【발명의 명칭】

뉴레귤린을 포함하는 상처 또는 안구건조증의 치료용 약학 조성물 【기술분야】

^ 발명은 뉴레글린올 포함하는 상처 또는 안구건조증의 치료용 약학 조성물 과 상기 조성물을 이용한 상처 또는 안구건조증의 치료방법에 관한 것이다.

【배경기술】

우리 몸에서 피부는 여러 가지 기능을 담당하고 있으며， 그 중에서도 가장 중요한 기능은 외부로부터 우리의 몸을 보호하는 장벽 역할이다. 이러한 장벽 역할 을 하는 피부의 정상적인 구조가 파괴된 상태를 상처라 한다. 상처를 입게 되면， 상처 부위가 노출되어 균의 침입올 받을 수 있어, 이를 신속하게 치료해야 한다. 한편, 각막은 안구 앞쪽 표면에 있는 투명하고 혈관이 없는 조직으로 흔히 검은자위라고 하는 부분으로, 눈을 외부로부터 보호한다. 또한， 빛을 통과， 굴절시 키는 투명한 조직으로 빛의 굴절과 전달에 주요한 기능을 하고， 신경이 잘 발달되 어 있어 외부 이물질에 민감하게 반웅한다. 각막은 각막상피, 보우만막, 각막실질， 뒤경계판 (데스메막) 및 각막내피의 5개 층으로 구성된다.

각막 표면은 외부에 직접 노출되어 있어 외상이나 스크래치에 취약하다. 특 히， 눈물의 양이 부족하면， 눈물에 의한 안구 보호 기능이 현저히 낮아져서 안구건 조증과 같은 질환을 겪고 있는 환자에서 각막 손상은 자주 발생한다. 각막이 손상 될 경우 자극감， 이물감 또는 건조감 등의 자극 증상이 나타나며 , 손상이 심각해질 경우 각막염 등으로 발전할 수 있다. 따라서， 안구를 건강하게 유지하고 시력을 보 존하기 위해서는 각막 손상을 예방하거나, 경미한 각막 손상이 악화되지 않도록 하 거나， 손상된 각막을 치료하는 것아필수적이다. 뉴레글린 (NR)은 상피성장인자 (EGF) 패밀리에 속하는 당단백질로, 4개의 아형 단백질이 알려져 있다. 뉴레글린은 신경 시스템의 발달， 및 척추동물의 배아생성에 서 중요한 역할을 한다. 또한， 뉴레글린은 타이로신 카이네이즈 수용체 중 erbB 패 밀리와 결합하여 이를 활성화시키는 것으로 알려져 있다.

【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】

본 발명의 목적은, 뉴레귤린을 포함하는 상처 치료용 약학 조성물， 및 상기 조성물을 이용하여 상처를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

다른 목적은, 뉴레귤린을 포함하는꾀부 개선용 화장료 조성물， 및 상기 조 성물을 이용하여 피부를 개선하는 방법을 제공하는 것이다.

또 다른 목적은， 뉴레귤린을 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학 조 성물， 및 상기 조성물을 이용하여 안구건조증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하 는 것이다.

【기술적 해결방법】 상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한， 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처 를 치료하는 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 상처의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명 의 조성물의 용도를 제공한다.

또한， 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조 성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 화장료 조성물을 개체에 도포하는 단계를 포함하 는 피부를 개선하는 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 피부 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한 본 발명 의 조성물의 용도를 제공한다.

또한， 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 안구 건조증을 치료하는 방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 안과용 제제를 제공한 다. 【발명의 효과】

본 발명의 뉴레글린을 포함하는 약학 조성물은 각막상피세포， 피부상피세포 및 구강상피세포의 증식을 촉진하고， 손상된 각막을 회복시키는데 효과적이다. 따 라서, 본 발명의 조성물은 상처 치료 또는 안구건조증의 치료뿐만 아니라 피부 개 선에도 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한설명】

도 1은 뉴레귤린 (NR)이 각막상피세포주의 증식을 촉진시키는 것을 보여주는 그래프이다.

도 2는 뉴레귤린이 각막상피세포주의 상처를 치유하는 효과가 있음을 보여주 는 세포사진이다.

