Область техники

Группа изобретений относится к медицине и может быть использована при лечении отитов и других воспалительных заболеваний в ухе.

Предшествующий уровень техники

Отит - это заболевание, представляющее собой воспалительный процесс в ухе. Ухо человека состоит из наружного уха, среднего уха и внутреннего уха.

В зависимости от локализации патологического процесса, соответственно, различают наружный отит, средний отит и внутренний отит.

Среди воспалительных заболеваний наружного уха различают ограниченный и диффузный наружный отит. Примером ограниченного наружного отита является фурункул наружного слухового прохода. Диффузный наружный отит представлен большой группой воспалительных заболеваний бактериальной вирусной, грибковой природы.

Заболевания среднего уха встречаются у представителей всех возрастных групп и имеют важное клиническое и социальное значение. Многообразие патогенетических механизмов этих заболеваний определяется особенностями анатомии и физиологии среднего уха, этиологического фактора в каждом конкретном случае, состоянием иммунной системы организма и т.п. При определении нозологической формы обычно учитывается преимущественное развитие процесса в том или ином отделе среднего уха. Термином «острый средний отит» принято обозначать преимущественное воспаление в барабанной полости, развитие острого воспаления главным образом в слуховой трубе - евстахиит, в сосцевидном отростке - мастоидит. По течению различают острый и хронический средний отит, по характеру воспаления - катаральный, серозный и гнойный. (Пальчун В. Т. и др. / Оториноларингология : учебник. - 2-е изд., испр. И доп. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011 - 656 с. : ил.; ISBN 978-5-9704-1804-8).

Одним из способов лечения воспалительных заболеваний уха является применение ушных капель. Традиционные ушные капли в основном базируются на аминогликозидных антибиотиках (софрадекс, гаразон, анауран). К антибиотикам класса аминогликозидов чувствительны основные группы микроорганизмов, вызывающих воспалительные заболевания уха. Однако, аминогликозиды обладают потенциальной ототоксичностью, что ограничивает их применение только наружными отитами и неперфоративными формами средних отитов (Балясинская Г.Л. Ушные капли отофа и полидекса при лечении детей с острым средним и наружным отитами // Вестник оториноларингологии. 2003. 3. С. 53-54.).

Из заявки WO2009142719, MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY et al., A61K 8/00, 8/18, опубликованной 26.1 1.2009 на 83 листах (Dl), известна фармацевтическая композиция для лечения заболеваний уха, содержащая терапевтический агент, которым, в частности, может быть анестетик, например, артикаин, или противопоспалительное средство, в частности, феназон.

Из патента CN101584689 В, NAVY MEDICINE RESEARCH INSTITUTE OF PL A, A61K31/167, 31/4152, A61P27/16, 29/00, опубликованного 16.03.2011 на 9 листах (D2) известна фармацевтическая композиция для лечения отитов, содержащая феназон и лидокаин.

Техническое решение, описанное в D2, может быть принято в качестве ближайшего аналога.

Составы заявляемой фармацевтической композиции предложены авторами впервые. Совместное применение артикаина и пропифеназона (равно как и совместное применение артикаина, пропифеназона и бензалкония хлорида) для изготовления фармацевтической композиции, предназначенной для наружного или местного применения, предложено авторами впервые.

Раскрытие изобретения

В связи с вышесказанным, целью настоящего изобретения является создание новой эффективной фармацевтической композиции для лечения отитов.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение эффективности (усиление клинического эффекта) лечения отитов и обеспечение эффективной и стабильной фармацевтической композиции, которая может быть использована для лечения отитов.

Варианты осуществления настоящего изобретения относятся к фармацевтической композиции для лечения отитов, содержащей, по меньшей мере феназон или пропифеназон и артикаин, а так же бензалкония хлорид.

Варианты осуществления настоящего изобретения относятся так же к способу лечения отитов и способу получения фармацевтической композиции для лечения отитов.

Краткое описание чертежей.

На фиг. 1 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 1, до нанесения рецептуры. На фиг. 2 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 1 , через одни сутки после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 3 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 1 , через двое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 4 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру JNs 1, через трое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 5 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 2, до нанесения рецептуры.

На фиг. 6 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 2, через одни сутки после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 7 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 2, через двое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 8 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру jN 2, через трое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 9 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 3, до нанесения рецептуры.

