발명의명칭:중추신경계질환의치료또는예방� �약학조성물 기술분야

[1] 본발명은아미드유도체화합물또는이의약학적 으로허용가능한염에관한 것이다.또한,본발명은상기화합물또는이의약� ��적으로허용가능한염을 포함하는증추신경계질환의치료또는예방용약 학조성물에관한것이다. 배경기술

[2] 중추신경계는뇌와척수를포함하는신경계로서 ,감각신경과운동신경을

제어하는중추적인역할을한다.말초신경계와� �리 , ^추신경계는한번 손상되면다시정상으로회복하는것이어렵다고 알려져있다.

[3] 중추신경계의손상으로인해야기되는질환의대 표적인예에는,외상성

뇌손상，뇌졸증，뇌경색,소아뇌성마비 ,다발성축삭경화증,근위축성측삭 경화증,척수손상，시신경손상,특히외상또는� ��내장에의한시신경손상, 루게릭병,알츠하이머병，헌팅톤병，파킨슨� �둥이포함된다.더욱이, 중추신경계의손상은신체기능의여러장애들을 초래하며합병증을동반할수 있는위험을크게갖고있다.

[4] 중추신경계가손상된경우,그회복또는복구를� �해하는요인은크게외인성 요인과내재성요인으로구분할수있다.

[5] 상기외인성요인은신경세포밖에서축삭돌기의 성장을조절하는역할을

하며,여기에는신경계를구성하는교세포 (oligodendrocyte)의세포막에존재하는 MAG(myelin-associated glycoprotein), OMgp(01igodendrocyte myelin glycoprotein), Nogo뿐만아니라신경손상부위에형성되는 CSPG(chondroitin sulfate proteoglycan)등이대표적으로알려져있다 (Fitch, M.T. et al., CNS injury, glial scars, and inflammation: inhibitory extracellular matrics and regeneration failure. Experimental Neurobiology, 2008).이러한외인성요인은손상된축삭돌기가다 시 성장하는것을억제한다고보고되었으며，최근 에는외인성요인으로서밝혀진 인자들의활성을저해시킴으로써신경손상을치 료하려는연구가진행되고 있다.

[6] 상기내재성요인은신경세포내에서축삭돌기의 성장을조절하는역할을

하며 (Sun, F. et al., Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS. Current opinion in Neurobiology, 2010)，여기에는 2가지유형이있다.먼저, 축삭돌기의성장을촉진시키는내재성요인으로 서 cAMP, mTOR(mammalian target of rapamycin), JAK/STAT신호전달체계둥이대표적으로알려져있� ��며 , 이들은손상된말초신경계에서다시활성화되지 만손상된중추신경계에서는 여전히블활성화된상태로존재하는것으로보고 되었다.반면,축삭돌기의 성장을억제시키는내재성요인으로서 , PTEN단백질은 mTOR단백질의활성을 저해하는것으로알려져있으며，세포분열에관 여하는 APC-Cdhl단백질은성체 포유류의신경세포에서과발현되어축삭돌기의 성장을억제하는것으로알려져 있다.

[7] 축삭돌기의성장은배아의발달기간동안활발하 게일어나지만，일단출생한 이후에는거의중지된다.이는축삭돌기의성장� �촉진시키는신경세포내의 내재성요인이출생이후에는제대로기능하지못 함으로써초래되는현상이다. 이와관련하여 ,감각신경과운동신경으로대표되는말초신경� �는신경손상 이후에도회복이가능하다고알려져있는데，그 이유는축삭돌기의성장을 촉진시키는내재성요인이신경손상후에다시활 성화된다는이론에의해 설명되고있다.반면,중추신경계에존재하는내� ��성요인은신경손상이후에도 다시활성화되지않는다고보고되었다.따라서� �신경손상이후에불활성화되어 있는내재성요인을다시활성화시켜줄수있는화 합물을개발하는것이， 중추신경계질환을치료또는예방하기위한대책 들중하나로서증요하게 고려될수있다.최근에,축삭돌기의성장을촉진� ��키는내재성요인 (예를들어， mTOR)의활성올인위적으로조절하는전략을통해� ��시신경손상모델에서 축삭돌기가재생된효과를확인한연구결과가보 고되었다 (Park, KK, et al., Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science, 2008).이러한실험결과들은축삭돌기의성장을촉 진하는 약물이손상된중추신경계의치료제로서개발될 수있다는점을시사하는 것이다.

[8] 또한，중추신경계의손상은전기적자극의전달 통로인축삭돌기의파괴및 신경세포자체의사멸과연관된다는점에주목하 여야한다.따라서，손상된 중추신경을회복시키는것은,파괴된축삭돌기� �재생및신경세포자체의 보호의 2개측면에서접근할수있다.이러한이유로인해� ��현재당해업계에서 연구되고있는약물들은대부분상기 2개측면에주안점을두고진행되고있다. 특히，축삭돌기의재생효과를갖는약물과신경 세포의보호효과를갖는약물올 혼합하여사용하는조합요법에대한관심이점점 더커지고있다 (Stakeholder opinions: Spinal Cord Injury, Datamonitor 2010).

[9] 그러나,전술한기대와노력에도불구하고，손� �된중추신경계를유의적으로 회복시킬수있는만족할만한약물은여전히개발 되지못하고있는것이현재 상황이다.

발명의상세한설명

기술적과제

[ 10] 본발명은중추신경계질환의예방또는치료에유 용하게사용할수있는

화합물또는이의약학적으로허용가능한염，및 이를포함하는약학조성물을 제공하는것을목적으로한다.

과제해결수단 [11] 상기과제를해결하기위하여，본출원인 (재)경기과학기술진흥원 경기바이오센터내에구축되어있는약 18만여종의화합물들을이용하였다.본 발명자들이순차적으로수행한스크리닝과정은 후술하는실시예에구체적으로 기재하였다.요약하면,먼저마우스의배아암종� ��포주인 P19세포모델에서 P19세포의분화및신경돌기의증식을촉진시키는 화합물들을

스크리닝하였으며,선별된화합물들중에서 SD래트배아의뇌

해마 (hippocampus)신경세포의축삭돌기의성장을촉진� �키는화합물들을 스크리닝하였으며,마지막으로 SD래트태아의전뇌피질 (cortex)신경세포의 사멸을억제시키는화합물을스크리닝하였다.

[12] 이와같이본발명에서원하는후보화합물을스크 리닝한후,본발명자들은 축삭돌기의길이측정시험,세포독성시험，신� �재생시험등을통해손상된 증추신경계의재생에유의적인효과를나타내는 화합물의구조를최적화할수 있었다.

[13] 그결과,하기화학식 1또는 2로표시되는아미드유도체화합물또는이의 약학적으로허용가능한염이중추신경계질환의 예방또는치료용약학 조성물의유효성분으로서사용될때예측하지못 한유의적효과를나타낸다는 것올발견하였다.

[14] [화학식 1]

[15]

[16] 상기화학식 1에서，

[17] - ¾은 수소원자， C1-C6알킬， C2-C6알케닐， C2-C6알키닐， C6-CK)

아릴， C3-C10시클로알킬，또는 R ₅ 로치환되거나비치환된 Ν, Ο및 S증에서 선택된하나이상의해테로원자를갖는 C3— 10해테로아릴또는

헤테로시클로알킬이며,

[18] •상기 R ₅ 는수소원자，할로겐원자， C1-C6알킬, -OR ₅ , -0(CO)R ₆ , -N0 ₂ , -N(R ₆ ) ₂ ， -CN, -COR ₆ , -NH(CO)R ₆ , -NH(CO)NHR ₆ , -NH(CS)NHR ₆ , -NH(S0 ₂ )R ₆ , -SH, -SR ₆₎ -SOR _f i, -S(CO)R _f i, -C0 ₂ R ₆ , -α)Ν(¾) ₂ , -S0 ₃ H, -≤0 ₂ Ν(Ι _ή ) ₂ 및 -CF ₃ 로이루어진 군에서독립적으로선택된 1개내지 5개의치환기로서，오르소，메타및파라 위치중하나이상의위치에결합되며,

[19] •상기 R ₆ 는서로독립적으로수소원자， C1-C6알킬， C2-C6알케닐， C2-C6 알키닐, C6-C10아릴, C3-C10시클로알킬，또는 Ν, Ο및 S중에서선택된하나 이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬이며; [20] - R ₂ 는 ^ ^^ , ^， ° ¾r， oAo,수소원자, C1-C6알킬,

C2-C6알케닐, C2-C6알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,토실기，또는 R ₇ 로치환되거나비치환된 Ν, Ο및 S중에서선택된하나이상의헤테로원자를 갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬이며；

•상기 R ₇ 는수소원자,할로겐원자, C1-C6알킬， -OR ₈ , -0(CO)R ₈ , -N0 ₂ , -N(R _S ) _: , -CN, -COR ₈ , -NH(CO)R ₈ , -NH(CO)NHR ₈ , -NH(CS)NHR ₈ , -NH(S0 ₂ )R ₈ , -C0 ₂ R ₈ , -CON(R ₈ ) ₂ , -SR ₈ , -SOR ₈ , -S(CO)R ₈ , -SQ ₃ H, -S0 ₂ N(R ₈ ) ₂ , -S0 ₂ R ₈ , -CF ₃ ,

테트라졸릴로이루어진군에서독립적으로선택 된 1개내지 5개의치환기로서 오르소，메타및파라위치중하나이상의위치에 결합되며，

[22] ·상기 R ₈ 는서로독립적으로수소원자， C1-C6알킬, C2-C6알케닐， C2-C6 알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,또는 N, O및 S중에서선택된하나 이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬이며;

[23] - 수소원자, C1-C6알킬， C2-C6

알케닐， C2-C6알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,또는 R ₉ 로치환되거나 비치환된 N, O및 S중에서선택된하나이상의해테로원자를갖는 C3-10 해테로아릴또는해테로시클로알킬이며;

[24] ·상기 ¾는수소원자，할로겐원자， C1-C6알킬, -OR ₁₀ , -O(CO)R ₁₀ , -N0 ₂ , -N(R 1 ₀ ) ₂ , -CN, -COR ₁₀ , -NH(CO)R ₁₀ , -NH(CO)NHR ₁₀ , -NH(CS)NHR ₁₀ , -NR ₁₀ (SO ₂ )R ₁₀ , -SR io, -SOR ₁₀ , -S(CO)R ₁₀ , -CO ₂ R ₁₀ , -CON(R ₁₀ ) ₂ , -S0 ₃ H, -SO ₂ N(R ₁₀ ) ₂ , -CF ₃ ,및

할로겐으로치환되거나비치환된피리디닐,디� �졸릴,트리아졸릴및

테트라졸릴로이루어진군에서독립적으로선택 된 1개내지 5개의치환기로서, 오르소，메타및파라위치중하나이상의위치에 결합되며，

[25] ·상기 。는서로독립적으로수소원자, C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6 알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,또는 Ν, Ο및 S중에서선택된하나 이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는해테로시클로알킬이며,

[26] ·상기 R„은서로독립적으로수소원자， C1-C6알킬， C2-C6알케닐， C2-C6 알키닐, C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬, N, 0및 S중에서선택된하나이상의 헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬, -OH, -OMe, -C0 ₂ CH ₃ 또는 -C0 ₂ CH ₂ CH ₃ 이며，

[27] - R ₄ 는수소원자, C1-C6알킬， C2-C6알케닐, C2-C6알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,또는 N, 0및 S중에서선택된하나이상의헤테로원자를 갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬이며;

[28] -상기 R ₃ 및 R ₄ 는서로결합하여 N을포함하는 C3-10헤테로아릴또는

헤테로시클로알킬을형성할수있음.

