 제 한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데， 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제, 증량제， 결 합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 회석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함 되며， 이러한 고형제제는 락토코커스 중앙젠시스에 적어도 하나 이상의 부형제 예 를 들면， 전분， 칼슘 카보네이트， 수크로오스, 락토오스 또는 젤라틴 등을 섞어 조 제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제 들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제 및 시럽 제 둥이 해당되는데 흔히 사용되는 단순회석제인 물， 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동 결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜， 폴리에틸렌 글리콜， 을리브 오일과 같은 식물성 기름， 에틸올 레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용 될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크 로골, 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 한편， 주사제에는 용해제， 등장화제, 현탁화제， 유화제， 안정화제， 방부제 둥과 같은 종래의 첨가제가포함될 수 있다. 또한， 본 발명의 치료용 조성물은 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체， 부 형제 또는 안정화제 (Remington: The Science and Pract i ce of Pharmacy, 19th Edi t ion, Al fonso, R. , ed, Mack Publ i shing Co . (Easton, PA : 1995) )를 추가로 포 함할 수 있다. 허용가능한 담체， 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에 서 수용자에게 비독성이고, 완층용액, 예를 들어 인산， 시트르산 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제 ; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단 백질， 예를 들어 혈청 알부민， 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 증합체, 예를 들 어 폴리비닐피를리돈; 아미노산， 예를 들어 글리신， 글루타민， 아스파라긴, 아르기 닌 또는 리신; 단당류, 이당류， 및 글루코스， 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트제， 예를 들어 EDTA; 당 알콜， 예를 들어 만니를 또는 소르비 틀; 염 -형성 반대이온， 예를 들어 나트륨; 및 (또는) 비이온성 계면활성제， 예를 들 어 트원, 플루로닉스 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이， 몸무게， 성 별， 투여형태， 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며， 알반적으로 0.01

- 100 mg/kg/day이며， 바람직하게는 0. 1 - 20 mg/kg/day이며， 더욱 바람직하게는 5

- 10 mg/kg/day일 수 있다. 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 간격으로 분 할 투여할 수도 있다. 본 발명은 또한， 상기 염증성 질환은 염증성 피부질환， 알레르기성 질환， 크 론씨 질환 (Crohn' s desease) 및 궤양성 대장염과 같은 염증성 장 질환， 복막염, 골 수염， 봉소염， 뇌막염， 뇌염,췌장염， 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 낭포성 섬유 증， 뇌졸중， 급성 기관지염， 만성 기관지염， 급성 세기관지염， 만성 세기관지염， 골관절염， 통풍, 척추관절병증， 강직성 척추염， 라이터 증후군, 건선성 관절병증， 장질환 척추염， 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반웅성 관절병증, 감 염성 관절염， 후-감염성 관절염， 임균성 관절염， 결핵성 관절염 , 바이러스성 관절 염， 진균성 관절염， 매독성 관절염， 라임 병， '혈관염 증후군 '과 관련된 관절염， 결절성 다발동맥염， 과민성 혈관염, 루게릭 육아종증， 류마티스성 다발성근육통， 관절 세포 동맥염， 칼슘 결정 침착 관절병증， 가성 통풍， 비 -관절 류마티즘， 점액 낭염, 건초염， 상과염 (테니스 엘보)， 신경병증성 관절 질환 (charco and joint ) , 출 혈성 관절증 (hemarthrosic) , 헤노흐-쉔라인 자반병， 비후성 골관절병증， 다중심성 세망조직구종， 수르코일로시스 (surcoi losis) , 혈색소증， 겸상 적혈구증 및 기타 혈 색소병증， 고지단백혈증， 저감마글로불린혈증， 가족성 지중해열， 베하트 병， 전신 성 홍반성 루푸스, 재귀열， 건선， 다발성 경화증， 패혈증， 패혈성 쇼크， 다장기 기 능장애 증후군, 급성 호흡곤란 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstruct ive pulmonary disease) , 급성 폐손상 (acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애 (broncho-pulmonary dysplasia)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특 징으로 하는 조성물을 제공하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 상기 알레르기성 질환은 알레르기성 피부질환， 아토피성 피 부염， 기관지 천식， 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염， 알레르기성 중이염, 두 드러기, 천식 및 아나필락시 쇼크 (anaphylact ic shock)로 이루어진 군에서 선택되 는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하나， 이에 제한되는 것은 아니 다. 본 발명에서 사용되는 용어 "알레르기" 는 어떤 외래성 물질과 접한 생체가 그 물질에 대하여 정상과는 다른 반응을 나타내는 현상을 의미한다. 알레르기란 광 범위하고 복잡한 병리적 현상의 총화로 면역반응에 근거한 생체의 전신적 또는 국 소적인 장애이다. 인체에 나타나는 알레르기는 면역 기전에 따라 I， Π , m 및 IV 형으로 분류되며， 이 중에서 즉시형 과민반웅에 속하는 I형 알레르기가 임상에 있 어서 중요한 부분을 차지하고 있으며, 아토피성 피부염， 알레르기성 비염, 기관지 천식, 고초열 및 화분증 등이 여기에 속한다. 