На фиг. 10 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру Ν° 3, через одни сутки после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 1 1 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру JNs 3, через двое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 12 представлена фотография после скарификации опытного уха кролика, получавшего рецептуру N° 3, через трое суток после первого нанесения рецептуры.

На фиг. 13 представлена фотография после скарификации контрольного уха кролика.

На фиг. 14 представлена фотография после скарификации контрольного уха кролика через одни сутки.

На фиг. 15 представлена фотография после скарификации контрольного уха кролика через двое суток.

На фиг. 16 представлена фотография после скарификации контрольного уха кролика через трое суток.

На фиг. 17-23 представлены исходные данные иммуноферментного анализа для цитокинов IL-Ιβ и TNF-a

На фиг. 24 показан уровень TNF-a в супернатантах активированных макрофагов (МФ) через 6 часов инкубации в зависимости от концентрации бензалкония хлорида.

з На фиг. 25 показан уровень TNF-α в супернатантах активированных макрофагов (МФ) через 24 часа инкубации в зависимости от концентрации бензалкония хлорида.

На фиг. 26 показано влияние на уровень синтеза IL-Ι β в супернатантах активированных МФ через 6 часов инкубации в зависимости от концентрации бензалкония хлорида.

На фиг. 27 показано влияние на уровень синтеза IL-Ι β в супернатантах активированных МФ через 24 часа инкубации в зависимости от концентрации бензалкония хлорида.

Варианты осуществления изобретения

Феназон (торговая марка: «Антипирин»)— лекарственное средство, анальгетик и антипиретик из группы пиразол онов.

Структурная формула феназона:

Согласно номенклатуре ИЮПАК: 1,2-dihydro- 1,5-dimethyl- 2-phenyl- 3H-pyrazol- 3- one

Представляет собой бесцветные кристаллы или белый кристаллический порошок без запаха, слабогорького вкуса. Очень легко растворим в воде (1 : 1), легко— в спирте. Растворы (рН 6,0-7,5) стерилизуют при +°120 С в течение 20 мин.

Синтезирован Людвигом Кнорром (Хёхст) в 1883 году.

Феназон был одним из первых синтетических анальгетиков, производных пиразолона, нашедших применение в медицине (1884). С получением других анальгетиков им стали пользоваться относительно редко. Широкого применения феназон в настоящее время не имеет.

Как и другие производные пиразолона, феназон оказывает болеутоляющее, жаропонижающее и в той или иной степени противовоспалительное действие. По анальгезирующей и жаропонижающей активности препараты этой группы близки к производным салициловой кислоты. Производные пиразолона уменьшают проницаемость капилляров и препятствуют развитию воспалительной реакции.

Феназон оказывает умеренное анальгезирующее, жаропонижающее и противовоспалительное действие. При местном применении отмечается некоторое кровоостанавливающее действие. Применяется при невралгиях, простудных заболеваниях. Пропифеназон - анальгетик и антипиретик из группы пиразолонов, является производным феназона и имеет аналогичные болеутоляющие и жаропонижающие свойства.

Структурная формула пропифеназона:

Согласно номенклатуре ИЮПАК: l,5-Dimethyl-2-phenyl-4-propan-2-yl-pyrazol-3-one (4-изопропил- 1 ,5-диметил-2-фенил- 1 Н-пиразол-3(2Н)-он).

Общеизвестно, что при пероральном приеме обладает выраженным анальгезирующим и жаропонижающим действием, противовоспалительная активность выражена слабо, как и у других пиразолонов. Быстро всасывается в желудочно-кишечном тракте, максимальная концентрация в крови развивается через 30 минут после приема внутрь.

По сравнению с другими производными пиразолона наиболее безопасен. При его применении, в частности, не отмечено развития агранулоцитоза. .

При этом необходимо отметить, что из уровня техники не известны случаи применения пропифеназона в качестве активного компонента фармацевтической композиции для наружного или местного применения.

Артикаин (Articaine) (торговое наименование - Ультракаин) — лекарственное средство с высокой анестезирующей активностью.

Более конкретно, в рамках настоящего изобретения описываются фармацевтические композиции, содержащие артикаина гидрохлорид.