[29] [화학식 2]

[31] 상기화학식 2에서，

[32] - R ₁₂ 는 C1-C6알킬， C2-C6알케닐, C2-C6알키닐， C6-C10

아릴, C3-C10시클로알킬，또는 R ₁₅ 로치환되거나비치환된 N, 0및 S중에서 선택된하나이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는

헤테로시클로알킬이며;

[33] •상기 R ₁₅ 는수소원자,할로겐원자， C1-C6알킬， -OR ₁₆ , -0(CO)R ₁₆ , -N0 ₂ , -N(R i ₆ ) ₂ , CN, -COR ₁₆ , -NH(CO)R ₁₆ , -NH(CO)NHR ₁₆ , -NH(CS)NHR ₁₆ , -NH(S0 ₂ )R ₁₆ , -SR ₁₆ ， -SOR ₁₆₎ -S(CO)R ₁₆ , -C0 ₂ R ₁₆ , -CON(R ₁₆ ) ₂ , -S0 ₃ H및 -S0 ₂ N(R ₁₆ ) ₂ 로이루어진군에서 독립적으로선택된 1개내지 5개의치환기로서，오르소,메타및파라위치중 하나이상의위치에결합되며;

[34] •상기 R ₁₆ 는서로독립적으로수소원자, C1-C6알킬， C2-C6알케닐， C2-C6 알키닐， C6-C10아릴， C3-C10시클로알킬,또는 Ν, Ο및 S중에서선택된하나 이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는헤테로시클로알킬이며；

[35] - ,수소원자, C1-C6알킬， C2-C6알케닐， C2-C6알키닐， C6-C10

아릴, C3-C10시클로알킬，또는 R ₁₇ 로치환되거나비치환된 N, O및 S중에서 선택된하나이상의헤테로원자를갖는 C3-10헤테로아릴또는

헤테로시클로알킬이며,

[36] •상기 R _l7 는수소원자，할로겐원자, C1-C6알킬, -OR, ₈ , -0(CO)R _{l 8} , -N0 ₂ , -N(R 1 ₈ ) ₂ , -CN, -COR ₁₈ , -NH(CO)R ₁₈ , -NH(CO)NHR ₁₈ , -NH(CS)NHR ₁₈ , -NH(S0 ₂ )R ₁₈ , -SR ₁₈ , -SOR, ₈ , -S(CO)R, ₈ , -CO,ᅳ R _l8 , -CON(R _l8 ) ₂ , -S0 ₃ H, -S0 ₂ N(R ₁₈ ) ₂ 및 -CF ₃ 로이루어진 군에서독립적으로선택된 1개내지 5개의치환기로서,오르소,메타및파라 위치중하나이상의위치에결합되며,

[37] •상기 R ₁₈ 는서로독립적으로수소원자， C1-C6알킬, C2-C6알케닐, C2-C6 알키닐， C6-C10아릴, C3-C10시클로알킬,또는 N, 0및 S중에서선택된하나 이상의헤테로원자를갖는 C3-10해테로아릴또는헤테로시클로알킬이며;

[38] R _l4 는

[39] 바람직한일구현예에서，상기화학식 1의치환기 은 2-메록시페닐,

2ᅳ에특시페닐, 3-메톡시페닐 , 2,4-디메록시페닐, 3,4-디메록시페닐，

2-플루오로페닐， 3-클로로 -4-메록시페닐, 2,5-디메록시페닐， 2-메틸페닐， 4-플루오로페닐 , 2,4-디메틸페닐또는 2-클로로페닐이다.

[40] 또다른바람직한일구현예에서，상기화학식 1의치환기 R ₂ 는하기로이루어진 군중에서선택된기이다:

[41]

[42] 또다른바람직한일구현예에서，상기화학식 1의치환기 R ₃ 은하기로이루어진 군증에서선택된기이다:

[43]

[45] 특히,바람직하게는상기화학식 1또는 2의화합물은하기로이루어진

군으로부터선택된다:

[46] N-(2-에록시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아口 [47] 2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-페닐아세트아미드，

[48] N-(2-에톡시페닐) -2-(4-메틸 -N-페닐페닐술폰아미도)아세트아미드,

[49] N-(2-에록시페닐) -2-(N-(2-메록시페닐)페닐술폰아미도)아세트아� ��드, [5이 N- (벤조 [d]옥사졸 -2-일메틸) -N-(2-메톡시페닐) -4-메틸벤젠술폰아미드,

[51] N- (벤조 [d]티아졸 -2-일메틸 )-N-(2-메특시페닐 )-4-메틸벤젠술폰아미드，

[52] N-(2-에틸페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드，

[53] N-(2-브로모페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드,

[54] N-(2-플루오로페닐 )-2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드

[55] Ν-(2-(1Η-테트라졸 -5-일)페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아 세트아미드，

[56] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-메특시피리딘 -3-일)아세트 아미드염산염,

[57] N-(2-((2-에특시페닐)아미노)에틸) -N-(2-메특시페닐) -4-메틸벤젠술폰아미드, [58] 메틸 2-(2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조에� ��트， [59] 2-(N-(2-에톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-메특시 -5-메틸페닐)아세트 아미드,

[60] N-(2,5-디메톡시페닐 )-2-(4-메톡시 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도)아세트아 미드,

[61] 2-(4-클로로 -N-(2-에록시페닐)페닐술폰아미도) -N-(2,5-디메록시페닐)아세트아 미드,

[62] 2-(N-(5-클로로 -2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-메톡시페닐)아세 트아미드，

[63] N-(2,4-디메톡시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미 드

[64] N-(2-클로로페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드， [65] N-(4-클로로 -2-메¾페닐) -2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드,

[66] N-(3-클로로 -4-메틸페닐)— 2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드,

[67] N-(2-메특시 -5-메틸페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드,

[68] N-(4-클로로벤질) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드， [69] N-벤질 -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드,

[70] 에틸 2-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조에� ��트, [71] N-(3-브로모페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드, [72] N-(2-플루오로페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드

[73] N-(3-메톡시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드, [74] N-(5-클로로 -2-메록시페닐) -2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세 트아미드 [75] N-(2-메특시벤질) -2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드, [76] N-(sec-부틸) -2-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤 자미드，

[77] 2-(N-(2-에특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(3-(N-메틸메틸술폰아미도)페 닐)아세트아미드，

[78] N-(2,3-디클로로페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미 드

[79] N-(2-메톡시 -5-메틸페닐) -2-(4-메특시 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도)아세 트아미드

[80] N-(2,5ᅳ디메톡시페닐) -2-(N-(2-에특시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도)아세 트아미드

[81] N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(2-플루오로페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드 [82] 2-(N-(3,4-디메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에특시페닐)아세트아미 드

[83] N-(2-에특시페닐) -2-(N-(4-이소프로필페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미 드

[84] N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(4-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드, [85] N-(2-에록시페닐) -2-(N-(3-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드, [86] 2-(N-(2,5-디메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에톡시페닐)아세트아미

[87] 2-(N-(3-클로로 -4-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에특시페닐)아세 트아미드

[88] 2-(N-(4-브로모페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에록시페닐)아세트아미드, [89] 2-(N-(4-클로로페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에톡시페닐)아세트아미드, [90] N-(2-에톡시페닐) -2-(4-메틸 -N-(o-를릴)페닐술폰아미도)아세트아미드,

[91] N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(4-플루오로페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드

[92] 2-(N-(2,5-디메틸페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에특시페닐)아세트아미드, [93] 2-(N-(2-클로로페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-에톡시페닐)아세트아미드， [94] N-(2-메특시페닐) -2-(4-메틸 -N-(o-를릴)페닐술폰아미도)아세트아미드，

[95] 2-(N-(3-클로로 -4-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-메톡시페닐)아세 트아미드

[96] N-(2-메톡시페닐) -2-(4-메틸 -N-(3- (트리플루오로메틸)페닐)페닐술폰아미도)아 세트아미드,

[97] 2-(N-(3,4-디메틸페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(2-메톡시페닐)아세트아미드， [98] (S)-메틸

1-(2-(Ν-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세틸)피를리딘 -2-카르복실레이 트

[99] (R)-메틸

2-(2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도) -2-페닐아세테이트 [100] (R)-에틸

2-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도) -3-페닐프로피오네 이트,

[101] N-(5-브로모티아졸 -2-일) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드,

[102] N-(3-(4-플루오로페닐) -1H-피라졸 -5-일) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰 아미도)아세트아미드，

[103] N-(5-히드록시 -1H-피라졸 -3-일) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아 세트아미드，

[104] N-(2-메톡시페닐) -4-메틸 -N-(2-옥소 -2-(4- (피리딘 -2-일)피페라진 -1-일)에틸)벤젠 술폰아미드，

[105] N-(2-(4-(4-플투오로페닐)피페라진 -1-일) -2-옥소에틸) -N-(2-메톡시페닐) -4-메틸 벤젠술폰아미드,

[106] N-(5-(4-클로로페닐) -1,3,4-옥사디아졸 -2-일) -2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술 폰아미도)아세트아미드,

[107] N-(2-에톡시피리딘 -3-일) -2-(N-(2-메.톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드，