도 3은 뉴레글린에 의한 각막상피세포주의 .상처 치유 효과를 정량화하여 나 타낸 그래프이다.

도 4는 뉴레글린이 각막의 손상을 치유하는 효과가 있음을 나타낸 것이다. 도 5는 뉴레귤린에 의해 손상된 각막이 회복되는 면적을 정량화하여 나타낸 그래프이다.

도 6은 뉴레글린이 피부상피세포주의 상처를 치유하는 효과가 있음을 보여주 는 세포사진이다.

도 7은 뉴레귤린에 의한 피부상피세포주의 상처 치유 효과를 정량화하여 나 타낸 그래프이다.

도 8은 뉴레귤린이 구강상피세포주의 상처를 치유하는 효과가 있음을 보여주 는 세포사진이다.

도 9는 뉴레글린에 의한 구강상피세포주의 상처 치유 효과를 정량화하여 나 타낸 그래프이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 약학 조성물올 제 공한다. ^' 본 명세서에서 사용된 용어 "뉴레귤린 (neuregul in) " 은 타이로신 카이네이 즈 수용체 중 erbB 패밀리와 결합하여 다중 세포 -세포 상호작용을 매개하는 신호전 달 단백질을 의미한다. 본 발명의 뉴레글린은 공지된 뉴레귤린의 아미노산 서열과 약 70%， 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 상기 뉴레귤린은 서열 번호 1 내지 서열번호 4로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열 을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 일 실시예에 의하면， 뉴레귤린은 서열번호 1의 아 미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다.

본 발명의 조성물에 포함되는 뉴레귤린의 농도는 0.002 내지 200 ng/m 일 수 있다. 뉴레귤린의 농도는 0.02 내지 20 ng/u 일 수 있고, 바람직하게 0.2 내지 2 ng/m£일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "상처" 는 생체가 손상된 것을 의미하며， 창상 이라고도 한다. 상기 상처는 각막 상처， 피부 상처 또는 구강 내 상처일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 "각막 상처" 는 안구의 표면인 각막에 생긴 상 처를 의미하며， 외부적인 층격뿐만 아니라 신체 내부에 의한 요인에 의해 생성될 수 있다. 이와 같은 손상은 물리적 또는 화학적 손상을 모두 포함할 수 있다. 물리 적 손상은 렌즈착용에 의한 손상， 라식 또는 라섹과 같은 수술에 의한 손상을 포함 할 수 있다. 한편， 화학적 손상은 산 또는 염기와 같은 화학 물질에 의한 손상을 포함할 수 있다. 이러한 상처는 각막상피， 보우만막, 각막실질， 뒤경계판 또는 각 막내피의 부위 중 어느 하나에 생길 수 있는 상처를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으 로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스， 솔비를， 만니를， 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트， 젤라틴， 규산 칼슘， 미세결정성 샐를로스， 폴리비닐피를리돈， 셀를로스， 물， 시럽， 메틸 셀를로스， 메틸하이드록시벤조에이트， 프로필하이드록시 벤조에이트， 활석, 스테아르산 마그네슴， 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나/ 이 에 한정되는 것은 아니다.

또한， 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제， 감미제, 향미제， 유화제， 현탁제, 보존제， 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 꺅학적으로 허용가능 한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량 % 내지 약