Структурная формула артикаина:

Согласно номенклатуре ИЮПАК: (RS)-Methyl 4-methyl-3-(2- propylaminopropanoylamino)tliiophene-2-carboxylate ((RS)-MeTCw 4 метил-3-(2- пропиламинопропаноиламино)тиоф� �н-2-карбоксилат).

Артикаин— местный анестетик, который применяется для инфильтрационной и проводниковой анестезии. Препарат обладает высоким обезболивающим эффектом, в 2 раза сильнее лидокаина и в 6 раз прокаина. Анестетик проникает через мембрану внутрь нервного волокна, высвобождая основание с липофильными свойствами в результате гидролиза в слабощелочной среде тканей организма (в кислой среде эффект препарата снижается). Таким образом ультракаин взаимодействует с нервными рецепторами, блокирует вход Na+ в клетку в фазу деполяризации и блокирует проведение импульсов по нервному волокну. Анестезия наступает сразу после введения и длится от 1 до 5 ч.

В стоматологическую практику вошёл в 1978 году. Действующее вещество — артикаина гидрохлорид (Метиловый эфир 4-метил-3[2-пропиламинопропионами� �о]-2- тиофекарбоновой кислоты) + адреналина гидротартрат (эпинефрин).

Бензалкония хлорид— антисептическое лекарственное средство, оказывает также противогрибковое, антипротозойное, местное контрацептивное (сперматоцидное) действие; инактивирует вирусы, вызывающие простой герпес (Herpes simplex).

Структурная формула бензалкония хлорида:

Согласно номенклатуре ИЮПАК: Alkyldimethylbenzylammonium chloride (алкилбензилдиметиламмония хлорид) .

Проявляет бактерицидную активность в отношении стафилококков, стрептококков, грамотрицательных бактерий (кишечной и синегнойной палочек, протея, клебсиеллы и др.), анаэробных бактерий, грибов, в том числе, плесеней и дрожжей, а также вирусов. Действует на штаммы бактерий, устойчивых к антибиотикам и др. химиотерапевтическим лекарственным средствам; подавляет плазмокоагулазу и гиалуронидазу стафилококков. Предупреждает вторичное инфицирование ран госпитальными штаммами микроорганизмов. Сперматоцидное действие обусловлено способностью повреждать мембраны сперматозоидов (в начале жгутиков, затем головки), что обусловливает невозможность оплодотворения поврежденным сперматозоидом. Эффект развивается через 8-10 мин (таблетки), 5 мин (вагинальные свечи), 3 мин (крем) или немедленно после введения во влагалище (тампон), in vitro активен в отношении Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia spp., Trichomonas vaginalis, Human herpesvirus 2, Staphylococcus aureus. He оказывает действия на Mycoplasma spp. и слабо действует на Gardnerella vaginalis, Candida albicans, Haemophilus ducreyi и Treponema pallidum. In vivo проявляет некоторую активность в предупреждении некоторых заболеваний, передающихся половым путем. Не влияет на нормальную микрофлору влагалища (в т.ч. на палочку Додерляйна) и гормональный цикл.

Пропиленгликоль - используется как наполнитель и основной растворитель субстанции пропифеназона (в комбинации с глицерином). Так же в виду отсутствия в заявляемых композициях консервантов, совместно с бензалкония хлоридом может выступать в виде консерванта, поскольку обладает бактерицидным действием.

Структурная формула пропил енгликоля:

ОН

Согласно номенклатуре ИЮПАК: Propane- 1,2-diol (пропан- 1,2-диол).

Глицерин - наполнитель, сорастворитель; также выступает в качестве заменителя воды, уменьшая количество используемого растворителя (вода) в котором нерастворима активная субстанция пропифеназона, тем самым повышая стабильность композиции при хранении. За счет своей вязкости повышает общую вязкость композиции, в целом способствуя, в том числе, улучшению реологических свойств композиции и процесса дозирования капель при применении.

Структурная формула глицерина:

Согласно номенклатуре ИЮПАК: propane- 1, 2,3 -triol (пропантриол- 1 ,2,3).