[108] N-(2-이소프로폭시피리딘 -3-일) -2-(N-(2-메록시페닐 )-4-메틸페닐술폰아미도) 아세트아미드，

[109] N-(2-클로로피리딘 -3-일) -2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트 아미드，

[110] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(3-메톡시피리딘 -2-일)아세트 아미드，

[111] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(4-메톡시피리딘 -3-일)아세트 아미드，

[112] N- (이소퀴놀린 -3-일) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미

[113] 2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N- (퀴놀린 -5-일)아세트아미드, [114] 2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N- (퍼플루오로페닐)아세트아미

[115] N-(2-에특시페닐) -2-(N-(2—메특시페닐)나프탈렌 -2-술폰아미도)아세트아미드，

[1 16] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N- (티아졸 -2-일)아세트아미드,

[1 17] N-(2-에특시벤질) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드

[1 18] N-( 1 H-이미다졸 -2-일 )-2-(N-(2-메톡시페닐 )-4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미 드

N-(2-메톡시페닐) -2-(N-(2-메록시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도)아세트아 미드，

N-(2-에특시페닐) -2-(N-(2-메록시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도)아세트아 미드,

N-(3-에톡시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도)아세트아 미드,

Ν-(3-(1Η-이미다졸 -1-일)페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미 도)아세트아미드염산염,

N-(2,5-디메특시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도)아세 트아미드,

N-(2,5-디메특시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4- (메틸술피닐)페닐술폰아미도)아 세트아미드，

N-(2,5-디메특시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4- (메틸술포닐)페닐술폰아미도)아 세트아미드，

N-(2,5-디메록시페닐)ᅳ 2-(4-플루오로 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도)아세트 아미드,

2-(4-시아노 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도) -N-(2,5-디메록시페닐)아세트아 미드,

N-(2,5-디메록시페닐 )-2-(N-(2-메톡시페닐 )-4-( 1 H-테트라졸 -5-일 )페닐술폰아미 도)아세트아미드，

2-(4-브로모 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도) -N-(2,5-디메톡시페닐)아세트아 미드,

2-(4-아세틸 -N-(2-메록시페닐)페닐술폰아미도) -N-(2,5-디메록시페닐)아세트아 미드,

메틸 4-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조에� ��트， 메틸

6-(2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)니코티� ��이트, 메틸

2-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도) -5-메틸벤조에이트 메틸

4,5—디메특시 -2-(2-(Ν-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조 에이트，

Ν-(3,4-디메특시페닐) -2-(Ν-(2-메특시페닐) -4ᅳ메틸페닐술폰아미도)아세트아미 2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N- (퀴놀린 -6-일)아세트아미드, Ν-(5-(1Η-이미다졸 -1 -일) -2-메특시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4- (메틸티오)페닐 술폰아미도)아세트아미드염산염,

[138] N-(2,5-디메톡시페닐 )-2-((2-메톡시페닐) (4-메틸벤질)아미노)아세트아미드, [139] N-(2,5-디메톡시페닐) -2-(4-(1-하이드록시에틸) -N-(2-메특시페닐)페닐술폰아미 도)아세트아미드，

[140] 4-클로로 -N-(2-((2,5-디메톡시페닐)아미노) -2-옥소에틸) -N-(2-메톡시페닐)벤자 미드，

[141] 2-(4-브로모 -N-(2-메특시페닐)페닐술폰아미도) -N-(4-메톡시피리딘 -3-일)아세 트아미드염산염,

[142] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4- (메틸티오)페닐술폰아미도) -N-(4-메록시피리딘 -3-일)아 세트아미드,

[143] 2-(4-아세틸 -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도) -N-(4-메특시피리딘 -3-일)아세 트아미드,

[144] 2-(4-(1-하이드록시에틸) -N-(2-메톡시페닐)페닐술폰아미도) -N-(4-메특시피리 딘 _3-일)아세트아미드,

[145] 메틸

2-히드록시 -5-(2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조에 이트,

[146] 메틸

2-히드록시 -4-(2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미도)벤조에 이트,

[147] N-(2-에특시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-메틸아세트 아미드,

[148] N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4—메틸페닐술폰아미도) -N- (프로프 -2-인 -1-일)아세트아미드,

[149] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N- (퀴놀린 -3-일)아세트아미드, [150] 2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(6-메록시피리딘 -2-일)아세트 아미드，및

[151] 2-(4-(1- (부틸아미노)에틸) -N-(2-메록시페닐)페닐술폰아미도) -N-(4-메록시피리 딘ᅳ 3—일)아세트아미드.

[152]

[153] 본발명의측면에서，알킬,알케닐，알키닐과� �은용어는선형또는분지형을 모두포함하는것으로의도된다.

[154] 본발명에서사용되는용어 "서로독립적으로"는，특정치환기가 2개이상 결합될경우서로에대해무관하게다른유형이선 택될수있다는것을 의미한다ᅳ예를들어，상기화학식 1에서치환기 R ₅ 가 - S0 ₂ N(R ₆ ) ₂ 인경우， 2개의 ¾ 중하나는수소원자이고다른하나는메틸기가선 택될수있다.

[155] 상기화학식 1또는 2의화합물은비대칭탄소중심을가질수있으므� �， R또는 S이성질체，라세미체，부분입체이성질체,또� ��이들의흔합물로서존재할수 있으며,이들은모두본발명의범위에포함된다.

[156] 후술하는실시예에서보는바와같이 ,본발명자들은상기화학식 1또는 2의 화합물또는이의약학적으로허용가능한염이신 경세포로의분화,신경돌기의 증식촉진,축삭돌기의성장촉진，신경세포의� �멸억제,세포무독성,신경재생 등의효과를나타낸다는사실을실험적으로확인 하였다.따라서，본발명은 화학식 1또는 2의화합물또는이의약학적으로허용가능한염� �포함하는것올 특징으로하는증추신경계질환의예방또는치료 용약학조성물을제공한다.

[157] 또한,본발명은상기화학식 1또는 2의화합물또는이의약학적으로

허용가능한염올유효성분으로포함하는약학조 성물을대상체 (예컨대，인간 또는포유류)에게투여하는단계를포함하는중� �신경계질환의치료또는예방 방법을제공한다.

[158] 상기 "중추신경계질환"은바람직하게는축삭돌기의� ��괴또는신경세포의 사멸로인해야기되는질환들을의미하며,여기� �는외상성뇌손상,뇌졸중, 뇌경색,소아뇌성마비 ,다발성축삭경화증,근위축성측삭경화증，척� ��손상, 시신경손상，특히외상또는녹내장에의한시신 경손상，루게릭병,

알츠하이머병，헌팅톤병,파킨슨병등이포함� �다.

[159] 본발명에서사용되는용어 "예방 "은,상기약학조성물을중추신경계질환이 발생될위험이높은대상체에게투여함으로써중 추신경계질환의발병을억제, 지연또는방지시키는모든행위들을의미한다.� �한,본발명에서사용되는 용어 "치료 "는，상기약학조성물을중추신경계질환을앓� �있거나

중추신경계가손상된대상체에게투여함으로써 증상을호전，역전，완치또는 개선시키는모든행위들을의미한다.

[160] 본발명의약학조성물은상기화학식 1또는 2의화합물또는이의약학적으로 허용가능한염과함께,필요에따라서는축삭돌� �재생에활성을갖는공지의 유효성분올 1종이상더함유할수도있다.

[161] 본발명에서사용되는용어 "약학적으로허용가능한염 "은，당해기술

분야에서통상적인방법에의해제조될수있는것 으로，예를들면，염산, 브롬화수소,황산,황산수소나트륨,인산,탄산� �의무기산과의 염또는개미산, 초산，옥살산,벤조산，시트르산,타르타르산� ��글루콘산，게스티스산,푸마르산， 락토비온산，살리실릭산，또는아세틸살리실 릭산 (아스피린)과같은유기산과 함께약학적으로허용가능한이들의산의염을형 성하거나，또는나트륨，칼륨 등의알칼리금속이온과반웅하여이들의금속염 을형성하거나，또는암모늄 이온과반웅하여또다른형태의약학적으로허용 가능한염을형성할수도 있다.

[162] 본발명에따른약학조성물은약학적으로허용되 는담체 ,희석제또는

부형제를추가적으로포함할수있다.본발명에� �사용되는용어 "약학적으로 허용가능한담체또는희석제 "는유기체에상당한자극을야기하지않고， 투여되는화합물의생물학적활성및성질을폐기 하지않는담체또는희석제를 의미한다ᅳ또한,본발명에서사용되는용어 "약학적으로허용가능한부형제' '는 본발명의화합물또는염의투여를더욱용이하게 하기위해약학조성물에 첨가되는불활성물질을의미한다.이러한부형� �의예는탄산칼슴,인산칼슴， 다양한유형의당류및전분，샐를로오스유도체 ，젤라틴,식물성오일및 폴리에틸렌글리콜이있지만，이에한정되는것 은아니다.

[163] 본발명에따른약학조성물은대상체에게다양한 경로로투여될수있다.예를 들어,경구，직장또는정맥주사，국부또는비� �구경로를통해투여될수 있지만，이러한투여경로에한정되는것은아니 다.

[164] 본발명에따른조성물은특정제형에한정됨이없 이경구투여용제제또는 비경구투여용제제로제형화할수있다.이때,본� ��명에따른유효성분은제형 내에단위용량이함유될수도있고,분취량으로� �뉘어함유될수도있다.본 발명에따른조성물올제형화하는경우，당업계 에서일반적으로사용되는 통상의층진제,증량제,결합제,습윤제，계면활 성제등의희석제또는부형제를 추가로사용할수있다.경구투여를위한고형제� �에는예를들어정계，환제， 산제，과립계,캡슐제등이포함되며，이러한� �형제제는상기유효성분외에 하나이상의부형제，예를들어전분，탄산칼슴 ，수크로스，락토오스또는젤라틴 등올포함할수있다.경구투여를위한액상제제� �는예를들어현탁제， 내용액제，유제및시럽제등이포함되며,이러� �액상제제는통상적으로 사용되는단순희석제인물,리퀴드파라핀외에� �러가지부형제들,예컨대 습윤제,감미겨ᅵ,방향제,보존제등을포함할수 있다.비경구투여를위한 제제에는예를들어멸균된수용액,비수용성제,� ��탁용제，유제，동결건조제제， 좌제가포함될수있다.현탁용제로서프로필렌� �리콜，폴리에틸렌글리콜， 올리브오일과같은식물성기름,에틸올레이트� �같은주사가능한에스테르 등이사용될수있다.

