COMPOSICIÓN FARMACÉUTICA DE PROTEINAS HÍBRIDAS RECOWtBINA TES CAPACES DE GENERAR ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES EN CONTRA DEL

VENENO DE ALACRANES CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere al diseño de proteínas recombinantes formadas con toxinas seleccionadas dei veneno de alacranes de varias partes del mundo (géneros Androcíonus, Buthacus, Buthus, Leiurus, Parabuthus, Ceniruroides, Tityus) las cuales se expresan tfeterólogamente, por ingeniería genética, con plegamiento adecuado, como proteínas híbridas, capaces de funcionar como antígenos (inmunógenos) eficientes en la producción de anticuerpos en mamíferos, funcionan así de manera individual o bien en determinadas mezclas de !as mismas quedando como composiciones adecuadas para inmunización y generación de anticuerpos con capacidad neutralizante del veneno completo de las especies de alacranes de los cuales se obtuvo la información genética de las toxinas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El conocimiento generado en los laboratorios de investigación de la ÜNA , primeramente en el instituto de Investigación en Fisiología Celular, después en el Instituto de Investigaciones Biomédieas ha permitido identificar los componentes tóxicos del veneno de alacranes de muchas partes del mundo (Possani y col., 1999). El uso de los péptidos tóxicos para la generación de antivenenos capaces de neutralizar el efecto dañino de estas proteínas del veneno, posibilitó el diseño de una estrategia tecnológica capaz de producir dichos antivenenos de una manera más racional y efectiva, objeto de esta invención.

De este modo se describe la síntesis de los genes que codifican para las toxinas rnayoritarias del veneno de alacranes peligrosos al humano, se traía de especies comunes de diversas regiones del planeta. Estos genes se incorporaron a vectores moleculares capaces de expresar en bacterias (Escheríchia cois) las proteínas de forma recombinante, como un producto híbrido no tóxico. Estos fueron utilizados en modelos animales (ratones y/o conejos y/o caballos) demostrando que son capaces de generar anticuerpos protectores.

Estudios previos han demostrado que las neurotoxinas de arácnidos son inmunogénícas y que los anticuerpos generados contra éstas, no solo son capaces de neutralizar a la toxina misma, sino al veneno total de la especie correspondiente (Calderon-Aranda y col., 1993). También se han reportado casos de anticuerpos que son generados contra un componente no tóxico, natural o sintético, y que también neutralizan al veneno total de la especie correspondiente. Así, se ha observado que la generación de anticuerpos contra un solo componente de un veneno, puede ser una alternativa eficaz para la producción de anti- venenos. Para definir a! componente dei veneno que una vez aislado es e¡ adecuado para generar la respuesta neutralizante deseada se requiere de un vasto conocimiento en el campo y diversas pruebas y diseños experimentales muy minuciosos, para concluir de manera exitosa. Ejemplos de componentes de venenos que pueden generar anticuerpos neutralizantes de los venenos son: ¡a anatoxina AmmVIH del alacrán Anciroctonus auretanicus mauretanicus (Norte de África) (Martin-Eauclaire et ai., 2006), la neurotoxína Ts1 (TsVSI o TSY) del alacrán Tityus serrulatus (Mendes et ai., 2008), Sa enzima S D-Lb1C de ia araña violinista Loxoceies boneti (Olvera et al., 2008), la neurotoxina Cn2 del alacrán Centruroides noxius (Licea et al., 1998), entre otros.

El desarrollo de la terapia con anticuerpos ha evolucionado rápidamente en los últimos veinte años, especialmente con las inmunogíobuiinas como proteínas modulares (Espino-Soíis et al., 2009), lo que ha ¡levado a un mayor número de estudios en ios que se pretende evaluar las propiedades inmunológicas de las neurotoxinas. Hasta ahora los resultados esenciales de ios estudios inmunológicos para toxinas de alacranes son la identificación, purificación, caracterización estructural y farmacológica de toxinas individuales y de familias de toxinas, obtención de suero y anticuerpos neutralizantes, localización y descripción estructural de los determinantes antigénicos, epftopes relativos a sitios tóxicos, y ensayos de neutralización y capacidad de protección de ¡os anticuerpos generados para las toxinas y para venenos totales. Actualmente la producción de anti-venenos se realiza inmunizando caballos con ei veneno total de los alacranes de interés, siendo que unas pocas toxinas presentes en los venenos son las que en verdad son tóxicas para ¡os humanos u otros mamíferos (Zamudio et al., 1992; Calderon-Aranda et al., 1993; Olvera et al., 2006; Hernández-Salgado et al., 2009). Debido a esto, una de ¡as desventajas de los actuales anti-venenos es la gran cantidad de proteína no-específica que contienen. Estos anticuerpos no específicos pueden ser los responsables de efectos secundarios en los pacientes bajo tratamiento, especialmente en menores de edad. La producción de Faboterápicos (i.e. F(ab') ₂ , producto de la eliminación del fragmento crisfalizable por digestión de la inmunoglobulina con ia enzima Pepsina), representa un avance para mejorar la calidad de los anti-venenos (Ismaii, 2003); sin embargo, estos aún podrían mejorarse al disminuir aquellos anticuerpos generados contra fracciones del veneno que no estén involucradas en la toxicidad ai humano, de esta manera se aumentaría la espeGificidad del anti-veneno. Las proteínas antigénicas híbridas, en las cuales se sustituye parte de la proteína cuyo reconocimiento por anticuerpos es irrelevante para neutralizar sus efectos tóxicos, y solo permanece Sa parte antigénica relevante (determinantes antigénicos) para generar anticuerpos neutralizantes, también representan una ventaja en el desarrollo de anti-venenos. Existen conocimientos para la producción de antígenos recombínantes para la producción de anti-venenos en contra de la picadura de alacrán (García-Gómez et al, 2008; Corona et al., 2008; Corzo-Burgueíe et al., 201 1 ). De esta manera, un objetivo principal de esta invención es obtener mezclas definidas de neurotoxinas recombínantes que al ser usadas como inmunógenos en caballos permita ¡a generación de anticuerpos altamente específicos contra los principales componentes tóxicos de un determinado veneno y neutralizar los efectos tóxicos producidos por la picadura de dicha especie o dichas especies de alacrán y su aplicación en una composición farmacéutica para su uso como antiveneno. En la presente se describen la selección de las clonas, la construcción de los vectores moleculares, la expresión de los genes híbridos, la composición farmacéutica usada de las proteínas híbridas y su uso en animales experimentales, quedando demostrado que son eficientes para ia generación de anticuerpos neutralizantes en contra del veneno de los alacranes estudiados.

Las especies de alacrán de los géneros Androclonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus son de las mas peligrosas en las regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente. Se estima que en estas regiones el número de picaduras de alacrán es de cerca de 637,000 picaduras al año, lo cual provoca aproximadamente 2421 muertes (Chippaux and Goyffon, 2008). Algunas de las toxinas recombínantes indicadas en este desarrollo provienen precisamente de venenos de alacranes de estos géneros y además son las toxinas mas potentes de sus respectivos venenos, éstas fueron seleccionadas, una por una, en base a ¡os reportes existentes respecto a ellas en cuanto a toxicidad y porcentaje que representan dentro de su respectivo veneno.

Datos epidemiológicos publicados por la Dirección Adjunta de Epidemiología de la Secretaría de Salud de México indican que en los últimos 10 años ha ocurrido un número registrado de accidentes por picadura de alacrán que rebasa anualmente un cuarto de millón de personas. Específicamente, para 2005 se reportaron 247,976 casos y para los años subsecuentes los datos fueron (se enlistan los años y el número de personas picadas) 2006: 282,598; 2007: 271 ,440; 2008: 271 ,976; 2009: 287,666; 2012: 280,160; 201 1 : 296,392; 2012: 313,559. Las áreas geográficas más afectadas correponden a los Estados de Jalisco, Guerrero, orelos y Michoacán. Los alacranes de importancia médica más importantes, según reportan Chippaux y Goyffon {Chippaux y Goyffon, 2008) son: C. etegans, C. ¡nfamatus, C. iimpldus limpidus, C. noxius, C. suffusus suffusus, C. tecomanus y C. sculpturatus. Como puede observarse estas especies de alacranes pertenecen todos al género Centruroides. Algunas de las toxinas recombínantes de este desarrollo son precisamente de venenos de alacranes de este género y ademas son las toxinas mas potentes de sus respectivos venenos. Estas toxinas fueron seleccionadas una por una en base a ¡os reportes existentes acerca de ellas en cuanto a toxicidad y porcentaje que representan dentro de su respectivo veneno.

En Sudamérica, y especialmente en Brasil, las picaduras de especies de alacranes del género Tityus representan un grave problema de Salud. Datos provistos por el sistema de información del Ministerio de Salud de Brasil (SINAN, Sistema Nacíona! de Informacao de Agravos de Notificacáo), muestran que de enero del 2007 a diciembre del 2011 , se presentaron 235, 892 casos de picaduras de alacrán tan solo en Brasil y 414 muertes debido a ésto. El género Tityus contiene el número más grande de especies peligrosas de alacrán en Sudamé ica. En Brasil, tres especies de este género: Tityus serrulatus (alacrán amarillo), Tityus bahiensís (Alacrán café) y Tityus stigmurus son los principales responsables de escorpionismo en humanos (Bucaretchi et al., 1995; Eickstedt et al., 1996). Tityus serrulatus es el alacrán Brasileño que causa los accidentes mas serios con una tasa de mortalidad de aproximadamente 1 % entre niños y ancianos. Esta especie está ampliamente distribuida en todo el País, abarcando los estados de Sao Paulo, Minas Gerais, Bahia, Espirito Santo, Goiás, Paraná y Rio de Janeiro (Ministério da Saúde, 2001 ).

El componente tóxico mayoritario del veneno de T. serrulatus es la neurotoxina Ts1 , también conocida como Ts-n (Martin-Eauciaire et. al., 1992.), pero también existen otros componentes tóxicos, tales como la toxina Ts2 y la toxina Ts3 (Martin-Eauciaire et al., 1994, Becerril et al., 1997.), las cuales comparten una identidad con la toxina Ts1 del 72% y 38%, respectivamente. La toxina Ts3 se une a otros sitios en el canal de sodio en comparación a la Ts1 y Ts2, así como a diferentes paráfopos de anticuerpos que las reconocen, epítopes. Debido a esto, anticuerpos producidos solamente contra la toxina Ts1 no son capaces de neutralizar al veneno completo. Por otra parte, del veneno de Tityus serrulatus, se ha aislado un péptido no tóxico, llamado TsNTxP (Guatimosim et al., 1999), que comparte una identidad de secuencia con la toxina Ts1 deí 65 %, con la toxina Ts2 del 59 % y con la toxina Ts3 del 43%. El uso del péptido TsNTxP como inmunogeno genera anticuerpos policlonales que tienen una reactividad cruzada contra varias toxinas del veneno, mostrando una capacidad neutralizante tanto en ensayos in vivo como in vitro. El suero generado es capaz de neutralizar 1.75 DL ₀ o del veneno del alacrán T. serrulatus (Guerra-Duarte et al., 2010). Debido a ésto, el péptido TsNTxP es considerado como una anatoxina natural importante en la seroterapia anti-Tityus.

Debido a los fundamentos anteriores algunas de las toxinas recombinantes incluidas en la presente invención son precisamente Ts1 , Ts3 y TsNTxP de Tityus serrulatus. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1A. Generación de! gen que codifica para la toxina AaH!, del alacrán Androctonus austraiis Héctor con uso preferencia! de codones de £. coii. A) Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E, coii y sintetizados para el ensamble del gen de ia toxina AaH!. Los cuatro primeros Rev1 -AaHI, Dir2 ^« AaHI, Rev2-AaHI y Dir3-AaH! son ¡os oiigonucleótidos internos y Dir1 -BEK-AaHi y Rev3-Xhol-AaH¡ son los dos oiigonucleótidos extemos. Nucleótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y dei sitio de corte de la enterocinasa (itálicas).

Figura 1 B. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina AaHIl.

Figura 1C. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica dei gen que codifica para la toxina AmmV. Los oiigonucleótidos externos Amm5__Up1 y Amm5__Lw6 introducen los sitios de clonación BamH! y Xhol respectivamente.

Figura 1 D. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina AmmVIII. Los oiigonucleótidos externos Amm8_Up1 y Amm8 _Lw8 introducen los sitios de clonación BamH! y Xhol, respectivamente.

Figura 1 E. Generación del gen que codifica para la toxina Boti, del alacrán Buthus occitanus tunetanus con uso preferencia! de codones de E. coii.

Figura 1 F. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos: Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina Lqhll y su correspondiente traducción en aminoácidos. Los oiigonucleótidos externos introducen los sitios de restricción necesarios para la clonación del gen en e! vector de expresión pET22B.

Figura 1 G. Generación del gen que codifica para ia toxina LqhlV, del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus con uso preferencia! de codones de E. coii. Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E, coii y sintetizados para e! ensamble de! gen de la toxina LqhlV.

Figura 1 H. Secuencia nucieotídica y de aminoácidos. Secuencia nucieotídica del gen que codifica para la toxina Pg8 y su correspondiente traducción en aminoácidos. Los oiigonucleótidos utilizados para el ensamble con uso preferencia! de codones de E, cois son aquellos reportados en e! artículo: Toxican 53 (2009) 770-778, El gen ensamblado fue utilizado como templado para clonarlo en el vector de expresión pET22b con los oligos externos señalados en la Figura 1 H.

Figura 1 !. Generación de! gen que codifica para la toxina Acra4, de! alacrán Androctonus crassicauda con uso preferencia! de codones de E. coii. Secuencia nucieotídica de los seis oiigonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coii y sintetizados para ei ensamble del gen de la toxina Acra4. Los oíigonucíeótldos REV1~Acra4, Dir2- Acra4, Rev2- Acra4 y Dir3- Acra4 son los oíigonucíeótldos Internos y Dlr1~BEK- Acra4 y Rev3-Xhol- Acra4 son los dos oíigonucíeótldos externos, Nuc eótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en cursivas ¡os nucleótidos del sitio de corte de !a eníerocinasa.

Figura 1J. Generación del gen que codifica para la toxina Bul , del alacrán Buthacus acrocentrus con uso preferencia! de codones de £ coli. Secuencia nucleotídica de los seis oíigonucíeótldos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Bul . Los oíigonucíeótldos REV1-Bu1 , Dír2-Bu1 , Rev2-Bu1 y Dir3-Bii1 son los oíigonucíeótldos internos y Dir1-BEK-Bu1 y Rev3~Xho!~Bu1 son ios dos oilgonucleótidos externos. Nucleótidos subrayados corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en cursivas los nucleótidos del sitio de corte de ¡a enterocinasa.

Figura 2. Vector de Expresión pET22b~Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina. AaHI. Se muestra un esquema del ensamble del gen de la toxina AaH! usando seis oilgonucleótidos y los sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio donde fue clonado el gen de la toxina AaHI (BamHI y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la protefna de fusión que se expresa, ia cual contiene en el N-terminaí ¡a proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa, luego ¡a toxina AaHI y finalmente, en el C- terminal hay 8 histidinas que permiten purificar la proteína de fusión.

Figura 3. Electroforesis en gei de acriSamida de la protefna de fusión Tiorredox¡na-EK-AmmV- 8His. SDS-PAGE. La figura muestra un gel de acrilamida al 12%, en el cual se visualiza en el carril 1 : el marcador de peso molecular, en el carril 2: la proteina de fusión Tiorredoxina-EK- AmmV-8His y en el carril 3: la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-6His. Estas muestras son resultado de la elusión de la cromatografía de afinidad a NI-NTA agarosa. La flecha indica a la proteína de fusión.

Figura 4A: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina~EK~AaHI~6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual ia flecha indica ia fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AaHI-6His,

Figura 4B: Purificación y repurificación de la proteina de fusión Tíorredoxina-EK-AaHíi-8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tíorredoxina~EK-AaHil-6His,

Figura 4C: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV-6Hís por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la protefna de fusión Ttorredoxina~EK~AmmV-8His. Figura 4D: Purificación de la protefna de fusión Tíorredoxina-EK-AmmVII!-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proieína de fusión Tiorredoxina~EK-AmmVII!~6His.

Figura 4E: Purificación y repurificación de la proieína de fusión Tiorredoxina-EK-Botl~6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ¡a proteina de fusión Tiorredoxina-EK-Boíl-6His.

Figura 4F: Purificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Lqhll-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC. en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Lqhll-8His.

Figura 4G: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxína-EK-Lqh¡V-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ¡a proteína de fusión Tiorredoxina-EK-LqhlV-6His.

Figura 4H: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Pg8-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Pg8-6His.

Figura 41. Purificación de ía protefna de fusión Thio-EK-Acra4-6His mediante HPLC. Se muestra el cromatograma de la purificación de la proteína de fusión Thio-EK-Acra4-6His mediante cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para lo cual se empleó una columna analítica C18 (Vydac, U.S.A) y un gradiente de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0.1% de TFA) de 20- 65 % en 45 minutos. El tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión de Acra4 es el tiempo 30.2.

Figura J. Purificación de la proteína de fusión Thio-EK-Bu1-8His mediante HPLC. Se muestra e¡ cromatograma de la purificación de la proteína de fusión Thio-E -Bu1-6His mediante cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para lo cual se empleó una columna analítica C18 (Vydac, U.S.A) y un gradiente de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0,1 % de TFA) de 20-85 % en 45 minutos. El tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión de Bul es el tiempo 29.4,

Figura 5. Título de anticuerpos de los conejos 05, 06 y 08 después de ser inmunizados por quinta vez con las toxinas recombinantes fusionadas a la Tiorredoxina.

Figura 8: Título de anticuerpos de los conejos 05, 06 y 08 contra el veneno de 5 diferentes especies del Norte de África después de la quinta inmunización.

Figura 7. Títuio de anticuerpos del conejo 05, contra el veneno de 4 diferentes especies de alacrán del Norte de África después de la segunda, tercera y cuarta sangría.

Figura 8: Título de anticuerpos del conejo 06, contra el veneno de 4 diferentes especies de alacrán del Norte de África después de la segunda, tercera y cuarta sangría. Figura 9. Título de anticuerpos de! conejo 08, contra el veneno de 4 diferentes especies del Norte de África después de ¡a segunda, tercera y cuarta sangría.

Figura 10. Fracciones de la columna de afinidad a Proteína A. Las fracciones de interés corresponden a! volumen de elución de 42 a 55 mi.

Figura 11 . Gráfica y tabla que ilustran el título de anticuerpos obtenido con el reconomiento de las toxinas recombinantes AaHI, AaHIl, AmmV, AmmVN, Lqhll, LqhlV, Bot!.

Figura 12. A. Gel SDS-PAGE a! 12% de ¡as proteínas de fusión recombinante. 1 ). Thio~E ~ AaHI (20,677 Da); 2). Thio-EK-AaHH (21 ,1 17 Da); 3). Thio-EK-AmmV (21 ,176.9 Da); 4). Thio- EK-ArnmVI! ( 21 ,292 Da), 5). Thio~EK~Lqh!l (21 ,150.9 Da), 6). Thío~EK~LqhlV (21 ,085.9 Da), 7). Thio-E -Bot! (21 ,133.8 Da), 8). Marcador de proteínas (Page Plus Ruler, Thermo scientific). B. Western Blot. Se sigue el mismo orden de las muestras del ge!.

Figura 13. Ensamble del gen que codifica para la toxina Cn2 del alacrán C. noxius con uso preferencia! de codones de E, coli. En !a parte superior se indica la secuencia nucleotidica del gen que codifica para la toxina Cn2 ensamblada con el uso preferencia! de codones para E. coli; dicha preferencia pudo ser corroborada a! utilizar el programa E, coli Codon Usage Analysis 2.0. (http://faculty.ucr.edu/~mrnaduro/codonusaqe/usaqe, htm). En la parte inferior se indica cada uno de los codones que codifican para los aminoácidos de la toxina Cn2, así como también la frecuencia con la cual E. coli utiliza ese codón.

Figura 14A. Generación del gen que codifica para la toxina Cn2, de! alacrán C. noxius con uso preferencia! de codones de £. coli, a y b) Secuencia nucleotidica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Cn2. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias reconocidas por las enzimas de restricción y las que codifican al sitio de corte de la enzima enterocinasa. c) Secuencia nucleotidica del gen ensamblado de la toxina Cn2, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante de! DNA se encuentra subrayada, en negro, la secuencia de los oligonucleótidos directos internos Cn2UpA y Cn2UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados, en itálicas, los oligonucleótidos reversos infernos Cn2LwB y Cn2L D.

Figura 14B. Generación de! gen que codifica para la toxina CII1 , de! alacrán C. limpidus limpidus con uso preferencia! de codones de E. coli. a y b) Secuencia nucleotidica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina OH . Los cuatro primeros CIH UpA, Cüi LwB, CIH UpC, CIH LwD son los oligonucleótidos internos, B-EK-CII1 corr y Rev~Xhol-CI!1 son los dos oligonucleótidos externos. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ios sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa. c) Secuencia nucleotidica del gen ensamblado de la toxina CII1 , con uso preferencia! de codones de E. co/ y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante del DNA se encuentra subrayada la secuencia de los oligonucleótidos directos internos CÍH UpA y CIH UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos internos GIH LwB y CIH LwD.