또한， 상기 알레르기 질환은 비만세포를 매개로 하는 알레르기 질환일 수 있 으며, 구체적으로는 락토코커스 중앙젠시스는 비만세포에서 탈과립을 억제함으로써 알레르기 질환에 그 효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 실시예에 따르면， 비만세포인 HMC-1 세포에 락토코커스 증앙젠시 스를 처리한 후 탈과립을 유도하는 compound 48/80을 처리한 결과， 비만세포의 활 성화와 탈과립을 나타내는 주요인자인 β -hexosaminidase의 분비가 억제되었고, 알 레르기성 질환을 유발하는 가장 중요한 인자 중 하나인 히스타민의 분비 또한 현저 히 억제되는 것을 확인하였다 (실시예 3) . 또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 락토코커스증앙젠시스를 경구투여 또는 피부도포한 BALB/c 마우스 또는 NC/Nga 마우스 혈청에서 알레르기성 질환을 매개하는 사이토카인인 IgE의 발현량을 측정한 결과, 양성대조군인 tacrol imus와 비교해 동등한 정도로 IgE의 발현을 억제하는 효능이 있음을 확인하여 (실시예 4- 4) , 락토코커스 중앙젠시스가 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용 될 수 있음을 알 수 있었다. 특히， 본 발명에 따른 락토코커스 중앙젠시스는 독성이 거의 없고， 항염증 및 항알레르기 효과에 의한 알레르기성 피부질환의 예방 및 치료 효과를 나타내며， 알레르기성 염증반웅 및 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 효과가 우수하여 아 토피성 피부염을 포함하는 알레르기성 피부질환에 탁월한 효과가 있으므로 락토코 커스 증앙젠시스를 포함하는 약학적 조성물은 알레르기성 피부질환을 예방 및 치료 하는데 유용하게 사용될 수 있다. 아토피 피부염은 흔히 태열이라 부르는 영아기 습진으로부터 시작하며, 급성 기에는 피부가 가렵고， 붉어지거나 붓거나 좁쌀처럼 돋아 오르거나， 작은 물집이 잡히거나 습하고 딱지가 앉는 등의 증상을 보이며, 만성기에는 가렵고, 피부가 딱 딱하게 되거나 두꺼워지거나 줄이 가거나 쌀가루 같은 비늘이 앉거나 검어지거나 또는 희게 탈색되는 등의 증상을 보인다. 아토피 피부염 환자의 혈액검사와 피부조직검사 소견을 보면 대부분 혈액에 는 IgE와 단핵구에 IgE 수용체 I 발현 및 호산구가 증가되어 있으며, 피부에는 IgE 수용체가 발현된 항원전달세포의 증가, 활성화된 T 세포， IL-5, IL-10, IL-13 및 호산구가 증가 되어 있다. 아토피 피부염 환자들은 면역학적 이상반응 즉, 환경적 항원에 대한 즉시형 과민반웅 증가， IgE와 IgE 수용체 발현 증가， 항원 특이성 T 세포와 Th2 세포의 증가가 나타나며， 상기 질환이 만성이 될 경우, Thl 세포가 증 가하는 이원성 사이토카인 프로파일이 나타난다. 또한 표피의 랑게르한스 세포와 기억 T 세포가 활성화되고， 수지상 세포와 호산구 증가， 비만세포가 활성화된다. 본 발명의 실시예에 따르면， DNCB에 의해 아토피성 피부염이 유도된 BALB/c 마우스 및 NC/Nga 마우스 동물모델에서 락토코커스 중앙젠시스 경구투여군， 락토코 커스 중앙젠시스 피부 도포군 및 양성대조군인 tacrol imus 피부 도포군의 치료효과 를 관찰한 결과, 육안으로 관찰되는 피부의 병리 상태인 각질， 홍반， 삼출성 가피 의 형성과 출혈， 부종 등의 증상이 락토코커스 중앙젠시스 경구투여군 및 tacrol imus 피부도포군에서 현저히 개선되었으며, 락토코커스 중앙젠시스 피부 도 포군에서도 천천히 피부상태가 개선되는 것을 확인하였다. 또한， 마우스의 긁는 횟 수 평가에서도 락토코커스 경구투여군은 tacrol imus 처리군과 동일한 수준으로 긁 는 현상이 현저히 감소함을 확인하였다 (실시예 4-2) . 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 락토코커스 중앙젠시스가 아토피성 피부 염과 관계된 케모카인 및 사이토카인 유전자의 발현에 미치는 영향을 아토피성 피 부염 동물모델의 피부조직에서 평가한 결과, 락토코커스 중앙젠시스 경구투여군과 양성대조군인 tacrol imus 피부도포군의 피부조직 내 IL-4, IL-5, IL-12 , IFN- γ , TNF- α 및 TARC의 mRNA 발현량아 감소한 것올 확인하였으며 (실시예 4-5)， 심장에서 채취한 혈액 샘플에서 상기 케모카인 및 사이토카인 단백질의 발현량이 현저히 감 소되어 있는 것을 확인한 바 (실시예 4-5)， 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스는 아 토피성 피부염 치료제로 사용되고 있는 tacrol imus와 유사한 수준으로 효과를 줄 수 있어， 아토피성 피부염을 포함한 알레르기성 피부질환의 예방 또는 치료제로 사 용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 염증성 질 환의 치료용 식품 조성물을 제공한다. 상기 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 식품 조성물은 락토코커스 중앙젠시스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고， 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용 될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "식품" 은 육류, 소시지， 빵， 초콜릿， 캔디류, 스넥류， 과자류， 피자, 라면, 기타 면류， 껌류， 아이스크림류를 포함한 낙농제품， 각종 스프, 음료수, 차， 드링크제， 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통 상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사 용되는 용어 "건강기능식품' '이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용 하여 정제， 캅셀， 분말, 과립， 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말 한다. 여기서 '기능성 '이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거 나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발 명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하 며 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제 조될 수 있으며， 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발 생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나， 본 발명의 건강기 능식품은 항염증제 또는 항알레르기제 등의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취 가 가능하다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제， 비타민, 전해질, 풍미제， 착색제， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제， 글리세린， 알코올， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스， 괴:일주스 음료 및 야채 음료의 제조 를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 흔합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물