Соответственно, основным аспектом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая анальгетическим, анестетическим, антисептическим и противовоспалительным действием, которая может быть использована для лечения отитов, в частности, наружного и среднего отитов, а также других воспалительных заболеваний уха, содержащая, по меньшей мере: в качестве анальгетического агента феназон или пропифеназон; в качестве анестетического агента артикаин; и в качестве антисептического и противовоспалительного агента бензалкония хлорид.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая анальгетическим, анестетическим и бактерицидным действием, содержащая, по меньшей мере: в качестве анальгетического агента феназон или пропифеназон в количестве 4% мае; в качестве анестетического агента артикаин в количестве 2% мае; и в качестве антисептического агента бензалкония хлорид в количестве от 0,05 до 0,2 %% мае.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая анальгетическим, анестетическим и бактерицидным действием, содержащая, по меньшей мере: в качестве анальгетического агента феназон или пропифеназон, в частности, в количестве 4% мае; в качестве анестетического агента артикаин, в частности, в количестве 2% мае; в качестве антисептического агента бензалкония хлорид, в частности, в количестве от 0,05 до 0,2 %% мае; и дополнительно необязательно содержащая в качестве вспомогательного вещества пропиленгликоль, в частности, в количестве от 44 до 60 %% мае, и дополнительно содержащая в качестве вспомогательного вещества глицерин, в частности, в количестве от 20 до 30 %% мае

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция по любому из описанных выше аспектов осуществления настоящего изобретения, отличающаяся тем, что представляет собой ушные капли.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, пропифеназон, артикаин и бензалкония хлорид, заключающийся в:

растворении пропифеназона в пропиленгликоле при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения и растворении артикаина и бензалкония хлорида в воде при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения;

смешивании полученного раствора пропифеназона и пропиленгликоля с полученным раствором артикаина, бензалкония хлорида и воды при перемешивании до достижения однородности получаемого смешиванием раствора;

добавлении глицерина к полученному смешиванием раствору при перемешивании до достижения однородности получаемого добавлением глицерина раствора;

постепенном добавлении воды до заданного объема при перемешивании.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, пропифеназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что перемешивание является интенсивным.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, пропифеназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что смешивание полученного раствора пропифеназона и пропиленгликоля с полученным раствором артикаина, бензалкония хлорида и воды осуществляют при перемешивании в течение не более чем 30 минут.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, пропифеназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что добавление глицерина к полученному смешиванием раствору осуществляют при перемешивании в течение не более чем 30 минут.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, пропифеназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что после постепенного добавления воды до заданного объема осуществляют фильтрацию, в частности, через сито, в частности, капроновое.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, феназон, артикаин и бензалкония хлорид, заключающийся в:

растворении феназона, артикаина и бензалкония хлорида в воде при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения;

добавлении глицерина к полученному перемешиванием раствору при перемешивании до достижения однородности получаемого добавлением глицерина раствора;

постепенном добавлении воды до заданного объема при перемешивании.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, феназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что перемешивание является интенсивным. Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, феназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что добавление глицерина к полученному перемешиванием раствору осуществляют при перемешивании в течение не более чем 30 минут. Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является описанный выше способ получения фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, феназон, артикаин и бензалкония хлорид, отличающийся тем, что после постепенного добавления воды до заданного объема осуществляют фильтрацию, в частности, через сито, в частности, капроновое.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является способ лечения отитов, заключающийся в введении фармацевтической композиции по любому из описанных выше аспектов осуществления настоящего изобретения в виде ушных капель в ухо пациента, страдающего воспалительным процессом в ухе.

Другим аспектом осуществления настоящего изобретения является способ лечения отитов, заключающийся в введении фармацевтической композиции по любому из описанных выше аспектов осуществления настоящего изобретения в виде ушных капель в ухо пациента, страдающего воспалительным процессом в ухе, причем воспалительным процессом в ухе является наружный или средний отит.

Осуществление изобретения

Антисептическая и противовоспалительная активность фармацевтической композиции.

На антисептическую и противовоспалительную активность проверялись следующие рецептуры фармацевтической композиции:

Рецептура N° 1— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,2% мае;

Рецептура N° 2— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,1% мае;

Рецептура N° 3— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,05% мае;

Рецептура N° 4— пропифеназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,2% мае;

Рецептура N° 5— пропифеназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,1% мае;

Рецептура Ν° 6— пропифеназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,0,5% мае;

На антисептическую и противовоспалительную активность на животных проверялись рецептуры Ν°Ν2 1-3.