Figura 14C. Generación del gen que codifica para la toxina CII2, del alacrán C. ¡srnpidus ¡impidus con uso preferencia! de codones de E. coli. a y b) Secuencia nucleotídíca de ¡os seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. cois y sintetizados para el ensambie del gen de la toxina CII2. Los cuatro primeros CI!2UpA, C!!2LwB, Cíl2UpC, CI!2LwD son los oligonucleótidos internos y B-EK-CII2 y Rev~Xhol~C!!2 son los dos oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ios sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa. c) Secuencia nucleotídíca de! gen ensamblado de la toxina CII2, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. En la hebra codificante del DNA se encuentra subrayada la secuencia de los oligonucleótidos directos internos C!l2UpA y CII2UpC y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos internos Ci!2LwB y CII2LwD,

Figura 14D. Generación del gen que codifica para la toxina Cssll, de! aiacrán C. suffusus suffusus con uso preferencia! de codones de £. coli. a) Secuencia nucleotídíca de los cuatro oligonucleótidos diseñados con uso preferencia! de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Cssll. b) Secuencia nucleotídíca del gen ensamblado de ia toxina Cssi!, con uso preferencia! de codones de E. coli y su traducción en aminoácidos. Se utilizo como DNA templado de ¡a secuencia nucleotídica de la toxina Cssll, la reportada en e! artículo: Estrada, et. al., 2007. Oügo Directo: introduce el sitio de Bamf-i! (negritas) y sitio de corte de enterocinasa en el a ino-terminal de la secuencia. Oligo Reverso: introduce el sitio de Xhol (negritas), en el carboxilo termina! de la secuencia.

Figura 15. Expresión y detección de la proteína de fusión de ia toxina Cn2 recombínante A) Electroforésis en gel de po!iacri!arnida, SDS-PAGE, a! 12%, en el cual se visualiza ia proteína de fusión presente en extractos peripiásmicos de diferentes cepas de bacteria, después de la inducccsón I: E.coíi cepa OrigamiDE3 II: E.coii cepa BI21 DE3 y !H: protefna de fusión de la toxina Cn2 purificada por columna de afinidad a Níquel. La flecha indica ¡a proteína de fusión expresada o purificada . B) Inmunodetección de la proteína de fusión de la toxina Cn2 recombínante, mediante un ensayo de ELISA, en e! cual se incluyo un control negativo (BSA) y un control positivo (toxina Cn2 nativa), para la inmunodetección se utilizó un anticuerpo recombínante Fab8009F especifico contra la toxina Cn2 (además solo reconoce a la Cn2 correctamente estructurada). C) Aminoácidos detectados mediante la metodología de degradación de Edman, se detectaron ios 10 primeros aminoácidos correspondientes ai N- termina! de la proteína de fusión).

Figura 18. Vector de Expresión pET22b~Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina Cn2. Se muestra un esquema del ensamble del gen de la toxina Cn2 mediante seis olsgonucíeóiidos y los sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio, donde fue donado el gen de la toxina Cn2 (BamH! y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la proteína de fusión que se expresa, ¡a cual contiene en el N-terminal ia proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa (E ), luego la toxina Cn2 y finalmente, en el C-terrninai hay 8 histidinas que permiten purificar a ia proteína de fusión.

Figura 17A: Purificación y repurifícación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cn2-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en e! cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina~E -Cn2-6His.

Figura 17B: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK~CII1~6Hís por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-CIH -8His,

Figura 17C: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tsorredoxina-EK-CII2-6His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-CII2-6His.

Figura 17D: Purificación y repurificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cssll~8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cuai la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Cssll-8His.

Figura 18. Ensayo de reconocimiento de las toxinas nativas por los anticuerpos policlonaies obtenidos después del esquema de inmunización. Las toxinas nativas Cn2 y II1 fueron inmunoabsorbidas en placas de ELISA y posteriormente fueron reconocidas por anticuerpos policlonaies obtenidos de la inmunización de ratones con las respectivas toxinas recombinantes. Se indica ¡a dilución que se uso del suero y las determinaciones se hicieron por duplicado.

Figura 19. Títulos de sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteína de fusión Cn2 recombinante. La titulación deí suero de los ratones inmunizados se llevó a cabo utilizando como antígenos el veneno total de C. noxius y a la proteína recombinante Cn2. Se indica las curvas de absorbancia con respecto a la dilución del suero y los títulos obtenidos en cada caso.

Figura 20. Títulos de sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteína de fusión Cssil recombinante. La titulación del suero de los ratones inmunizados se llevó a cabo utilizando como antígenos el veneno total de Centruroides suffusus sulfusus y a ¡a proteína recombinante Cssll. Se indica las curvas de absorbancia con respecto a Sa dilución del suero y los títulos obtenidos en cada caso.

Figura 21. Análisis de la secuencia del gen que codifica para la toxina Ts1 , del alacrán Tityus serruiatus con el uso preferencia! de codones de E. coli. La entrada de la secuencia de DNA del gen al programa E. coli Codon Usage Analysis 2.1 genera un diagrama conformado por una barra horizontal para cada codón. El largo de la barra es proporcional a la frecuencia en la que se expresa cada codón. En la parte inferior de cada codón se indica e! aminoácido codificante.

Figura 22. Análisis de la secuencia de! gen que codifica para la toxina TsNTxP, del alacrán Tityus serruiatus con el uso preferencial de codones de E. coli. La entrada de la secuencia de DNA del gen al programa E. coli Codon Usage Anaiysis 2.1 genera un diagrama conformado por una barra horizontal para cada codón. El largo de la barra es proporcional a la frecuencia en la que se expresa cada codón. En ía parte inferior de cada codón se indica el aminoácido codificante.

Figura 23A. Generación del gen que codifica para la toxina Ts1 , del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencia! de codones de £. coli. A) Secuencia nucieotídica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Ts1. Los cuatro primeros GamTserUpI , CamTserLw2, GamTserUpS y GamTserLw4, son los oligonucleótidos internos y Ts1__4TRXUp y Ts1__4TRXLw, son los dos oligonucleótidos externos. Los nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y en itálicas el sitio de corte de la enterocinasa. B) Secuencia nucieotídica del gen ensamblado de la toxina Ts1 , con uso preferencia! de codones de E. coli . En la hebra codificante de! DNA se encuentra resaltada en itálicas ía secuencia de los oligonucleótidos directos GamTserUpI y GamTserUp3 y en la hebra complementaria de DNA se encuentran subrayados los oligonucleótidos reversos GamTserLw2 y GamTserLw4.

Figura 23B. Generación del gen que codifica para la toxina TsNTxP, del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencial de codones de E coli A) Secuencia nucieotídica de los seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E. coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina TsNTxP. Los cuatro primeros son los oligonucleótidos internos y los dos últimos son oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de los sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa (itálicas). B) Secuencia nucieotídica del gen ensamblado de la toxina TsNTxP, con uso preferencial de codones de E. coli. Figura 23C, Generación del gen que codifica para la toxina Ts3, del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencial de codones de E. coii. A) Secuencia nucleotídica de ios seis oligonucleótidos diseñados con uso preferencial de codones de E, coli y sintetizados para el ensamble del gen de la toxina Ts3. Los cuatro primeros son los oligonucleótidos internos y ¡os dos últimos son oligonucleótidos externos. Nucleótidos en negritas corresponden a las secuencias de ¡os sitios de restricción y del sitio de corte de la enterocinasa (itálicas). B) Secuencia nucleotídica del gen ensamblado de la toxina Ts3, con uso preferencia! de codones de E. coÍi,

Figura 24. Vector de expresión pET22b-Thio y clonación del gen ensamblado de la toxina Ts1. Se muestra un esquema del ensamble de la toxina Ts1 mediante seis oligonucleótidos y ¡os sitios de restricción dentro del vector de expresión pET22b-Thio donde fue clonado ei gen de la toxina Ts1 (BamHi y Xhol). Puede visualizarse un esquema de la proteína de fusión que se expresa, la cual contiene en el N-terminal la proteína Tiorredoxina seguida de un sitio de corte para enterocinasa. luego la toxina Ts1 y finalmente, en el C-terminai hay 6 histidinas que permiten purificar la proteina de fusión.

Figura 25. Expresión y purificación de la proteina de fusión Thio-EK-TsNTxP. A. Gel SDS- PAGE al 12%. 1 ). Extracto de la cepa de E. coli BL21 (DE3) antes de la inducción, 2). Extracto de la cepa de £. coli BL21 (DE3) después de las 6 horas de inducción con SPTG, 3). Extracto periplásmico con PPB, 4). Fracción de agua, 5). Elución de ía proteina de fusión de la columna de afinidad a Ni+2; 6). Proteina de fusión purificada por HPLC en una columna analítica C18 (Tiempo de retención de 34.9 min), 7). Marcador de peso molecular, B. Western Blc-t, 1 ). Marcador de peso molecular, 2). Extracto de la cepa de E. coli BL21 (DE3) antes de la inducción, 3). Extracto de la cepa de E. ooll BL21 (DE3) después de las 6 horas de inducción, 4). Fracción de PPB, 5). Fracción de agua, 6). Elución de la proteína de fusión por la columna de afinidad. 7). Proteína de fusión purificada por HPLC (Tiempo de retención de 34.9 min). La flecha indica ei lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 20 kDa, tanto en el gel como en el Western blot Se emplearon anticuerpos anti-histidinas en el revelado del western blot.

Figura 26A: Purificación y re purificación de la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-Ts1 -8His por HPLC. Cromatograma de HPLC, en el cual la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a ia proteína de fusión Tiorredoxina-EK~Ts1~8Hís.

Figura 26B. Purificación por HPLC de la protefna de fusión Thio~EK~TsNTxP-6His. A la fracción correspondiente al tiempo de retención de 34 minutos, se ie determinó la masa motecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo ¡a serie iónica esperada, la cual indica que ¡a masa experimental es la misma que ¡a teórica, la cual corresponde a 20,630 Da.

Figura 28C. Purificación por HPLC de la praíeína de fusión Thio~EK~Ts3-8His. A la fracción correspondiente a! tiempo de retención 34 minutos se le determinó la masa molecular a través de un espectrómetro de masas y resultó ser similar a la masa teórica, la cual corresponde a 21 ,323 Da.

Figura 27, Ensayo de reconocimiento de ¡as toxinas recombinantes (Mezcla de los híbridos de Ts1 , TsNTxP y Ts3) por ¡os anticuerpos poiiclonales obtenidos después del esquema de inmunización aplicado al conejo 34. Las toxinas recombinantes fueron inmunoabsorbidas en placas de ELISA y posteriormente fueron reconocidas por anticuerpos poiiclonales obtenidos de la 2a, 4a y 5a inmunización del conejo 34 con la mezcla de ¡os híbridos de Ts1 , TsNTxP y Ts3. Se indica la dilución que se uso del suero (3,000, 9,000, 27000 y 81000 corresponden a ¡as diluciones 1 :3000, 1 :9000, 1 :27000 y 1 :81000) y las determinaciones se hicieron por duplicado.

Figura 28. Vector de expresión pQE-30 y donación del gen ensamblado de la toxina Ts1 . Representación del ensamble de los 8 oligonucleótidos para construir el gen del péptido Ts1 , el cual esta flanqueado por los sitios de restricción BamHI y Pstl para ser clonado en e¡ vector de expresión pQE-30. De tal manera, que la construcción quedará conformada por la cuatro aminoácidos del vector (MRGS), seis residuos de histidina, seguidos por un sitio de corte para la proteasa FXa (IEGR) y finalmente la secuencia de la toxina Ts1 .

Figura 29. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión M~6His~FXa-Ts1. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Marcador de Peso Molecular, 2). Extracto de la cepa Origami de £. coü en el tiempo 0, 3). Extracto de ¡a cepa Origami de E, coíi antes de inducir, 4). Extracto de la cepa Origami de £. coü después de inducir, 5). Fracción soluble, 8). Fracción insolubie, 7 y 8). Elución de la proteína M~8His-FXa-Ts1 de la columna de afinidad. 9). Proteína de fusión purificada por HPLC (16 min, ver figura 2). La flecha indica el lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 8.7 kDa.

Figura 30. Purificación y repurificación por HPLC de la proteína de fusión -8His~FXa~Ts1. En el cromatograma la flecha indica la fracción y el tiempo de retención correspondiente a la proteína de fusión.

Figura 31. Espectro de masas. Representa la abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La masa teórica para la proteína fusión -6His-FXa- Ts1 es de 8,742.98 Da.

Figura 32. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión M-6His-EK-Ts3. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Marcador de Peso Molecular, 2). Extracto de la cepa Origami de E. coli antes de inducir, 3). Extracto de ¡a cepa Origami de E. coli después de inducir, 4). Fracción soluble, 5). Fracción insoluble, 6). Elución de la proteína M-6His-FXa~Ts1 de la columna de afinidad a níquel, 7). Proteina de fusión purificada por HPLC (15.8 mín, ver figura 33). La flecha indica el lugar de migración de ia proteina de fusión airededor de los 9.4 kDa. Figura 33. Purificación por HPLC de la proteina de fusión M-6His-EK-Ts3. En el cromatograma se muestra que la proteína es eiut ^' da a los 15.8 min.

Figura 34. Espectro de masas. Representa !a abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La masa determinada experimentaímente es de 9,493.8 Da.

Figura 36. Expresión y purificación por afinidad de la proteína de fusión SVS-6His-EK-TsNTxP. Gel SDS-PAGE al 15%. 1 ). Extracto de la cepa Origami de E. coli antes de inducir, 2). Extracto de la cepa Origami de E. coli después de inducir, 3), Fracción soluble, 4). Fracción insoluble, 5). Elución de la proteína M-8His-FXa-Ts1 de la columna de afinidad. 6). Proteina de fusión purificada por HPLC (15 min, ver figura 38), 7). Marcador de Peso Molecular. La flecha indica el lugar de migración de la proteína de fusión alrededor de los 8.7 kDa.

Figura 36. Purificación por HPLC de la proteína de fusión M-6His-EK-TsNTxP. En el cromatograma se muestra que la proteina es elufda a los 15 min.

Figura 37, Espectro de masas. Representa la abundancia relativa de los iones producidos con respecto a su relación masa/carga. La serie iónica observada indica que ¡a masa teórica es de 8,742.23 Da.

Figura 38: Títulos de anticuerpos de los sueros de los conejos inmunizados con la mezcla de Sas proteínas fvl-SHis-Fxa-Hís, -6His-EK-Ts3, M-6His-EK-TsNTxP. El suero preinmune de los conejos 71 , 72y 73, así como el suero de la primera sangría se evaluaron contra el veneno de Tityus serrulatus.

Figura 39: Títuios de anticuerpos de los sueros obtenidos de la inmunización de conejos con la mezcla de las proteínas y-8His~Fxa-HÍ$, M-8His-EK-Ts3, M~6His-EK-TsNTxP. En la gráfica se muestra la titulación de anticuerpos de los sueros obtenidos en ¡a 2da y 7a sangría contra el veneno de Tityus serrulatus.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Como se puede constatar existe un problema de Salud Pública generalizado en varios países, causado por la picadura de alacranes que contienen toxinas que causan síntomas de intoxicación graves, que si no son tratados en tiempo adecuado pueden ocasionar la muerte de las personas picadas. El tratamiento de elección indicado en ia práctica clínica es la utilización de fragmentos de anticuerpos de caballos híper-inmunizados con ios venenos correspondientes, los cuales son fragmentos funcionales en su capacidad de neutralizar los Ί ^ síntomas de intoxicación de los pacientes. Estos fragmentos se denominan "faboterapicos", cuyo significado viene de la abreviación "Fab" de ¡a literatura inglesa "fragment of antigen binding", que en Español se traduce por "fragmento de pegado a antígeno". Esto es, son los segmentos de las inmunoglobuíinas, sinónimo de anticuerpos, que se pegan a ios antígenos, que son los componentes extraños a los organismos. Los antígenos son todas ¡as substancias extrañas a un organismo que no son aceptados por el sistema inrnunológico, el cual es capaz de sintetizar un anticuerpo que reconoce y se pega al antígeno, impidiendo que este cause daño al organismo en contacto con el antígeno no deseado. La práctica médica consiste en utilizar los "fragmentos de pegado a antígeno" de anticuerpos generados por caballos, los cuales se purifican de la sangre de los animales y se preparan para su uso terapéutico, quedando como el principio activo de los anfivenenos, de donde surge el término "faboterápico" utilizado ya de manera genérica en alguna de la literatura científica del campo. Entonces los faboterápicos, para el caso del piquete de alacranes, son fragmentos neutralizantes de ia acción de las toxinas del veneno de alacrán. Así mismo, existen distintos tipos de faboterápicos dependiendo del tipo de antígeno, en contra del cual queremos tener una inmunoglobulina (anticuerpo) que lo reconozca y neutralice su posible acción dañina al individuo en cuestión.

Para el caso específico de los faboterápicos anti-aíacrán estos se producen por medio de la inyección de mezclas de varios venenos, o de homogeneizados de las glándulas venenosas de alacranes de diferentes especies peligrosas a ios humanos, a caballos que se toman inmunes ai veneno. En México se usa una mezcla de los venenos de las especies de alacrán Centruroides noxius, Centruroides ¡impidas iimpidus, Centruroides suffusus suffusus y Centruroides Iimpidus tecomanus (Alacramyn™ faboterápico del Instituto Bioclón, México). Una vez inmunizado el caballo, su sangre es obtenida y sus inmunogiobulinas son tratadas para producir solamente ¡os fragmentos "F(ab ^' ) ₂ ", entre los cuales hay algunas moléculas que son capaces de neutralizar las toxinas del veneno.

Parte de la invención describe la selección de una mezcla específica de proteínas {toxinas de alacrán fusionadas a la proteína tiorredoxina) que son capaces de generar anticuerpos en cabaílos y en otros animales como ratón y conejo, sin requerir el uso de los venenos totales o del bomogeneizado de glándulas venenosas para producir fragmentos de anticuerpos protectores en contra de las toxinas de varias especies de alacranes, y a continuación se describe la estrategia y los productos (inmunógenos) utilizados.

De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas del veneno de los siguientes alacranes: Para Norte de África, Marruecos, Este de ía cuenca Mediterránea, Sahei Africano, Turquía, Cercano y Medio Oriente:

I . AaHI del alacrán Androctonus australis {Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:1

2. AaHIl del alacrán Androctonus australis (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:2

3. AmmV del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3

4. AmmViH dei alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:4

5. Boíl de! alacrán Buthus o citanus tunetanus (Norte de África, Este de la cuenca mediterránea y el Sahel Africano), SEQ ID No:5

6. Lqhll del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6

7. LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:7

8. Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus (Sur de África), SEQ ÍD No:8

9, Acra4 dei alacrán Androctonus crassicauda (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:9

10, Bul del alacrán Buthacus macrocen us (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:10

De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas dei género Centruroides para México:

I I . Cn2 del alacrán Centruroides noxius (México), SEQ ID No:21

12, CIHdel alacrán Centruroides limpidus (México), SEQ ID No:22

13. Ci¡2 del alacrán Centruroides limpidus (México), SEQ ID No:23

14, Cssil del alacrán Centruroides suffusus (México), SEQ ID No:24

De forma específica, seleccionamos las siguientes secuencias de aminoácidos de toxinas de Tityus serruiatus para Sudamérica:

15. Tsi del alacrán Tiíyus serru!atus (Brasil), SEQ ID No: 13

16, Ts3 del alacrán Tityus serruiatus (Brasil), SEQ SD No: 14

17. TsNTXP del alacrán Tityus serruiatus (Brasil), SEQ ID No:15

Al final de la presente, se proporcionan listados de 38 secuencias de las toxinas recombinantes ya sea maduras o bien híbridas (fusiones) obtenidas y probadas, agrupadas por región geográfica. Las híbridas pueden ser con tiorredoxina o con colas de histidinas y contienen las secuencias de reconocimiento de las endopeptidasas EK y de FXa como se explica más adelante para cada caso.

Una vez conocidas ias secuencias de aminoácidos de las toxinas seleccionadas, se procede al diseño de la estrategia para obtener una secuencia nucieotídica capaz de expresar en un sistema heterólogo dichas toxinas. La selección de dichas toxinas hace parte de la presente invención, pues no obstante que las secuencias fueron determinadas previamente y constan en publicaciones científicas y banco de datos (Rochat et al., 1970; Rochat et al., 1972; Rosso y Rochat, 1985; Alami et al., 2003; Gregoire y Rochat, 1983; Borneman y Hahin, 1993; Corzo et ai., 2001 ; García-Gómez et al., 2009; Callskan, et al., 2013; Caliskan et ai., 2012, Vázquez et. al., 1995; Ramírez et. al., 1994; Dehesa-Davila et. al., 1996; Martin et, al., 1987, Martin-Eauclaire et. al., 1992; Martin-Eauclaire et. al., 1994; Guatirnosim et al., 1999) no es obvio ni está al alcance de cualquier experto en el campo del arte, poder establecer que dichas secuencias funcionarán como inmunógenos, o sea como antígenos, capaces de generar anticuerpos protectores. La presente invención es una innovación tanto en la selección de las toxinas que generan ¡os anticuerpos neutralizantes, así como en ¡a prueba y selección de las mezclas que aportan ventajas al campo técnico, con respecto a lo que implica el uso de los venenos nativos.