100 중량부당 0.01-0Λ 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이나， 이에 제한되 지 않는다. 또한， 본 발명의 식품 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 과 당과 같은 모노사카라이드， 말토스， 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비를, 에리트리틀 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴， 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나， 사카 린， 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 lOOml^ 일반적으로 약 0.01~0.0½, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 식품 조성물 중 락토코커스 중앙젠시스의 흔합량은 그의 사용 목 적 (예방， 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로， 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 식품 또는 음료의 제조시에 상기 특정식품 소재 1 g (또는 ) 당 본 발명의 균을 1 X 10 ⁷ 내지 1 X 10 ⁹ 개 (균 수) 첨가하고， 바람직하게는 1 X 10 ⁸ 내지 5 X 10 ⁸ 개의 양으로 첨가한다. 또한， 본

5 10 발명의 락토코커스 중앙젠시스 식품 조성물의 1일 섭취량은 1 X 10 내지 1 X 10

CFU/kg, 바람직하게는 1 X 10 ⁵ 내지 1 X 10 ⁷ CFU/kg이고， 섭취는 하루에 한 번 섭취할 수도 있고， 수희 나누어 섭취할 수도 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 균주의 유효용량은 상기 약제학적 조성물의 유효용량에 준해서 사 용할 수 있으나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며， 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하 다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 염증성 질 환의 치료용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 염증성 질환은 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명에 따른 상기 화장료 조성물에 있어서, 이를 포함하는 화장품으로서 의 제형으로는 락토코커스 중앙젠시스에 추가로 지방 물질, 유기용매， 용해제 및 겔화제， 연화제, 항산화제， 현탁화제， 안정화제, 발포제 ( forming agent ) , 방향제， 계면활성제， 무， 이온형 또는 비이온형 유화제， 층전제, 금속이온 봉쇄제 및 킬레 이트화제， 보존제， 비타민， 차단제， 습윤화제, 필수오일, 염료， 안료， 친수성 또는 친유성 활성제， 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도 입될 수 있다. 본 발명 조성물의 화장품으로서의 구체적인 제형으로는 스킨로션, 스킨 소프 너， 스킨토너， 아스트린젠트， 로션， 밀크로션， 모이스처 로션， 영양로션， 맛사지크 림， 영양크림， 모이스처 크림， 핸드크림, 에센스， 영양에센스， 팩, 비누， 샴푸， 클 렌징폼， 클렌징로션， 클렌징크림， 바디로션， 바디클렌저， 유액， 프레스파우더， 루 스파우더， 아이새도 등의 제형을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 염증성 질 환의 치료용 피부 외용제를 제공한다. 상기 염증성 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명의 조성물이 피부 외용제로 제조되는 경우， 본 발명의 조성물은 상술 한 락토코커스 중앙젠시스 조성물 뿐만 아니라， 피부 외용제에 통상적으로 이용되 는 성분들을 포함하며， 예컨대 항산화제, 안정화제， 용해화제， 비타민, 안료 및 향 료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다. 또한， 본 발명의 조성물은 락토코커스 중앙젠시스 이외에， 그 작용을 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사 용되어오던 피부 습윤제， 피부 밀폐제 및 세라마이드 함유 보습제를 함께 흔합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 피부 외용제는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로 도 제조될 수 있으며， 예를 들어， 용액，현탁액， 유탁액， 페이스트， 겔， 크림， 로 션， 파우더， 비누， 계면활성계 -함유 클린징， 오일， 분말 파운데이션，유탁액 파운데 이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이로 제형화될 수 있으나， 이에 한정되는 것은 아 니다. 보다 상세하게는， 유연화장수， 영양 화장수， 영양 크림, 마사지 크림, 에센 스, 아이 크림， 클렌징 크림， 클렌징포음， 클렌징 워터， 팩， 스프레이 또는 파우더 의 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물 성유， 식물성유, 왁스， 파라핀， 전분， 트라칸트， 셀를로오스 유도체， 폴리에될렌 글리콜， 실리콘， 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는산화아연이 이용될 수 있다. 본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토 스, 탈크, 실리카， 알루미늄 히드록시드， 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더 가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카 본， 프로판 /부탄또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 제형이 용액 또는유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매， 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고， 예컨대 물， 에탄올， 이소프로판을， 에틸 카보네이 트， 에틸 아세테이트, 벤질 알코을, 벤질 벤조에이트， 프로필렌글리콜， 1 ,3-부틸글 리콜 오일， 글리세를 지방족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물， 에탄올또는 프로 필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제，에톡실화이소스테아릴 알코올， 폴리옥시에틸렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미소결정 성 셀를로오스， 알루미늄 메타히드록시드， 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트가 이용 될 수 있다. 본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지 방족 알코올 설페이트， 지방족 알코을 에테르설페이트， 설포숙신산 모노에스테르， 이세티오네이트， 이미다졸리늄 유도체， 메틸타우레이트, 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트， 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄을아미드， 식물성 유， 라놀린유도체 또는 에특실화 글리세롤 지방산 에스테르가 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococc s chungangensis)^ 유효 성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스 ( ac ococ /s chungangensis^ 유효 성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시 유효 성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 락토코커스 중앙젠시스 (Zac ococ /s chungangensis)를: 유효 성분으로 포함하는 세균 감염 치료용 피부 외용제를 제공한다. 본 발명의 일실시예에 따르면， 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분 으로 포함하는 조성물은 스타필로코커스 아우레우스에 대해 항균작용을 나타냄으로 써， 세균 감염에 대한 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있었다 (실시예 5) . 상기 세균은 구체적으로 유해 미생물인 대장균 (<57> E. col i ) , 살모넬라 티피 뮤리움 (Salmonel la typhimur ium) , 스타필로코커스 아우레우스 (Staphyl lococcus aureus) , 칸디다 균 (Candidaalbican)， 흙곰광이 (Aspergi 1 lus niger ) 또는 여드름균 (Pro i on i bacter ium acnes)일 수 있고， 바람직하게는 스타필로코커스 아우레우스일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 한편， 이에 제한되는 것은 아니나 상기 세균 감염은 아토피 피부염을 갖는 환자의 피부를 통해 세균이 침투하여 감염이 되는 것을 의미할 수 있다. 아토피 피 부염을 갖는 환자들은 피부가 매우 건조해지고 가려워져서 계속해서 긁게 되고， 이 로 인해 피부에 상처가 발생한다. 이러한 상처를 통해 세균, 바이러스와 같은 유해 물질이 침입해 2차 감염이 나타나 염증이 발생하거나 심하면 오한， 발열 등의 증상 을 동반하기도 한다. 이러한 아토피 피부염에 의한 2차 감염을 유발하는 가장흔한 세균이 스타필 로코커스 아우레우스 (5 ?AK/oa?cras a e s)이다.스타필로코커스 아우레우스는 정 상인의 단지 5»에서만 존재하는 반면， 아토피 피부염 환자의 90% 이상에서 피부 병 변을 콜로니화하는 것으로 밝혀져 있다 (Leyden, JE, Marples, RP and Kligman AM Br. J. Dermatol. 90:525-530,1974). 상기 박테리아는 독소 (예를 들면， 엔테로특신 A, B, C 및 D; 독성 쇼크 증후군 독소)를 방출하는 것을 통해 아토피 피부염 환자 의 악화와 만성화에 유력한 것으로 보여지며, 독소의 대부분이 자연계에서 고 항원 성이어서 피부에서의 염증 반웅을 악화시킨다 (Leung, DYM et al J. Clin. Invest . 92 1374-80, 1993) . 어린이에 대한 한 특정 연구는， 질환의 심각성이 독소를 생성 하는 균주에 의한 콜로니화와 관련이 있음을 보여주는 것으로서， 81%의 환자가 스 타필로코커스 아우레우스 콜로니화를 가지고 있음 (대조군은 4%)을 확인하였다 (Bunikowski , R et al J. Allergy Clin Immunol . 105(4) :814-819, 2000). 따라서， 스타필로코커스 아우레우스에 대해 항균활성을 나타내는 본 발명에 따른 조성물이 아토피 피부염의 증상을 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라， 아토피 피 부염에 따른 2차 감염을 예방 또는 개선할 수 있다는 점에서 매우 중요하다. 상기 약학적 조성물， 식품 조성물， 화장료 조성물 및 피부 외용제에 대해서 는 상기에서 설명한 바와 같다. 본 발명은 락호코커스 증앙젠시스 (Lactococcus chungangens i s )의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 염증성 질환의 치료 방법을 제공 한다. 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangens is)를 유효성분으 로 포함하는 염증성 질환의 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangens is)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 세균 감염의 치료 방법을 제공한 다. 본 발명은 락토코커스 중앙젠시스 (Lactococcus chungangensis)를 유효성분으 로 포함하는 세균 감염의 치료용 제제를 제조하기 위한 용도를 제공한다. 본 발명의 상기 '유효량' 이란 개체에게 투여하였을 때， 세균 감염 또는 염 증성 질환의 개선시키는 양을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하거 나， 실질적으로 예방하거나, 또는 상태를 개선시키는 양을 포함할 수 있다. 상기 ' 개체' 란 동물, 바람직하게는 포유동물， 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며， 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 상기 개체는 치료가 필요한 환 자 (pat ient ) 일 수 있다.

본 발명의 상기 '치료' 는 세균 감염 또는 염증성 질환의 증상을 개선시키는 것을 포괄적으로 지칭하고， 이는 이러한 질환을 치유하거나， 실질적으로 예방하거 나， 또는 상태를 개선시키는 것을 포함할 수 있으며， 세균 감염 또는 염증성 질환 으로부터 비롯된 한 가지 증상 또는 대부분의 증상을 완화시키거나， 치유하거나 예 방하는 것을 포함하나， 이에 제한되는 것은 아니다.