Оценивали противовоспалительное и антисептическое действие трех образцов ушных капель по ранозаживляющему эффекту кожного дефекта на кроликах и ю морфологическому исследованию мазков-отпечатков с раневой поверхности. По характеру и продолжительности заживления ран наблюдался выраженный эффект. При этом, судя по снижению общего количества лейкоцитов в раневом отделяемом, образцы ушных капель обладают противовоспалительным действием.

Основным показанием для разрабатываемых ушных капель являются отиты. Поскольку адекватная модель этих заболеваний на животных отсутствует, то противовоспалительное действие трех образцов ушных капель изучали на модели скарифицированных кожных ран в экспериментах на кроликах. Основными критериями оценки действия препаратов были характер и продолжительность ранозаживления, а также морфологические показатели раневого отделяемого.

Тест-система.

Эксперименты проводили на кроликах-самцах породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг. Животных получали из Филиала «Андреевка» ГУ НЦ «Биомедицинские Технологии» РАМН и содержали в виварии согласно санитарным правилам на стандартном рационе с использованием сухого гранулированного корма.

Сформировали 3 опытные группы по 4 кролика в каждой на каждую рецептуру ушных капель:

1 группа - Рецептура Ν° 1 ;

2 группа - Рецептура Ν° 2;

3 группа - Рецептура Ν° 3.

Описание эксперимента.

Скарифицированные кожные раны воспроизводили у кроликов следующим образом. На наружном ухе (с учетом предназначения капель максимально близко к наружному слуховому проходу) каждого кролика с обеих сторон на участке примерно 1 ^χ 1 см скальпелем делали несколько поверхностных насечек. На раневую поверхность на правом ухе (далее по тексту - «опытное ухо») всех опытных кроликов примерно через 1 час наносили определенную рецептуру ушных капель соответственно номеру группы, указанной выше, в количестве 2-3 капель. Аппликации капель проводили два раза с интервалом 24 ч до образования плотного струпа.

Контролем служила раневая поверхность на противоположном левом ухе (далее по тексту также «контрольное ухо»), которое лечению не подвергалось.

На протяжении всего эксперимента проводили наблюдение за общим состоянием и поведением подопытных кроликов.

В течение 7 суток ежедневно оценивали клиническое состояние ран и окружающих тканей, сроки образования струпа и полного заживления ран. Сразу же после скарификации и через 24 часа после лечения с раневой поверхности опытного уха каждого кролика делали мазок-отпечаток; в указанные сроки мазок-отпечаток делали с раны контрольного уха. Мазки окрашивали азур-эозином; микроскопические препараты исследовали под микроскопом «Micros» (Австрия); увеличение 90>< 10.

Результаты.

После воспроизведения раневой поверхности и в последующие сроки наблюдений (7 суток) общее состояние и поведение кроликов оставалось без видимых нарушений. Все животные охотно потребляли корм и воду.

Ежедневно осматривали раневую поверхность у всех кроликов. Ниже приводятся результаты этих наблюдений во временной динамике.

Через 24 часа после первого нанесения всех трех образцов на раневых поверхностях в опыте и контроле появились признаки эпителизации ткани в виде каемки по периферии ран. В центре раневого участка хорошо просматривалась тонкая, сухая и бесцветная пленка. Ни в одном случае не наблюдали гнойных и кровянистых выделений. Отмечали начало формирования струпа. В прираневой зоне гиперемия, отеки и уплотнения отсутствовали.

Через 48 часов струп сформировался полностью только на опытном ухе. Струп был чистый, ровный, плотный и сухой. Во всех случаях не отмечали раневого отделяемого. Кожа вокруг ран была ровная, гладкая, чистая, без покраснений и припухлости. Признаков воспаления не отмечали (см. фиг. 1-12). Струп на контрольном ухе полностью не был сформирован и на третьи сутки (см. фиг. 13-16).

В последующие периоды времени имело место дальнейшее заживление ран. Во всех группах полное восстановление кожных дефектов контрольных ушей имело место примерно на 7 сутки. Полное восстановление кожных дефектов опытных ушей наблюдалось уже на 4-5 сутки.