Las toxinas seleccionadas se encuentran en cantidades limitadas en sus respectivos venenos, por io cual fue necesario generar un sistema de expresión capaz de producir en cantidad suficiente a las toxinas recombinantes y principalmente en forma estrueturalmente plegada, ya que este tipo de toxinas poseen 8 cisteínas que forman 4 puentes disulfuro, por lo cual aquella toxina recombinanfe que no esté plegada como la nativa tiene muy baja probabilidad de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes. (Pedroso De Lima & Düzgünes N. Eds. 1995). Existen ejemplos en la literatura de toxinas de alacrán expresadas en citoplasma de bacterias, pero éstas son producidas sin plegamiente, es decir, carecen de los puentes de disulfuro que mantienen la estructura tridimensional requerida para su función, por io cual se requiere de un paso extra posterior a su purificación que permite que se formen los puentes disulfuro correctamente. Esto resulta bastante costoso para la producción del antígeno. Además el rendimiento de ¡a proteína plegada final es bajo. En nuestro sistema de expresión bacterial, fusionamos el gen de la proteína tiorredoxina con la toxina deseada y con el plegamiento adecuado.

La tiorredoxina incluida como parte de la fusión protéica en los casos probados, funciona como una proteína que brinda, por una parte, estabilidad a la toxina a ¡a cual esta fusionada y por otra parte, tiene actividad de chaperona de plegamiento intramolecular por lo cual favorece el plegamiento de la toxina a la que esta unida. Además de todos estos beneficios, el hecho de que la toxina recombinante este fusionada a la íiorredoxina y este híbrido se utiiice para inmunizar, hace posible que se pueda aplicar una mayor cantidad de toxina porque en su forma de híbrido no es tóxica, de esta manera representa a un inmunógeno ideal, estrucíuraimente plegado, estable y no tóxico para inmunizar a los animales experimentales.

!nrrsunogenos recombirsantes á® alacranes del Norte de Africa, b rruecos, Este de la cuenca Mediterránea, Sahd Africano, Turquía, Cercano y Medio Oriente

Se diseñaron olígonucleótidos externos e internos para ensamblar a cada una de ias toxinas, AaH ly AaH II del alacrán Androctonus austraiis Héctor, AmmV y AmmVIII del alacrán Androctonus mauratanicus auretanicus, Bot I del alacrán Buthus occñanus tunetanus, Lqhll y LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus, Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus, Acra4 de! alacrán Androctonus crassicauda y Bul del alacrán Buthacus macrocentrus, con uso preferencial de codones de E. cois. Estos olígonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química, en la unidad de síntesis y secuenciación del ADN del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Véanse Figuras 1A-1J

Se realizó el ensamble de la secuencia nucleotídica de los genes mediante PCR recursivo y clonación posterior en el vector pBluescriptKS(-). El PCR de ensamble de cada toxina fue realizado utilizando Vent DNA polimerasa (New Engiand Biolabs, USA), siguiendo las instrucciones sugeridas por el proveedor. Los dos olígonucleótidos externos se usaron a una concentración final de 0.2 pmoí/μΙ y los olígonucleótidos internos a una concentración de 0.02 pmol/μΙ. Las condiciones de PCR fueron: 5 minutos a 94°C, seguido por 8 ciclos con una temperatura baja de alineamiento (94°C 30 seg, 50°C 1 min, 72°C 1 min), y luego 25 ciclos cortos con una temperatura alta de alineamiento (94°C 30 seg, 80°C 30 seg, 72°C 30 seg), finalizando con 5 min de incubación a 72°C.

Los productos de PCR fueron separados en gel de agarosa y purificados con el kit QIAQuick gel extraction (QIAGEN, USA). Los productos de PCR fueron clonados con extremos romos dentro del vector pBluescriptKS(-) (Stratagene, USA), digerido previamente con la enzima EcoRM, usando T4 DNA ligasa (Fermentas, Canad ), de acuerdo al protocolo suministrado por el proveedor. Ei producto de ligación fue electrotransformado dentro de células electrocompetentes DH5 alpha las cuales fueron subsecuentemente plateadas en cajas Petri con medio 2XYT conteniendo además IPTG/X-Gal/Ampicílína para selección de clonas blancas o azules y las clonas positivas (blancas) fueron verificadas por PCR de colonia con los olígonucleótidos T7-like (5'-GCG TAA TAC GAC TCA CTA TA-3") y T3-like (5"-CTC ACT AAA GGG AAC AAA AGC-3'). Las clonas que dieron el PCR con el tamaño esperado fueron amplificadas y se obtuvo DNA plasmídico de ellas por medio del método de lisis alcalina. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia donada de cada gen de cada toxina fuera correcta.

Se continuó con la preparación del vector de expresión pET22b-Tiorredoxina~sitio de corte para Enferocinasa. Para construir el vector de expresión, se ocupó el vector pThioHís C (ínvitrogen) para obtener el gen que codifica para la tiorredoxina y el sitio de corte para enterocinasa (EK) ₍ para lo cual se realizó un PCR utilizando oligonucleótidos que incluían el sitio de restricción Ncoi en el amino-terminal de la tiorredoxina y el sitio Xho en el carboxilo terminal del sitio EK, El producto de PCR fue digerido con las enzimas A/col y Xhol y se clonó en el vector de expresión pET22b (Novagen). Este vector de expresión fue llamado pET22b- Thio. Véase la Figura 2.

Una vez preparado el vector de expresión pET22b-Thio, procedimos a la inserción de los genes ensamblados dentro del mismo. Las secuencias que codifican para cada toxina clonada en el vector pBluescriptKS {-), descritas anteriormente, fueron usadas como templados para reaamplificar por PCR los genes de las toxinas y proseguir con su subcionación en el vector de expresión pET22b-Thio. Los oligonucleótidos externos que codifican para el N-terminal de cada toxina contienen un sitio de clonación BamHI el cual permite clonar al gen de la toxina en el mismo marco de lectura que el gen de la tiorredoxina del vector de expresión, seguido por una secuencia que codifica para el sitio de corte de la enterocinasa bovina (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) para poder separarla de! último gen que codifica para la toxina. Esta construcción se hizo para cada una de las toxinas recombinantes utilizadas en el proyecto. El oligonucleótido reverso introduce un sitio de restricción Xhol diseñado para mantener la construcción en el marco de lectura de la secuencia que codifica para las 8 histidinas del vector de expresión.

Por lo tanto, los plásmidos conteniendo a los genes de las toxinas fueron digeridos con las enzimas BamHI y Xhol (New England Bioiabs, USA) y los insertos liberados fueron purificados por electroforesis de gel de agarosa utilizando el kit "QIAQuick gei extraction" (QIAGEN). Los fragmentos de restricción purificados fueron ligados al vector de expresión pET22b-Thio previamente digerido con BamHI y Xhol. Véase la Figura 2.

Cada uno de ios vectores de expresión conteniendo el gen codificante para la toxina fue eiectrotransformado dentro de células bacterianas. La bacteria que se utiliza es E. coli cepa BL21 (DE3) (Stratagene, Agilent Technologies Co.), esta cepa no es patógena, está modificada genéticamente en funciones relacionadas con recombinación de su material genético, síntesis de aminoácidos, producción de proteasas, entre otras funciones, con el fin de hacerla más eficiente para ia expresión de proteínas recombinantes. La principal característica de BL21 (DE3) es que incluye DE3, un profago Π , que contiene el gen de la T7 2 ϋ

RNA poíimerasa bajo el control del promotor lacUVS, por lo cual es posible utilizarla para producir proteínas a partir de un gen clonado en un vector de expresión bajo el control del promotor T7.

La E. coü cepa BL21 (DE3) es descendiente de la cepa E. coü B utilizada por el Instituto Pasteur en París, en los primeros estudios con bacteriófagos. E. coü B es el hospedero más común de los fagos T1-T7, por lo cual las cepas derivadas de E. coü B son ampliamente usadas junto con ¡os derivados de E. coü K-12. Ambas consideradas corno organismos de bajo riesgo {Nivel 1 ) (NIH Guideíines, U.S. Departament of Health and Human Services, 1986). E. coü BL21 (DE3) codifica para proteínas que le otorgan resistencia al antibiótico ampicilina. El gen que codifica para la proteína que confiere la resistencia al antibiótico, es obtenido de la naturaleza y es utilizado en ingeniería genética para seleccionar e identificar al organismo ya modificado. Los métodos utilizados para la introducción de material genético en ¡a cepa modificada son transformación, conjugación o transfección. En nuestro proyecto de investigación solo utilizamos el método de electrotransformación para introducir en E. coü BL21 (DE3), el plásmido portador dei gen que codifica para ia toxina de interés.

Para la expresión de las proteínas de fusión Tiorredoxina-Toxina, se procedió de la siguiente manera: Se creció pre-inóculo en medio LB con ampicilina a una concentración fina! de 100 fig/rni. El cultivo se obtiene de cepas recién transformadas con el vector correspondiente o directamente de un vial de glíceroi de la cepa de interés. Se crecieron cultivos de 750 mi de LB a 37°C y 200 rpm de la cepa BL21 transformada con el plásmido de expresión. Previamente, se adicionó ampicilina al medio de cultivo, a una concentración final de 200 μθ/ΕτιΙ, Después de crecer hasta una DO entre 0.7-1 , medida a 600 nm, se indujo la expresión con IPTG (Isopropy! β-D- -thiogalactopyranoside) a concentración final de 1 rn por un periodo de 6 a 12 h manteniendo los cultivos a 30 °C. Después se centrifugó a 5,000 x g durante 10 min a 4°C en tubos para centrífuga de 250 mi, con el fin de obtener todo el precipitado celular. Se congelaron las células -20°C, hasta su uso.

Para la obtención del extracto peripiásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión expresada, se resuspendieron completamente las células precipitadas en 20 mi de buffer PPB (200 mg/ml de sacarosa, 1 mlVI EDTA, 30 m Tris-HCI pH8) y se incubó en hielo durante 30 minutos. Se centrifugó 20 minutos a 5,000 x g y se recuperó el sobrenadante. Posteriormente, se resuspendió el precipitado celular en 20 mi de H ₂ 0, se incubó por una hora en hielo y se centrifugó nuevamente a 5,000 x g por 20 min a 4"C. Se recuperó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en 5 mi de Tris 50 mM, pH 8. Las células se rompieron utilizando sonicador, dando pulsos de 30 segundos de encendido y 10 segundos de descanso. Esto se realizó siempre en hielo, para evitar que se calentase la muestra. Luego se centrifugó a 5,000 x g a 4°C durante 20 min y se recuperó el sobrenadante. Se adicionó DNAsa a los sobrenadantes recuperados ^g de DNAsa por cada 1 mi de cóiuias iisadas), se incubó 15 minutos en hielo y se centrifugó 5,000 x g a 4°C durante 20 min o hasta eliminar completamente ¡os restos celulares de ¡a muestra. Se recuperó el sobrenadante y se filtraba la muestra, en caso de ser necesario. Se adicionó azida de sodio (concentración final 0,02%) para evitar contaminación. Este extracto se utilizó para ¡a purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad. Véase ia Figura 3 (carriles 2 y 3).

Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC. Utilizamos columnas de afinidad que contenían resina Ni-NTA agarose (QIAGEN), siguiendo las recomendaciones del proveedor. Una vez obtenido el extracto, se empacó la resina en una columna adecuada al voiumen usado (10 mi), se equilibró con tampón fosfato salino, comúnmente conocido como buffer PBS (por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buñered saüne) concentración 1X y pH=8, adicionando 20 mM de imidazoi. Previo a la elución de ias proteínas, se realizó un lavado con PBS + 30 mlvl de imidazoi. Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazoi en PBS 1X (véase ejempio en la Figura 3). Se colectaron de 3-5 fracciones de 1 mi cada una. Posteriormente se realizó la repurificación por RP HPLC, usando como solvente A 0.1 % TFA en H ₂ 0 y solvente B 0.1 % TFA en acetonitriio. Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm. Véanse Figuras 4A - 4J.

Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) de acuerdo con el método descrito por Laemmíi (Laemmli, 1970). Se utilizó una cámara Mighty small II (Hoefer Scienfific Instruments, San Francisco, USA), con geles de 0.75 mm de espesor. Un gel concentrador al 5 % precede al gel de separación al 12%. Cada una de las muestras se diluyó en una solución de desnaturalización que contiene 125 mM Tris pH 8.8, 4% dodecil sulfato de sodio (SDS), 20% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol, 0.05% (v/v) de azul de bromofenol y se incubaron durante 5 min a 95 °C. La separación se efectuó a corriente constante de 30 mA. Después de la migración el gel se incubó en una solución de ácido acético (10% v/v), metanol (30% v/v) y azul de Coomassie (0.2% v/v). Posteriormente se realizaron lavados del gel en una solución de agua: metano!: ácido acético en una relación 6:3:1 respectivamente, para quitar el exceso de colorante. Véase ejemplo en la Figura 3 (carriles 2 y 3).

Las digestiones de las proteínas de fusión se realizaron con la proteasa enteracinasa (EK) (Roche Applied Science, Alemania), siguiendo las especificaciones del proveedor. La reacción de proteólisis se iievó a cabo después de purificar la proteína con aprox. 98 % de pureza. La concentración final de proteína de fusión para la proteólisis fue de 1 mg/m! en una solución de Tris 10 mM, pH 8. La reacción se reaiizó a 16 °C durante 14 h.

Las masas moleculares de los péptidos recorrí binantes obtenidos fueron determinadas mediante ¡VIALDI-TOF o ESi-ION-TRAP (Romeo et ai., 2008), en el laboratorio de proteómica del instituto de Biotecnología de la UNAM.

Los inmunoensayos ligados a enzima (ELISA) se realizaron en placas de polivinilo de 96 pozos (Costar, Cambridge MA. U.S.A.) acoplando 3 μg por pozo de la toxina nativa disueíta en una solución de NaHC0 ₃ 0.05 M H 9.4 incubado a 37 °C por 1 h. Se realizaron 3 lavados con PBS 1X adicionado con 0.1 % de tween 20 (a esta solución de PBS 1X + Tween lo abreviamos como PBST). Los sitios de unión no específica fueron bloqueados con una solución saturante de BSA (albúmina sérica bovina) al 0.5% en PBST coiocando 200 μΙ por pozo e incubando a 37 °C durante 2 h ó a 4°C durante toda la noche. Se realizaron 3 lavados con PBST. Se prepararon diluciones seriales del suero con PBS colocando 100 μΙ de cada dilución por triplicado e incubando a 37°C durante 1 b. Después de los correspondientes 3 lavados con PBST se adicionaron 100 μΙ de una dilución 1 :2,000 (v/v) del anticuerpo cabra- antiratón acoplado a peroxídasa en PBST incubando a 37°C durante 1 h. Para la reacción enzirnáiica se preparó una solución de fosfatos 0.1 M a pH 5 adicionado con 0.4 de orto- feniídiamina, y 0.4 μΙ de peróxido de hidrógeno a! 30% por mililitro. Se coíocaron 100 μΙ por pozo. Se incubó protegiendo de la luz por 10 min a 37°C y se detuvo la reacción adicionando 100 μΙ de HCI 6 N en cada pozo. Se midió la absorbancia a 492 nm inmediatamente, ya que la reacción de oxidación continúa.

La actividad tóxica de cada antígeno recombinante fue evaluada en ratones cepa murina CD1 , a los cuales se les inyectó vía intraperitoneal diez veces la dosis letal media (DL _S0 ) reportada para cada toxina.

El resultado obtenido fue que a esa concentración la proteína no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que la toxina al tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N- terminal, afecta su actividad probablemente por impedimento estérico. Sin embargo, el hecho de que como proteína de fusión la toxina no sea tóxica es una de las principales ventajas al utilizarla como antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el animal sujeto al proceso de inmunización sufra ei efecto tóxico de la recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con altas dosis del antígeno.

Además en varios experimentos (se describe con detenimiento más adelante) se inmunizaron ratones y conejos con las toxinas recombinantes y al realizar experimentos de desafío, estos mostraron haber desarrollado anticuerpos que son capaces de reconocer el veneno y proteger en contra de ¡as toxinas. Por esta razón resolvimos también realizar ¡os experimentos de inmunización en caballos, que son ios animales experimentales de elección para ¡a producción de faboterápicos (anticuerpos neutralizantes), y que además son ios procedimientos autorizados por ¡as autoridades de salud, tanto nacional como de ¡a Organización Mundial de ía Salud. Los antivenenos actualmente en uso para humanos, en su mayoría son hechos mediante hfper-inmunización de caballos. Ejemplo de esto es el llamado "Alacramyn", que es uno de los antivenenos actualmente en uso en la población Mexicana que requiere de este producto.

Los venenos totales de alacranes empleados en ios experimentos que sustentan ¡a presente descripción fueron comprados a la compañía Latoxan (Francia).

A continuación se describe la inmunización en ratones y los resultados de neutralización utilizando los sueros obtenidos. Se inmunizaron inicialmente grupos de 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio. Los inmunógenos utilizados fueron las proteína de fusión r(toxina)His (SEC ID No 12, SEC ID No 13, SEC ID No 14, SEC ID No 16, y SEC ID No 18). La inyección de ¡as toxinas se realizó por vía subcutánea. La emu¡sión se preparó con la toxina disuelta en PBS ai 1X con adyuvante completo de Freund (rockiand) en la primera inmunización, e incompleto o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μΙ de solución por ratón en cada ocasión, con un periodo de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó la generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas o recombinantes por ensayos de ELISA. Después de la última inmunización se realizaron pruebas de neutralización de 1 a 3 DL ₅₀ de veneno total con grupos de 3 o más ratones (Ver Tablas 1-3 de datos de neutralización, de acuerdo al esquema de inmunización que les precede.

Para la presente invención se inmunizaron grupos de ratones: con cada uno de los híbridos de ¡as toxinas recombinantes (formato de proteína de fusión): rThio-toxina (rThio-EK-toxina- 8His) (SEC ID No 11- SEC ¡D No 20). Se realizaron dos esquemas de inmunización: a) para Sas toxinas recombinantes rThioAaHIl, y rThioAmmV + rThioAmmVlli (se inmunizo con ambas toxinas), se ¡levaron a cabo 5 inmunizaciones usando cantidades de rThio-toxina (desde 5 a 25 μο) y volumen de PBS (en μΙ) variables (ver detalles en el esquema i), b) Para la toxina rThraLqh2 se realizaron 6 inmunizaciones usando una cantidad de toxoide (30 μο) y volumen de PBS (en μΙ) fijos (ver detalles en el Esquema ii). Para ambos esquemas, en la primera inmunización se inyectó un adyuvante completo de Freund (Rockiand), para desarrollar ¡a respuesta inmunológica del ratón; ias siguientes fueron con adyuvante incompleto o alúmina, alternadamente. A continuación se muestran los esquemas de inmunización y ios resultados de la neutralización correspondiente:

Esquema de inmunización I: Se inmunizaron 10 ratones con la proteína de fusión:

Tiorredoxsrs®-EK-AaHH-8His

TIorredoxina-EK-AmmV-fiHis

TiorredQxlna-E -AmmVIÍI-8His

1 ^a . inmunización 5 9 de proteica tota! / Adyuvante completo

2 ⁸ . Inmunización 10 μο de proteína total / Adyuvante incompleto

3 ^a . Inmunización 15 μ3 de pro-teína total / Alúmina

4 ^a . inmunización 2ϋμρ de proteína total / Adyuvante incompleto

5 ^a . inmunización 25 ¡ig de proteína total / Alúmina

Volumen inyectado a cada ratón: 50 μί Una vez terminado el protocolo de inmunización se procedió a desafiar la capacidad protectora del proceso de inmunización con ias proteíns híbridas, inyectando directamente el los anímales previamente inmunizados los venenos solubles de lo alacranes a ¡as dosis indicadas en la Tablas 1 a 3.

Tabla 1. Reto directo de Sos ratones inmunizados CO! n ia proteina de fusión

Tlorred© xsrsa~EK-AaHil-6His con el veneno de Androct onu. s austraiis.

Suero OLso eneno usado Proporción de ratones sobrevivientes con respecto al total de ratones ensayados

Suero d e ratones inmunizados 3 DL.50 de veneno de 8/1 1

con ia proteina de fusión Androctonus austraiis

Tiorredox ina-EK-AaHli-6His

Controles 3 DL.50 de veneno de 0/3

Androctonus austraiis

Síntomas observados en el ratón d e prueba: 6 de los ratón es n stados mostraron síntomas severos c ie intoxicación, pero sobre ^■ ¡vivieron a ia inyección.

En el caso de los ratones controles: todos murieron entre un tiempo de 25 minutos a 1 y media ho ra. Tabla 2, Reto directo de Sos ra tomes inmunizados, cos fas proteínas de fusión Tiorredaxina-EK-AmmVHI-6Hís y Tiorredoxina-EK-AmmV- 6His, con el veneno de Androctonus australls.