[165] 본발명에따른약학조성물의투여량은환자의나 이 ,성별，체중및건강상태， 질환의중증도，발병시점,치료기간둥을고려� �여당해기술분야의숙련된 의사또는수의사가적절하게선택할수있다.예� �들어，몸무게가 70kg인 성인환자를기준으로할때일반적으로 0.01 mg/일내지 1000 mg/일이며，의사 또는약사의판단에따라일정시간간격으로 1일 1회내지수회로분할투여할 수도있다.

[166]

[167] 화학식 1의화합물의제조방범

[168] 본발명에따른화학식 1의화합물은예를들어하기반웅식 1내지 7중어느 하나에따라제조할수있다.하기반웅식 1내지 7에서 R _l5 R ₂ , R ₃ , R ₄ 는각각 상기에서정의한바와같다.

[ 169]

[170] [반웅식 1] R厂 NH ₂

A

C D

：가수분 H

G

[172] 상기반웅식 1에서，화합물 A와화합물 B를반응시켜화합물 C를수득하고， 이를에틸클로로아세테이트와반웅시켜가수분 해하여화합물 E를제조한후, 화합물 F와아미드결합반웅을수행하여최종생성물로� �화합물 G를 제조한다.최종생성된화합물 G는화학식 1에서 가11인화합물이다.

[173] 이때，마지막단계에서카르복실산화합물 E와아민화합물 1 ]아미드결합을 위해，옥살릴클로라이드,티오닐클로라이드� �을이용하여카르복실산을 카르복실산클로라이드로전환시킨후아미드결 합을시키는것이바람직하다. 또다른대안으로서， Ν,Ν'-디시클로핵실카르보다이미드 (DCC),

히드록시벤조트리아졸 (HOBt),

1 -bis (디메틸아미노)메틸렌 -1 H- 1 ,2,3-트리아졸로 [4,5-b]피리디늄 3-옥시드 핵사플루오로포스페이트 (HATU),

Ν,Ν,Ν,Ν-테트라메틸 -0-(1Η-벤조트리아졸 -1-일)우로늄

핵사플루오로포스페이트 (HBTU),

(벤조트리아졸 -1 -일옥시 )트리피롤리디노포스포늄

핵사플루오로포스페이트 (PYBOP), Bis(2-옥소 -3-옥사졸이디닐)포스피닉 클로라이드 (BOP-C1)등을이용하여카르복실산을활성화킨후� ��민과반웅시켜 아미드결합을시키는것도고려될수있다.

[174]

[175] [반웅식 ¾

C G

[177] 상기반웅식 2에서,화합물 C와화합물 H를반웅시켜화합물 G를제조한다. 최종생성된화합물 G는화학식 1에서 ¾가11인화합물이다.

[178]

[179] [반웅식 3]

[181] 3에서 ,화합물 Α와화합물 H를반응시켜화합물 I를제

화합물 B와반웅시켜화합물 G를제조한다.최종생성된화합물 G는화학식 1에서 R ₄ 가 H인화합물이다.

[182]

[183] [반웅식 4]

G 160°C, 20m in J

[ 185] 상기반웅식 4에서，화합물 G를요오드메탄과반웅시켜화합물 J를제조한다. 이때，상기반응식 1내지 3중어느하나에따라제조된화합물 G (즉，화학식 1에서 R ₄ 가 H인화합물)가출발물질로서사용된다.최종생성 된화합물 J는 화학식 1에서 ^가메틸인화합물이다.

[186]

[ 187] [반웅식 5]

[189] 상기반웅식 5에서,화합물 K mCPBA와반웅시켜산화시킨다.이때

3 를 , mCPBA의첨가량및반웅온도와같은조건에따라，� ��합물 L또는화합물 M이 제조된다.생성화합물 L은 가 이고 이 -SOC¾인화합물이다.

생성화합물 M은화학식 1에서 R ₂ 가 이고 R ₇ 이 -S0 ₂ CH ₃ 인화합물이다.

[190]

[191] [반웅식 6]

[193] 상기반응식 6에서 ,화합물 Ν을 NaN ₃ 와반웅시켜화합물 O를제조한다.생성 화합물 0는화학식 1에서 R ₂ 가 이고 R ₇ 이테트라졸릴인화합물이다.

[194]

[195] [반웅식 7]

[196] . [197] 상기반웅식 7에서，화합물 P를 NaBH4로환원시켜화합물 Q를제조한다.생성 화합물 Q는화학식 1에서 R ₂ 가 이고 ¾이메틸인

화합물이다.

[198]

[199] 하학식 2의화함물의제조방법

[200] 본발명에따른화학식 2의화합물은예를들어하기반응식 8또는 9에따라 제조할수있다.하기반웅식 8및 9에서 R ₁₂ , R,3, R ₁₄ 는각각상기에서정의한 바와같다.

[201]

[202] [반응식 8]

[204] 상기반웅식 8에서，화합물 R과클로로아세틸클로라이드를반응시켜화합� � S를제조하고 PPA조건하에화합물 T를제조한후,화합물 Y에의한알킬화 반웅을통해최종생성물로서화합물 U를제조한다.최종생성된화합물 U는 화학식 2에서 R ₁₄ 가 인화합물이다.

[205]

[206] [반응식 9]

[208] 상기반웅식 9에서，화합물 V와클로로아세틸클로라이드를반웅시켜화합� � W를제조한후,화합물 Y에의한알킬화반응을통해최종생성물로서화� �물 X를제조한다.최종생성된화합물 X는화학식 2에서 R ₁₄ 가

화합물이다. [210] 전술한제조방법외에도,당해업계의통상의지� �을가진자라면본발명에 따른화학식 1또는 2의화합물또는이의약학적으로허용가능한염� �적절한 과정및조건을적용하여수득할수있을것이다.

발명의효과

[211] 본발명에따른화합물은신경세포의분화，신경 돌기의증식，축삭돌기의길이 성장,산화적스트레스에의한신경세포의사멸� �제，세포무독성,손상된 중추신경계의재생과같은유의적인효과를나타 내는것으로실험올통해 입증되었다.

[212] 따라서 ,본발명에따른화합물은중추신경계의손상으� �인해야기되는질환， 예를들어외상성뇌손상,뇌졸중，뇌경색,소아� ��성마비,다발성축삭경화증， 근위축성측삭경화증,척수손상，시신경손상� �특히외상또는녹내장에의한 시신경손상,루게릭병,알츠하이머병，헌팅톤� ��，파킨슨병등을치료또는 예방하기위한약학조성물의활성성분으로유용 하게사용될수있다.

도면의간단한설명

[213] 도 1은본발명에따른화합물의세포독성을확인하� �위하여 SD래트의망막 신경세포의생존율을측정한결과를막대그래프 로도시한것이다.

대조군 (화합물비처리그룹)과실험군 (2, 10, 20 μΜ농도 CYM화합물처리 그룹)으로나누어진다.

[214] 도 2및 3은본발명에따른화합물의축삭돌기성장촉진� �과를확인하기

위하여 SD래트의망막신경세포의축삭돌기길이를측정� ��결과를

막대그래프로도시한것이다.

[215] 구체적으로,도 2는축삭돌기의길이가 50 μπι이상인신경세포의총수를

비교한것이며，도 3은축삭돌기의길이가 50 ~ 100 μιη, 100 ~ 200 μιη, 200 μιη 이상인신경세포의수를각각별도로나누어비교 한것이다.

[216] 도 4및 5는본발명에따른화합물의시신경재생정도를� �인하기위한실험 결과를도시한것이다.

[217] 구체적으로，도 4는 SD래트의시신경압박손상모델에서화합물을처� ��한후 재생된시신경을염색후촬영한사진으로서，녹 색으로염색된부분이시신경의 축삭돌기를나타낸다.도 4의상단부사진은대조군 (PBS처리그룹)을촬영한 것으로서손상된시신경이거의재생되지않았음 을시사하며 ,도 4의하단부 사진은실험군 (CYM화합물처리그룹)을촬영한것으로서손상된� ��신경이 매우유의적으로재생되었음을시사한다.도 5는시신경압박손상부위에서 떨어져있는거리 (500 μηι, ΙΟΟΟ μηι, 1500 μτη)에따라축삭돌기의수를비교한 것이다.

발명의실시를위한형태

[218] 본발명에대해서는하기의실시예와본명세서에 첨부된도면에기초하여 보다상세하게설명될것이나，이는본발명의권 리범위를제한하려는것이 아니다.또한,당해기술분야에서통상의지식을� ��진자라면본발명의취지를 해하지않는범위내에서본발명에대해다양한변 형및수정을가할수있을 것이다.

[219]

[220] 심시예 1:스크리닝제 1단계 - P19세포의신경세포로의분화및신경돌기의

、 증식촉진

[221] (재)경기과학기술진흥원경기바이오센터내에� ��축된저분자화합물

라이브러리 177,920개에대해， P19세포모델을이용하여신경세포로의분화및 신경돌기의증식을촉진시키는화합물을스크리 닝하였다.

[222] 상기 P19세포는마우스의배아암종세포주로서，일반 적인배양조건에서는 거의분화되지않는다.반면,신경세포특이적전� ��조절인자 NeuroD2를 P19 세포에전달해주면,신경돌기 (neurite)가증식하고신경세포로분화한다.

[223] 따라서,본발명자들은신경세포특이적전사조� �인자 NeuroD2 DNA

플라스미드를 P19세포와함께배양하는 P19세포모델올구축하였다.이때， 어떠한화합물이 P19세포를신경세포로분화시키는것을촉진하고 신경돌기의 증식을촉진하는지관찰하였다.

[224] 먼저， P19세포는 10%소태아혈청 (FBS), 50 U/mL페니실린및 50 g/mL

스트랩토마이신， 2 mM Glutamax, 1 mM피투브산나트륨이첨가된

MEM (최소필수배지)을이용하여 37 ⁰ C, 5% C0 ₂ 배양기에서배양하였다.상기 배양된 P19세포를 384-웰플레이트에 4,000세포 /웰로 80 씩분주하였으며, 이때사용한배지는 5.9%소태아혈청， 2 mM Glutamax, 1 mM피루브산나트륨이 포함된 MEM배지이다.그리고최종 150 nL/웰의 Fugene HD및최종농도 50 ng/웰의 NeuroD2 DNA플라스미드흔합 MEM배지 15}AL를첨가하여세포내로 유전자를도입 (transfection)시켰으며，이때소태아혈청의최종� ��도는 5%이다.