99.99 중량 %， 바람직하게는 약 90 중량 ¾» 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있으며， 상기 약학적으로 허용가능한 첨가제는 약 0. 1 중량 % 내지 약 20 중량 %로 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 상처 를 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 비경구로 투여될 수 있고 , 바람직하게는 국소 투여 방식으로 피부에 직접 투여될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 제형은 경피 투여 주사제， 연고제, 액제， 크림게, 결제, 스프레이제， 패취제 등과 같은 피부 외용제 형태일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간， 투여 경로， 배설 속도 및 반응 감응 성과 같은 여러 관련 인자에 비추어 결정될 수 있다. 또한， 본 발명은 상처의 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 상기 서 술한 뉴레귤린을 유효성분으로 함유하는 조성물의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 화장료 조 성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 앞서 전술한 바와 같은 약학 조성물과 유 효성분이 동일하다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 주름의 발생 억제， 피부 노회^ᅵᅵ， 피부 탄력 개선， 피부 재생， 상처 또는 창상 회복 (wound hea l ing) , 각막 재생, 피、분자극 완화 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는， 피부 세포의 기능 저하 또는 손 실로부터 피부를 보호 또는 피부 상태를 개선하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 피부 상태의 개선을 목적으로 피부에 직접 적용 될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 화장료 제형으로 제 제화될 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들어， 용액， 현탁액, 유탁액， 페이스 트, 겔, 크림， 로션， 파우더， 비누， 계면활성제 -함유 클렌징， 오일， 분말 파운데이 션， 유탁액 파운데이션， 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나， 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는， 유연 화장수， 영양 화장 수， 영양 크림， 마사지 크림， 에센스， 아이 크림， 클렌징 크림， 클렌징품， 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트， 크림 또는 겔인 경우에는 동물 성유, 식물성유, 왁스, 파라핀， 전분， 트라가칸트， 셀를로오스 유도체， 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘， 벤토나이트， 실리카ᅳ 탈크, 산화아연 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 락토 스， 탈크， 실리카， 알루미늄 하이드록시드， 칼슘 실리케이트， 폴리아미드 파우더 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있으며， 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로하이드로카본， 프로판 /부탄 또는 디메틸 에테르 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 용매， 용매화제， 유 탁화제 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 이의 예로는, 물， 에탄올 이소프로판올， 에틸 카보네이트， 에틸 아세테이트， 벤질 알코올， 벤질 벤조에이트， 프로필렌 글리콜， 1 ,3-부틸글리콜 오일， 글리세롤 지방 족 에스테르， 폴리에틸렌 글리콜， 소르비탄 지방산 에스테르， 및 이의 흔합물 등을 들 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 물， 에탄올 또는 프로 필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제， 에특실화 이소스테아릴 알코을， 폴리옥시에틸 렌 소르비를 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제， 미세 결정성 셀를로오스， 알루미늄 메타히드록시드， 벤토나이트, 아가, 트라가칸트 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 지 방족 알코을 설페이트, 지방족 알코을 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트 이미다졸리늄 유도체 메틸타우레이트， 사르코시네이트， 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코을, 지방산 글리세리드， 지방산 디에탄올아미드， 식물성유， 라놀린 유도체， 에록실화 글리세롤 지방산 에스 테르 및 이의 흔합물로 이루어진 군에서 선택되는 담체 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물에서 "담체 성분"이란 화장품 제제에 포함될 수 있 는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물로서, 피부에 접촉 시 인체가 적웅가능한 이상의 독성， 불안정성 또는 자극성이 없는 성분이다.

본 발명의 화장료 조성물은 담체 성분 이외에도， 항산화제， 안정화제， 용해 화제， 보습제， 안료, 향료， 자외선 차단제， 발색제， 계면 활성제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 화장료 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 보조제라면 사용에 제한이 없다. 따라서, 본 발명은 상기 화장료 조성물을 이용하여 피부 상태를 개선하는 방 법을 제공한다.

상기 피부 상태를 개선하는 방법은， 이를 필요로 하는 대상의 피부에 도포하 는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대상은 포유동물일 수 있고， 구체적으로는 인간일 수 있다.

피부에 도포하는 단계는 본 발명에 따른 화장료 조성물올 그 형태에 따라 피 부에 직접 도포하거나， 분무하는 것을 포함할 수 있다. 이때, 상기 화장료 조성물 의 도포량 및 하루 사용 횟수는, 사용자의 연령， 성별， 용도， 증상의 정도 등에 따 라 적절하게 설정될 수 있고, 예를 들면, 상기 화장료 조성물의 적당량을 하루 1 내지 6회의 빈도로 피부에 도포할 수 있다. 또한， 본 발명은 피부 개선을 위한 화장료의 제조에 사용하기 위한 본 발명 의 조성물의 용도를 제공한다. 본 발명은 뉴레귤린을 유효성분으로 포함하는 안구건조증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 앞서 전술한 바와 같은 유 효성분과 동일하다.