Suero DLSQ veneno usado Proporción de ratones sobrevivientes con respecto ai total de ratones ensayados

Suero de ratones inmunizados 3 DLso de veneno de 8/10

con ¡as proteína de fusión Androctonus australis

Tiorredoxina-EK-AmmVüi-BHis y

Tsorredoxina-EK-AmmV-6His

Controles 3 DLso de veneno de 0/3

Androctonus australis

Síntomas observados en ios ratones inmunizados: Se observaron síntomas de intoxicación severa en 4 ratones, pero 3 horas posteriores a la inyección y sobrevivieron 8 ratones de un grupo de 10 Síntomas observados en los ratones control: todos murieron entre un tiempo de 25 minutos a 1 hora y media.

Nota: Es importante notar que ios ratones fueron inmunizados con Sa mezcia de las proteínas de fusión de AmmV y AmmV! í i (de Androctonus mauretanicus mauretanicus) y e! reto fue con veneno de Androctonus austraiis.

Esquema de inmunización II:

Esquema de inmunización utilizado par a inmunizar un grupo de rator ses (cepa CD1) cor, ia proteína fusión Tiorredoxina-E -Lqhi!-6His.

No, No. DE CANTIDAD DE Te txina ADYUVANTE INMUNIZACIÓN RATONES > ( ¡g) tola! (tipo)

1 10 30 Completo

2 10 30 Incompleto

3 10 30 Aiúmfna

4 10 30 Incompleto

5 10 30 Alúmina

6 10 30 Incompleto

También obtuvimos los títulos de anticuerpos en conejos después de someterse a inmunizaciones con ia mezcla de las proteínas de fusión correspondientes a las toxinas recombinantes AaHI y AaHN de Androctonus austraiis, ArnmV y AmmVIII de Androctonus maur&tanicus, Lqhll y LqhlV de Leirus quinqueshiatus y Boíl de Buthus occitanus, mediante ensayos de ELISA. Así como, la evaluación de la capacidad neutralizante de los sueros obtenidos contra el veneno total de los alacranes ya antes mencionados, tal y como se describe a continuación: A partir de los sueros obtenidos se purificaron anticuerpos mendiante 3a cromatografía de afinidad a Proteína A. Los anticuerpos purificados se evaluaron mediante ensayos de ELISA y Western blot para determinar la capacidad de reconcimiento hacia cada una de las toxinas recombinantes.

Partiendo de Sas proteínas de fusión correspondientes a las toxinas AaHÍ. AaHIl, ArnrnV, AmmVIII, Lqhll, LqhlV y Boti tratando de cubrir los tres grupos inmunogénicos: I

AaHf KRDGYIVYPNNCVYHCVPP-CDGLCKK GGSSGSCS—

VPSGLAC CICOLPDNVPSKDTS CT

Lq lV GVRDAYiADDKNCWTCGANSYCNTECTKNGAESGYCQWFGKY- GNACWCIKLPDKVPIRIPG-KC-R

U

AaH2 V DGYIVDDVNCWCGR AYCNEECTKLKGESGYCQ ASPY- G ACYCY LPDHVRTKGPGR-CH

AmmV L DGYIVND! CTYFCGR AYCNELCf LKGESGYCQWASPY- GNSGYCY LPDHVRT GPGR-CN

Lqhil fKDGYfVDDVNCTYFCGRNAYCMEECTKL GESGYCQWASPY- GNACYCY LPDH¥RT GPGR-C~

Amm¥ L DGYI1DDL CTFFCGR AYCDDEC K GGESGYCQ ASPY- G N AC WC Y LPD RVSf KE KG R-C

GRDAYIAQPENCVYECAQNSYCMDLCTKNGATSGYCQWLGKY'

G AC CKOLPDNVPIRIPGK-CHF

Ai incluir las toxinas en los tres grupos inmogenicos en los protocolos de inmunización en conejos de la cepa Nueva Zelanda, se espera obtener anticuerpos con la capacidad de neutralizar al veneno completo de los diversos alacranes que contienen estas toxinas. A continuación se muestra el esquema de inmunización en conejos que se siguió:

Esquema de inmunización en conejos (05, 06, 08} con las toxinas recombinantes AaHI, AaHIl, AmmV, AmmVIII, LqhIL LqhlV y Botl. μ!

5íi¡rtiiE!;s Facha Adyuvante Toxina bcutén Sangría

ciór¾ (añs 2014- m Recomb 80/

16) imante conejo

1 ^B 31 de Complet 250 30 500 Pr nm n

Octubre o e

2 ^a 14 de fncomple 300 50 600

Noviembr to

e

3 ^a 28 de Alúmina 300 100 600

oviambr

@

4 ^a 12 d® Ineomple 300 200 600

Diciembr to

Θ

5 ^a 26 de Alúmina 300 250 600

Oicsembr

e

6 ^a 09 de ¡ncomple 300 300 600 1 ^a Sangría

Enero to

7 ^a 27 de Alúmina 300 350 600

Enero

8 ^a 13 ¡ncompS© 300 400 600 2 ^a

Febrero to Sangría

9 ^a 27 Alúmina 300 4S0 600

Febrero

10 ^a 13 de Ineomp 300 SOO 600 3 ^a Sangría

to

11 ^a 28 de Alúmina 300 700 600

arzo

7 de Abril 4 ^a Sangría

12 ^a 14 de fncomplle 300 600

Abril to

23 da 5 ^a Sangría

Abril

Para evaluar ía capacidad del suero de los conejos hiperínmunizados se determinaron los títulos de ¡os anticuerpos mediante ensayos ELISA por el método convencional con anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa se detectó absorbancia a 490 nrn.

Quince días después de ¡a quinta inmunización se realizó la primera sangría y se evaluaron los títulos de anticuerpos contra las toxinas recombinantes así como con veneno total. En ía tabla 4 se muestran los valores obtenidos contra las toxinas recombínantes y contra la 2.9 proteína acarreadora Tiorredoxina. En la figura 5 Se puede observar que las toxinas son más inmunogénicas que el acarreador.

Los títulos de anticuerpos obtenidos después de la quinta inmunización contra el veneno diversos alacranes del norte de África se muestran en la Tabla 5 y en la Figura 6.

Como se puede observar en !a Figura 6 hay un mejor reconocimiento del veneno de Androctonus mauretanicus en ios tres conejos, mientras que el suero del conejo 08 comienza a tener reconocimiento del veneno de A. austraiis.

Posteriormente, se reaíizaron cuatro sangrías con una diferencia de un mes cada una. Con los sueros obtenidos se evaluaron los títulos de anticuerpos contra el veneno de las especies de alacrán ya empleadas, mediante ensayos de ELISA. Los resultados se muestran en la tabla 6 y en la figura 7. Tabla 6. Títulos de anticuerpos del Conejo 05

Veneno \ Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría

Androctonus australis i 3,353 ± 642 7,497 ± 1 ,004 10,465 ± 1 ,231

Androctonus rnauretanicus j 2,494 ± 480 5,653 ± 918 10,510 ± 1 ,11 1

Buthus occítanus 3,994 ± 1 ,067 6,591 ± 1 ,237 6,976 ± 959

Leiurus quinquestriaíus j 3,519 ± 686 6,873 ± 649 j 7,997 ± 857

Tabla 7. Títulos de anticuerpos del Conejo 08

Veneno Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría

Androctonus australis 3,160 ± 629 6,725 ± 750 10,228 + 978

Androctonus rnauretanicus 2,491 ± 551 6,617 ± 900 13,165 ± 839

Buthus occítanus 24,895 ± 2,068 6,649 ± 901 7,589 ± 584

Leiurus quínquestriatus 12,422 ± 1 ,068 6,998 ± 635 9,120 ± 1 ,390

Tabla 8. Títulos de anticuerpos del Conejo 08

Veneno Segunda Sangría Tercera Sangría Cuarta Sangría Androctonus austraiis 2,230 ± 304 6,718 + 746 8,321 ± 1 ,057 |

Androctonus maurítanicus 2,155 ± 614 6,631 ± 832 8,371 ± 708 |

Buthus occítanus 14,009 ± 1 ,593 21 ,196 ± 2,1 14 7,146 ± 71 1 |

Leirus quínquestriatus 11 ,43 1 1 ,255 8,995 ± 387 7.330 ± 780 I

Como se puede observar en los datos anteriores, el conejo 08 es el que presenta mejores títulos contra los venenos de A. austraiis, A. rnauretanicus, B. occítanus y L quínquestriatus, por lo que se decidió usar el suero de este conejo para realizar de ensayos de neutralización contra Sos cuatro venenos en ratones hembra de la cepa CD1 de 18 a 20 g de peso. Ver figuras 8 y 9, Debido a que los títulos contra ¡os venenos no fueron tan altos se decidió comenzar a probar 2 DL ₅₀ de cada veneno solo en dos ratones control y dos más para el ensayo de neutralización con 250 μΙ de suero. En los casos en donde hubo muerte de los ratones en presencia del suero se redujo a 1 DL ₅₀ , mientras que en otro caso se dejaron las 2 DL ₅₀ debido a que se observaron síntomas severos de intoxicación de los ratones y en otro se aumentó a 3 DL ₅₀ .

En las siguientes tablas se muestran ios resultados obtenidos del ensayo de neutralización realizado con el suero obtenido del conejo 06 después de ¡a doceava inmunización. Para todos los experimentos se usaron 250 μΙ de suero.

En la tabla 9 se muestran los ensayos de neutralización del veneno de A. australis, en donde se observa que con 2 DL ₅₀ el 100% de la población de los ratones tanto en los controles como con el suero mueren. Por lo que se retaron los ratones solo con 1 DL ₅₀ de veneno y en los ratones control se observa la muerte en 30 minutos, aquí se esperaría solo la muerte del 50 % de ia población por lo que esto ndica que tal vez no estamos usando la cantidad de veneno correcta o este grupo de ratones fue muy sensible, por lo que habría que hacer más ensayos. Ahora bien, cuando se compara el grupo control con los del suero se observa que muere el 50% de la población y el tiempo en el que se presentan los síntomas se retarda, en el control los ratones mueren alrededor de los 30 minutos, mientras que en el otro grupo mueren a ios 70 minutos.

En la tabla 10, se muestra que con 2 DL ₅ o del veneno de A. mauretanicus muere el 100% de la población, mientras que aplicando el suero solo muere un 50%. Por esta razón, se decidió retarlos solo con una DL ₅₀ y se observa que el 100% de la población control muere, mientras que al inyectar esta misma dosis del veneno con el suero hay una sobrevivencia del 100%. Estos resultados indican que los anticuerpos del suero del conejo 06 son capaces de neutralizar una DL ₅₀ del veneno de A. inaureíanícus.

En la tabla 11 , se muestra que se inyectan solo dos ratones con 3 DL50 del veneno total de L. quinquestriatus. Se observa que el 100% de la población muere tanto en el grupo de los ratones control como en los que se administra el veneno mezclado con los 250 μΙ de suero. Con base en estos resultados, se decidió retar a un grupo de 8 ratones solo con 2 DL50 del veneno con y sin suero. Se observa que el 100% de los ratones control muere mientras que en el otro grupo sobreviven el 100%, Estos resultados indican que el suero del conejo 08 es capaz de neutralizar 2 DL50 del veneno de L. quinquestriatus.

En la tabla 12 se muestra el ensayo de neutralización con el veneno de Buthus occitanus, en la cual es evidente que el suero del conejo 06 es capaz de neutralizar 2 DL ₅₀ del veneno total.

Como se puede observar en las tablas anteriores, el suero del conejo 06 no solo tiene una buena capacidad de reconocer a los diferentes venenos de los alacranes del norte de África, sino que también es capaz de neutralizar 1 DL ₅₀ , 2 DL ₅₀ y 3 DL ₅₀ de los venenos de A. austraiis, A, mauretanicus, B. occitanus y L quinquestriatus, respectivamente.

En los resultados anteriores se muestra que los anticuerpos obtenidos en este protocolo de inmunización no fueron capaces de neutralizar 3 DL ₅₀ de todos los venenos empleados. Como se recordará nosotros empleamos en el protocolo de inmunización las toxinas recombinantes que conforman los tres grupos inmunogénicos, por lo que tai vez al inyectarlas todas se está generando una distracción inmunológica. Sin embargo, resultados previos obtenidos tanto en caballos como en ratones, muestran que al inmunizar estos animales con las toxinas recombinantes que pertenecen al grupo ínmonogénico II (AaHIl, Lh2, Amm5 y Amm8) los anticuerpos que se generan son capaces de neutralizar a 3 DL ₅₀ de los venenos de A. australis, A, mauretanicus y L quinquestriatus. Por lo tanto, para protocolos posteriores se recomienda inmunizar con las toxinas que pertenecen a cada grupo por separado. De acuerdo con los resultados anteriores se decidió purificar ios anticuerpos del suero del conejo 03 mediante cromatografía de afinidad a Protesna A, Ver resultado en la figura 10. La Proteína A tiene la característica de unirse a la región Fe (fragmento constante) de las inmunogíobulinas a través de la interacción con la cadena pesada. El protocolo para la purificación de los anticuerpos se basa en el uso de cromatografía de afinidad con agarosa acoplada a Proteína A, ésta permite que los anticuerpos presentes en el suero diluido en buffer de unión queden unidos a la columna como lo marca la técnica convencional y utilizando un flujo lento se van colectando fracciones de 1 mi. Se deja de pasar buffer hasta que la absorbancia a 280 nm sea igual o menor a 0.07, se usa buffer 2M Tris-HCI pH 8.0 para prevenir la desnaturalización de los anticuerpos. Las fracciones de interés se dializan contra 10 volúmenes de la muestra con PBS1X, se realizan cuatro cambios de 1 hora a 4 °C. Los anticuerpos se almacenan en PBS1X + 50% de Glicerol + 0.02% NaN _3> se preparan alícuotas de 750 pg/1.5 mi y se guardan a -70°C. Con estas alícuotas se determinó el título de anticuerpos contra las toxinas recombínaníes AaHI, AaHIi, AmmV, AmmVII, Lqhll, LqhlV y Botl. Ver Figura 1 1.

Con ¡os anticuerpos purificados se puede monitorear la expresión de las toxinas recombínaníes ya mencionadas. Para evaluar el reconocimiento de estos anticuerpos, se corrió un gei de SDS-PAGE al 12%, aplicando en cada carril 10 pg de praíeína de fusión reconnbinaníe pura (Thio-EK-AaHI, Thio-EK-AaHIl, Thio-E -AmmV, Thio-EK-AmmVIII, Thio- EK-Lqhll, Thío-EK-LqhJV, Thio-EK-Bofl). Cada proteína se cargó por duplicado en el gel; una parte se tiñó con azul de Coomassíe y la otra mitad se transfirió a una membrana de nitroceluíosa para el inmunoensayo Western Blot (WB), empleando el método Semihúmedo de Kyhse-Andersen. El anticuerpo purificado se utilizó a una dilución típicamente de 1 :50000, sin embargo, la dilución usada depende del suero del respectivo conejo inmunizado. Se incubó 1 h a 37° C. En la Figura 12 se muestra el reconocimiento de las proteínas de fusión recombinante por el anticuerpo purificado. Como se muestra en la Figura 12A, se observan bandas alrededor de los 20 kDa correspondiente a las proteínas de fusión de interés, así como un dímero de estas proteínas entre 35 y 40 kDa. En el caso del WB, se observa un buen reconocimiento de las proteínas obteniéndose bandas alrededor de los 20, 40 y 80 kDa, indicando que el anticuerpo está reconociendo también dímeros y trímeros de las proteínas de fusión.

Estos resultados indican que estos anticuerpos pueden ayudar a monitorear tanto la expresión como la purificación de las proteínas de fusión Thio-EK-AaHI, Thio-EK-AaHI I, Thio- EK-AmmV, Thío-EK-AmmVlli, Thio-EK-Lqhll, Thio-EK-LqhlV, Thio-EK-Botl.

Posteriormente, se procedió a la realización de ensayos ahora para la especie Parabuthus granuiatus. Con el fin de obtener el suero suficiente para realizar ensayos de neutralización contra el veneno de esta especie, se propuso un esquema de inmunización en conejos que se detalla enseguida, como inmunógenos se empleó tanto la toxina recombinante Pg8 digerida sin tiorredoxina (para evitar distracción del sistema inmune), y también se usó ¡a proteina recombinante Pg8 sin digerir.

Se inmunizaron dos grupos de conejos Nueva Zelanda de 2,5 Kg con cada uno de estos inmunógenos, ¡a administración fue vía subcutánea, inyectando la toxina recombinante en un volumen final de 500 μ! de PBS 1X. Se realizaron 8 inmunizaciones con lapsos de 10 días entre ellas. Una vez terminado el protocolo de inmunización, se llevaron a cabo ensayos de neutralización del veneno total con los sueros obtenidos. Se emplearon 3 grupos de ratones con peso aproximado de 17 a 20 gramos e inoculados vía intraperitoneaí. Para el control se usaron 4 ratones a los que se les inyectó únicamente el veneno total de Parabuthus granulatus. Para cada uno de ios retos se emplearon 6 ratones a los que se les inyectaron 250 μΙ de suero preinmune previamente incubado a 37°C durante 60 min con 3 DL _S o del veneno total.

Durante este ensayo murieron los 4 ratones control, sobrevivieron 5 de 6 ratones inmunizados con la toxina digerida y 3 de 5 con !a toxina sin digerir. Los resultados de ELISA Indican que la proteína digerida promueve la generación de títulos más altos de anticuerpos contra el veneno total de Parabuthus granulatus, lo cual correlaciona con la neutralización. Los títulos obtenidos fueron de 158,206 para los sueros obtenidos de ratones inmunizados con la proteina digerida y de 66,724 para los generados con la toxina sin digerir.

Un protocoüo similar de inmunización se llevo a cabo para tres conejos inmunizados con los híbridos de las toxinas Acra4 y Bul .

De forma resumida, para la generación de anticuerpos en otros mamíferos se inmunizaron grupos de dos conejos con las siguientes toxinas: a) con toxina recombinante rThioPgS (SEQ ID NO: 18, fusionada a tiorredoxina), b) con toxina recombinante rPg8 digerida (sin la proteína tiorredoxina), (SEC ID No 8 más 6 histidinas en el carboxilo terminal) y usando tres conejos c) inmunizando simultáneamente con las toxinas recombinantes Acra4 (SEC ID No 19) y Bu1 (G ID No 20).

Las inmunizaciones se realizaron de manera similar a la realizada en el sistema con ratones y en las siguientes tablas de esquemas de inmunización {III y IV) se pueden observar los detalles de cada inmunización y al final de cada esquema se encuentra la tabla de la neutralización correspondiente donde se valoró la capacidad protectora de cada suero: Esquema II!. InmunízaGiones en conejos con la proíeína de fusión Tlorredox na-EK-Pg8-6His o Protefna Pg8 sola {digerida). Se usaron 2 conejos por cada inmunógeno, 500 μί subcutáneo/conejo.

Fecha de Adyuvante Toxina de Toxina

Inmuniz ción Inmunización fusión- FgS ecombinanl® Pg8

(Año 2011} recombinante sola,

í ) digerida fpg)

Sangrado 6 mayo

Pre-ínmyne

1 ^a 6 mayo Completo 30 30

2 ^a 16 mayo Incompleto 30 30

3 ^a 28 mayo Alúmina 50 50

1 ^a Sangría 6 junio

4» 6 Junio Incompleto 50 50

5 ⁸ 16 junio Alúmina eo 80

6 ^a 27 junio Incompleto eo 80

2 ^a Sangría T julio

7 ^a T juiio Alúmina 100 100

8 ^a 19 julio Incompleto 100 100

Sangrado total 29 julio

Tabla 13. Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Parabuthus granuíatus y el suero de los conejos inmunizados con la toxina recombinante Pg8 digerida (Pg8 - hsstidinas).

DLso de Suero de conejo Proporción de

Prueba veneno de inmunizados ratones

Parabuthus con la proteína sobrevivientes granuíatus recombinante Pg8 respecto a los digerida ratones inyectados

Grupo de ratones control (solo

se les inyectó veneno) 2 DLso 1/4

Ratones inyectados con 250 μ! 6/6 veneno y suero del Conejo 45, 2 DL50

inmunizado

con la toxina recombinante

Pg8 digerida

Ratones inyectados con 250 μΙ 4/4 veneno y suero del Conejo 46, 2 DLso

inmunizado

con ¡a toxina recombinante

Pg8 digerida

Grupo de ratones control (solo

se les inyectó veneno) 3 ,DLso - 1/4

Ratones inyectados con 250 μ! 5/6 veneno y suero del Conejo 45, 3 DL50

inmunizado

con la toxina recombinante

Pg8 digerida

Ratones inyectados con 250 μ| 2/6 veneno y suero del Conejo 48, 3 DL50

inmunizado

con la toxina recombinante

Pg8 digerida DLso de veneno de P. granuíatus- 44.9 pg/20 g de ratón, vía intraperitoneal Tabla 14, Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Parabufhus granulatus y el suero de los conejos inmunizados con la toxina de fusión con Pg8 recombinante.