[225] 36시간동안배양한후,리퀴드핸들러 (liquid handler)를이용하여각각의

화합물을최종농도 10 μΜ로세포를처리하였다.양성대조군으로서최� ��농도 25 ηΜ의스타우로스포린 (Staurosporin)을이용하였다.화합물처리 48시간후에 , PBS에희석된 3.7%포름알데히드를이용하여 P19세포를고정시켰다.이어서 PBS로 5회세척하고， 0.25%트리톤 X-100을포함한 PBS를 8분동안처리하여 세포막투과성을증가시켰다.이어서 PBS로 5회세척한후 10%

BSA (소혈청알부민)가포함된 PBS로 30분동안처리하였으며, 5% BSA와 a-beta ΙΠ-류불린항체가포함된 PBS로 2시간동안반웅시켰다.이어서 PBS로 5회 세척한후， 594 nm파장대의형광단백질이부착되어있는이차항� ��를 1시간 동안반웅시키고， PBS로 5회이상세척하였다. 0.25%트리톤 x-100을처리하는 과정을제외한모든실험은 37°C배양기에서진행하였다.형광염색이종료된 후 Cellomics의 NeuronalProfiling.V3.5프로그램을사용하여신경돌� �의길이를 정량화하였다. [226] 염색된 P19세포를분석한결과, 184개의화합물들이신경세포특이적 전사조절인자 NeuroD2에의한 P19세포의분화및신경돌기증식 (즉, 신경돌기의길이신장)의촉진을나타낸다는점� �확인되었다.특히,상기 화합물들은양성대조군으로사용된스타우로스 포린 (Staurosporin)의신경돌기 길이신장활성에대비하여 0.5배이상의효과를나타내는것이관찰되었다.

[227]

[228] 심시예 2:스크리닝체 2단계 -해미 · 1 세포의축식 ·듬기의성장촉 ?1

[229] 상기스크리닝제 1단계에서선별된 184개의화합물들에대해, SD래트배아의 뇌해마신경세포모델을이용하여축삭돌기의성 장을촉진시키는화합물을 스크리닝하였다. ,

[230] 먼저，임신 18일째 (E18)인 SD(Sprague Dawley)래트의배아로부터뇌

해마 (hippocampus)를분리하였다.상기분리된해마를 HBSS로세척하고 아큐테이즈 (Accutase)와함께 10분동안실온에서반응시켰다.이어서 , 2 mM Glutamax, 1 x B27이포함된 Neurobasal A배양액을첨가하고 1회세척한후， 피펫팅을통해조직을파쇄시켰다.이어서 , 1 X B27, 2 mM Glutamax가첨가된 Neurobasal A배양액으로 3회이상세척하고, 40 μιη나일론여과기로여과시켜 해마신경세포를획득하였다.상기신경세포를 2% Β27, 2 mM Glutamax가 포함된 Neurobasal A배양액에현탁한후， 384-웰플레이트에 2,000세포 /웰씩 분주하였다.

[231] 24시간후，각각의화합물을최종농도 10 μΜ로처리하고 48시간동안

배양하였다.본실험의음성대조군으로서 DMSO 0.5%를사용하였다.그후, α-beta m-튜불린염색및정량화과정을상기스크리닝계 1단계와동일하게 진행하였다.

[232] 염색된해마신경세포를분석한결과, 10개의화합물들이해마신경세포의 축삭돌기성장을촉진시키고축삭돌기의길이를 증가시킨다는점이

확인되었다.특히，상기화합물들^음성대조군� ��로사용된 DMSO의축삭돌기 길이신장활성에대비하여 1.5배이상의더큰효과를나타내는것이 관찰되었다.

[233]

[234] 심시예 3:스크리닝제 3단계 -산화적스트레스에의하피짐시경세포의사^ 억제

[235] 상기스크리닝제 2단계에서선별된 10개의화합물들에대해, SD래트배아의 전뇌피질신경세포모델을이용하여산화적스트 레스 (oxidative damage또는 oxidative stress)에의한세포사멸을억제시키는화합물을� �크리닝하였다.

[236] 먼저，임신 18일째 (E18)인 SD래트의태아에서전뇌피질 (cortex)을분리및 회수하였다.상기회수된전뇌피질을 HBSS로 1회세척하고，

아큐테이즈 (Accutase)를실은에서 10분동안처리하였다.아큐테이즈를 제거하고배양액 (NBG, Neurobal A배지， 1 X B27 supplement, 2 mM GlutaMax)으로 1회세척한후，배양액 2 mL을첨가하고피펫팅을통해조직을 파쇄시켰다.이어서，배양액으로 3회이상세척한후 , 40 μηι의나일론여과기를 이용하여피질신경세포를획득하였다.상기신� �세포를

폴리 -디-라이신 (p ₀ ly-D-Lysine)이코팅된 96-웰폴레이트에 8xl0 ⁴ 세포 /웰의 밀도로 200 씩분주하였다.성숙한신경세포로성장시키기� �하여, 37°C, 5% C0 ₂ 배양기에서 10일동안배양하였다.

[237] 화합물을최종농도 10 μΜ, 20 μΜ, 30 M(DMSO 0.5%)가되도록각각

신경세포에첨가하여， 4시간동안배양기에서처리하였다.신경세포의� ��멸올 유도하기위하여과산화수소 ( 0 ₂ )를사용하였다. 4시간동안전처리한 화합물을제거하고 50 μΜ의과산화수소가함유된배지 (NG: Neurobasal A배지，

2 mM GlutaMax)를첨가하고 3분동안처리하였다.배지를제거한후

배양액 (NBG)을 200 μί씩첨가하고,각각의화합물을전처리농도와� ��일한 농도로첨가하였다.

[238] 배양기에서 24시간동안처리한후에， 30 [xL의 WST-8를첨가하여배양기에서 4시간동안반웅시켰다.상기 WST-8은수용성테트라졸륨염으로서세포 생존율을측정할수있도록해주며,이에따라화� �물의신경세포사멸억제 효과를확인할수있다.즉,노란색의 WST-8은살아있는세포내에존재하는 탈수소효소에의해오렌지색의 WST-8포르마잔으로환원되며,이는

약효평가시스템 (Hexstation)을이용하여흡광도 450 nm에서측정할수있다. 과산화수소를처리하지않은신경세포의생존율 을 100%로설정하였다.본 실험의양성대조군으로서 NEU2000화합물을사용하고,음성대조군으로서 DMSO 0.5%를사용하였다.상기 NEU2000화합물은뇌신경성장인자들의 신경세포생존능력을증진시키고,뇌세포를괴� �시키는뉴로트로핀단백질의 독성작용을억제하는물질로서알려져있다.

[239] 과산화수소로처리한피질신경세포의생존율을 분석한결과,

N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드가 세포생존율이가장높았음이확인되었다.이는� �산화수소에의한피질 신경세포의사멸을억제하는효과가가장우수하 다는것을나타낸다.또한，상기 동정된화합물은본실험의양성대조군으로사용 된 NEU2000화합물과 비교하였을때신경세포사멸억제효과가동등한 수준으로확인되었다.

[240]

[241] 상기스크리닝제 1단계,제 2단계，제 3단계에서각각선별된화합물들의

화학구조를종합하여분석한결과에기초하여,� �발명자들은신경세포로의 분화를촉진시키고，신경돌기및축삭돌기의증 식및길이성장을촉진시키고， 신경세포의사멸을억제하고재생을촉진시키는 물질로서,화학식 1또는 2로 표시되는화합물을도출해내었다.

[242]

[243] 짐시예 4:화학식 1의화함물또는이의 약학적으로허용가능하염의제조 [244] 4-1.상기반용식 1에따 화학식 1의하함몰의체조

4 5

[246] 시약및조건: ( _a )토실클로라이드, K ₂ C0 ₃ , DMF,실온, 8h; (b)

에틸브로모아세테이트, K ₂ C0 ₃ , DMF,실온， 12h; (c) 2.5N NaOH, THF,환류， 6h; (d) i)옥살릴클로라이드, CH ₂ C1 ₂ ,환류， 3h; ii) TEA, CH ₂ C1 ₂ ,실온， 8h.

[247] 체 1다계: 한물 5름체조하는다계

[248] 화합물 4(10.0 g, 81.2 mmol)를 DMF(150 mL)에녹이고 K ₂ C0 ₃ (16.8g,

122mmol)를첨가한후， 10분동안실온에서교반하였다.토실클로라이드 (16.3 g, 85.3 mmol)를천천히첨가하고,실온에서 8시간동안교반하였다.반웅종결후에 에틸아세테이트로추출하고，물과브라인 (brine)으로 3회씩세척하였다.

유기층에서무수황산나트륨으로물기를제거한 후，감압증류하여용매를 제거하였다.석출된고체를핵산에현탁하고화� �물 5를여과하여

수득하였다 (흰색결정 15.0 g,수율 67%).화합물 5는

N-(2-메톡시페닐) -4-메틸벤젠술폰아미드이며，그식별데이터는 다음과같았다:

[249] Ή NMR(CDC1 ₃ ) δ 2.32 (s, 3H), 3.60 (s, 3H), 6.67-6.72 (d, IH), 6.84-6.89 (t, IH),

6.98-7.03 (t, IH), 7.07 (s, IH), 7.14-7.16 (d, 2H), 7.50-7.52 (d, IH), 7.62-7.64 (d, 2H);

[250] ¹³ C NMR 6 21.48, 55.54, 110.43, 120.76, 120.80, 125.08， 125.72, 126.97, 129.08,

135.95, 143.35, 149.22.

[251] 체 2다계 :하함물 6을체조하는다계

[252] 상기제 1단계에서제조된화합물 5(15.0 g, 54.1 mmol)를 DMF(100 mL)에

녹이고 K ₂ C0 ₃ (18.6 g, 135 mmol)를첨가한후, 5분동안실은에서교반하였다. 에틸브로모아세테이트 (5.98 mL, 85.3 mmol)를천천히첨가하고,실온에서 12시간동안교반하였다.반웅종결후에에틸아세 테이트로추출하고,물과 브라인으로 3회씩세척하였다.유기층에서무수황산나트륨� ��로물기를제거한 후,감압증류하여용매를제거하였다.이어서，� ��공건조하여화합물 6을 수득하였다 (19.0 g,수율 96%).화합물 6은에틸

₂ · _(Ν _(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세테이트이며,그식� ��데이터는 다음과같았다:

[253] Ή NMR(CDC1 ₃ ) δ 1.15-1.30 (t, 3H), 2.40 (s, 3H), 3.39 (s, 3H), 4.10-4.20 (q, 2H), 4.39 (s, 2H), 6.70-6.82 (d, 1H), 6.90-6.96 (t, 1H), 7.18-7.30 (m, 3H), 7.48-7.62 (m, 3H);

[254] ^,3 C NMR 0 14.16, 21.53, 51.11, 54.89, 61.13, 111.26, 120.42, 126.49, 127.35,

128.76, 129.77, 133.53, 137.07, 142.79, 155.52, 169.12.