본 명세서에서 사용된 용어 "안구건조증" 은 눈물의 양이 감소, 결핍 또는 과다하게 증발하여 안구에 불편을 느끼는 증상을 의미한다. 이러한 안구건조증은 상하안검 사이 ( interpalpebral )의 각결막 (ocul ar surf ace)에 손상을 유발할 수 있 다. 안구건조증에 의한 증상으로는， 눈물 생성이 억제된 환자에서 눈물 부족으로 인한 눈의 뻑뻑함， 이물감， 따가움 또는 이와 관련된 각결막 상피 장해 등을 포함 할 수 있다. 상기 조성물은 안과용으로 사용될 수 있는 제형일 수 있다. 구체적으로 상기 제형은 용액， 로션， 고약， 겔， 크림， 페이스트， 분무제， 현탁액， 분산액， 하이드로 겔， 연고， 오일 또는 발포제 형태일 수 있다. 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 되는 특히 안과용으로 허용가능한 비독성 부형제 또는 담체와 흔합함으로써 제형 화될 수 있다. 또한， 상기 제형은 적절한 pH로 조절되어 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 바람직한 담체는 물， 셀를로스 유도체, 예를 들면 메틸셀를로스， 카르복시메틸셀를로스의 알칼리 금속염류， 히드록시메틸셀를로 스， 히드록시에틸셀롤로스， 메틸히드록시프로필셀를로스 및 히드록시프로필셀를로 스， 중성 카보폴， 또는 이들의 흔합물들이다.

본 발명의 안과용 조성물에 사용될 수 있는 안정제는 예를 들면 틸록사폴, 지방산 글리세를 폴리 -저급 알킬렌 글리콜 에스테르류， 지방산 폴리 -저급 알킬렌 글리콜 에스테르류, 폴리에틸렌 글리콜류， 글리세를에테르류 또는 이들 화합물들의 흔합물들이다. 이들 안정제는 활성 성분을 용해시키기에 층분한 양으로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용할 수 있는 완층제는 보레이트, 탄산 수소 /카르보네 이트， 글루코네이트, 포스페이트， 프로피오네이트 및 TRIS (트로메타민) 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. 바람직하게는 트로메타민 및 보 레이트 완층제를 사용할 수 있다. 부가된 완층제 기질은 생리학상 허용되는 pH 범 위를 보장하고 유지하는데 필요하다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 보존제는 4차 암모늄염， 티오살리실산의 알킬 -수은 염류， 파라벤류, 알콜류， 구아니딘 유도체 등을 포함한다. 바람직한 보 존제는 세트리미드， 염화 벤잘코늄， 염화 벤족소늄 및 파라벤류이다. 세균 및 진균 에 의해 유발되는 사용중 2차 오염을 막기 위해 적절한 양으로 상기 보존제를 첨가 할 수 있다.

생리학적 강장성 (예， 0.9% 염수)을 조절하기 위해 긴장제를 사용할 수 있 다. 예를들면， 염화나트륨, 칼륨 염화물， 염화칼슘, 덱스트로스 및 /또는 만니를을 본 발명의 조성물에 부가할 수 있다. 긴장제의 양은 부가되어야 하는 특정작용제에 따라 변화한다. 일반적으로 특정한 본 발명의 조성물은 150-450 mOsm , 바람직하게 는 250-350 mOsm의 안과용으로 허용되는 삼투성을 가질 수 있다.

또한, 안과용 제형 내의 적절한 점도를 유지하기 위하여 단량체성 폴리올류， 중합체성 폴리올류， 셀를로스 유도체 (셀를로스 부류의 중합체들)， 덱스트란류， 수 용성 단백질들， 비닐 중합체류, 다른 폴리을류， 카르보머류, 다당류 /글리코사미노 글리칸류 등을 포함할 수 있다. 1개 이상의 점도 증진제가 담체 (비히클)의 점도를 증가시키기 위해 본 발명의 조성물들에 부가될 수 있다.

부가된 부형제의 양 및 유형은 특정 요건들에 따라 달라질 수 있으나， 일반 적으로 대략 0.0001 내지 대략 90중량 % 범위에서 사용될 수 있으며， 통상 안과용 당업자가 사용하는 범위 내에서 사용할 수 있다. 또한， 안과용 제형들의 pH 범위는 3.5 내지 9， 바람직하게는 4.5 내지 8 및 가장 바람직하게는 pH 5.5 내지 7.8을 나 타낼 수 있으며， pH 7.0 일 수 있다.