DLso de Veneno Proporción de ratones

Prueba de sobrevivientes respecto al total

Parabufhus de ratones inyectados

granulatus

Grupo de ratones control (solo se les

inyectó veneno) 2 DLso 1/4

Ratones inyectados con veneno y 2 DLso 6/8

suero del Conejo 47, inmunizado

con la toxina de fusión de Pg8

recombinante

Ratones inyectados con veneno y 2 DLso

suero del Conejo 48, inmunizado 4/4

con la toxina de fusión de Pg8

recombinante

Esquema IV. Inmunización de 3 conejos (números 37, 38 y 39) con la proteína de fusión de la toxina Acra4 y con la proteína de fusión de la toxina Bul , Este esquema de inmunización se realizó inmunizando con una mezcla equimolar de proteína de fusión de la toxina Acra4 más proteína de fusión de ¡a toxina Bul , debido a que ambas provienen de venenos de alacranes de Turquía.

Tabla 15. Ensayos de neutralización utilizando el veneno de Androctonus crassicauda y el suero de los conejos inmunizados con la toxina de fusión con Acra4 recombinante.

DL.50 de Veneno de Proporción de ratones

Prueba Androctonus sobrevivientes respecto al total de crassicauda ratones inyectados

Grupo de ratones control 1 DL50

(solo se les inyectó veneno) 0/3

Ratones inyectados con 1 DL50 3/3

veneno y suero del Conejo

37

Ratones inyectados con 1 DLsc

veneno y suero dei Conejo 2/3

38

Ratones inyectados con 1 DL ₅₀

veneno y suero del Conejo 2/3

39

Debido a ios resultados obtenidos en las inmunizaciones realizadas en ratones y conejos, se decidió inmunizar caballos con la mezcla de ias toxinas de los alacranes del norte de África. Se propuso un sistema de inmunización empleando ias proteínas híbridas de las toxinas recombinantes AaHH de Androctonus australis Héctor; Amm5 y Amm8 de Androctonus mauretanicus mauretanicus y Lqh2 de Leiurus quinquestriatus hebraeus, todas ellas consideradas las más tóxicas de su respectivo veneno. Se emplearon 3 caballos a los que se les inyectó la mezcla de las 4 toxinas recombinantes mencionadas. Se realizaron 9 inoculaciones, la primera se inyectó con adyuvante completo de Freunds (Rockland) para desarrollar la respuesta inmunológica del caballo; las siguientes fueron con adyuvante incompleto o alúmina. Los volúmenes de las inoculaciones y cantidad de antígeno (μο) vanaron durante el esquema de inmunización (Ver esquema V). A continuación se muestra el esquema V de inmunización en caballos y diferentes tablas con los resultados de la neutralización utilizando el suero obtenido. Esquema V de inmunización en caballos con mezcia de las proteínas de fusión de AaHIL ArnmV, AmmVIfi y Lqhll. Se usaron 3 caballos: caballo 42, caballo 43 y caballo 44: dna Volumen

Día (fecha) Ad vant por cabaüo por

(año 2011) @ { ο de ¡a caballo

intradórmic

1 0 (20 abril) Completo 250 2.0

a

Incompíet

2 7 (27 abril) 250 2.0 Subcutánea

0

3 21 (11 mayo) Alúmina 250 1.5 Subcutánea

Incompíet

4 35 (25 mayo) 250 2.0 Subcutánea

0

5 49 (8 junio) Alúmina 250 1.5 Subcutánea

Sin

6 63 (22 junio) acarreado 250 1.0 Subcutánea r

Incompíet

7 (Sangría) 77 (8 julio) 300 2.0 Subcutánea

0

8 (Sangría) 91 (20 julio) Alúmina 300 1.5 Subcutánea incompíet

9 (Sangría) 105 (3 agosto) 500 2.0 Subcutánea o

1 19 (17

Sangría

agosto)

Al finalizar la novena inmunización se realizaron pruebas de neutralización en ratones contra el veneno de Androdonus mauretanicus mauretanicus, Androdonus australís y Leiurus quinquestríatus hebraeus (ver Tabla 16), utilizando el suero de los caballos inmunizados. Para fines prácticos solamente se muestran ios resultados obtenidos con el suero de un solo caballo, pero los resuitados obtenidos son comparables a ios dos otros caballos también inmunizados. Tabla 16. Ensayos de neutralización con e! suero de caballos inmunizados con la mezcla de ¡as proteínas de fusión de AaHI!, AmmV, AmmVlll y Lqhll. Para facilidad se muestran ios resultados de solo uno de los caballos.

Proporción de ratones

Prueba DL ₅₀ de Veneno sobrevivientes respecto al total de ratones inyectados

Grupo de ratones control 2 DL ₅₀ de Veneno de

(solo se les inyectó Androctonus 0/2

veneno) mauretanicus

mauretanicus

Ratones inyectados con 2 DL.50 de Veneno de

veneno y 300 μΙ de suero Androctonus 2/2

del Caballo 43 mauretanicus

mauretanicus

Grupo de ratones control 2 DL ₅₀ de Veneno de

(solo se les inyectó Androctonus australis 1/2

veneno)

Ratones inyectados con 2 DL50 de Veneno de 2/2

veneno y 300 μΙ de suero Androctonus australis Nota: Los ratones presentaron del Caballo 43 síntomas ligeros de intoxicación pero

30 minutos después con respecto a los ratones control

Grupo de ratones control 2 DL ₅₀ de Veneno de

(solo se les inyectó Leiurus quinquestriatus 0/2

veneno) hebraeus

Ratones inyectados con 2 DL ₅₀ de Veneno de 1/2

veneno y 300 μΙ de suero Leiurus quinquestriatus Se observaron síntomas ligeros como del Caballo 43 hebraeus parálisis de las patas traseras. El veneno de Leiurus tiene otras toxinas de importancia médica, y solo se uso una de ellas para inmunizar al caballo, lo cual puede ser la razón de la parcial neutralización que se obtuvo.

Con ios resultados de neutralización anteriores {Tabla 16) se puede observar que los híbridos de las toxinas recombinantes empleadas funcionaron muy bien como inmunógenos. Se hizo una verificación de esos resultados utilizándose una cantidad reducida de suero (300 microlifros), logrando neutralizar hasta 2 DL ₅₀ tanto del veneno de Androctonus austraíis Héctor como del veneno de Androctonus mauretanicus mauretanicus y un 50% de neutralización con 2 DL ₅₀ del veneno de L&iurus quinquestríatus hebraeus, Es importante considerar que este úiíimo veneno es más complejo ya que tiene otras toxinas que participan en el envenenamiento por la picadura de este alacrán). Con el objetivo de incrementar la potencia del suero de ¡os caballos previamente inmunizados, se decidió aplicar inmunizaciones extras con los venenos de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus, a tos caballos 42, 43 y 44 previamente inmunizados con las proteínas de fusión de AaHI!, AmmV, AmmVili y Lqhll, El esquema de estos refuerzos con veneno se muestran a continuación en el Esquema VI. La idea de esta ampliación del proceso de inmunización tiene dos razones de ser: La primera es que confirma la eficiencia de las toxinas híbridas como primadoras de una respuesta inmune. Por tratarse de inmunógenos híbridos la toxicidad de los péptidos se ve inhibida de tal forma que se pueden hacer protocolos de inmunización con una cantidad más elevada de antígeno. El segundo punto, como se demostrará a continuación, con un refuerzo dado con e! material compleío (veneno soluble completo de tos alacranes) esto madura ia respuesta inmune en un periodo muy corto y produce sueros altamente neutralizantes.

Esquema VI. Refuerzos de inmunización con la mezcla del veneno total de Androctonus austraíis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus a caballos previamente inmunizados con la mezcla de las proteínas de fusión de Aa

10 sangría 0 /6 juí lncompleto/1.3 1000 2.0 Subcutánea

1 1 sangría 14 /20 jul Alúmina/1.0 3000 2.0 Subcutánea

12 sangría 28 /3 ago Sncompleto/1.3 6000 2.Q Subcutánea

Sangría 35/17ago

Para evaluar la efectividad del suero de los caballos previamente inmunizados con los híbridos recorn binantes de las toxinas AaHIl, AmmV, AmmVIII y Lqhll y reforzados con tres inmunizaciones de veneno total de los alacranes Androctonus austraüs Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus, se realizaron ensayos de neutralización por cada veneno iota! y para ello se utilizaron ratones cepa CD1 con peso aproximado de 17 a 20 gramos. Se usaron grupos de 4 ratones, un grupo se empleó como control a! que únicamente se le inyectó a cada ratón 3 DL ₅₀ del veneno a neutralizar. A los otros grupos de ratones se les inyectó diferentes cantidades del suero obtenido de los caballos inmunizados, previamente incubado a 37°C durante 80 min con 3 DL ₅₀ del veneno total a evaluar (ver Tablas 17 a 20). Para fines prácticos solamente se muestran los resultados obtenidos con el suero de un solo caballo, sin embargo, esencialmente el mismo tipo de resultados se obtuvieron con los otros dos caballos ensayados. Para el caso de la neutralización del veneno de Androctonus austraiis Héctor, los 4 ratones del grupo control inyectados con 3 DL ₅₀ de veneno murieron, en contraste el grupo de cuatro ratones inyectados con la mezcla de este veneno y con 100 μΙ de suero del caballo 43 (Tabla 17) todos sobrevivieron, además se logró neutralizar 3 DL ₅₀ del veneno de A. austraiis con tan solo 40 μΙ de este suero (Tabla 20). Estos resultados son extremadamente positivos, pues con un mililitro de este suero seguramente se puede neutralizar 75 DL ₅₀ del veneno en cuestión. Para el caso de la neutralización del veneno de Androctonus rnauretanicus mauretanícus, todos los ratones del grupo control inyectados solo con veneno, murieron, mientras que los cuatro ratones que se inyectaron con la mezcla de 100 μΙ de suero del caballo 43 más 3 DL _5e de veneno sobrevivieron (Tabla 18). Para el caso del ensayo de neutralización del veneno de Leiurus quinquestriatus hebraeus, se evaluaron dos grupos control de ratones, con 4 ratones cada uno, a ios cuates se les inyectó, respectivamente, 1.5 DL ₅₀ y 3 DL ₅₀ de veneno tota! de L quinquestriatus hebraeus, en ambos grupos todos los ratones murieron. Las mismas dosis de veneno (1.5 DL ₅₀ y 3 DL ₅₀ ), pero adicionando 300 μΙ, 150, 100 μΙ o tan soto 70 μΙ del suero del caballo 43, fue aplicada a otros grupos de ratones y el resultado fue que todos los ratones sobrevivieron (Tabla 19 y Tabla 20).

Tabla 17. Ensayos de neutralización contra el veneno de Androctonus austraiis Héctor y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestriatus hebraeus. Vía: intraperitoneal. Para facilidad se muestran ios resultados de solo uno de los caballos.

Proporción de ratones

Prueba DL ₅₀ de Veneno sobrevivientes respecto de Androctonus austraiis al total de ratones

Héctor inyectados

Grupo de ratones control 3 DL ₅ 0

(solo se les inyectó veneno) 0/4

Ratones inyectados con 3 DL5 ₀

veneno y 300 μΙ de suero del 2/2

Caballo 43

Ratones inyectados con 3 DL«o

veneno y 100 μΙ de suero dei 4/4

Caballo 43

Tabla 18. Ensayos de neutralización contra el veneno de Androctonus mauretanicus mauretanicus y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austraiis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestriatus hebraeus. Vía: intraperitoneal. Para facilidad se muestran los resultados de solo uno de los caballos.

Prueba DL ₅ o de Veneno Proporción de ratones de Androctonus sobrevivientes respecto mauretanicus mauretanicus al total de ratones inyectados

Grupo de ratones control

(solo se les inyectó veneno) 3 DL¾o 0/4

Ratones inyectados con

veneno y 300 μΙ de suero 3 DL50 2/2 del Caballo 43

Ratones inyectados con

veneno y 100 μΙ de suero 3 DL50 4/4 del Caballo 43 Tabla 19. Ensayos de neutralización contra el veneno de Leiurus quinquestríatus ebraeus y usando el suero de caballos reforzados con el veneno total de Androctonus austtalis Héctor, Androctonus mauretanicus mauretanicus y Leiurus quinquestríatus hebraeus. Vía: inlraperitonea!. Para facilidad se muestran los resultados de solo uno de os caballos.

LDgo de Veneno Proporción de ratones

Prueba De Leiurus quinquestríatus sobrevivientes respecto a! total hebraeus de ratones inyectados

Grupo de ratones

control (solo se les 1.5 LD ₅₀ 0/4

inyecto veneno)

Ratones inyectados con

veneno y 300 μΙ de 1.5 LDgo 2/2

suero dei Caballo 43

Grupo de ratones

control (solo se ¡es 3 LDso 0/4

inyecto veneno)

Ratones inyectados con

veneno y 150 μΙ de 3 LD50 4/4

suero del Caballo 43

Los resultados anteriores destacan Sa eficacia del uso de los híbridos recombinantes (proteínas de fusión) de las toxinas de alacrán para generar anticuerpos neutralizantes contra el veneno de las especies de alacrán de los géneros Androctonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus que son de las mas peligrosas en ías regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente y se prueba también, que estos híbridos recombinantes de toxinas de alacrán funcionan perfectamente como inrnunógenos y tienen ia capacidad de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes en diferentes mamíferos desde ratones hasta caballos,

AdicionaSmente, con el objetivo de optimizar la generación de anticuerpos neutralizantes para los venenos de los alacranes peligrosos de las regiones del Norte de África, Sahel Africano, Este y Sur de África, Cercano y Medio Oriente, permitieron confirmar que las alfa-toxinas del veneno de alacranes de las regiones mencionadas se agrupan en 4 grupos aníigénicos. Esto significa que una toxina de un grupo aníigónico dado, puede inducir anticuerpos que reconocen a toxinas de ese mismo grupo pero no reconocen a toxinas de los otros grupos aníigénicos (Deiori et al., 1981 ; E! Ayeb y Pierre Delorl, 1984). Por tai razón se incluye en la presente a un representante de cada grupo antigénico: la toxina AaHI del alacrán Androctonus australis (perteneciente al grupo antigénico 1 ), ¡a toxina AaHH del alacrán Androctonus australis (perteneciente grupo antigénico 2), la toxina Bot1 del alacrán Buthus occitanus tunetanus (perteneciente ai grupo antigénico 3) y la toxina LqhlV del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (perteneciente ai grupo antigénico 4). Con esta estrategia. aunada a la capacidad inmunogénica que tienen ¡os híbridos de todas las toxinas recombinantes propuestas en ia presente, se tiene una combinación de inmunógenos recombinantes que producen sueros neutralizantes (o sus derivados) de venenos de diversas especies de alacrán de ios géneros Androctonus, Buthus, Leiurus y Parabuthus, que son de los mas peligrosos a nivel mundial.

Dicha combinación inmunogénica puede acompañarse de ai menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para conformar una composición farmacéutica utiíizabie como inmunógeno que permita inducir ¡a generación de antivenenos contra diversas especies de alacrán.

Inmunógenos recombinantes de alacranes de México.

Para estos inmunógenos de manera similar a los anteriores, se diseñaron 2 oligonucleótidos externos y 4 internos para ensamblar a cada una de las toxinas: Cn2 de! alacrán Ceníruroides noxius, CIH deí alacrán Centruroides Iimpidus, CII2 del alacrán Centruroides iimpidus, Cssil del alacrán Centruroides suffusus, con uso preferencia! de codones de Escherichia coii. Ver figura 13. Estos oligonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química, en la unidad de síntesis de oügonucleótidos del Instituto de Biotecnología de la UNAM. Véanse Figuras 14A-14D.

Realizamos el ensamble de la secuencia nucleotídica mediante PCR recursivo y la donación del producto en el vector pBluescriptKS(-)tal y como se describió para el grupo de antígenos recombinantes del primer grupo. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia clonada de cada toxina fuera correcta. Se muestra un ejemplo con la toxina Cn2 en la Figura 15. De manera similar al grupo anterior, se preparó el vector de expresión pET22b-Tiorredoxina-sitio de corte para Enterocinasa. (Ver Figura 18).

Las secuencias que codifican para cada toxina de Centruroides clonada en el vector pBluescriptKS (-), descritas anteriormente, fueron usadas como templados para obtener los genes de las toxinas mediante subclonación en el vector de expresión pET22b-Thío. La inserción en este vector de expresión de los genes que codifican para ¡as toxinas, se realizó de la misma manera que la descrita para el grupo de recombinantes anteriores.

Cada uno de ios vectores de expresión conteniendo el gen codificante para la toxina fue eiectroporado en £. coü cepa BL21 (DE3) de la misma manera que ia ya descrita para el primer grupo de antígenos. El proceso de expresión se inició al crecer un preinóculo en medio LB con ampiciiína, Después de crecer el cultivo hasta una DO entre 0.7-1 , determinada a 600 nm, se indujo la expresión con IPTG (Isopropyl p-D~1 ~ thiogalactopyranoside) durante 6 a 12 h a 30 °C. El cultivo se centrifugó a 5,000 x g durante 10 min a 4 °C en tubos para centrifuga de 250 m!, con el fin de obtener todo el precipitado celular. Se congelaron las células -20°C, hasta su uso. Se procedió a obtener un extracto periplásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión expresada, de la misma manera descrita anteriormente. Este extracto se utilizó para la purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad.

Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC, tal y como se describió para el grupo anterior, Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazol en PBS 1X (véase ejemplo en la Figura 15 (A) III). Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm (Figuras 17A-17D).

Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamída en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), por el método también ya descrito anteriormente Véase como ejemplo la Figura 15 A.

Las digestiones de las proteínas de fusión de centruroides, se realizaron con la proíeasa enterocinasa {EK}, también se obtuvieron sus masas moleculares mediante MALDI-TOF o ESI-ION-TRAP como ya se describió para otras proteínas. Los ensayos de ELISA también se realizaron de manera similar a la descrita y Sos resultados se muestra en la Figura 15 (B) y en la Figura 18.

La actividad tóxica de cada antígeno recombinante de fusión (híbrido) de centruroides, fue evaluada la cepa murína CD1 , a los cuales se les inyectó vía intra perifonea i la cantidad de proteína de fusión calculada para contener el equivalente a diez veces ia dosis letal media (DL ₅₀ ) reportada para cada toxina, E! resultado obtenido fue que a esa concentración la proteina no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que ia toxina al tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N-terminal, afecta su actividad sobre los canales de sodio probablemente por impedimento estérico. Sin embargo, el hecho de que como proteína de fusión la toxina no sea tóxica es precisamente una de las principales ventajas al utilizaría corno antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el anima! sujeto al proceso de inmunización sufra el efecto tóxico de ia recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con aítas dosis del antígeno.

Si bien que para los experimentos de neutralización se utilizaron los venenos totales de tos animales inmunizados con las toxinas recombinantes, también se purificaron las toxinas correspondientes, con la posibilidad de ensayadas separadamente. En en el caso de que los anticuerpos generados no fueran capaces de proteger en contra deí veneno tota!, ai menosse sabría si neutralizan a ¡as toxinas. Sin embargo, los resultados obtenidos como se demuestra a seguir fueron excelentes y no se necesitó usar las toxinas puras. No obstante ío anterior, los protocolos fueron ejecutados y la toxina Cn2 del alacrán Ceníruroid&s noxius fue purificada de acuerdo a la metodología reportada en: Zamudio et ai., 1992. Las toxinas CII1 y CII2 fueron purificadas de acuerdo a la metodología reportada en: Ramírez et al. ,1994. La toxina Cssii fue purificada de acuerdo a la metodología reportada en Martin et al., 1987. Para los ensayos de neutralización se inmunizaron iniciaimente grupos de 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio (ver esquemas de inmunización 1 , 2 y 3 siguientes). Los inmunógenos utilizados fueron las proteínas de fusión r(toxina)Hís (SEC ID No. 25 - SEC ID No. 28). La inyección de las toxinas se realizó por via subcutánea. La emulsión se preparó con ia toxina disuelta en PBS IX con adyuvante completo de Freund (aceite mineral y micobacterias muertas) en la primera inmunización, e incompleto (aceite mineral) o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μί de solución por ratón en cada ocasión, con un periodo de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó ia generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas por ensayos de ELISA (ver ejemplo en la Figura 19). Después de ia última inmunización se realizaron pruebas de neutralización en ratones usando de 1 a 3 DL ₅₀ . Ver Tablas 21 a 25.

A continuación se describe el esquema de inmunización 1 que se llevó a cabo utilizando 2 grupos de 8 ratones de ia cepa CD1. Uno de los grupos se inmunizó con la proteína de fusión de ia toxina Cn2 recombinante de Centruroides noxius, y otro grupo con la proteína de fusión de la toxina CII1 recombinante de C. linipidus ümpidus. Los 15 \ig inyectados. corresponden a la cantidad de toxina Cn2 presente en la proteína de fusión:

1 ^a inmunización: 15 ο + Adyuvante completo 10 días

T inmunización: 15 μ + Adyuvante incompleto 10 días

3 ^a inmunización: 15 μ + Adyuvante incompleto 10 días

(sangrado para evaluar titulación def suero) 4 ^a inmunización: 15 + Adyuvante incompleto 10 días

5" inmunización: 15 + Adyuvante incompleto 10 días

obtención de suero

1 DL ₅₀ de Cn2= 0.25 § de toxina Cn2 por cada 20 gr de ratón

2 DL ₅₀ de Cn2= 0.50 μ§ de toxina Cn2 por cada 20 gr de ratón

Tabla 22. Neutralización de la toxina nativa CEU , utilizando suero de ratones inmunizados con la proteina de fusión de CII1 recombinante.