Таким образом, рецептуры N°N° 1-3 обладают выраженным антисептическим и противовоспалительным действием, что проявляется в более быстром формировании струпа и более быстром заживлении раны опытного уха.

Материалы и методы исследования противовоспалительной активности рецептур JVs 1-3 in vitro.

Получение культуры сенсибилизированных перитонеальных макрофагов (МФ) крысы.

Активированные МФ выделяли из перитонеального экссудата крысы через 4 дня после внутрибрюшинной инъекции 5 мл лошадиной сыворотки. Перитонеальную полость промывали PBS (ПанЭко, Россия), затем полученную суспензию собирали в центрифужную пробирку (CORNING, 50 ml). После центрифугирования (Eppendorf, 5702RH, Германия), в течение 5 минут при 200 об/мин, удаляли супернатант, а клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде RPMI-1640 (GIBCO) с добавлением 10% FBS (GIBCO), L-Glutamine и антибиотика/антимикотика (GIBCO) стандартной концентрации. Мононуклеарные клетки считали в камере Горяева на микроскопе «Олимпус» (Olympus СК 40, Япония), после чего готовили клеточную суспезию с концентрацией 1,6 х 10 6 кл/мл. Готовую суспензию мононуклеаров вносили по 1 мл в каждую лунку 24-луночного планшета (CORNING) и инкубировали во влажных условиях С02 - инкубатора (New Brunswick, Galaxy 170R) при t=37°C и 5% С02.

Для исследования выделенные МФ высевали в два 24-луночных планшета. После двух часов инкубации удаляли не прикрепившиеся клетки и отмывали лунки теплым раствором Хенкса (ПанЭко, Россия). Прикрепившиеся МФ составляют приблизительно 50 - 60 % от тотального количества посаженных мононуклеарных клеток.

Приготовление исследуемых препаратов. Действие препарата на сенсибилизированных МФ изучали в трех разведениях. Для этого на ростовой среде RPMI- 1640 (GIBCO) с добавлением 1% FBS, L-Glutamine и антибиотика/антимикотика, в стерильных условиях готовили рецептуры N°N° 1-3 в указанных концентрациях.

Готовые стерильные растворы Рецептур Ν°Νο 1-3 вносили по 500 мкл в каждую лунку. Контрольные лунки разделили на две группы К1 и К2, по четыре лунки на каждую группу. В первую группу (К1) внесли по 500мкл исходной ростовой среды RPMI-1640 с 1% FBS без исследуемых препаратов. В лунки второй контрольной группы (К2) внесли ростовую среду, содержащую феназон и артикаин.

Пробы супернатанта для иммуноферментного анализа отбирали в четырех повторах через 6 часов и 24 часа после внесения исследуемых препаратов. Перед замораживанием супернатант центрифугировали (2 минуты, 10 000 об/мин) и хранили в аликвотных частях при -70°С до проведения иммуноферментного анализа (ИФА).

Иммуноферментный анализ.

Количественное содержание растворимых цитокинов IL-Ιβ и TNF-α в супернатантах активированных МФ определяли стандартным методом твердофазного ИФА. Исследования выполнены со стандартными наборами реактивов для ИФА "Quantikine ELISA Rat TNF- a" (Catalog Number RTA00) и "Quantikine ELISA Rat IL-Ιβ" (Catalog Number RLB00), производитель R&D Systems (Великобритания). Анализ проводили по стандартному протоколу. Оптическую плотность измеряли на ридер- спектрофотометре «Anthos 2010» (Австрия) при длине волны 450nm. Исходные данные иммуноферментного анализа для обоих цитокинов приведены на фиг. 17-23. Результаты.

В работе было исследовано влияние рецептур N°N° 1-3 на синтез IL-Ιβ и TNF-a активированными МФ в модели in vitro. В ходе всего эксперимента проводили светоскопическое наблюдение за состоянием культуры МФ. При визуальном осмотре через 6 часов и 24 часа культивирования не обнаружено морфологических различий между клетками в контрольных и исследуемых лунках. Клетки во всех лунках имели одинаковую степень распластанности, детрит в среде отсутствовал. Из чего можно заключить, что исследуемые препараты не вызывают цитотоксического действия на культуру клеток в течение 24 часовой инкубации.