【유리한 효과】

따라서 , 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 조성물 은 염증성 질환에 대한 예방 또는 치료효과가 우수하며， 염증 주요 인자인 Nitric oxide 및 Prostaglandin E ₂ 의 분비를 억제하는 효과가 뛰어나며, 알레르기 관련 주 요인자인 ^-hexosaminidase 및 Histamine 분비를 억제하는 효과가 뛰어날 뿐만아 니라， 피부질환관련 사이토카인 및 케모카인의 생성을 현저하게 억제하여， 염증성 질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명에 따른 조성물은 아토 피 피부염의 2차 감염 등을 유발하는 미생물인 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균력을 나타내 세균 감염의 예방또는 치료에 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 락토코커스 중앙젠시스의 세포 독성 평가 (세포 생존 능력 측정)를 확 인한 결과이다. 도 2는 락토코커스 중앙젠시스를 대식세포에 처리하여 N0(Ni tric oxide)의 생성량을 측정한 결과이다. 도 3은 락토코커스 중앙젠시스를 대식세포에 처리하여 PGE ₂ (Prostaglandin E ₂ )의 생성량을 측정한 결과이다.

도 4A는 락토코커스 중앙젠시스를 비만세포주인 HMC-1 세포에 처리하여 β ^~ hexosaminidase 의 분비를 측정한 결과이다. 도 4B는 락토코커스 중앙젠시스를 비만세포주인 HMC-1 세포에 처리하여 Histamine의 분비를 측정한 결과이다. 도 5는 BALB/c 마우스의 피부손상 정도를 촬영한 사진을 나타낸 도면이다 (Normal: 정상 BALB/c 마우스， DNCB: 아토피 유발 BALB/c 마우스， Skin application L. chungangens i s: 아토피 유발 BALB/c 마우스에 락토코커스 중앙젠시 스 피부도포， Oral administration L. chungangens i s: 아토피 유발 BALB/c 마우스 에 락토코커스 중앙젠시스 구강투여， Tacrolimus: 아토피 유발 BALB/c 마우스에 타 크로리무스 피부도포， 이하의 도면에서 모두 동일한 의미). 도 6은 NC/Nga 마우스의 피부손상 정도를 촬영한 사진을 나타낸 도면이다. 도 7A는 아토피 유발 BALB/c 마우스가 긁는 횟수를 10분간 측정한 값을 나타 낸 결과이다 (Dermatitis score: 마우스가 긁는 횟수). 도 7B는 아토피 유발 NC/Nga 마우스가 긁는 횟수를 10분간 측정한 값을 나타 낸 결과이다 (Dermatitis score: 마우스가 긁는 횟수). 도 8은 각 동물군 마우스의 등쪽 피부조직과 귀에서 표피 및 진피를 H&E로 염색하여 광학현미경으로 촬영한 결과이다. 도 9는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 면역글로블린 IgE 생성 량을 비교 평가한 결과이다. 도 10A는 각 동물군 마우스의 피부조직에서 알레르기 관련 케모카인 및 사이 토카인 ( IL-4, IL-5, IL-12, IFN- γ , TNF- α， 및 TARC)의 mRNA 발현량을 PCR로 평가 한 결과이다. 도 10B는 각 동물군 마우스의 피부조직에서 알레르기 관련 케모카인 및 사이 토카인 ( IL-4, IL-5, IL-12, IFN- γ , TNF- a， 및 TARC)의 mRNA 발현량을 PCR로 평가 한 결과이다. 도 11A 는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 IL-4 단백질 량을 평 가한 결과이다. 도 11B 는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 IL-5 단백질량을 평 가한 결과이다. 도 12A 는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 IL-12 단백질량을 평 가한 결과이다. 도 12B 는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 IFN- Y 단백질량을 평가한 결과이다. 도 13A는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 TNF- a 단백질량을 평 가한 결과이다. 도 13B는 각 동물군 마우스의 혈액에서 분리한 혈청의 TARC 단백질량을 평가 한 결과이다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하본 발명을 상세히 설명한다.

단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. 통계분석

모든 실험결과에서 실험군 간의 통계분석은 one-way ANOVA로 각군 간의 평균 치에 대한 유의성 검정을 수준에서 분석 하였다. p 값이 0.05 이하인 경우

* 로 도면에 표시하여 나타내었다. 인간 케라티노사이트 세포주인 HaCaT 세포와 NC/Nga마우스의 결과에서는 p 값이 0.05 이하인 경우 #로 표시하여 구분하였다.

<실시예 1>

락토코커스 ^ 1 ^ ( Lactococcus ch賺 a ensis) 배양

락토코커스 중앙젠시스는 본 실험실에서 분리한 균주로서， 활성화된 슬러지 거품에서 분리되었다. 상기 균주는 Korean Col lect ion for Type Cultures(KCTC) 기 탁되었다. 락토코커스 중앙젠시스를 대두카제인 배지 (TSB: Trypt ic Soy Broth) 배 양액에 접종하고， 30 ^° C shaking incubator에서 24시간 배양하였다. 각각의 세포밀 도는 microplate reader (model Inf inite F200 , Tecan , Mannedor f , Swi t zer 1 and) ¾· 이 용하여 측정하였다.

<실시예 2>

락토코커스 증앙젠시스의 대식세포와 케라티노사이트 세포에 대한 효능 평가

<2-1>락토코커스 중앙젠시스의 RAW264.7 세포와 HaCaT세포에 대한 세포 독 성 평가

상기 실시예 1에서 배양된 락토코커스 중앙젠시스의 세포 독성 측정을 수행 하였다. 마우스 대식세포주인 RAW264 7 세포와 인간 케라티노사이트 세포주인 HaCaT 세포를 세포 독성 측정 실험에 사용하였고, 세포 독성을 측정하기위해 세포 생존 능력 측정을 수행하였다. RAW264.7 세포와 HaCaT 세포는 1주일에 4-5회 계대 하였으며， 배지는 20/ml 젠타마이신 용액과 10% FBSCfetal bovine serum)를 함유한 DMEMCDulbecco ' s Modi f ied Eagle ' s Medium) 배지를 이용하여 37 ^° C , 5% C0 ₂ 의 환경에 서 배양하였다. 세포 생존 능력 측정을 위해 배양된 RAW264.7 세포와 HaCaT 세포를 이용하여 lxlO ⁵ 세포 /wel l의 농도로 24-wel l plate에 분주하고， 24시간 동안 배양하 였다. FBS가 함유되지 않은 새로운 DMEM 배지에 락토코커스 중앙젠시스를 10 ⁹ cel l/ml 되게 세포주에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 세포주의 생존율을 측정하기 위해 MTT[3-(4, 5-dimethylthiazol-2— yl )-2, 5-di phenyl t et razo 1 i urn bromide] 시약을 사용하여 microplate reader (model Inf ini teF200, Tecan , M, Switzer land)로 590nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 1에 나타낸 것과 같이， 락토코커스 중앙젠시스를 처리한 RAW264.7 세포와 HaCaT 세포의 세포 생존 능력은 무처리군의 세포와 같은 수준의 세포 생존 능력을 확인하였다.