Suero inmunizado Proporción de

Prueba DLso de CII1 con la proteína de ratones

nativa fusión TEkCIH His Sobrevivientes

respecto a los ratones inyectados

Grupo de ratones

control 2 DL ₅₀ de CII1 - 1/4

(solo se les inyectó

toxina)

Grupo de ratones

inyectados con 2 DL ₅₀ de CÜ1 250 μ! 6/6 mezcla

de toxina y suero de

ratones inmunizados

con

CII1 1 DLso de 0111= 1 ,73 μο de toxina CII1 por cada 20 g de ratón (determinada en ratones cepa Balb/C, por la Dra. Georgina Curróla, IBT-UNAM)

2 DL ₅₀ de Cil1 = 3.46 μ§ de toxina CII1 por cada 20 g de ratón

Como puede observarse en los resultados de las Tablas 21 y 22, tanto la proteína de fusión con la toxina Cn2 recombinante, como la proteína de fusión con la toxina CII1 recombínante, funcionan como excelentes inmunógenos ya que tienen la capacidad de inducir en ios ratones inmunizados la producción de anticuerpos neutralizantes de las respectivas toxinas nativas Cn2 o CII1 (aisladas directamente del veneno de C. noxius o C. Hmpidus iimpidus, respectivamente). En el caso dei suero de ratones inmunizados con ¡a proteina de fusión de la toxina Cn2, este tiene la capacidad de neutralizar 2 y 3 DL ₅₀ de toxina nativa Cn2 (Tabla 21 ) y los ratones a los cuales se les inyectó la mezcla de toxina Cn2 nativa y el suero de los ratones inmunizados no presentaron síntomas de intoxicación.

Respecto al suero de ratones inmunizados con la proteina de fusión de la toxina CII1, éste tiene la capacidad de neutralizar 2 DL _S o de toxina nativa OH (Tabla 22) y los ratones a los cuales se ¡es inyectó la mezcla de toxina CI11 nativa y el suero de los ratones inmunizados tampoco presentaron síntomas de intoxicación.

Con el éxito de ¡os resultados anteriores, se decidió realizar otro esquema de inmunización con la proteína de fusión de la toxina Cn2, con el objetivo de evaluar la capacidad del suero neutralizante y evaluarlo contra el veneno total de C. noxius. Se realizó el siguiente esquema (2) de inmunización:

Esquema de inmunización 2 en ratones (CD1 ) ensayando el híbrido de la toxina Cn2 de Centruroides noxius:

Toxina ( ,g) (tipo)

Sangría tota! §3 Tabla 23. Reto de ratones inmunizados con el híbrido de la toxina Cn2

DL50 de Veneno

Prueba Proporción de ratones sobrevivientes de Cen uroides

respecto ai total de ratones inyectados noxius

Grupo de ratones control

(solo se íes inyectó 3 DLso 0/3

veneno)

Grupo de ratones

inmunizados con la toxina 3 DL ₅₀ 9/10

recombinante Cn2 Siguiendo el esquema de inmunización descrito anteriormente, detallaremos los resultados obtenidos con el híbrido (proteína de fusión) de la toxina recombinante Cn2 de Centruroidles noxius. Primero, se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1. Se comenzó inyectando 5 _μ9 de hibrido rCn2His hasta llegar a 25 μ9 en la ultima inoculación, en un volumen final de 100 μΙ de solución. Con ei fin de evaluar la efectividad de ios anticuerpos generados por los ratones inmunizados, estos mismos se retaron directamente (mediante inyección) con veneno total de C. noxius. Para el reto se usaron un grupo control de 3 ratones (a ios cuales se les inyectó solo veneno total de C. noxius) y el grupo de los ratones previamente inmunizados. Los ratones fueron inyectados por vía subcutánea con 3 DL ₅₀ de veneno tota! de C. noxius en un volumen final de 200 μΙ de PBS. En este ensayo murieron todos los ratones del grupo control mientras que en ei grupo de los ratones previamente inmunizados únicamente murió uno de los 10 ratones (Tabla 23). Los 9 ratones inmunizados y retados con el veneno total de C. noxius que sobrevivieron (Tabla 23) fueron sangrados 48 horas después del reto para determinar los títulos de anticuerpos presentes en ei suero obtenido. La inmunización dio como resultado la generación de anticuerpos que reconocen específicamente a la toxina recombinante Cn2 y al veneno total. La titulación de los sueros por ELISA, reveló que ios títulos finales de la mezcla de suero, de los 9 ratones sobrevivientes, fueron de 18997 contra el hibrido de la toxina Cn2 recombinante y de 9165 contra el veneno total (Figura 19).

Dado el éxito obtenido con el híbrido de la toxina Cn2 y sus propiedades inmunogénicas para generar suero neutralizante del veneno total de C. noxius, se decidió realizar otro esquema de inmunización con una mezcla de la proteína de fusión de la toxina CII1 y la proteína de fusión de la toxina C¡!2, con el objetivo de evaluar la capacidad del suero neutralizante generado y evaluarlo contra el veneno total de C, ¡impidas ümpidus. De manera similar, se inmunizaron ratones con la protefna de fusión de la toxina Cssll, con el objetivo de evaluar la capacidad neutralizante del suero generado contra el veneno total de C. sufíusus suffusus. En ambos casos se siguió el siguiente esquema (3) de inmunización:

Esquema de inmunización 3 en ratones (CD1 ) empleado con la mezcla de los híbridos de ¡as toxinas CH1 y CII2 de Centruroides ümpidus límpidas y para la toxina Cssll de Centruroides suffusus suffusus:

Toxina {μ§) total m 10

3

6 DIc 2010

16 Dic 2010

Nota: se determinó previamente la DL _5Ü para ei veneno usado en esta prueba: 1 DL ₅₀ por 20 g peso de ratón, Vía intraperitoneal. 5 b

Nota: 1 DL ₅₀ de veneno de C. suffusus suffusus = 10.3 μg por 20 g peso de ratón. Vía intraperitonea!.

Una vez concluido el esquema de inmunización se decidió retar directamente a los ratones inmunizados con el veneno total correspondiente. Para eí caso del reto con el veneno total de C, Iimpidus iimpidus, se utilizó un grupo control de 6 ratones a los cuales se les inyectó 1 DLso de veneno de C. Iimpidus Iimpidus y un segundo grupo integrado por 8 de ios ratones inmunizados con ia mezcia de los híbridos de ias toxinas Cl!1 y CII2, a los cuales se les inyectó directamente 1 DL ₅₀ de veneno de C, Iimpidus iimpidus. Dos de ios seis ratones del grupo control murieron pero los cuatro ratones restantes presentaron síntomas graves de intoxicación por mas de 24 horas (Tabla 24). En el grupo de los ratones inmunizados retados con el veneno, soio murió un ratón pero este sobrevivió tres horas mas con respecto a los ratones que murieron en el grupo controi (Tabla 24). Los 5 ratones sobrevivientes no presentaron sintomatoiogía grave de intoxicación, Este resultado sugiere que los híbridos de las toxinas recombinantes CII1 y CÍI2 funcionan como inmunogenos y son capaces de generar en el anima! inmunizado, anticuerpos que reconocen a las toxinas nativas CII1 y CII2, respectivamente y por lo tanto logran neutralizar eí veneno del alacrán C. iimpidus iimpidus.

De la misma forma se evaluó el híbrido de ia toxina Cssll recombinante y su capacidad de generar anticuerpos neutralizantes contra el veneno total de Centruroides suffusus su usus. Para el objetivo mencionado se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1 bajo el esquema de inmunización anterior: Se realizaron 6 inmunizaciones vía subcutánea inyectando 30 μg de rCssilHis en cada una de ellas, en un volumen final de 100 μΙ de solución de PBS 1X. Se obtuvieron dos sangrías a ¡o largo de las inmunizaciones para estimar y comparar los anticuerpos que iban generando los ratones. Una vez terminado el protocolo de inmunización, se evaluó la efectividad de los anticuerpos generados retando a ios ratones inmunizados con veneno total Se usaron como control un grupo de 3 ratones de aproximadamente 20 gramos. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con 3 DL ₅₀ de veneno total de Centruroides suffusus suffusus en un volumen final de 200 μ! de PBS 1X. No se observó sobrevivencia de ninguno (¡o que era esperado pues se usaron 3 DL ₅ r>) de los ratones control mientras que de los ratones retados, sobrevivió el 100% (Tabla 25). Los ratones inmunizados y que sobrevivieron al ser retados con el veneno de C. suffusus suffusus, fueron sangrados 48 horas después del reto para determinar el título de tos anticuerpos generados y esto se determinó mediante ensayo de ELISA utilizando a la toxina rCn2 y al veneno total como antígenos, el título de los anticuerpos generados. Los títulos finales de la mezcla de suero de los 10 ratones fueron de 11 ,011 contra la toxina de fusión con Cssll recombinante y de 1 ,890 contra el veneno total (Figura 20).

Los resultados anteriores permiten concluir que las toxinas recombinantes fueron capaces de inducir la generación de anticuerpos neutralizantes y con ello proteger a los ratones contra de la intoxicación por veneno de alacranes de este género,

fnmunógenos recombinantes de alacranes de Sudamérica.

También se diseñaron oíigonucleótidos externos e internos para ensamblar los segmentos de DNA que codifican para cada una de ías 3 toxinas del veneno del alacrán Tityus serrulatus: Ts1 , Ts3 y TsNTXp del alacrán Tityus serruiatus con uso preferencia! de codones de Escherichia cois. Ver figuras 21 y 22. Estos oíigonucleótidos se sintetizaron mediante síntesis química. Véase Figuras 23A-23C.

Realizamos el ensamble de Sa secuencia nucleotídica mediante PCR recursívo y su clonación en el vector pBluescriptKS{-)tai y como se describió para los antígenos recombinantes anteriores. Las construcciones fueron secuenciadas para verificar que el ensamble y secuencia clonada de cada segmento de DNA que codifica para la toxina corespondiente fuera correcta. De manera similar al grupo anterior, se preparó el vector de expresión pET22b-Tiorredoxina que contiene también un sitio de corte para la enzima enteroquinasa. La inserción en este vector de expresión, de ios segmentos de DNA que codifican para las respectivas toxinas, se realizó de la misma manera que ia descrita para las recombinantes anteriores. Ver Figura 24.

Cada uno de los vectores de expresión conteniendo el gen codificante para ia toxina fue etectroporado en E. coli cepa BL21 (DE3) también de la misma manera que la ya descrita para ios antígenos anteriores. Se procedió a obtener un extracto periplásmico bacteriano conteniendo a la proteína de fusión bajo el control deS promotor T7. Este extracto se utilizó para la purificación de la proteína utilizando columnas de afinidad. Véase ejemplo en la figura 25,

Las proteínas de fusión expresadas se purificaron mediante cromatografía de afinidad y HPLC, tal y como se describió para el grupo anterior, Las proteínas se eluyeron con 400 mM de imidazoí en PBS 1 X (véase ejemplo en la Figura 25 (A) III). Los péptidos obtenidos fueron separados en una columna C18 (25mm x 4.1 mm) con un gradiente de 20 a 80% de solvente B en un lapso de 40 min y se colectaron manualmente por monitoreo de absorbancia a 230 nm (Figuras 26A-28C).

Las proteínas fueron separadas por electroforesis en un gel discontinuo de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes(SDS-PAGE), por el método también ya descrito anteriormente Véase como ejemplo la Figura 25 A.

Las digestiones de las proteínas de fusión de Tityus se realizaron con la proteasa enterocinasa (EK), también se obtuvieron sus masas moleculares mediante MALDI-TOF o ESI-.ION-TRAP como ya se describió. Los ensayos de ELISA también se realizaron de manera similar a la descrita y los resultados se muestran en la Figura 27.

La actividad tóxica de cada antígeno recombinante de T. serruiatus fue evaluada en ratones cepa CD1 , a los cuales se les inyectó vía intraperitoneal diez veces la dosis DL ₅₀ reportada para cada toxina. El resultado obtenido fue que a esa concentración la proteína no ejerce ningún efecto tóxico sobre el ratón, debido a que la toxina ai tener fusionada a la tiorredoxina en su extremo N~termina¡, afecta su actividad sobre los canales de sodio probablemente por impedimento esférico. Sin embargo, el hecho de que co o proteína de fusión la toxina no sea tóxica es una de las principales ventajas al utilizarla como antígeno, ya que al inmunizar animales no hay peligro de que el animal sujeto al proceso de inmunización sufra el efecto tóxico de la recombinante, permitiendo de esta forma inmunizarlos con altas dosis del antígeno.

Para los ensayos de neutralización, primero se inmunizaron 10 ratones de la cepa CD1 de 17 g en promedio (ver Esquema de inmunización 1). El inmunógeno utilizado fue la proteína de fusión de Tsi (SEC ID No1a). La inyección del Inmunógeno se realizó por vía subcutánea. La emulsión se preparó con la toxina disuelta en PBS al 1X con adyuvante completo de Freund en la primera inmunización, e incompleto (aceite mineral) o alúmina en las siguientes inmunizaciones. La inmunización se realizó inyectando la toxina en 100 μΙ de solución por ratón en cada ocasión, con un período de aproximadamente 10 días entre inmunizaciones. Se comprobó la generación y el incremento de anticuerpos en suero contra el veneno total y las toxinas nativas por ensayos de ELISA. Esquema de inmunización 1 : Inmunización de ratones cepa CD1 con ¡a proteina de fusión de Ts1 de Tityus serrulatus.

1 13 0c! 2012 10 30 Completo

2 25 Oct 2012 10 30 Incompleto

3 4 Nov 2012 10 30 Alúmina

4 16 Nov 2012 10 30 incompleto

5 26 Nov 2012 10 30 Alúmina

6 6 Dic 2010 10 30 Incompleto

Reto 16 Dic 2010

Sangría tota! 21 Dic 2010

Después de la última inmunización se realizaron pruebas de neutralización de 1 y 3 DL ₅₀ de veneno (ver Tabla 28).

Nota: 1 DL ₅₀ de veneno de T. Serrulatus- 13.2 μ por 20 g peso de ratón, Via intraperitoneal.

Como puede observarse en los resultados de neutralización del veneno tota! de Tityus serruiatus (Tabla 26), el híbrido de la toxina Ts1 recombinante funciona como inmunogeno, ya que seis de los siete ratones inmunizados con esta proteina sobrevivieron al ser refados directamente con 1 DL ₅₀ de veneno tota! de T. serrulatus. Dos de los ratones inmunizados con el híbrido de ¡a toxina Ts1 no sobrevivieron a! ser retados directamente con 3 DL ₅₀ el veneno total, pero esto era de esperarse ya que como se mencionó en la introducción de este documento, existen otras toxinas en el veneno de T. serruíatus que participan de manera importante en el envenenamiento por ia picadura de este alacrán,

Con el fin de obtener un suero mas potente y capaz de neutralizar e! veneno de Tityus serruiaíus, se propuso un esquema de inmunización en conejos. Con la finalidad de neutralizar no solo a ¡a toxina Ts1 presente en dicho veneno sino a otras toxinas importantes, se decidió emplear, como inmunógenos, los híbridos de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP. Para este fin, se inmunizaron tres conejos Nueva Zelanda de 2.5 kg, con ia mezcla de los tres inmunógenos recombinantes, la administración fue vía subcutánea, inyectando la mezcla de toxinas recombinantes en un volumen final de 500 μΙ de PBS 1X.

Los 3 conejos (números 33, 34 y 38) se inmunizaron, como se mencionó anteriormente, con la mezcla de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP del Alacrán Tityus serrulatus (ver esquema de inmunización 2), En el caso del conejo 33 se realizaron solo 6 inmunizaciones con la mezcla de las toxinas recombinantes y los conejos 34 y 38 recibieron además 3 inmunizaciones adicionales con veneno de Tityus serru!atus (ver esquema de inmunización 3). Las inmunizaciones se aplicaron con un lapso aproximado de 10 días entre ellas. Esquema de inmunización 2: Inmunización de los conejos 33, 34 y 36, con la mezcla de los híbridos de toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP del alacrán Tityus serrulatus.

2 ^a inmunización incompleto 250 30 500

5 ⁸ inmunización Alúmina 250 80 500 β ³ inmunización 80 500 Únicamente Sos conejos 33 y 34 recibieron 3 refuerzos de veneno total como se muestra el siguiente esquema:

Esquema de inmunización 3: refuerzos con veneno a los conejos 34 y 38.

REFUERZO CON VENENO TOTAL

Adyuvante {≠ Veneno μί subcutáneo/

7 ^S ¡inmunización Alúmina 250 30

8 ^a inmunización incompleto 250 30

9 ^a inmunización Alúmina 2513 30

Después del último refuerzo, ya sea con la mezcla de los híbridos de las toxinas recombinantes, para el caso de¡ conejo 33, o con refuerzo de veneno total, para el caso de los conejos 34 y 35, se realizaron ensayos de ELISA con el suero de los conejos, para observar el reconocimiento de los anticuerpos generados por las inmunizaciones contra las toxinas recombinantes y contra el veneno de Títyus serru!atus. Un ejemplo de esta evaluación puede verse en ia Figura 27,

Posterior a los ensayos de ELISA, se evaluó la capacidad neutralizante de cada uno de los sueros de ios conejos inmunizados con las toxinas recombinantes en contra del veneno de Tityus serrulatus (ver Tabla 27}. A continuación se muestra los datos del ensayo de neutralización y los resultados obtenidos:

Tabla 27. Ensayos de neutralización con veneno de Tityus serruiatus utilizando el suero de los conejos inmunizados con la mezcla de los híbridos de las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.

DLso de Proporción de ratones

Prueba veneno de sobrevivientes respecto a los

Tityus ratones inyectados

serruiatus

Grupo de ratones control

(solo se les inyectó veneno) 2 DLso 0/6

Grupo de ratones inyectados con

veneno y suero del e©n@jo 33 2 DL50 0/6

Grupo de ratones inyectados con

veneno y suero del conejo 34 2 DL50 5/8

Grupo de ratones inyectados con

veneno y suero del conejo 36 2 DLso e/6

Grupo de ratones control 3 DLso 0/6

(solo se les inyectó veneno)

Grupo de ratones inyectados con

veneno y suero del conejo 34 3 DLso 1/6

Grupo de ratones inyectados con

veneno y suero del conejo 36 3 DLso 6/6

1 DL ₅₀ =13.2 pg/ 20g ratón; 2 DL ₅₀ = 28.4 pg/ 20g ratón; 3 DL ₅₀ = 39,6 pg/ 20g ratón

Stock veneno = 2.5 pg/pl.

Con base en los resultados de neutralización mostrados en la Tabla 27, puede notarse que, como era de esperarse, los grupos de ratones control que fueron inyectados con 2 DL ₅₀ ó 3 DL ₅₀ de veneno total de Tityus serruiatus, todos murieron.

El suero del conejo 36, fue el mejor en cuanto a capacidad neutralizante, ya que se pudieron neutralizar tanto 2 DL ₅₀ como 3 DL _S0 de veneno total de Tityus serruiatus. Este resultado indica que la mezcla de los híbridos recombinantes de ias toxinas Ts1 , Ts3 y TsNTxP induce una buena respuesta inmune, la cual se ve incrementada al aplicar veneno tota! en los últimos refuerzos de inmunización. Es importante señalar que solamente dos inmunizaciones con veneno total no serian suficientes para lograr ¡os títulos de anticuerpos encontrados con el uso de las mezclas de ¡as proteínas de fusión. Es evidente que las toxinas de fusión descritas enriquecen la respuesta inmunológica.

Con el objetivo de no utilizar ningún refuerzo extra de veneno en ¡as inmunizaciones, se planteó la estrategia de inmunizar solo con ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP, pero sin protefna de fusión (tiorredoxina), por lo cual se decidió expresarlas en el sistema de expresión pQE30. Se produjeron las proteínas recombinantes solo fusionadas a 8-His y al sitio de corte para enterocinasa (EK) de manera contigua para conferir estabilidad y un piegamiento adecuado. Con esto se espera que al inmunizar con ellas se enriquezca más la respuesta inmunológica, o mejor aún, no se requiera refuerzo con veneno total. Al final se obtendrían sueros con mayor potencia en su capacidad neutralizante. Esta alternativa fue exitosa en el caso de la expresión de las toxinas Pg8 y Cssll (ambas toxinas protegidas con sus respectivas patentes García-Gómez et al., 2008 y Corzo-Burguete et al., 2011 ).

Para expresar las toxinas Ts1 , Ts3 y TsNTxP, sin la proteína de fusión, se decidió utilizar el sistema de expresión en el vector pQE30 que como mencionamos, fue exitoso en el caso de la expresión de la toxina Pg8 y Cssll (ambas toxinas protegidas en sus respectivas patentes García-Gómez et al., 2008 y Corzo-Burguete et al, 2011 ). Esto con el objetivo de centralizar la generación de anticuerpos neutralizantes enriquecidos solo contra ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.