[255] 제 3다계:화함물 7음제조하는다계

[256] 상기제 2단계에서제조된화합물 6(19.0 g, 52.3 mmol)을 THF(150 mL)에

녹이고, 2.5 N NaOH수용액 (63 mL, 157 mmol)올첨가하고환류하였다. 6시간 후에반응을종결하고,용액의온도를실온으로� �힌후,감압증류하여 THF 용매를제거한후에 EA를첨가하였다.유기층에서 IN HC1수용액으로 pH를 2로 조정한후,유기층을물과브라인으로씻어주고� �무수황산나트륨으로물기를 제거한후감압증류하여용매를제거하였다.석� �된고체를 EA와 HX로 재결정하여화합물 7을수득하였다 (15.0 g,수율 86%).화합물 7은

2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트산이며,그식별� ��이터는 다음과같았다:

[257] Ή NMR(CDC1 ₃ ) δ 2.30 (s, 3H), 3.30 (s, 3H), 4.30 (s, 2H), 6.65-6.70 (d, 1H),

6.80-6.86 (t, 1H), 7.10-7.15 (d, 2H), 7.16-7.21 (m, 1H), 7.35-7.40 (dd, 1H), 7.40-7.45 (d, 2H);

[258] '3C NMR 0 21.49, 51.15, 54.97, 111.36, 120.59, 126.27, 126.93, 127.27, 128.84,

129.08, 130.02, 133.06, 136.33, 143.12, 155.28, 171.75.

[259] 제 4다계:최종생성물로서화합물 9를제조하는다계

[260] 상기제 3단계에서제조된화합물 7(500 mg, 1.49 mmol)을 DCM(20 mL)에

녹이고옥살릴클로라이드 (384 μ 4.47 mmol)를천천히첨가하였다.온도를높여 환류하고， 3시간후에반웅을종결하였다.반웅용액을감압� ��류하고이를다시 DCM(5 mL)에녹였다.화합물 8(185 mg, 1.49 mmol)을 DCM(15 mL)에녹이고 TEA(416 μL, 2.98 mmol)로 10분동안활성화시킨후，화합물 7로부터만든 염산용액을천천히적하하였다 . 8시간후에반웅을종결하고용액에물을 첨가하고,유기층을브라인으로세척한후무수� �산나트륨으로물기를 제거하고감압증류하였다.농축한용액을 EA/HX (1/1 )조건으로컬럼 크로마토그래피를수행하여화합물 9를수득하였다 (흰색고체 250 mg,수율 38%).화합물 9는

2-(N-(2-메록시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(4-메록시피리딘 -3-일 )아세트아 미드이며，그식별데이터는다음과같았다: [261] 'Η NMR (CDC1 ₃ ) δ 2.43 (s, 3H), 3.42 (s, 3H), 4.05 (s, 3H), 4.34 (s, 2H), 6.75-6.90 (m, 2H), 6.95 (s, IH), 7.20-7.40 (m, 4H), 7.53 (s, 2H), 8.30 (s, IH), 9.24 (s, IH), 9.39 (s, IH);

[262] ^,3 C NMR δ 21.61, 54.70, 55.02, 55.95, 105.55, 111.92, 120.75, 124.23, 126.89, 127.74, 129.10, 130.34, 131.46, 134.96, 141.43, 143.78, 146.37, 154.21, 155.45, 166.59.

[263]

[264] 4-2.상기반응식 2에따른화학식 1의화합물의제조

[266] 시약및조건: (a)클로로아세틸클로라이드，디클로로메탄， 실은， 1 h; (b) K ₂ CO _;

, DMF, 80°C, 2 h.

[267] 겨 U다계:중?물짐로서사용되는화합물 12름제조하는단계

[268] 화합물 11(10.0 g, 73.0 mmol)올디클로 메탄 (300 mL)에녹이고 TEA( 12.2 mL, 87.5 mmol)를첨가한후, 0°C에서 30분동안교반하였다.클로로아세틸

클로라이드 (8.66 mL, 109 mmol)를천천히적하하고실온에서 3시간교반한후, IN HC1수용액으로반웅을종결하였다.증류수로 3번세척한후 Na ₂ S0 ₄ 로 수분을제거하고감압여과,감압증류하였다.컬� ��

크로마토그래피 (EA/HX=1/10)로분리하여화합물 12를수득하였다 (노란색고체 4.82 g,수율 66.7%).화합물 12는 2-클로로 -N-(2-에록시페닐)아세트아미드이며, 그식별데이터는다음과같았다:

[269] Ή NMR (CDC1 ₃ ) δ 1.41-1.45 (t, 3H), 4.04-4.06 (q, 2H), 4.15 (s, 2H), 6.82-6.83 (d, IH), 6.90-6.95 (t, IH), 7.01-7.03 (t, IH), 8.31-8.33 (d, IH), 9.02 (s, IH);

[270] ^l3 C NMR δ 14.690, 43.073, 64.144， 110.783, 119.066, 120.560, 124.201, 126.453, 147.259, 163.073.

[271] 제 2다겨ᅵ:최종생성물로서화합물 10.1음제조하는단계

[272] 상기제 1단계에서제조된화합물 12(2.00 g, 7.22 mmol),화합물 10(1.54 g, 7.22 mmol), K ₂ CO ₃ (2.00g,14.4mmol)를 DMF(10 mL)에첨가하고 80°C에서 2시간동안 교반하였다.디클로로메탄으로추출한후 1N HC1수용액으로반웅을 종결하였다.증류수와브라인으로세척한후 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고 감압여과，감압증류하였다.컬럼크로마토그� �피 (EA/HX=1/10)로분리하여 화합물 10.1을수득하였다 (연한노란색고체 1.78 g,수율 54.3%, mp 162°C). 화합물 10.1은

N-(2-에톡시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도)아세트아미드이 며,그식별데이터는다음과같았다:

[273] Ή NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz) d 9.56 (S, 1 H), 8.36 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.57 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.51 (d, J = 7.6 Hz, 2 H), 7.34-7.27 (m, 3 H), 7.09 (t, J = 6.4 Hz, 1 H), 6.99-6.97 (m, 3 H), 6.79 (d, J = 1.2 Hz, 1 H), 4.35 (s, 2 H), 4.26 (q, J = 8.8， 6.8 Hz, 2 H), 3.36 (s, 3 H), 2.45 (s, 3 H), 1.69 (t, J = 7.2 Hz, 3 H);

[274] > 'C NMR δ 15.016, 15.087, 21.402, 21.584, 64.600, 111.522, 119.152, 120.426, 120.646, 126.751, 127.236, 127.532, 127.638, 128.836, 129.018, 130.065, 132.340, 135.412, 143.435, 147.515, 155.236, 166.475.

[275]

[276]

[278] 제 1단계 :화합몸 14를제조하는단계

[279] 화합물 4(0.98 mL, 8.7 mmol),화합물 13(2.0 g, 8.7 mmol)을 DMF(17.4 mL)에 녹이고 K ₂ C0 ₃ (1.8g, 13. lmmol)를첨가한후， 80°C에서 2시간동안교반하였다. 증류수를첨가하여반웅을종결시킨후,에틸아� �테이트로추출한후유기층을 증류수와브라인으로세척하였다.유기층을분� �하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을 제거하고감압여과,감압증류하였다.컬럼크로� ��토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/2)를통해 화합물 14를수득하였다 (갈색고체 2.1 g,수율 76%).화합물 14는

N-(2,5-디메특시페닐) -2-((2-메록시페닐)아미노)아세트아미드이다.

[280] 체 2다계:최종생성물로서화합물 16을체조하는다계

[281 ] 상기제 1단계에서제조된화합물 14(20 mg, 0.06 mmol),화합물 15(13 mg, 0.07 mmol)를디클로로메탄 (0.3 mL)에녹이고피리딘 (25.0 μΐ 0.32 mmol)을첨가한 후,실온에서 3시간동안교반하였다.증류수를첨가하여반웅� ��종결시킨후， 디클로로메탄으로추출하고유기층을황산구리 (Π)오수화물수용액과증류수로 세척하였다.유기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고감압여과， 감압증류하였다.컬럼크로마토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/4)를수행하여화합물 16을 수득하였다 (연한노란색고체 22 mg,수율 78%).화합물 16은 2-(4-플루오로 -N-(2-메특시페닐)페닐술폰아미도) -N-(2-메특시페닐)아세트아미 드이며,그식별데이터는다음과같았다:

[282] Ή NMR (DMSO-d6, 400MHz) d 9.25 (S, 1H), 7.75-7.72 (m, 3 H), 7.46-7.33 (m, 4 H), 7.01-6.98 (m, 3 H), 6.64 (dd, J=8.8, 2.8Hz, 1H), 4.42 (s,2H), 3.84 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.41 (s, 3H); LRMS found 475.1.

[283]

[284] 4-4.상기바용식 4에따른화학식 1의화합물의제조

160°C, 20min 17

[286] 상기실시예 4-2에서최종생성물로제조된화합물 10.1(100mg, 0.22mmol), 요오드메탄 (i6|iL, 0.26mmo0를 VIF(0.22 mL)에녹이고 K ₂ C0 ₃ (45mg,

O.33mmol)을첨가한후，마이크로웨이브 (50wt, 160°C)를이용하여 20분동안 반웅시켰다.증류수를첨가하여반웅을종결시� �후,에틸아세테이트로추출한 후유기층을증류수와브라인으로세척하였다.� �기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로 수분을제거하고감압여과，감압증류하였다.� �럼

크로마토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/2)를수행하여화합물 17을수득하였다 (연한노란색 고체 25 mg,수율 24%).화합물 17은

N-(2-에특시페닐) -2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-메틸아세트아 미드이며，그식별데이터는다음과같았다:

[287] Ή NMR (CDC1 ₃ , 400MHz) d 7.61 (d, J=8.0Hz, 2H), 7.50 (d,J =7.6Hz, 1H), 7.33 (t, J=8.0Hz, IH), 7.26 (t, J=7.6Hz, 1H), 7.21 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.04 (d, J=7.2Hz, 1H), 6.98-6.88 (m, 3H), 6.77 (d, J=8.0Hz, IH), 4.23 (q, J=l 1.6， 2.8Hz, 2H), 4.04-3.95 (m, 2H), 3.41 (s, 3H), 3.12 (s, 3H), 2.40 (s, 3H), 1.27 (t, J=6.8Hz, 3H); LRMS found 469.1.