또한， 본 발명은 상술한 바와 같은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단 계를 포함하는 안구건조증을 치료하는 방법을 제공한다.

상기 투여는 직접투여일 수 있고， 이는 용액, 로션， 고약， 겔， 크림， 페이스 트， 분무제， 현탁액， 하이드로겔， 연고， 오일 또는 발포제를 직접 도포하여 조직에 접촉시키는 것을 포함한다.

또한， 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있 고， 공지의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 투여는 일일 총 0.08 내지 2.0 의 용량으로， 1일 1회 또는 수회에 나누어 투여될 수 있다. 구체 적으로 1일 2회 내지 5회로 나누어 투여될 수 있다. 그러나， 본 발명에 따른 조성 물의 투여는 개체의 연령， 성별， 질병의 정도， 약물의 활성， 약물에 대한 민감도， 치료기간 등과 같이 조성물의 효과에 영향을 즐 수 있는 요소들을 모두 고려하여 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여 경로의 예는 경피 (이를 테면， 국소) 투여 형 태가 바람직하며， 비경구， 비강내 (이를 테면， 흡입)， 점액막을 통한 투여를 포함하 나 이에 한정되지 않는다.

상기 개체는 포유동물， 구체적으로 인간일 수 있다.

또한， 본 발명은 안구건조증 치료를 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.

【발명의 실시를 위한 형태】

이하， 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명의 범위가 이들만으로 제 한되는 것은 아니다. 실험예 1 : 세포증식률 비교

먼저， 각막상피세포주 (human corneal epi thel ial cel l l ine , HCE) (ATCC, 미국)를 15% 우태아혈청 (FBS) , 5 zg/ 의 인슐린， 10 ng/m£의 인간 상피세포 성장인자 (hEGF)가 포함된 DMEM/F12 배양배지에서 37 ^° C， 5% C0 ₂ 의 조건으로 배양하였다. 배양한 세포에 0.05%(w/v)의 트립신을 처리하여 세포만 수득하였다. 그후, 이를 각 웰당 3xl0 ³ 개가 되도록 96-웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 배양 배지를 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체한 뒤， 다시 12시간 동안 배양하였다. 한편， 뉴레글린 (서열번호 1XR&D system, 미국)을 0.02 , 0.2 , 2 또는 20 ng/ 의 농도로 FBS가 포함되지 않은 배지에 첨가하였다. 상기 뉴레귤린을 포함하는 배지를 배양된 세포에 첨가하였고, 이때 대조군에는 혈청이 포함되지 않은 배양배지만을 첨가하였다. 이를 각각 12， 24 또는 48시간 동안 배양한 뒤， 각 웰에 10 ^의 CCK-8 반웅액 (Doj indo)을 첨가하였다. 상기 반웅물을 37 ^° C에서 1시간 동안 반웅시킨 뒤 , 마이크로플레이트 리더 (Bio-rad, CA,

USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 뉴레글린이 첨가되지 않은 배양액에서 자란 세포의 흡광도 값올 기준으로, 각 웰의 흡광도 값을 비교한 결과를 도 1에 나타내었다. 뉴레귤린을 첨가한 경우 대조군과 비교하여 각막상피세포주의 증식률이 증가하였다 (도 1 참조) . 실험예 2: 상처 치료효과 확인

상기 실험예 1에 기재된 바와 같이 준비된 각막상피세포주를 웰당 2xl0 ⁴ 개가 되도록 24-웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 배양 배지를 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체한 뒤, 다시 12시간 동안 배양하였다. 세포의 층에 틈을 생성하여 2 讓 간격으로 손상을 주었다. 한편, 뉴레귤린을 0.002， 0.02 , 0.2 , 2， 20， 50 , 100 또는 200 ng/m.e의 농도로 FBS가 포함되지 않은 배지에 첨가하였다. 상기 뉴레글린을 포함하는 배지를 배양된 세포에 첨가하였고， 이때 대조군에는 혈청이 포함되지 않은 배양 배지만을 첨가하였다. 이를 24시간 동안 배양한 뒤， 도립현미경 (Olympus)을 이용하여 촬영하였다. 촬영된 이미지들로부터 T— Scratch 소프트웨어 (Computat ional Sc ience & Engineer ing Laboratory, 스위스)를 이용하여 손상을 준틈의 거리를 측정하였고， 이를 대조군과 비교하였다. 그 결과， 뉴레귤린을 처리한 경우 각막상피세포주가 성장하여 손상된 부분의 거리가 좁아졌다 (도 2 및 도 3 참조) . 실험예 3 : 손상된 각막의 회복효과확인