La secuencia nucleotídica del gen que codifica para el péptido Tsl , del alacrán Tityus serrulaíus con uso preferencial de codones de E. coit y su traducción en aminoácidos es la siguiente:

K E G L M D H E G C K L S C F I

aaa gaa ggc ta T. ctg atg gat cat: gaa tgc aaa ctg age tgc ttt att ttt ctt ccg ata gac tac cta gta ctt ccg acg ttt gac teg acg aaa taa

R P S G Y C G R E C G I G S S

cgc ccg age ggc tat tgc ggc cgc ¾3. tgc ggc att aaa aaa ggc age age

ggc teg ccg ata acg ccg gcg ctt acg ccg taa ttt ttt ccg teg teg

Q Y C A W F A C y C Y G L P N W V

ggc tat tgc gcg tgg ccg gcg tgc tat tgc tat ggc ctg ccg aac tgg gtg ccg acg cgc acc ggc cgc acg ata acg ata ccg gac ggc ttg acc cae aa gtg tgg gat cgc gcg acc aac aaa tqc

tt cac acc cta gcg cqc tgg ttg ttt acg

La secuencia nucleotídica del gen que codifica para el póptido TsNTxP, dei alacrán Tityus serrulatus con uso preferenciai de codones de E. coü y su traducción en aminoácidos es la siguiente:

6 R E G Y P Λ D S G C K ϊ T C F

ggt cgt Q33 ggt tac ceg gcg gac tet ggt gc aaa ate acc tgc ttc cea gca ctt cea atg ggc cgc ctg aga tt cea acg tag tgg acg aag

L T A A G Y C N T E C T L K X G S

ctg acc gcg gcg ggt tac tgc aac acc gaa tgc acc ctg aaa aaa ggt tet gac tgg coc cgc cea atg acg ttg tgg ct acg tgg gac ttt ttt cea aga s G Y C A W P A C Y c Y G L P D S

tet ggt tac tgc gcg tgg ceg gcg tgc tac. tgc tac ggt ctg ceg gac tet aga cea atg acg cgc acc ggc cgc acg atg acg atg cea gac ggc ctg aga

V ϊ w T s E T N K C G

gtt aaa ate tgg acc tet gaa acc aac aaa tgc ggt

caá teg acc tec aga ctt tgg ttg ttt acg cea

La secuencia nucieoiídica del gen que codifica para ¡a toxina Ts3, del alacrán Tityus serrulatus con uso preferencia! de codones de £. coü y su traducción en aminoácidos es la siguiente:

K K D G Y P V I Y D N C A Y X C W

a a aaa gac ggt tac ceg gtt gaa tac gac aac tgc gcg tac ate tgc tgg ttt ttt ctg cea atg ggc cgg ctt atg ctg ttg acg cae atg tag acg acc

M Y D N A Y C D L C K D K A D

aac tac gac aac gcg tac tgc gac aaa ctg tgc aaa gac aaa aaa gcg gac ttg atg ctg ttg cgc atg acg ctg ttt gac acg ttt ctg ttt ttt cgc ctg

S S Y C Y W V H Ϊ L C Y C Y G L P

tet ggc tac to tac tgg gtt cac ate ctg c tac tgc tac ggt ctg ceg aga ceg atg acg atg acc C3ci gtg tag gac acg atg acg tg cea gac ggc D S E P T T N G K C K S

gac tct gaa ccg acc aaa acc aac ggt aaa tgc aaa tct

ctg aga ctt ggc tgg ttt tgg ttg cca ttt acg ttt aqa Una vez obtenido el gen recombinaníe por PCR que codifica para Ts1 , se analizó la secuencia nucleotídíca para observar el uso preferencial de codones de E. col! y el resultado de este análisis puede verse en la Figura 21.

El vector utilizado para su expresión fue el vector pGE-30 (QIAGEN) y la cepa Bacteriana: Escherichia coli Origami. En la figura 28 se muestra unb esquema de la construcción del vector de expresión. Para la donación en pQE30 se realizó PCR recursivo. El ensamble de cada gen se realizó utilizando Vent DNA Polymerase (New England Biolabs, USA), siguiendo las instrucciones del proveedor. Los dos oligonucieótidos externos se usaron a una concentración final de 0.2 pmol/μΙ y los oligonucieótidos internos a una concentración de 0.02 pmoi/μΙ. Las condiciones de PCR fueron: 5 min a 94 ^t! C, seguido por 8 ciclos con una temperatura baja de alineamiento (94°C 30 seg, 50°C 1 min ,72°C 1 min), y luego 25 ciclos cortos con una temperatura alia de alineamiento (94°C 30 seg, 55°C 30 seg, 72°C 30 seg), finalizando con 10 min de incubación a 72°C.

Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 1 % y purificados con el kií QIAQuick gel extractíon kií (QIAGEN, USA). Se empleó la enzima T4 DNA ligasa (Fermentas, Canadá) para clonar los productos de PCR dentro del vector pQE30 (digeridos previamente con las enzimas Ba Hl y Pst\; New England BioLabs, USA), Con el producto de la ligación se transforma a las células electrocompetentes DH5a y subsecuentemente son plaqueadas en cajas Petri con medio 2xYT adicionado con ampiciiina (200 pg/ml). Las clonas resultantes se verifican por PCR con los oligonucieótidos pQE30Forw (5 ^! -GAG CGG ATA ACA ATT ATA A-3") y pQE30Rev (5 -GGT CAT TAC TGG ATC TAT-3'). Las clonas que por PCR dieron el tamaño esperado (-250 pb), se amplificaron y el DNA plasmidico se purificó por medio del método de lisis alcalina.

Las construcciones se secuenciaron para verificar que la secuencia clonada que codifica para cada toxina se encuentre en el marco de lectura correcto. A continuación se muestran las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes a cada una de las toxinas recombinantes clonadas en el vector de expresión pQE30.

M~8His-Fxa-Tsi (77 aa)

Peso Molecular = 8744.9 Da

SEQ ID NO: 38

M R G S H H H H H H G S I E G R K E G Y atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccatcgagggaaggaaagaaggctat

L M D H E G C K L S C F I R P S S Y C G

ctgatggatcatgaaggctgcaaactgagctgctttattcgcccgagcggctattgc ggc

R E C G I K K G S S G Y C A W P A C Y C

cgcgaatgcggcattaaaaaaggcagcagcggctattgcgcgtggccggcgtgctat tgc

Y G L P N V K V D R A T N K C

tatggcctqccqaactgggtgaaagtgtgggatcgcgcgaccaacaaatgc

M-6His-EK-Js% (82 aa)

Peso Molecular = 9499.4 Da

SEQ SD NO: 37

M R G S H H H H H H G 5 G D D D D K K atgagaggatcgcatcaccatcaccatcacggatccggtgatgacgatgacaaaaaaaaa D G Y P V E Y D N C A Y I C N Y D H A

gacggttacccggttgaatacgacaactgcgcgtacatctgctggaactacgacaac gcg

Y C D K L C D K K A D S G Y C Y W V H

tactgcgacaaactgtgcaaagacaaaaaagcggactctggctactgctactgggtt cac

I L G Y C Y G L P D S E P T K T N G C

atcctgtgctactgctacggtctgccggactctgaaccgaccaaaaccaacggtaaa gc S

aaatct

M-6H/s-£ -TsNTxP (81 aa)

Peso Molecular = 8748.7 Da

SEQ ID NO: 38

M R G S H H H H H H G S G D D D D K G R

atgagaggatcgcatcacea caceatcacggatccggtgatgacgatgacaaagg bcgt E G Y P A D S K G C K I T C F L T A A G

gaaggttacccggcggactctaaagg tgcaaaatcacctgcttcctgaccgcggcgggt

Y C N T E C T L K K G S S G Y C A W P A

tactgcaacaccgaatgcaccctgaaaaaaggttcttctggttactgcgcgtggccg gcg

C Y C Y G L P D S V K I W T S E T N K C

tgctactgctacggtctgccggactctgttaaaatctggacctctgaaaccaacaaa tgc G

ggt

Para ia expresión de las toxinas recombinantes IV1~8His-FXa-Ts1, -6His-FXa-Ts3 y IV1-8His- FXa-TsNTxP, se utilizó a ¡a cepa E. coii Origami, transformada mediante choque térmico. Después de que el cultivo ¡legó a la DO recomendada, se indujo ¡a expresión de las recombinantes con ¡PTG a una concentración final de 0.5 mM y se mantuvo el crecimiento por 6 a 8 h más a 30 °C agitando a 120 rprn. Posteriormente, se centrifugó a 6,500 x g durante 5 min a 4 °C en botellas para centrífuga de 250 mi. El paquete celular se lavó con 200 mi de una solución de Tris 50 mM, pH 8 y se centrifugó nuevamente a 8,500 x g por 5 min a 4 °C. Se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 25 mi de la misma solución adicionada con 0.3 mg lisoz¡ma/ml. Las células se rompieron utilizando 3 ciclos de sonscación de 8 minutos con pulsos de 40 s y 20 s de reposo permitiendo 10 minutos entre cada ciclo, las muestras se mantuvieron en hielo durante todo el proceso. El extracto se centrifugó a 8,000 x g por 20 min, y se eliminó e¡ sobrenadante (Fracción soluble). La pastilla celular se lavó con 20 mi de Tris 20 mM pH 8, se centrifugó a 8000 x g por 15 min, se eliminó el sobrenadante y se realizaron dos lavados más. La pastilla resultante se trató con 15 mi de una solución desnaturalizante de Tris 50 mM, 6 M de cloruro de guanidina a pH 8 y agitación suave, para extraer la proteína insoluble que se aglomera como cuerpos de inclusión. Finalmente la preparación se centrifugó a 8,000 x g a 4 °C durante 1h. La proteina de interés se obtiene tanto en forma insoluble como soluble, por ¡o que se purifica la proteina de ambas fracciones.

Para ¡a purificación de las proteínas recombinantes de fusión presentes en la fracción soluble, se siguió el protocolo de afinidad a Níquel (QIAexpress® System, QUIAGEN), aprovechando que las proteínas de fusión a las toxinas contienen en e! extremo N-terminal una cola de histidinas las cuales son afines al níquel y nos permiten separarlas fácilmente de otras proteínas de E. coii. La metodología fue la siguiente: 1. Preparar una mini columna conteniendo 1.5 mi de resina de Níquel-NTA Agarosa (Qiagen).

2. Equilibrar cada columna con 10 volúmenes de buffer 20 rnM de imidazoí en 50 m Tris-HCI pH 8.0.

3. Cargar ¡as muestras de proteína en ia columna y dejar fluir por gravedad hasta pasar el total de la muestra.

4. Lavar con 10 volúmenes de buffer 30 mM de ímidazoi en 50 mM Tris-HCI pH 8.0, para eliminar ei pegado inespecífico.

5. E ulr ia proteína recombinante con 5 volúmenes de buffer 300 mM de ímidazoi en 50 mM Tris-HCI pH 8.0.

Para la purificación de las proteínas recombinantes de fusión de la fracción insolubie el protocolo fue el siguiente:

1. Preparar una mini columna conteniendo 1.5 mi de resina de Níquel-NTA Agarosa (Qiagen).

2. Equilibrar cada columna con 10 volúmenes de buffer 20 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCI pH 8.0 y 8 M de Cloruro de guanidinio.

3. Cargar las muestras de proteína en la columna y dejar fluir por gravedad hasta pasar el total de la muestra.

4. Lavar con 10 volúmenes de buffer 30 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCI pH 8 y 6 M de Cloruro de guanidinio, para eliminar el pegado inespecífico.

5. Eluir la proteína recombinante con 5 volúmenes de buffer 300 mM de imidazoí en 50 mM Tris-HCÍ pH 8.0 y 6 M de Cloruro de guanidinio.

Se continuó con el ensayo de píegamiento in vitro. Las condiciones de piegamienío fueron ias siguientes: Tris 0.2 M, cloruro de guanidina 2 M, pH 8 con GSH:GSSG 1 mM:0.1 m respectivamente, durante 4 °C durante 72 horas. Posteriormente, las proteínas plegadas se purificaron por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC).

Se evaluó la expresión y purificación de la proteína de fusión M-6His-FXa-Ts1 en un gel de poíiacriiarnida al 15% (ver figura 29).

Después de la purificación por afinidad y del ensayo de píegamiento, se realizó una purificación de la recombinante M-6His-Fxa-7s/ por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC). Para la ímplemeníación de este paso, se empleó una columna analítica C ₁₈ (Vydac, U.S.A) y un gradieníe de buffer A (Agua + 0.12% de TFA) a buffer B (Acetonitrilo + 0.1% de TFA) de 20- 60 % en 40 minutos. La proteína de fusión de interés eiuye en un tiempo de 16 minutos, como se indica con una flecha en la Figura 30. A ¡a fracción correspondiente ai tiempo de retención de 16 minutos se te determinó ¡a masa molecular por espectrometría de masas, obteniendo ia serie iónica observada en la Figura 31 , la cual indica que la masa experimental es la misma que ia teórica, la cual corresponde a 8,741 ,98 Da.

Para la proteína de fusión M-Fxa-EK-Ts3 también se evaluó la expresión y purificación en un gel de poiiacriiamida al 15% (ver figura 32).

Para ia proteína de fusión recombinante M~6His-EK-Ts3, posterior a su purificación por afinidad y al ensayo de píegamiento también se realizó su purificación por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC) de manera similar que corno se describe anteriormente para -8His-Fxa-Ts1. La proteína de fusión de interés es eluída alrededor de los 15.8 minutos, como se muestra en la Figura 33.

A ía fracción correspondiente a! tiempo de retención de 16 minutos se le determinó ia masa molecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo la serie iónica observada en la Figura 34, ia cual indica que ía masa experimental es la misma que la teórica, la cual corresponde a 9,493.8 Da,

Se evaluó la expresión y purificación de la proteína de fusión M-6His-EK-TsNTxP en un gel de poüacrilamida al 15%, Ver figura 35.

Para la proteína de fusión recombinante -6His~EK-TsNTxP, posterior a su purificación por afinidad y ai ensayo de píegamiento también se realizó su purificación por cromatografía de líquidos de alta presión por fase reversa (RP-HPLC) de manera similar que como se describe anteriormente para M-8His~Fxa-Ts1. La proteína de fusión de interés eluye a ios 15 minutos, como se muestra en la Figura 36.

A la fracción correspondiente al tiempo de retención de 15 minutos se Se determinó la masa molecular a través de un espectrómetro de masas, obteniendo la serie iónica observada en la Figura 37, ía cual indica que la masa experimental es la misma que la teórica, la cual corresponde a 8,742.2 Da.

Una vez purificadas las proteínas de fusión correspondientes a las proteínas Ts1 , Ts3 y TsNTxP se realizó la inmunización en conejos de de 2.5 kg de ia cepa Nueva Zelanda, esperando producir con ello anticuerpos con la capacidad de neutralizar a! veneno completo del alacrán Tityus serrulatus. La administración fue vía subcutánea, inyectando la mezcla de toxinas en un volumen final de 500 μΙ de PBS 1X. A continuación, se muestra el Esquema de inmunización empleado:

Esquema de inmunización en conejos (71 , 72 y 73) con las toxinas recombinantes Ts1, Ts3 y TsNTxP (Expresadas en pGE-30): Θ POR

TOXi SA

¡mUNiZACIÓ FECHA RECO BSNAN SUBCUTÁNE

(AÑO 2014) ADYUVANTE (μί) TE O/CONEJO SANGRÍA

1 ^a 1 de Julio Completo 250 10 500 ? ³ reinmune

2 ^a 11 de J fio incompleto 300 10 600 ^■

3 ^a 22 d Julio Alúmina 300 20 600 -

4 ^a 1 de Agosto incompleto 300 20 600 1 ^a Sangría

5* 11 de Agosto Alúmina 300 30 600

6 ^a 22 de Agosto Incompleto 300 30 600 2 ^a Sangría

1 de

Septiembre Alúmina 300 40 600

11 de

8 ^a Septiembre Incompleto 3Q0 40 600 4 ^a Sangría

Se realizaron ensayos de ELISA de reconocimiento dei suero de ios conejos inmunizados (Tablas 28 y 29) contra las toxinas recombinantes y contra el veneno total de Tityus s&rru!atus.

Tabla 28. Títuios de anticuerpos del suero de ios conejos inmunizados contra los antígenos recombinantes durante la 8 ^a Inmunización.

Título contra ia Títuío contra la Título contra la

Suero Toxina rTsl Toxina rTs3 Toxina rTsNTxP

Conejo 71 90621 ± 10652 17090 1 1236 9361 ± 1286

Conejo 72 381427 ± 37731 139034 ± 15248 84679 ± 14176

Conejo 73 305391 ± 53702 86627 ± 1 1816 71598 ± 7127 Tabla 29. Títulos de anticuerpos de los sueros de conejos inmunizados contra el veneno total de Tityus serruiatus durante la 6 ^a Inmunización. suero Título contra veneno de Tityus serruiatus

Conejo 71 1384 ± 228

Conejo 72 15210 ± 205

Conejo 73 887 ± 143

Los resultados de esta Tabla en la que se muestran los títulos de anticuerpos obtenidos contra el veneno total de Tityus serruiatus, indican que se estaría neutralizando completamente el veneno utilizando como ínmunógeno únicamente la mezcla de ¡as toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP.

A continuación se muestra el esquema de inmunización que se siguió:

Esquema de inmunización en conejos (71 , 72 y 73) con las toxinas recombinantes Ts1 , Ts3 y TsNTxP (expresadas en pQE~30)

Mg or

Fecha Adyuvars Toxina i¡! subcutáneo/

inmunización Adyuvante Sangría

{año 2Q1 ) te {μ!) aeojü í conejo

ríante

S 1 ^a Preinmu

1 de Julio Completo 250 10 500

incomplet

2 ^a 11 de Julio 300 10 600

0 -

3 ^a 22 de Julio Alúmina 300 20 600 -

4a Incomplet 1 ^a

1 de Agosto 300 20 600

0

0 Sangría

5 ^a 11 de Agosto Alúmina 300 30 600

Incomplet 2 ^a

6 ^a 22 de Agosto 300 30 600

0 Sangría ja 1 de Septiembre Alúmina 300 40 600

Incomplet 3 ^a S 8 ^a 11 de Septiembre 300 40 600

0 Sangría

9 ^a 22 de Septiembre PBS 60 600

4 ^a

26 de Se ptiembre de 2014

Sangría

10 ^a 02 de Octubre Alúmina 300 120 600

0 Incomplet 5 ^a

11 ^a 17 de Octubre 300 40 600

0 Sangría

REFUERZO CON VENENO

12 ⁸ 29 de Octubre Alúmina 300 50 600

Incomplet

13 ⁸ 14 de Noviembre 300 50 600 5 ^a Sangría o

28 de Noviembre . ,

a D¾anco

Para evaluar el suero de cada uno de los conejos inmunizados y determinar si el suero es capaz de reconocer a! veneno total de Tityus serruiatus y se determinaron los títulos de cada0 uno de los sueros mediante ensayos ELISA y el protocolo a seguir fue el siguiente:

Ensayo de ELISA

1. En placas de ELISA se agregó 100 μΙ/ pozo del antígeno (Veneno total de Tityus serruiatus 10 fig/ml) en buffer de bicarbonato de sodio 50 mM pH=9.4. Se incubó toda la noche (12- 8 horas) a 4 ^° C. Se Lavó 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1%). 2. Se agregó a cada pozo 200 μΙ de una solución de BSA al 0.5% en buffer de PBS 1X . Se incubaron por 2 h a 37 C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1 %).

3. Se agregó el anticuerpo (las diferentes diluciones del suero del respectivo conejo inmunizado) + PBS 1X (100 μ! por pozo). Se incubaron por 1 h a 37 ^° C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1%).

4. Se agregó anticuerpo anti-conejo acoplado a peroxidasa + PBS 1X 1 :2000 (100 μΙ por pozo). Se incubó por 1 h a 37 C y se lavaron 3 veces con PBS 1X + Tween (0.1 %).

5. Se preparó la solución de revelado con 11 mi buffer de fosfato de Na 0.1 N pH 5.0, 4.4 mg Orto-fenilendiamina y 4.4 μΙ H ₂ 0 ₂ y se agregó a cada pozo 100 μΙ de la solución. Se cubrió la píaca de ELISA con aluminio de 3 a 10 min a temperatura ambiente, hasta que se observó una coloración. Se agregó 10 μί de HCf 6N _S para detener la reacción. Se midió ía absorbancia a 490 nm en el lector de ELISA.

Los sueros obtenidos en e! suero preinmune y en la primera sangría se titularon contra mezcla de toxinas recombinantes como se muestra en la siguiente tabla. Ver figura 38.

©ando con arm

± ?73± 32 236 ± 58 sangría 8150 ± 1802 ± 89 2079Í8 ± 251

e la segunda sangría se realizaron las titulaciones de los sueros contra el veneno de Tityus serru!atus. En la gráfica de la Figura 39 s ^¡ e muestra la comparación de la seg sangría con la séptima y en la siguiente tabla se os valores de los títulos » de cada sangría.