[288]

[289] 4-5.상기바용식 5에따른하학식 1의화함물의제조

[291] 체 1다계 :하함물】9름체조하는다계

[292] 화합물 18(50mg, 0.1mmol)을디클로로메탄 (1.0 mL)에녹인후， 0°C에서화합물 mCPBA(17 mg, 0.1 mmol)를천천히첨가하였다. 0°C에서 10분동안반웅시킨후 반웅용액으5 mL를덜어내어증류수를첨가하고반웅을종결시� ��다.이어서, 디클로로메탄으로추출한후,유기층올증류수� �브라인으로세척하였다.

유기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고감압여과,감압증류하� �다.컬럼 크로마토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/4)를수행하여화합물 19를수득하였다 (연한노란색 고체 10 mg,수율 40 %).화합물 19는

N-(2,5-디메특시페닐) -2-(N-(2-메록시페닐) -4- (메틸술피닐)페닐술폰아미도)아세 트아미드이며,그식별데이터는다음과같았다:

[293] Ή NMR (DMS0-d6, 400MHz) d 9.24 (S, IH), 7.88 (dd, J=8.0Hz, 4H), 7.75 (s, IH), 7.43 (d, J=6.4Hz, IH), 7.36 (t, J=8.0Hz, IH), 7.00 (d, J=8.8Hz, 3H), 6.64 (dd, J=8.8, 2.8Hz, IH), 4.44 (s, 2H), 3.84 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.33 (s, 3H), 2.82 (s, 3H); LRMS found 519.1.

[294] 제 2다계:화합물 20음체조하는다계

[295] 상기제 1단계에서화합물 19를제조하는것과병행하여,제 2단계에서는별도의 화합물 20을제조할수있다.

[296] 상기제 1단계에서덜어낸반웅용액 0.5 mL에 mCPBA(8.5 mg, O.lmmol)를

0°C에서천천히첨가하였다.실온에서 20분동안반웅시킨후증류수를첨가하고 반웅을종결시켰다.이어서,디클로로메탄으로� ��출한후유기층올증류수와 브라인으로세척하였다.유기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고 감압여과,감압증류하였다.컬럼크로마토그래� �� (ΕΑ/ΗΧ=1/4)를수행하여 화합물 20을수득하였다 (연한노란색고체 13 mg,수율 52%).화합물 20은

N-(2,5-디메특시페닐) -2-(N-(2-메특시페닐) -4- (메틸술포닐)페닐술폰아미도)아세 트아미드이며，그식별데이터는다음과같았다 :

[297] Ή NMR (DMSO-d6 ,400MHz) d 9.23 (S, IH), 8.15 (d, J=8.4Hz, 2H), 7.93 (d,

J=8.4Hz, IH), 7.74 (s, IH), 7.44 (d, J=6.4Hz, IH), 7.39 (t, J=6.4Hz, IH), 7.02-6.97 (m, 3H), 6.41 (dd, J=8.8, 3.2Hz, IH), 4.47 (s, 2H), 3.82 (s, 3H), 3.68 (s, 3H), 3.34 (s, 3H), 3.30 (s, 3H); LRMS found 535.1

[298]

[299] 4-6.상기반용식 6에따른화학식 1의화합물의제조

[301] 화합물 21(10 mg, 0.02 mmol), NaN ₃ (4 mg, 0.06 mmol), NH ₄ CI(3.4mg,

0.06mmol)을 DMF(0.5 mL)에녹인후 120°C에서 6시간동안교반하였다. 증류수를첨가하여반웅을종결시킨후，에틸아 세테이트로추출하고유기중을 증류수와브라인으로세척하였다.유기층을분� �하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분올 제거하고감압여과，감압증류하였다.컬럼크� �마토그래피 (MC MeOH=10/l)를 수행하여화합물 22를수득하였다 (노란색고체 6 mg,수율 55 %).화합물 22는 N-(2,5-디메특시페닐 )-2-(N-(2-메톡시페닐) -4-(1Η-테트라졸 -5-일)페닐술폰아미도 )아세트아미드이다.

[302]

[303] 4-7.상기반용식 7에따른화학식 1의화합물의제조

[305] 화합물 23(20 mg, 0.04 mmol)을 MeOH(0.4 mL)에녹인후 0 ^o C에서 NaBH ₄ (3 mg, 0.12 mmol)를천천히첨가하였다.실은에서 2시간동안교반시킨후,증류수를 첨가하여반웅을종결시키고，에틸아세테이트 로추출한후유기층을증류수와 브라인으로세척하였다.유기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고 감압여과，감압증류하였다.컬럼크로마토그� �피 (EA/HX=1/1)를수행하여 화합물 24를수득하였다 (흰색고체 8 mg,수율 38 %).화합물 24는

N-(2,5-디메톡시페닐) -2-(4-(1-히드록시에틸) -N-(2-메특시페닐)페닐술폰아미도) 아세트아미드이며,그식별데이터는다음과같� �다:

[306] Ή NMR (CDC1 ₃ , 400 MHz) 9.26 (S, 1H), 7.37 (S, 1H), 7.57 (dd, J = 23.6, 8.4 Hz, 4 H), 7.37-7.32 (m, 2 H), 6.98 (t, J = 8.4 Hz, 3 H), 6.64 (dd, J = 8.8, 2.8 Hz, 1 H), 5.51 (S, 1H), 4.83-4.80 (m, 1 H), 4.36 (s, 2H), 3.84 (s, 3 H), 3.58 (s, 3 H), 3.30 (s, 3 H), 1.33 (d, J = 6.4 Hz, 3 H) LRMS found 501.1

[307]

「3081 심시예 S:화학식 2의화합물또는이의 약학적으로허용가능하염의제조

[309] 5-1.상기반웅식 8에따른화학식 2의화합물의체조

[310]

[311] 제 1다계 :화합물 S 체조하는다계

[312] 화합물 R(50 mg, 0.46 mmol)을디클로로메탄 (1.5 mL)에녹이고클로로

아세틸클로라이드 (44.0[iL, O.55mmol)를첨가한후,실온에서 30분동안 교반하였다.증류수를첨가하여반응을종결시� �후,디클로로메탄으로 추출하고유기층을증류수와브라인으로세척하 였다.유기층을분리하여 Na ₂ SO 4로수분을제거하고감압여과,감압증류하여화� ��물 S를수득하였다 (갈색액체 81 mg,수율 95%).화합물 S는 2-클로로 -N-(2-히드록시페닐)아세트아미드이다.

[313] 제 2다계:화함물 τ름제조하는다계

[314] 상기제 1단계에서제조된화합물 S(50 mg, 0.27 mmol)에폴리인산 (0.13 mL, 2.7 mmol)을첨가하고， 150 ^o C에서 30분동안교반하였다.증류수를첨가하여반웅을 종결시킨후，에틸아세테이트로추출하고유기 층을증류수와브라인으로 세척하였다.유기층을분리하여 N S0 ₄ 로수분올제거하고감압여과, 감압증류하여화합물 T를수득하였다 (검은색액체 39 mg,수율 87%).화합물 T는 2- (클로로메틸)벤조 [d]옥사졸이다.

[315] 저 13다계:최종생성물로서화함물 25름제조하는다계

[316] 상기제 2단계에서제조된화합물 T(15 mg, 0.05 mmol),화합물 10(9 mg, 0.05 mmol)을 DMF(0.18 mL)에녹이고 K ₂ C0 ₃ (l lmg, 0.08mmol)을첨가한후， 80°C에서 2시간동안교반하였다.증류수를첨가하여반웅� ��종결시킨후，

에틸아세테이트로추출하고유기층을증류수와 브라인으로세척하였다.

유기층을분리하여 Na ₂ S0 ₄ 로수분을제거하고감압여과,감압증류하� �다.컬럼 크로마토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/4)를수행하여화합물 25를수득하였다 (연한갈색 고체 14 mg,수율 64%).화합물 25는

N- (벤조 [d]옥사졸 -2-일메틸) -N-(2-메록시페닐) -4-메틸벤젠술폰아미드이며,그 식별데이터는다음과같았다:

[317] Ή NMR (CDC1 ₃ , 400MHz) d 7.66-7.63 (m, 3 H), 7.55 (d, J=7.6Hz, 1H), 7.40-7.25 (m, 6H), 6.88 (t, J=7.2Hz, 1H), 6.80 (d, J=8.4Hz, 1H), 5.12 (s, 2H), 3.37 (s, 3H), 2.44 (s, 3H); LRMS found 409.1.

[318]

[319] ；-2.상기반응식 9에따른화학식 2의화합물의제조

[321] 체 1다계 :화함물 W롬계조하는다계

[322] 화합물 V(50 mg, 0.40 mmol)를톨루엔 (으8 mL)에녹이고클로로

아세틸클로라이드 (38.0 μL, 0.48 mmol)를첨가한후，실온에서 30분동안 교반하였다.증류수를첨가하여반응올종결시� �후,에틸아세테이트로 추출하고유기층을증류수와브라인으로세척하 였다.유기층을분리하여 Na ₂ SO 4로수분을제거하고감압여과,감압증류하여화� ��물 W를수득하였다 (갈색액체 45 mg,수율 62%).화합물 W는 2- (클로로메틸)벤조 [d]티아졸이다.

[323] 체 2다계 :최종생성물로서화함물 26음제조하는다계

[324] 상기제 1단계에서제조된화합물 W(15 mg, 0.05 mmol),화합물 10(9 mg, 0.05 mmol)을 DMF(0.18 mL)에녹이고 K ₂ C0 ₃ (llmg, 0.08mmol)을첨가한후， 80°C에서

2시간동안교반하였다.증류수를첨가하여반� ��을종결시킨후,

에틸아세테이트로추출하고유기층을증류수와 브라인으로세척하였다.