<2-2> 락토코커스 중앙젠시스에 의한 RAW264.7 세포에서의 항염증 활성 축정 상기 실시예 1에서 배양된 락토코커스 중앙젠시스의 항염증 활성 측정을 수 행하였다. <실시예 2-1〉과 마찬가지로 RAW264.7 세포를 항염증 활성 측정 실험에 사용하였다. 배양된 세포를 이용하여 lxlO ⁵ 세포 /wel l의 농도로 24-wel l plate에 분 주하고， 24시간 동안 배양하였다. 염증을 유발시키기 위해 FBS가 함유되지 않은 새 로운 DMEM 배지에 LPS를 0.1/ig/ml이 되도록 첨가하고， 락토코커스 중앙젠시스를

10 ⁹ cel l/ml 되게 세포주에 세포주에 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 세포 배양 상등액 내에서 세포주의 NO의 생성 정도를 측정하기 위해 Griess 시약을 1 : 1로 흔합하여 넣고， 10분 동안 반웅 시킨 후 microplate reader (model Inf initeF200, Tecan, M, Switzer land)로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 세 포 배양 상등액 내에서 세포주의 PGE^ 생성 정도를 측정하기 위해 Prostaglandin

TM

E2 Parameter Immunoassay Ki t (R&D Systems , Minneapol i s , MN, USA)를 .사용하여 매뉴얼에 따라 실험을 진행하였다. PGE ₂ 의 단백질량은 microplate reader로 450nm에 서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 도 2 와 도 3에 나타낸 것과 같이， LPS로 자극된 RAW264.7 세포에서 락토코커스 중앙젠시스를 첨가한 세포는 NO의 생성량이 현저하게 줄어든 것을 확인 하였고 (도 2) , PGE ₂ 생성양 역시 같은 양상을 보였다 (도 3) . 따라서 락토코커스 중 앙젠시스가 염증반웅을 억제하고 항염증 효과가 있음을 확인하였다. 본 연구의 결 과는 락토코커스 중앙젠시스가 옆증에 높은 치유효능을 보여줌으로써 락토코커스 중앙젠시스는 항염증 조성물에 용이하며， 더 넓게는 염증 치료 또는 약학적 조성물 로 사용 가능함을 나타낸다.

<실시예 3>

락토코커스 중앙젠시스의 in vitro항알러지 효능 평가 <3— 1>락토코커스 중앙젠시스에 의한 비만세포 (HMOl)의 ^—hexosaminidase 분비 비교

^-hexosaminidase 분비는 비만세포의 활성화와 탈과립을 나타내는 주요인자 로 널리 사용된다. 따라서 본 연구에서는 인간 비만 세포주인 HMC-1 세포를 이용하 여 ^-hexosaminidase 분비를 측정 하였다. HMC-1 세포는 1주일에 4— 5회 계대하였 으며， 배지는 20/g/ml 젠타마이신 용액과 1 FBS( fetal bovine serum)를 함유한 IMDMClscove's modified Dulbecco's Medium) 배지를 이용하여 37 ^° C, 5% C0 ₂ 의 환경 에서 배양하였다. 이렇게 배양된 세포를 이용하여 lxlO ⁶ 세포 /well의 농도로 24- well plate에 분주하고， 락토코커스 중앙젠시스를 10 ⁹ cell/ml으로 tyrode's buffer (137mM NaCl , 2.7mM KC1 , 1.8mM CaCl ₂ , l.lmM MgCl ₂₎ 11.9mM NaHC0 ₃ , 0.4mM NaH ₂ P0 ₄ , 5.6mM glucose, pH 7.2)에 섞어 세포에 처리하고 30분간 37 ^° C에서 배양한 다. 이후 compound 48/80을 6 g/ml 농도로 첨가하고 다시 37 ^° C에서 30분 동안 배양 하였다. 10분간 ice에서 반웅을 종결시키고 원심분리하여 세포를 가라앉힌 후, 상 등액만을 취하여 상등액 를 96 well plate로 옮겨 기질인 ImM의 4-;广 nitrophenyl-N-acetyl-^-D-glucosaminide 30^를 첨가하여 37 ^° C에서 한 시간 반웅 시켰다. 마지막으로 120^의 stop solution(sodium bicarbonate, pH 10.2)으로 반 응을 종료시킨 뒤 microplate reader로 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 락토코커스 중앙젠시스를 HMC— 1 세포에 처리한 후， compound 48/80로 탈과립 을 유도하여 분비된 ^-hexosaminidase의 결과를 도 4A에 나타내었다. 도 4에서 도 시된 바와 같이， 락토코커스 중앙젠시스가 ^-hexosaminidase 억제 효과가 뛰어난 것으로 확인되었으며, ^—hexosaminidase 분비를 65% 억제하였다.

<3-2> 락토코커스 중앙젠시스에 의한 비만세포 (HMC-1)의 Histamine 분비 비 교

인간 비만 세포주인 HMC-1 세포로부터 분비되는 히스타민의 농도를 측정하기 위해 HMC-1세포를 배양하여， lxlO ⁶ 세포 /well의 농도로 24-well plate에 24시간 배 양하였다. 배양 후 상기 실시예 3-1과 같은 방법으로 락토코커스 중앙젠시스를 10 ⁹ cell/ml로 처리하여 1시간 동안 배양하였다. 여기에 compound 48/80(10«g/ml )을 처리하여 20분 동안 배양한 다음 세포 배양액을 수거하였다. 세포배양액 내 히스타 민의 농도는 Histamine assay EL ISA Kit (Cayman Chemical Company； Ann Arbor , IL, USA)를 사용하여 microplate reader로 450nra에서 흡광도를 측정하였다. 락토코커스 중앙젠시스를 처리한 후, compound 48/80로 HMC-1 세포의 히스타 민을 유도하여 분비된 히스타민 양을 비교한 결과를 도 4B에 나타내었다. 도 4에서 확인할 수 있는 것과 같이， 락토코커스 중앙젠시스는 81%의 히스타민 분비 억제능 력으로 높은 억제능력을 보여주었다. 이로서 락토코커스 중앙젠시스는 알러지에 높 은 치유효능을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 연구의 결과는 락토코커스 중앙젠시스가 알러지에 높은 치유효능을 보여줌으로써 락토코커스 증앙젠시스는 항 알러지 조성물에도 용이하며 , 더 넓게는 알러지 치료 또는 약학적 조성물로도 사용 가능함을 시사한다.

<심시예 4> 락토코커스 중앙젠시스의 아토피 유발 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 모델에 대한 //? vivo효능 평가

<4-1> 아토피 유도 및 약물처리

무처리군 (normal ) , DNCB 군, tacrol imus 피부도포군， 락토코커스 중앙젠시스 피부도포군， 락토코커스 중앙젠시스 구강투여군의 총 5그룹으로 나누어, 그룹별로 각각 10마리의 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스를 이용해 평가하였다. BALB/c 마우 스와 NC/Nga 마우스의 등 및 목 부위에 제모 크림을 O. lg 도포하고 상처가 나지 않 도록 부드러운 티슈를 사용하여 털을 제거 하였다. 미세상처가 아물도록 5일 동안 방치한 후, 주 3회씩 2주간 1% DNCB 200(아세톤：올리브오일 =3 : 1)를 등과 귀에 도포 하여 아토피를 유도하였다. 아토피가 유도된 후에는 주 2회씩 4주간 락토코커스 중 앙젠시스를 환부 (患部)에 10 ⁹ cel l/mouse으로 도포하였고， 주 2회씩 4주간 락토코커 스 중앙젠시스를 구강에 10 ⁹ cel l/mouse으로 투여하였다. 효능을 비교하기 위하여 아 토피 치료제로 사용중인 tacrol imus를 사용하였다. tacrol imus는 아토피 환부에 100mg/kg으로 주 2회씩 4주간 도포하였다.