A partir de la tercera sangría como los títulos de anticuerpos contra el veneno completo de T. serru!atus fueron altos sobretodo en el conejo 72 (1 :70000) se comenzaron a realizar ensayos de neutralización, para evaluar la capacidad de neutralizar al veneno completo. En las siguientes tablas se muestran los resultados obtenidos en cada ensayo de neutralización realizado con ios sueros obtenidos de la tercera, cuarta y séptima sangría. Para todos los casos el guión (--} indica que el ratón no murió.

1 DL ₅₀ =13.2 pg/ 20g ratón. 3 DL _S0 = 39.6 pg/ 20g ratón. Stock veneno = 2.2 μρ/μΙ Títyus serrulatus.

)L ₅₀ =13.2 MC / 20g raíór i.2 DL50 = 26. 4 μ§ί 20g rat ón. Stock ve neno = 3.5 §/μ! Tit us serrulatus.

L ₅₀ =13.2 pg/ 20g ratón. Stock veneno = 3.5 Mg/μΙ Tityus serru!afus.

1 DL ₅₀ =13.2 μ 1 20g ratón. 3 DL _S0 = 39.6 \igl 20g ratón. Stock veneno = 5.7 Mg/μί. NOTA: El guión {--) indica que el ratón no murió. Con base en los resultados, el mejor suero obtenido fue el del conejo 72, el cual fue capaz de neutralizar 3 DL ₅₀ del veneno total de Tityus serrulatus.

Los antígenos recombinant.es son capaces de primar la respuesta inmune, lo cual se confirma al usar ei suero final después de los dos refuerzos dados con el veneno total de Tityus serrulatus, el cual es capaz de neutralizar las 3 DL ₅ o, como se observa en la tabla 7, en donde todos los ratones tratados con el suero del conejo 72 sobreviven. Sin embargo, hay una variación dependiente de la respuesta inmune de cada conejo para producir sueros con buena capacidad neutralizante. La producción de antivenenos a nivel industrial basado por ejemplo en ¡a obtención de suero usando caballos, existe ¡a opción de seleccionar a ¡os mejores ejemplares respondedores, y a pesar de tal variabilidad en ¡as respuestas, con eí uso de ¡as toxinas recombinantes, motivo de esta invención, la conclusión es ciara: se recomienda su uso para potenciar la respuesta inmune y representan una ventaja para la producción de antívenenos de alta calidad, como ya se ha argumentado a So ¡argo de la descripción.

Habiendo descrito la invención son modalidades de la misma ¡as siguientes:

Una vez probada la eficacia de las toxinas recombinantes para generar anticuerpos neutralizantes contra toxinas y/o venenos de alacranes de diferentes géneros aplicando esquemas de inmunización en especies de mamíferos, es el objeto principal de la invención proveer de composiciones inmunogénicas con los antígenos descritos ya probados y en diferentes combinaciones o mezclas, las que resulten convenientes para la zona geográfica y más aún las que resulten sinérgicas o que muestren una protección cruzada.

Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno utilizando los antígenos recombinantes de manera separada o preparando mezclas con al menos dos de las mismas:

* AaH¡ del alacrán Androctonus austraüs (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:1 y ¡a profeína de fusión Tíorredoxina-EK-AaHI-6His SEQ ID No:1 1

® AaHI! del alacrán Androctonus austraüs (Norte de África, de Argelia a Egipto), SEQ ID No:2, y ¡a proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AaHII-6His SEQ ID No:12

* AmmV de¡ alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:3 y la proteína de fusión Tiorredoxina~EK-AmmV-8His SEQ ID No:13

« AmmVIII del alacrán Androctonus mauretanicus mauretanicus (Norte de África, Marruecos), SEQ ID No:4 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-AmmV¡il-8His SEQ ID No:14

* Bol I del alacrán Buthus occitanus tunetanus (Norte de África, Este de ¡a cuenca mediterránea y el Sahel Africano), SEQ ID No:5 y la proteína de fusión Tiorredoxina-EK- Botl-6His, SEQ ID No:15 * Lqhll del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ID No:6 y la proteína de fusión Tiorredoxina-E -LqHI¡-6His, SEQ ID No:16

® Lqh!V del alacrán Leiurus quinquestriatus hebraeus (África y Medio Oriente), SEQ ¡D No:7 la proteína de fusión Tiorredoxina-EK-LqbíV-6His, SEQ ID No;17

* Pg8 del alacrán Parabuthus granuiatus (Sur de África), SEQ ID No:8 la proteína de fusión Tiorredoxina-E -Pg8-6His, SEQ ID No; 18

^® Acra4 del alacrán Androctonus crassicauda (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:9 y la proteína de fusión T¡orredoxina-EK-Acra4-6His, SEQ ID No:19

* Bul del alacrán Bufhacus acrocentrus (Norte de África a Arabia Saudita y Turquía), SEQ ID No:10 y la profeína de fusión Tiorredoxina-E -Bu1-6His, SEQ ID No:20

Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno utilizando los siguientes antígenos recombinantes de especies de México de manera separada o aplicando mezclas con a! menos dos de las mismas, (híbrido es la profeína de fusión):

* Cn2 del alacrán Centruroides noxius (México), SEQ ÍD No: 21 híbrido Tíorredoxina-EK- Cn2-6His SEQ ID No:25

« ClU del alacrán Centruroides iimpidus (México), SEQ ID No: 22 híbrido Tiorredoxina-EK-

CIÍ1 -6HÍS SEQ ID No:26

» CII2 del alacrán Centruroides iimpidus (México), SEQ ID No: 23 híbrido Tiorredoxína-EK-

CII2-6HÍS SEQ ID No:27

® Cssl! del alacrán Centruroides suffusus (México), SEQ ID No: 24 híbrido Tiorredoxina- EK-Cssll-6His SEQ ID No:28

» Péptido híbrido His-Fxa-Cssií SEQ ID No:29

Es modalidad de la invención la posibilidad de obtener un antiveneno en un procedimiento que implica el uso de los siguientes antigenos recombinantes de la especie Tityus serruiatus de Sudamérica, de manera separada o aplicando mezclas con al menos dos de ias mismas:

• Ts1 SEQ ID No:30

» Ts3 SEQ ID No:31

• TsNTXp SEQ ID No:32

• Híbrida de Ts1 Tiorredoxína-EK-Ts1-8His SEQ ID No:33

· Híbrida de Ts3 Tiorredoxina-EK-Ts3-6His SEQ ID No:34

• Híbrida de TsNTXp Tiorredoxína-EK-TsNTXp-6His SEQ ID No:35

• Híbrida de Ts1 -6Hís-FXa-Ts1 SEQ ID No:36

• Híbrida de Ts3 M~6His-EK- Ts3 SEQ ID IMo:37

• Híbrida de TsNTXp M-6His-Ek-TsNTXp SEQ ID No:38 Dicha mezcla o combinación puede acompañarse de a! menos un excipiente farmacéuticamente aceptable para conformar una composición farmacéutica utílizable como mezcla inmunogénica, para obtener antivenenos de diversas especies de alacrán. Es modalidad de la invención que estos antivenenos sean fragmentos F{ab) o bien F{ab ^* ) ₂ de ios anticuerpos policlonales obtenidos de piasma hiperinmune de mamíferos, incluyendo caballos.

Con ias estrategias descritas de mezclas de antígenos recombinantes con o sin fusión, con el empleo de esquemas de inmunización adecuados diseñados por expertos en el campo de la invención, aunado a la capacidad inmunogénica que tienen los híbridos de todas las toxinas recombinantes propuestas en la presente, se tiene la posibilidad de seleccionar combinaciones de inmunógenos recombinantes que producen sueros neutralizantes de venenos de diversas especies de alacrán.

Dichas combinaciones pueden acompañarse de a! menos un excipiente farmacéuticamente aceptabie para conformar una composición farmacéutica utílizable como inmunógenos para obtener antivenenos de diversas especies de alacrán.

Es mcdaiidad de la invención la preparación de composiciones farmacéuticas que comprendan a las proteínas de la invención, solas ó bien en fas posibles combinaciones de las mismas, como el componente activo, pueden venir en estado liofilizado y antes de su inoculación, deberán ser reconstituidas en un disolvente que es un vehículo farmacéuticamente aceptable, quedando éste último como el componente inactivo y/o como un segundo componente adyuvante de la respuesta inmune de la composición farmacéutica. Para formulaciones iiofilizadas de ios antígenos pueden contener: al menos un protector de la Siofilización tales como: sucrosa, Ficoll 70, polivinilpirrolidona; al menos un agente para ganar volumen, por ejemplo manito!.

En las vacunas de antígenos que se presenten iiofilizados habrá que mezclar e! principio activo (liofilizado) con el disolveníe.y homogenizar perfectamente antes de su inoculación, el disolvente puede ser por ejemplo solución salina (como puede ser de NaCI) isotónica.

Para el uso de las composiciones inmunogénicas para la obtención de sueros antitóxicos, se puede manejar un pían de inmunización de equinos adecuado para obtener un suero con aíto título de anticuerpos (hiperinmune), los equinos deberán ser adultos jóvenes mestizos, estar en buen estado de salud y recibir una dieta balanceada y con refuerzos de vitaminas y minerales, negativos para anemia infecciosa equina y piroplasmosis y desparasitados con afbendazoí-praziquante!. Deben ser mantenidos de acuerdo a condiciones éticas estrictas de acuerdo con la "International Animal Welfare Recommendations" y por el "Committee Members, International Society on Toxinology". Los equinos pueden ser inoculados con ia composición antigénica de la invención, siguiendo un esquema de inmunización definido por personal experto en el área técnica, utilizando o no adyuvantes que confirmen la presentación de ¡os antígenos, por ejemplo: adyuvante de Freund Compieto o Adyuvante de Freund Incompleto, opcionalmente se puede manejar como adyuvante fosfato de aluminio u otras sales de aluminio. También es modalidad de la invención el uso de vehículos de liberación de los antígenos de la invención, que sean conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo: micelas anfifílicas, nanotubos de carbón, nanopartículas o microesferas de polímeros como poli (D,L-Lactida-co-glicolido) (PLG) y poli lactida (PLA), entre otros.

REFERENCIAS

Alami, ., Vacher, H., Bosmans, F., Devaux, C, Rosso, J.P., Bougis, P.E., Tytgat, J., Darbon, H., Martin-Eauclaire, M.F. 2003. Characterization of Amm Vil! from Androctonus mauretanicus mauretanicus: a new scorpion toxín fhat discriminates between neuronal and skeletal sodium channels, Biochem J. 375: 551 -80.

Becerril, B., arangoni. S. and Possani, L.D. Toxins and genes isolaíed from scorpions of the genus Tityus: a review. Toxican 35:821 -835 (1997).

Bomeman, J., Hahin, R. 1993. Purificatíon of proíein toxins from Leiurus quinquestriatus hebraeus that modify Na channels. Toxicon. 31 (8): 1019-38.

Bucaretchi, F., Baracat, E.C., Nogueira, R.J., Chaves, A., Zambrone, F.A., Fonseca, .R., Tourinho, F.S. 1995. A comparative study of severe scorpion envenomation in children caused by Tityus bahiensis and Tityus serrulatus. Rev. Inst. ed. Trop, Sao Paulo, 37 (4): 331—336.

Calderon-Aranda, E.S., Hozbor D., Possani L.D. 1993. Neutralizing capacity of murine sera induced by different antigens of scorpion venom. Toxicon. 31(3): 327-37.

Caliskan, F., Quintero-Hernández, V., Restano-Cassulini, R., Batista, C.V.F., Zamudio, F.Z., Coronas, F.l. and Possani L.D. 2012. Turkísh scorpion Buthacus macrocentrus: general characterization of the venom and description of Bul , a potent mammalian Na+~channe! alpha-toxin. Toxicon, 59: 408-415

Caiiskan, F., Quintero-Hernández, ., Restano-Cassulini, R., Coronas- Valderrama, F.L, Corzo, G., Possani, L.D. 2013. Molecular cioning and biochemicaS characterization of the first Na+-channel alpha-type toxin peptsde (Acra4) from Androctonus crassicauda scorpion. Biochimie, 95, 1216-1222.

Chippaux, J.P., Goyffon. M. 20Q8. Epiderniology of scorpionism: a global appraisal. Acta Trop. 107(2): 71 -9. Corona, M., García, . C, Valdez, N. A., Gurrola, G., BecerriS, B. y Possani, LD. 2008. Recombinant Immunogens for íhe Generation of Antivenoms to the Venom of Scorpions of the Genus Gentruroides. Patente US7335759 concedida en Estados Unidos el 26 de febrero de! 2008.

Corzo, G., Villegas, E., Nakajima, T. 2001. Ssolation and strucíuraí characterizatíon of a peptide from the venom of scorpion wiíh toxicity towards inveríebrates and vertebrales, protein and peptide letters. 8: 385-393.

Corzo-Burguete, GA, Estrada-Tapia, G., Hernández-Salgado, K., García-Gómez B. I. Y Possani, L. D. 2008. inmunógenos recombinanles para ¡a producción de antivenenos contra el veneno de alacranes del género Gentruroides. Patente MX29Q8G3 concedida en México el 29 de septiembre del 201 1.

Dehesa-Davila, M., Ramírez, A.N., Zamudio, F.Z., Gurroia-Briones, G., Lievano, A., Darszon, A., Possani, L.D.1996. Structural and functional comparison of toxins from the venom of the scorpions Gentruroides infamatus infamatus, Gentruroides ümpidus limpidus and Gentruroides noxius. Comp. Bioehem. Physioi. B, Biochem. Mol. Bio!. 1 13(2): 331 -339.

Delori, P., Rietschoten, J., Rochat, H. 1981. Scorpion venoms and neurotoxíns: an immunological study. Toxicon. 19(3): 393-407.

Duarte, C.G., Aivarenga, L.M., Dias-Lopes, C., Machado-de-Avila, R.A., Nguyen, C, Molina, F., Grarsier, C, Chávez-Olórtegui, C. 2010. ¡n vivo protection against Tityus serrulatus scorpion venom by antibodies raised against a discontinuous synthetic epitope. Vaccíne. 28(5): 1168-76.

Eickstedí, V.R.D., Ribeiro, L.A., Candido, D.M., Albuquerque, M.J., Jorge, M.T. 1996. Evolution of scorpionism by Tityus bahiensis (PERTY) and Tityus serrulatus Lutz and Mello and geographica! distribution of the two species in the state of Sao Paulo - Brazil J. Venom. Anim. Toxin. 2(2): 92-105.

Ei Ayeb, M. y Pierre Delori P. 1984. capítuto 18, páginas 607 a 638, del libro: Handbook of Natural Toxins, vol. 2 (editor Anthony T. Tu), editorial Marcel Dekker, ¡nc. New York.

Espino-Solis, G.P., Calderón-Amador, J., Calderon-Aranda, E.S., Ucea, A.F., Donis- ÍWlaturano, L, Flores-Romo, L., Possani, L.D. 2009. Rationaí design of synthetic peptides to genérate antibodies that recognize in situ CD11 c(+) putative dendritic cells in horse lymph nodes. Vet Immuno! Immunopathol. 132(2-4): 181-90.

Estrada, G., García, B.I., Schiavon, E., Ortiz, E., Géstele, S., Wanke, E., Possani, L.D., Corzo, G. 2007. Four disulfíde-bridged scorpion beta neurotoxin Cssll: Heterologous expression and proper folding in vifro. Biochimica et Biophysica Acta. 1770: 1 161-1 168. García-Gómez, B. !., Olamendi-Gómez T, C. y Possani, L. D. 2008 ¡nmunógenos recombinantes para la producción de antivenenos contra e! veneno de alacranes del género Parabuthus. Patente MX2Q08011306A concedida en México el 4 de septiembre del 2008, García-Gómez, B. I., Olamendi-Gómez T. C. y Possani, L. D, 2008 Inmunógenos recombinantes para la producción de antivenenos contra el veneno de alacranes del género Parabuthus. Patente MX2Q08011308A concedida en México el 4 de septiembre del 2008. García-Gómez, B.I., Olamendí-Portugal, T.C., Panlagua, J., van der Walt, J., Dyason, K., Possani, L.D. 2009. Heterologous expression of a gene that codes for Pg8, a scorpion toxin of Parabuthus granuiatus, capable of generating protecting aníibodies in mice, Toxicon, 53(7- 8): 770-8.

Gregoire, J., Rochat, H. 1983. Covalent strueture of toxins i and II from the scorpion Buthus occitanus tunetanus. Toxicon. 21 (1 ): 153-82.

Guatimosim, S.C., Kafapothakis, E., Diniz, C.R., Chávez-Olórtegui, C. 2000. Induction of neutralizing antibodies against Tiíyus serruiatus toxins by immunization with a recombinant nontoxic protein. Toxicon. 38(1 ): 113-21.

Guatimosim, S.C., Prado,V.F., Diniz, C.R., Chavez-Olortegui, C, Kafapothakis, E. 1999. Molecular cloning and genomic analysis of TsNTxp: an immunogenic protein from Tifyus serruiatus scorpion venom, Toxicon. 37(3): 507-517.

Hernández-Salgado, K., Estrada, G., Olvera, A., Coronas, F.I., Possani, L.D., Corzo, G. 2009. Heterologous expressed toxic and non-toxic peptide variants of toxin Cssll are capable to produce neutralizing antibodies against the venom of the scorpion Centruroides suffusus suffusus. Immunoi LetL 125(2): 93-9.

Ismail, M. 2003. Treatment of the scorpion envenoming syndrome: 12~years experience with serotherapy. Int J Antimicrob Agents. 21(2): 170-4.

Licea, A.F., Becerril, B., Possani, L.D. 1998. Fab fragments of the monoclonal anfibody BCF2 are capable of neutralizing the whole soluble venom from the scorpion Centruroides noxius Hoffmann. Toxicon. 34(8): 843-7.

artin-Eauclaire , M.F., Alami, M., Giamarchi, A., Missimiili, V., Rosso, J.P., Bougis, P.E. 2008. A natural anatoxin, Amm VIII, induces neutralizing antibodies against the pofent scorpion alpha-toxins. Vaccine. 24(12): 1990-6.

Martin-Eauclaire, M.F., Ceard, B., Ribeiro, A.M., Diniz, C.R., Rochat, H., Bougis, P.E. 1992. Molecular cloning and nucleotide sequence analysis of a cDNA encoding íhe main beta- neurotoxin from the venom of the South American scorpion Tityus serruiatus. FEBS Lett. 302 (3): 220-222. Martin-Eauc!aire, M.F., Céard, B. ₍ Ribeiro, A.M., D niz, C.R., Rochat, H., Bougis, P.E. 1994. Biochemical, pharmacologicaS and genomic characterisation of Ts IV, an alpha-toxin from the venom oí the South American scorpion Tiíysjs serrulatus. FEBS Lett. 342(2): 181 -4.

Mendes, T.M., Dias, F., Horta, C.C., Pena, I.F., Arantes, E.C., Kaíapothakis, E. 2008. Effective Tityus serrulatus aníi-venom produced using the Ts1 componen! Toxicon. 52(7): 787-93.

inistério da Saúde. 2001. Manual de diagnóstico e tratamento de acideníes por animáis peconhentos, Fundacao Nacional de Saúde/Coordenagáo de Controle de Zoonoses e Animáis Peconhentos. CENEPI, Brasilia.

Qfvera, A., Ramos-Cerrillo, B., Estévez, J., Clement, H., de Roodt, A., Paniagua-Solís, J., Vázquez, H., Zavateta, A., Arruz, M.S., Stock, R.P., Alagón, A. 2006. North and South American Loxosceíes spiders: deveíopmení of a polyvalent antivenom with recombinaní sphingomyeünases D as antigens. Toxicon. 48(1 ): 84-74.

Pedroso De Lima María C. y Düzgünes Nejat Eds. Trafficking of Intracellular embranes:: From Molecular Sortlng to Membrane Fusión (Nato ASI Subseries H:)Jan 1 , 1995

Possani, L.D., Becerril, B., Deiepierre, M., Tytgat, J. 1999. Scorpion toxins specific for Na*- channefs. Eur. J. Biochem. 264: 287-300.

Ram rez, A.N., Martin, B.M., Gurrola, G.B., Possani _s L.D. 1994. Isolation and characterization of a nove! toxin from the venom of the scorpion Centruroides ¡impidus limpidus Karsch. Toxicon. 32(4): 479-490.

Rochat, H., Rochat, C, Miranda, F., Lissitzky, S., Edman, P. 1970. The amino acid sequence of neurotoxin S of Androctonus austraiis hedor. Eur J Biochem. 17(2): 282-6.

Rochat, H., Rochat, C„ Sarnpieri. F., Miranda, F. & Lissitzky, S. 1972. The amino acid sequence of neurotoxin II of Androctonus austraiis Hedor. Eur J. Biochem. 28, 381-388. Rosso, J.P., Rochat, H, 1985, Characterization of ten proteins from the venom of the scorpion Androctonus mauretanicus rnauretanicus, six of which are toxic to the mouse. Toxicon, 23: 113-125

Zamudio, F., Saavedra, R., Martin, B.M, Gurrola-Briones, G., Hérion, P., Possani, L.D. 1992. Amino acid sequence and immiinologÍGal characterization with monocional antibodies of two toxins from the venom of the scorpion C&n uroides noxius Hoffmann. Eur J Biochem. 204(1 ): 281-92.