6주령의 BABL/C 마우스 (30 g) 암컷을 한 그룹당 6마리가 되도록 2개의 그룹으로 분류하였다. 2 aim의 페이퍼 디스크를 20%(w/v)의 에탄올에 적시고, 이를 준비된 마우스의 각막에 60초 동안 덮어 각막의 손상을 유도하였다. 그 후， 2 mm의 블레이드 펀치 (bl ade punch)로 각막에 상처를 내었다.

각막이 손상된 마우스에 2 ng/ ^의 뉴레귤린이 포함된 토브라마이신 안연고 (태준제약， 한국)를 하루에 1회 각막에 도포하였다. 이때， 대조군에는 토브라마이신 안연고만을 도포하였다. 각막 상피의 상처 치유 효과는 안연고를 도포한 16， 24 또는 48시간 후에， 각막형광염색법으로 확인하였다. 구체적으로， 플루오레세인 ( f luoresce inXSigma-Aldr i ch , 미국)을 각막 상피에 점안하고， 1분 후 멸균된 인산완층생리식염수로 이를 세척하였다. 염색된 각막을 청색등하에서 현미경을 이용하여 관찰하였다. 치유된 면적은， 이미지를 촬영하여 Adobe Acrobat 9.5 프로그램으로 측정하였다.

그 결과， 형광염색된 마우스 각막의 이미지를 도 4에， 치유된 면적을 도 5에 나타내었다. 뉴레글린이 포함된 토브라마이신 안연고를 도포한 군의 경우, 대조군과 비교하여 더 빠른 속도로 손상된 각막을 회복시켰다 (도 4 및 도 5 참조) . 실험예 4 : 피부의 상처 치료 효과 확인

피부상피 ^' 세포주 (human adul t l ow cal c ium high temperature , HaCaT) (ATCC , 미국)를 io% FBS가 포함된 DMEM을 사용하여 배양하였다. 배양은 37 ^° C， 5% C0 ₂ 조건에서 수행하였다. 배양된 세포주를 웰당 6xl0 ⁴ 개의 세포가 되도록 24-웰 플레이트에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 배양 배지를 FBS가 포함되지 않은 배지로 교체한 뒤， 다시 12시간 동안 배양하였다. 세포의 층에 틈을 생성하여 2 匪 간격으로 손상을 주었다. 한편， 뉴레글린올 0.002， 0.02 , 0.2， 2 또는 20 ng/m의 농도가 되도록 FBS가 포함되지 않은 배지에 첨가하였다. 상기 뉴레글린을 포함하는 배지를 배양된 세포에 첨가하였고， 이때 대조군에는 혈청이 포함되지 않은 배양배지만을 첨가하였다. 이를 9시간 동안 배양하였고， 이후의 과정은 상기 실험예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

그 결과， 손상된 름의 거리를 측정한 값을 대조군과 비교하여 나타내었다. 뉴레귤린에 의해， 손상된 피부상피세포주의 재생이 빠르게 일어나는 것을 확인하였다 (도 6 및 도 7 참조) . 실험예 5 : 구강상피의 상처 치료 효과 확인

구강상피세포주 (human gingival f ibrobl ast-1 , HGF-1) (ATCC , 미국)를 웰당

2.5xl0 ⁴ 개가 되도록 24-웰 플레이트에 분주한 것과， 뉴레글린을 처리하고 24시간 동안 배양한 것을 제외하고는， 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과， 뉴레글린의 구강상피 상처 치유 효과를 확인하였다. 대조군과 비교하여 뉴레글린이 구강상피의 상처를 치유하는데 우수한 효과가 있음을 확인하였다 (도 8 및 도 9 참조) .