На фиг. 24 и 25 показан уровень TNF-a в супернатантах активированных МФ через 6 часов и 24 часа инкубации в зависимости от концентрации бензалкония хлорида. Ко - контроль, не кондиционированная среда RPMI-1640 с 1% FBS. Через 6 часов концентрация TNF-a по сравнению с контрольными группами К1 и К2 снижается в среднем на 30%. Причем рецептуры Ν2Ν° 1-3 в равной степени ингибируют синтез TNF-a активированных макрофагов. Через сутки, к конечной точке исследования, эта тенденция сохраняется. Из этого можно заключить, что исследуемые рецептуры в равной степени ингибируют синтез TNF-a активированных МФ в течение 24 часов.

На фиг. 26 и 27 показано влияние исследуемых препаратов на уровень синтеза IL-1 β в супернатантах активированных МФ. Концентрация IL-Ιβ имеет тенденцию к снижению через 6 часов инкубации. По отношению к контрольным группам К1 и К2 концентрация IL-Ι β уменьшается примерно в 2 раза под действием рецептур К° 1 и 2. Рецептура Ν° 3 в меньшей степени ингибирует синтез IL-Ι β. К 24 часам ингибирующее действие исследуемых препаратов ослабевает.

Таким образом, исследование противовоспалительной активности рецептур Ν2Ν ⁰ 1- 3 на активированных МФ показало, что данные образцы обладают наиболее выраженным противовоспалительным действием на ранних сроках воспалительной реакции. Ингибирование синтеза цитокинов активированных МФ имеет прямопропорциональную зависимость от концентрации бензалкония хлорида. Наиболее эффективным противовоспалительным действием обладает Рецептура j\° 1.

Материалы и методы исследования антисептической активности рецептур N°Ni- 4-6 in vitro.

Изучение антисептической активности рецептур N2.N2 4-6 проведено на тест- культурах референтных штаммов Haemophilus influenzae (Н. influenzae) АТСС 49247, Moraxella catarrhalis АТСС 25235, Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 29213, полученных из музея ГИСК им. Л.А. Тарасевича, а также на тест-штаммах Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) N° 1, Streptococcus pyogenes (S. pyogenes) J s 664, вьщеленных из клинического материала (музей межклинической бактериологической лаборатории Первого МГМУ им. И.М. Сеченова).

Антисептическую активность рецептур исследовали в жидкой питательной среде и на плотной питательной среде.

Исследование антибактериальной активности рецептур N2N2 4-6 в жидкой питательной среде.

Для культивирования М. catarrhalis, S. aureus, S. pneumoniae, S. pyogenes использовали агар с сердечно-мозговым экстрактом с добавлением 5% крови, культивирование Н. influenzae проводили на шоколадном агаре на основе сердечно- мозгового экстракта. Суточную агаровую культуру соответствующего тест- микроорганизма смывали стерильным физиологическим раствором и полученную бактериальную взвесь доводили до концентрации 1-1,5 млрд. микробных клеток в 1 мл по стандарту МакФарланда. Из приготовленных взвесей готовили 10-кратные бульонные разведения, содержащие примерно 1,0-1,5x108 КОЕ/мл, М. catarrhalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae - в сердечно-мозговом бульоне, S. aureus— в бульоне Мюллера- Хинтона.

Приготовленные бульонные культуры тест-микроорганизмов разливали в 4 пробирки по 1 мл. В пробирки N° 1, 2, 3 вносили по 1 мл соответствующих рецептур. В качестве контроля служила пробирка N° 4 с культурой, в которую вместо рецептур вносили 1 мл соответствующего бульона. Все пробы инкубировали в термостате при t = 350°С и через определенные промежутки времени - 1 час и 4 часа, - делали высевы на чашки с плотной питательной средой для определения бактериальной концентрации (БК). Через 24-48 часов инкубации чашек с посевами, в зависимости от вида микроорганизма, подсчитывали количество выросших колоний и определяли БК.

Исследование антибактериальной активности рецептур N° N2 4-6 на твердой питательной среде.