<4-2> 아토피 유발 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 육안 평가

tacrol imus 피부도포군， 락토코커스 중앙젠시스 피부도포군， 락토코커스 중 앙젠시스 구강투여군에 대한 각각의 치료 효과를 평가하기 위하여 육안평가를 실시 하였다. 육안평가는 평가지표인 흥반 /출혈， 건조 /흉터， 부종， 침식 /벗겨짐 정도에 따라 피부상태를 4단계 (0=absence , l=mi ld, 2=moderate , 3=severe)로 평가하여 약 12점 이상이면 아토피 증상이이 최고조에 달하는 것으로 판단하였고， 그 결과는 BALB/c 마우스는 하기 표 1 내지 표 5에서 보여주며， NC/Nga 마우스 하기 표 6 내 지 표 10에서 보여준다. 육안으로 관찰할 수 있는 피부상태를 도 5 및 도 6에 나타 내었다. 또한 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스가 긁는 흿수를 10분간 측정하여 도 7A 및 7B와 같이 나타내었다.

【표 1]

정상 BALB/c 마우스 (normal ) 육안평가 결과

[표 2】

DNCB에 의해 아토피 유도된 BALB/c 마우스 육안평가 결과

【표 3】

DNCB로 아토피 유발 후 아토피치료제 (타크로리무스) 피부도포 처리된 BALB/c 마우스 육안평가

[표 4】

DNCB로 아토피 유발 후 락토코커스 중앙젠시스 피부도포 처리된 BALB/c 마우 入

【표 5】

DNCB로 아토피 유발 후 락토코커스 중앙젠시스 구강투여 처리된 NC/Nga 마우 人

【표 6]

정상 NC/Nga 마우스 (normal ) 육안평가 결과

【표 7】

DNCB에 의해 아토피 유도된 NC/Nga마우스 육안평가 결과

8]

DNCB로 아토피 유발 후 아토피치료제 (타크로리무스) 피부도포 처리된 NC/Nga 마우스 육안평가

【표 9】

DNCB로 아토피 유발 후 락토코커스 중앙젠시스 피부도포 처리된 NC/Nga 마우 人

[표 10】

DNCB로 아토피 유발 후 락토코커스 중앙젠시스 구강투여 처리된 NC/Nga 마우 人

BALB/c 마우스를 2주간 (도 3의 0~2week)의 DNCB 처리를 통하여 아토피 유도 후， 아토피치료제인 tacrol imus 100mg/kg으로 환부에 도포한 군, 락토코커스 중앙 젠시스 10 ⁹ cel l/mouse으로 환부에 도포한 군， 락토코커스 중앙젠시스 l cel 1/mouse 으로 구강투여한 군으로 피부손상상태를 육안으로 관찰한 결과를 도 5 및 상기 표 1〜표 5에서 보여준다. 아토피가 유도된 피부는 피부건조로 인한 각질과 전반적 홍 반, 삼출성 가피의 형성과 출혈， 부종 등의 여러 증상들이 일어났으며， tacrol imus 피부도포군과 락토코커스 중앙젠시스 구강투여군은 피부상태가 현저히 좋아지는 현 상이 관찰되었다. 반면 락토코커스 중앙젠시스 피부도포군은 락토코커스 중앙젠시 스 구강투여군 보다는 느렸지만, 육안으로 봤을 때 천천히 피부상태가 좋아지는 것 을 확인 할 수 있었다. 이러한 현상은 BALB/c 마우스의 긁는 횟수 평가에서도 마찬 가지로 유사한 경향을 보여주었으며， 특히 락토코커스 증앙젠시스 구강투여군은 tacrol imus 처리군과 동일한 수준으로 긁는 현상이 현저하게 감소하였다. NC/Nga 마우스 역시 2주간 (도 3의 0~2week)의 DNCB 처리를 통하여 아토피 유도후， 같은 방법으로 아토피치료제인 tacrol imus 100mg/kg으로 환부에 도포한 군， 락토코커스 중앙젠시스 10 ⁹ cel l/mouse으로 환부에 도포한 군， 락토코커스 중앙젠시스

10 ⁹ cel l/mouse으로 구강투여한 군으로 피부손상상태를 육안으로 관찰한 결과를 도 6 및 상기 표 6~표 10에서 보여준다. NC/Nga 마우스도 마찬가지로 피부각질과 홍반， 삼출성 가피의 형성과 출혈， 부종 등의 여러 증상들이 확인되었으며 시험물질 처리 후, BALB/c 마우스보다 빠른 치유능력을 보여주었다. 결과적으로 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스의 락토코커스 중앙젠시스 구강투여한 군은 DNCB 처리로 인한 피부의 손상에 높은 치유효능을 나타낸다는 것을 알 수 있다. <4-3>조직 병리검사

시험물질 처리 종료 후， 실험군 및 대조군 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스들 의 등 쪽 피부조직 ( 1.5 X 1.5cm)과 귀를 떼어내어 10% 파라포름알데히드에서 24시 간 고정한 뒤， 상기 조직들을 파라핀에 층분히 굳힌 후 5로 절편하여 슬라이드 글 라스를 제작하였다. H&E(haematoxyl in-eos in)올 이용하여 공지의 방법으로 염색을 실시하였고， 광학현미경을 이용하여 표피와 진피의 두께정도를 관찰하여， 그 결과 를 도 8에 나타내었다. 도 8에 나타낸 것과 같이， DNCB에 의해 아토피 유도된 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스의 표피에서 각질의 탈락， 표피 비후， 각막비후증 (hyperkeratos i s )이 관찰되었다. 반면에 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 그룹의 아토피 치료제인 tacrol imus 피부도포군과 락토코커스 중앙젠시스 구강투여군의 처리에 의해 각질의 탈락， 표피 비후, 각막비후증이 현저히 감소된 것을 확인하였으며， 락토코커스 중 앙젠시스 피부도포군에서도 각질의 탈락, 표피 비후， 각막비후증이 DNCB에 의해 아 토피 유도된 마우스보다 약간의 감소된 것을 확인 하였다.