유기층을분리하여 ^ ₂ 50 ₄ 로수분을제거하고감압여과,감압증류하� �다.컬럼 크로마토그래피 (ΕΑ/ΗΧ=1/4)를수행하여화합물 26을수득하였다.화합물 26은

N- (벤조 [d]티아졸 -2-일메틸) -N-(2-메특시페닐) -4-메틸벤젠술폰아미드이며,그 식별데이터는다음과같았다:

[325] Ή NMR (CDC1 ₃ , 400MHz) d 7.91 (t, J=7.6Hz, 2H), 7.61(d, J=6.4Hz, 2H), 7.52 (dd, J=6.4, 1.6Hz, 1H), 7.45-7.38 (m, 2H), 7.28-7.27 (m, 3H), 6.92 (t, J=7.2Hz, 1H), 6.77 (d, J=8.4Hz, 1H), 5.26 (s,2 H), 3.35 (s, 3H), 2.45 (s, 3H); LRMS found 425.1.

[326]

[327] 심시예 6:대뇌피짐시경세포름이용하.축삭돌기의증식 및성장효과테스트

[328] 본실험의목적은,상기실시예 4또는 5에따라제조된화학식 1또는 2의

화합물들이축삭돌기를휴의적으로성장시키고 증추신경을재생시킬수 있는지에대해확인하기위한것이다.

[329] 먼저,임신 18일째인 SD래트의배아로부터대뇌피질을분리하였다.상 기 분리된대뇌피질올 HBSS로세척한후,아큐테이즈 (Accutase)와함께 10분동안 실은에서반웅시켰다.이어서， 2 mM Glutamax, 1 x B27이포함된 Neurobasal A 배양액을첨가하고 1회세척한후，피펫팅을통해조직을파쇄시켰� �.이어서, 1 X B27, 2 mM Glutamax가첨가된 Neurobasal A배양액으로 3회이상세척하고， 40 μπι나일론여과기로여과시켜피질신경세포를 획득하였다.상기신경세포를 2% Β27, 2 mM Glutama가포함된 Neurobasal A배양액에현탁한후, 384-웰 플레이트에 2,000세포 /웰씩분주하였다.

[330] 24시간후，각각의화합물을최종농도 10 μΜ로처리하여 48시간동안

배양하였다.본실험의음성대조군으로서 DMSO 0.5%를사용하였다.그후， α-be m-류불린염색및정량화과정을상기실시예 1의스크리닝제 1단계와 동일하게진행하였다.

[331] 염색된피질신경세포의축삭돌기의길이를측정 하고，그평균값을

음성대조군 (DMSO 0.5%)의축삭돌기의길이에대해상대적인값으로� ��하기표 1의가장우측컬럼에나타내었다.예를들어，하� ��표 1의첫번째화합물 (이는 상기실시예 4-2에서제조된화합물 10.1임)로처리된그룹의축삭돌기는， 음성대조군 (DMSO 0.5%)그룹의축삭돌기에비해그길이가 3.16±038배가더 길었다. ]

C8Z00/9T0ZaM/X3d

503.41 !색고쳬 504.4 1.8

458.96 460.0 1.7 o ° ¹ 늬

ᄂ^丫 ⁿ T 438,54 훤색고제 439.5 2,6 卜」

S

442,5 흰색고쳬 443.5 2.2

452.57 흰색고 ¾ 453.6 2,3

1!색고제 460.0 2,6 연한노란색

424.51 425.5 2.1 고제

474.96 476.0 1,9

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[347] 상기실시예 1및 2에서스크리닝을통해신경돌기의증식및축삭� �기의

성장이촉진된효과가관찰된것과마찬가지로,� �발명에따른화학식 1또는 2의화합물들은상기표 1에서보는바와같이대뇌피질신경세포의축삭� �기를 유의적으로성장시킨다는것이입증되었다.

[348]

[349] 심시예 7:망막시 세포를이 —하.화함물의세포독 ^ 여부 측식—듬 71의 성장효과테스트

[350] 본실험의목적은,상기실시예 4또는 5에따라제조된화학식 1또는 2의

화합물들이세포독성이있는지여부를먼저확인 하고,축삭돌기를유의적으로 성장시킬수있는지에대해확인하기위한것이다 .이를위해, SD래트의망막 신경세포를이용하였으며,

2-(N-(2-메톡시페닐) -4-메틸페닐술폰아미도) -N-(4-메톡시피리딘 -3-일)아세트아 미드를대표적인화합물로서사용하였다 (이하, CYM화합물이라고약칭함).

[351]

[352] 7-1.망막시 세포의배양및형광염새

[353] SD래트로부터망막신경세포를분리하여배양시� ��다.상기망막신경세포가 함유된배양액에상기 CYM화합물을각각 0, 2, 10, 20 μΜ의농도로처리한후， 각각 3홀씩총 12홀에서배양하였다.이때 CYM화합물의농도가 0 μΜ인그룹은 대조군으로서사용되었다.

[354] 72시간동안배양한후,커버글라스위에서망막신 경세포들을마우스

항-신경미세섬유항체 (anti-neurofilament antibody) SMI™Covance를이용하여 일차형광염색하였다.그후,형광물질 (Alexa Fluor 594)이부착된염소항-마우스 면역글로불린 G로이차염색을수행하였다.여기서，각커버글� ��스의면적은 13.55 mm ² 이었으며， 0， 2， 10, 20 μΜ농도의 CYM화합물처리군은각각 3개의 커버글라스위에위치하여,총 12개의커버글라스가사용되었다.

[355]

[356] 7-2.화합뮬의세포독성테스트

[357] 본발명의화합물이세포에부작용을미치는지여 부를확인하기위하여，

커버글라스위에서형광염색된망막신경세포의 수를카운팅하였다.총 12개의 커버글라스에대해 4회반복하여얻은값들의평균을도 1에막대그래프로 도시하였다.

[358] 그결과,도 1에서확인할수있는바와같이，망막신경세포� �수는대조군 (0 μΜ농도)과 CYM화합물처리군 (각각 2, 10, 20 μΜ농도)사이에서유의적인 차이를나타내지않았다.오히려,대조군에비해 CYM화합물처리군에서망막 신경세포의수가더증가하였음을알수있다.따� �서, CYM화합물은

세포독성과같은부작용이없으며세포의생존율 에악영향을미치지않는 것으로입증되었다.

[359]

[360] 7-3.화합물의축산돌기성장촉? ΐ테스트

[361] 본발명의화합물이축삭돌기의성장을촉진시키 는지여부를확인하기위하여, 커버글라스위에서형광염색된망막신경세포의 축삭돌기의길이를

측정하였다.상기실시예 7-2와마찬가지로총 12개의커버글라스에대해 4회 반복하여측정을수행하고평균값을산출하였다 .

[362] 도 2는각그룹에서축삭돌기의길이가 50 μιη이상인신경세포의수를

막대그래프로나타낸것이다.대조군 (Ο μΜ농도)에비해 CYM화합물

처리군 (각각 2， 10, 20 μΜ농도)에서는축삭돌기의길이가 50 μιη이상인 신경세포의수가유의적으로더많음을알수있다 .

[363] 도 3은축삭돌기의길이가 50 μηι이상인신경세포를각각 50 μιη이상 100 μηι 미만, 100 μπι이상 200 μηι미만, 200 μηι이상으로더욱구체적으로분류하여 막대그래프로나타낸것이다.축삭돌기의길이� �각각 50 μιη이상 ΙΟΟ μιη미만， 100 μιη이상 200 μιη미만， 200 μηι이상으로분류하였을때에도,대조군 (0 μΜ 농도)에비해 CYM화합물처리군 (각각 2， 10, 20 μΜ농도)에서신경세포의수가 유의적으로더많았다.

[364] 도 2및 3의결과로부터,본발명의화합물이처리된경우� ��경세포의

축삭돌기의길이가더신장되었으며，축삭돌기 의성장이유의적으로

촉진되었음이입증되었다.

[365]

[366] 심시예 8:시시경압받 Φ상모템음이용하.시 채생효과테스트

[367] 본실험의목적은，시신경압박손상모델을이용 하여상기실시예 4또는 5에 따라제조된화학식 1또는 2의화합물들이신경을재생할수있는지를확인� �기 위한것이다.

[368] 실험동물로 SD래트 (8주령,수컷)를사용하였다.졸레틸과럼푼을이� ��하여 근육마취한후，결막을절개하여시신경을노출 시켰다.이어서，미세한포셉으로 시신경을안구와시신경연결부위약 2 mm뒤에서 15초동안압박손상함으로써， 시신경을손상시켰다.실험군 (4마리 )에는 CYM화합물으022 μ _§ 을 DMSO및 인산칼륨완층액에녹여서안구초자체내에주입 하였으며，대조군 (3마리)에는 PBS를주입하였다.안구내주입은수술당일부터� �작하여 일에한번씩 안구내에주입하였으며,주입전에 SD래트의전방수를천자하여안구내압력을 감소시킨후안구초자체내에각용액을 5 μL·주사하였다. 3주후에, SD래트를 졸레틸과럼푼으로근육마취한후， 4%파라포름알데히드로관류고정시켰다. 이어서,시신경이부착되어있는안구를꺼내각� �과수정체를제거하고, 냉동절편조직으로만들었다.래빗항 -생명연장형단백질항체 (anti-GAP43 Ab)를 이용하여일차염색하였으며,형광물질 (DyLight 488)이부착된항 -래빗

면역글로불린 G로이차염색하였다.

[369] 도 4는염색후촬영한사진으로서,이때녹색으로염� ��된부분이시신경의

축삭돌기를나타낸다.도 4의상단부사진은대조군 (PBS처리그룹)올촬영한 사진이며,손상된시신경이거의재생되지않았� �을알수있다.도 4의하단부 사진은실험군 (CYM화합물처리그룹)을촬영한사진이며,손상된 시신경이 매우유의적으로재생되었음을알수있다.

[370] 다음으로,시신경압박손상부위에서머리방향� �로 500 μιη, 1000 μιη, 1500 μηι 떨어져있는지점에서， Steven Leon et al.의문헌 [The Journal of Neuroscience, June 15, 2000, 20(12):46154626]에개시된방법을이용하여,염색된� ��삭돌기의수를 카운팅하였다.그결과는시신경압박손상부위� �부터떨어져있는거리를

X-축으로하여도 5에나타내었다.손상된시신경부위를본발명에� ��른 화합물로처리하였을때，축삭돌기의수가유의 적으로증가하였으며，시신경이 유효하게재생되었음이입증되었다.