<4-4> 면역글로블린 IgE측정

시험물질 처리 종료 후， 다섯 군의 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스를 희생시 키고 심장에서 혈액을 채취하였고， 이로부터 혈청을 분리하여 IgE 를 측정하였다. 구체적으로 IgE EL ISA Ki t (BD Biosc i ences , San Di ego , CA)를 사용하여， 항체를 완 층용액에 회석하여 96-wel l pl ate에 부착하여 4 ^° C에서 밤새 정치하고 매뉴얼에 따 라 실험올 진행하였다. IgE의 단백질량은 mi cropl ate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 각각의 심장에서 혈액을 채취하여 분리시킨 혈청으로부터 아토피 질환을 매개하는 IgE의 양을 IgE ELISA Ki t를 사용하여 측정 한 결과를 도 9에 나타내었다. 시험물질 처리된 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스의 IgE의 양을 확인 한 결과 tacrol imus 피부도포한 군과 락토코커스 중앙젠시스 구강 투여한 군에서 IgE의 생성을 높은 수준으로 억제 하였다. BALB/c 마우스는 DNCB 유 도된 군과 비교했을 때 tacrol imus 피부도포한 군은 48% 억제하였고, 락토코커스 중앙젠시스를 구강투여한 군은 49% 억제하였다. 또한 락토코커스 중앙젠시스를 피 부도포한 군에서도 25% 정도인 낮은 수준의 억제를 확인 하였다. 또한 NC/Nga 마우 스 역시 DNCB 유도된 군에 비해 tacrol imus 피부도포한 군은 62% 감소하였고, 락토 코커스 중앙젠시스를 구강투여한 군은 58% 감소하였으며， 락토코커스 중앙젠시스를 피부도포한 군에서는 30% 감소하였다. 위 결과는 락토코커스 중앙젠시스가 아토피 질환에 효과를 줄 수 있음을 보여준다.

<4-5> 케모카인 및 사이토카인 측정

BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스의 시험물질 처리 종료 후, DNCB로 아토피 유 도된 대조군 마우스， tacrol imus 피부도포 군， 락토코커스 중앙젠시스 피부도포군， 락토코커스 중앙젠시스 구강투여 군의 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스를 회생시키 고 피부조직을 적출하여 Triz이을 넣고， 용해될 때까지 homogenizer로 분쇄하여 분 쇄된 조직에서 RNA를 추출하였다. 구체적으로 상기 각각의 대조군 및 실험군 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스로부터 적출된 피부조직에 Triz 을 넣고, 클로로포 름 (CHC1 ₃ )올 첨가하고 흔합한 후， 10분간 방치하여 원심분리 하였다. 원심분리된 상 등액을 회수하여 2-propan이을 동량 흔합 후 10분간 방치하였고, 이를 다시 원심분 리하여 80% EtOH로 수세하고 건조시켜 RNA를 획득했다. 역전사 PCR에서 AMV 역전사 효소， dNTP(Promega, Madison, WI ) , EX Taq DNA 폴리머라제 (Takara Shuzou, Kyoto, Japan)를 이용하여 cDNA를 수득 하였고, 수득한 cDNA는 아토피 관련 케모카인 및 사이토카인의 mRNA 발현량을 확인하는데 사용되었다. 구체적으로 IL-4, IL-5, IL- 12, IFN- γ , TNF- α , TARC의 사이토카인 및 케이모카인과 대조군인 GAPDH 각각에 대한 하기 표 5에 기재된 프라이머쌍들을 사용하여. PCR을 수행하였다. 상기 PCR 반 응은 94 ^° C에서 1분， 95 ^° C에서 30초， 55_65 ^° C에서 30초， 및 70 ^° C에서 3분의 조건으 로 30순환 반복하였다. 상기와 같은 PCR 반웅 후, 1.5¾> 아가로즈 젤 전기영동법을

TM

이용해 반웅물을 분석하였고， GelDoc XR+ (Bio-Rad, Hercules , CA, USA)를 이용하 여 이미지화 하고 그 결과를 도 10A 및 10B에 나타내었다. 상기 PCR에 사용된 프라 이머는 마크로젠사에 제작하여 사용하였다. 하기 표 11는 역전사 PCR에 사용된 프 라이머 (primer)의 염기서열이다.

또한 각각의 마우스 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스심장에서 혈액을 채취하 여 분리시킨 혈청으로부터 IL-4, IL-5, IL-12, IFN- γ , TNF- α， TARC 단백질의 변 화를 각각의 IL-4 Quant ikine Immunoassay Ki t , IL-5 Quant ikine Immunoassay Ki t , IL-12 Quant ikine Immunoassay Kit , TNFᅳ a Quant ikine Immunoassay Ki t , CCL17/TARC Quant ikine Immunoassay Kit (R&D Systems , Minneapol is , MN, USA)를 사용하여 microplate reader로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 【표 11】

PCR에 사용된 프라이머 염기서열

BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스의 DNCB로 아토피가 유도된 대조군 마우스， tacrol imus 피부도포군 마우스， 락토코커스 중앙젠시스 피부도포군 마우스， 락토코 커스 중앙젠시스 구강투여 군 마우스를 희생시키고, 적출된 조직에서 추출된 RNA를 각각의 케모카인 및 사이토카인 특이적 프라이머 (pr imer)로 확인한 결과， DNCB에 의해 유도된 아토피 마우스에 비해 tacrol imus 피부도포군 마우스， 락토코커스 중 앙젠시스 구강투여군 마우스의 IL-4, IL-5, IL-12 , IFN- γ , TNF- α , TARC의 mRNA 발현량이 감소한 것을 확인하였다 (도 10) . 또한 BALB/c 마우스와 NC/Nga 마우스 심장에서 혈액을 채취하여 분리시킨 혈 청으로부터 아토피 질환을 매개하는 케모카인 및 사이토카인의 양을 ELISA Ki t를 사용하여 측정한 결과， DNCB에 의해 유도된 아토피 마우스에 비해 tacrol imus 피부 도포군 마우스， 락토코커스 중앙젠시스를 구강투여군 마우스의 IL-4 , IL-5 , IL-12 , IFN- γ , TNF- α , TARC가 크게 감소한 것을 단백질 수준에서 확인 하였다 (도 11 내 지 도 13) . 락토코커스 중앙젠시스를 피부도포군 마우스에서도 IL-4 , IL-5, IL-12 , IFN- γ , TNF- α , TARC가 약간 감소한 것을 단백질 수준에서 확인 하였다. 따라서 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스은 타크로리무스와 유사한 수준으로 아토피에 효 과를 줄 수 있으며， 더 넓게는 아토피 치료 또는 약학적 조성물로도 사용 가능함을

<실시예 5> 락토코커스 중앙젠시스의 아토피 2차 감염유발 미생물인 스타필 로코커스 아우레우스에 대한 항균 활성 검증

<5-1>실험 미생물 준비

락토코커스 중앙젠시스는 대두카제인 한천 배지 (TSB: Trypt i c Soy Agar )를 이용해 30 ^° C 배양기에서 24시간 배양한 것을 사용하였다. 항균활성 테스트를 수행 하였다. 실험에는 공지의 기탁기관인 국가병원체자원은행 NCCP (Nat i onal Cul ture Col lect ion for Pathogens)에서 스타필로코커스 속 세균 ( Staphylococcus aureus NCCP 14780)을 분양받아사용하였다.

<5-2>락토코커스 중앙젠시스의 아토피 2차감염유발 미생물인 스타필로코커 스 아우레우스에 대한 항균 활성 측정

락토코커스의 중앙젠시스의 항균 활성을 측정하기 위해， 30 ^° C 배양기에서 24 시간 락토코커스를 배양하였다. 분양받은 균주인 스타필로코커스 속 세균은 BHI (Brain Heart Infusion) 배지를 이용해 37 ^° C 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 된 락토코커스 중앙젠시스는 다른 대두카제인 한천 배지에 옮긴 후， 배양된 스타필 로코커스 속 세균을 배양접시 당 균수가 5 X 10 ⁷ 이 되도록 조절하여 60 ^° C의 굳지 않 은 BHI한천배지 7ml을 부은 뒤 잘 굳힌 다음 30 ^° C 배양기에서 24시간 동안 배양하 였다. 배양 후 생성된 세균의 생육저지대， 즉， 투명환 (Cl ear zone)을 확인하고 베 니어 캘리퍼스 (Vernier cal ipers)를 사용하여 직경을 측정하였고， 그 결과를 표 12 에 나타내었다.

【표 12]

락토코커스 중앙젠시스의 항균 활성 측정 Mi croorgani sm Strain Clear zone (mm)

1 2 3 Average

Staphylococcus aureus NCCP14780 30 40 40 36.7 표 12에 나타낸 바와 같이， 락토코커스 중앙젠시스는 스타필로코커스 속 세 균에 대하여 항균활성을 나타냄을 확인할 수 있었다. 따라서 스타필로코커스 속 세 균에 의한 아토피 2차감염으로부터 보호할수 있고 항균제보다 안전하기 때문에 아 토피 치료 또는 약학적 조성물로도 사용 가능함을 시사한다.

<제조예 1>

피부 외용제제의 제조

<!-!> 연고의 제조

연고는 당분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 하기에 제시된 제제의 재료를 흔합함으로써 제조된다. 락토코커스 중앙젠시스 5.00 중량 % 카프린 /카프릴트리글리세리드 10.00중량 %

액상 파라핀 10.00중량%

소르비탄세스퀴놀리에이트 6.00 중량 % 옥틸도데세스 -25 9.00 중량 % 세틸에틸핵사노에이트 10.00중량 %

스쿠알란 1.00 중량 % 살리실산 1.00 중량 ^< ¾ 글리세린 15.00 중량 % 소르비를 10.00중량 ^< ¾

정제수 잔량 중량 %

<1-2> 로션의 제조

로션은 당분야에서 통상적으로 수행되는 방법에 따라 하기에 제시된 제제의 재료를 흔합함으로써 제조돤다.

W 락토코커스 중앙젠시스 0. 10 중량 ^< ¾

글리세린 3.00 중량 % 카보머 0. 10 중량 ^< ¾ 잔탄검 0.05 중량 %

1 ,3-부틸렌 글리콜 3.00 중량 % 폴리글리세릴 -3 메틸글루코스 디스테아레이트 1.50 중량 % 글리세릴 스테아레이트 0.50 중량 ^< ¾ 세틸아릴 알콜 0.30 중량 % 호호바 오일 3.00 중량 % 유동 파라핀 2.00 중량 % 스쿠알란 3.00 중량 ^< ¾ 디메치콘 0.50 중량 ^< ¾ 토코페릴아세테이트 0.20 중량 ¾> 트리에탄올아민 0. 10 중량 ^< ¾ 방부제， 향， 색소 미량

정제수 잔량 중량 %

<제조예 2>

식품 조성물의 제조

<2-1> 발효유의 제조 본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 이용하여 발효유를 제조하였다.

원유 (74.41%)와 탈지분유 (6.45%) 등을 흔합하여 배양 종균과 락토코커스 중 앙젠시스를 넣어 배양시켜 배양액 (락토코커스 중앙젠시스: 1X10 ⁹ CFU/ml )을 제조하 였다. 비교 대상으로는 동일한 흔합액 조성에서 배양 종균 만을 넣어 배양시킨 배 양액을 제조하였다. 당액을 제조하여 앞에서 만들어진 각각의 배양액을 섞어 발효 유 제품을 제조하였다.

<2-2>음료의 제조 꿀 522 mg 치옥토산아미드 5 mg

니코틴산아미드 10 m

염산리보플라빈나트륨 3 mg

염산피리독신 2 mg

이노시를 30 mg

오르트산 50 mg

락토코커스중앙젠시스, 이의 배양 상등액

물 200

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<2-3> 건강기능식품 (분말제)의 제조

락토코커스 중앙젠시스 동결건조분말 ( I X 10 ⁹ CFU/g)20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 흔합하고 기밀포에 층진하여 분말제를 제조한다. <2-4> 건강기능식품 (정제)의 제조

락토코커스 중앙젠시스 동결건조분말 ( I X 10 ⁹ CFU/g)10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 흔합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제 한다.

<2-5> 건강기능식품 (캅셈제)의 제조

락토코커스 중앙젠시스 동결건조분말 (1 X 10 ⁹ CFU/g)10 mg

결정성 샐를로오스 3 mg 락토오스 14.8 mg

마그네슘스쩨아레이트 0.2 mg

통상의 캡슬제 제조방법에 따라상기의 성분을흔합하고 젤라틴 캡슐에 층전 술제를 제조한다.

<2-6>거강기능식품 (혼합분말제)의 제조 ( 1) 락토코커스 중앙젠시스동결건조분말 ( I X 10 ⁹ CFU/g) l g

비타민 흔합물 적량

비타민 A아세테이트 70 / g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0. 13 mg

비타민 B2 0. 15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 μ

비타민 C 10 mg

비오틴 10

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 β

판토텐산칼슘 0.5 mg

무기질 흔합물 적량

황산제 1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제 1인산칼륨 15 rag

제 2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

<2-7> 거강기능식품 (혼합분말제)의 제조 (2) 락토코커스 중앙젠시스 동결건조분말 ( I X 10 CFU/g) l g

비타민 흔합물 적량

비타민 A 700 //g

비타민 B1 1.2 mg

비타민 B2 1.4 mg

비타민 B6 1.5 mg

비타민 B12 2.4

비타민 C 100 mg

나이아신 15 mg

판토텐산 5 mg

비타민 D 5 //g

비타민 E 11 mg

비오틴 30 Mg

엽산 400 ig

베타카로틴 500 βζ

무기질 흔합물 적량

아연 8.5 mg

구리 0.8 mg

샐렌 55

크롬 50 ig

요오드 150

망간 3mg

몰리브덴 25 / g 상기의 비타민 및 미네랄 흔합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만， 그 배합비를 임의로 변형 실시하여 도 무방하며， 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 다음， 과립을 제조하고， 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있 다. 이상의 설명으로부터， 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본.발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여， 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범 - 위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

【산업상 이용가능성】

본 발명의 락토코커스 중앙젠시스를 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증성 질환에 대한 예방 또는 치료효과가 우수하며， 염증 주요 인자인 Ni tr i c oxide 및 Prostaglandin E ₂ 의 분비를 억제하는 효과가 뛰어나며, 알레르기 관련 주요인자인

^-hexosaminidase 및 Hi stamine 분비를 억제하는 효과가 뛰어날 뿐만 아니라, 피 부질환 관련 사이토카인 및 케모카인의 생성을 현저하게 억제하며， 이러한 효능은 공지의 피부질환 치료제 (타크로리무스)와 비교하여도 효과가 동일한 수준이고 아토 피 2차 감염유발 미생물인 스타필로코커스 아우레우스에 대한 항균력을 보유하기 때문에 산업상 이용 가능성이 높다.