Из суточных культур испытуемых тест-микроорганизмов, выращенных на соответствующих твердых питательных средах (шоколадный и 5% кровяной агар с сердечно-мозговым экстрактом) готовили стандартные бактериальные суспензии, соответствующие по плотности 0,5 по стандарту МакФарланда (примерно 1,5x108 КОЕ/мл). Стерильным ватным тампоном суспензия наносилась на чашку Петри со средой для определения чувствительности. После подсушивания в течение 5 минут на поверхность питательной среды с тест- микроорганизмом были нанесены по 1й капле (20 мкл) рецептур NeNs 4-6. Учет результатов проводили через 24-48 часов инкубации чашек с посевами по зоне задержки роста тест-микроорганизма.

Результаты.

Результаты изучения антимикробной активности рецептур N°N° 4-6 представлены в таблицах 1-6.

Как видно из таблиц 1-5, рецептуры Ν°Νο 4-6 при исследовании в жидкой питательной среде обладают выраженной антисептической активностью в отношении тестируемых бактерий. Рецептуры N° 2 4-6 обеспечивают гибель S. aureus, М. catarrhalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae через 60 минут.

Таблица 1. Результаты исследования антисептического действия рецептур N°N° 4-6 на

S. aureus АТСС 29213.

Таблица 2. Результаты исследования антисептического действия рецептур N°N° 4-6 на

Н. influenzae АТСС 49247.

Таблица 3. Результаты исследования антисептического действия рецептур N°N° 4-6 на

М. catarrhalis АТСС 25235.

БК тест-микроорганизма (КОЕ/мл)

Таблица 5. Результаты исследования антисептического действия рецептур N°N° 4-6 на

S. pneumoniae N° 1.

Выраженная антисептическая активность рецептур j °Nb 4-6 на тест- микроорганизмах также была выявлена при исследовании на твердых питательных средах (таблица N° 6). В зоне воздействия (капля) рецептур Ν°Ν° 4-6 отмечается полное подавление роста S. aureus, М. catarrhalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae. Таблица 6. Антисептическая активность рецептур N°N° 4-6

Н. influenzae

S. pyogenes

S. pneumoniae

Таким образом, рецептуры j\ j\b 4-6 обладают выраженной антисептической активностью в отношении S. aureus, М. catarrhalis, S. pneumoniae, S. pyogenes, H. influenzae.

Принимая во внимание тот факт, что рецептуры N°N° 4-6 отличались от соответствующих рецептур N°N° 1-3 только применением пропифеназона вместо феназона, можно сделать вывод, что по своим антисептическим и противовоспалительным действиям оба типа рецептур идентичны, т.к. этот эффект обусловлен, в целом, наличием и концентрацией бензалкония хлорида.

Анальгетический и анестетический эффект при этом обеспечивается, соответственно, феназоном или пропифеназоном и артикаином, о чем свидетельствуют менее выраженные реакции кроликов на воздействие на скарифицированное опытное ухо.

Предпочтительные рецептуры.

Предпочтительные рецептуры помимо феназона (или пропифеназона), артикаина и бензалкония хлорида дополнительно содержат вспомогательные вещества. Этими рецептурами являются следующие рецептуры:

Рецептура j\° 7— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,2% мае; дополнительно содержащая глицерин;

Рецептура N° 8— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,1% мае; дополнительно содержащая глицерин;

Рецептура N° 9— феназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,05% мае; дополнительно содержащая глицерин;

Рецептура N° 10— пропифеназон 4% мае, артикаин 2% мае, бензалкония хлорид 0,2% мае; дополнительно содержащая пропил енгликоль и глицерин; Рецептура N° 1 1— пропифеназон 4% мае., артикаин 2% мае., бензалкония хлорид 0,1% мае.; дополнительно содержащая пропиленгликоль и глицерин;

Рецептура .Ns 12— пропифеназон 4% мае, артикаин 2% мае., бензалкония хлорид 0,05% мае; дополнительно содержащая пропиленгликоль и глицерин.

Содержание пропиленгликоля в упомянутых рецептурах при этом должно быть в пределах от 40 до 60 %% мае. Содержание глицерина - от 20 до 30 %% мае. Остальное - вода.

Такие предпочтительные рецептуры могут быть получены следующим образом. Рецептуры N°N° 7-9, содержащие феназон, получали путем растворения феназона, артикаина и бензалкония хлорида в воде при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения, последующим добавлением глицерина к полученному перемешиванием раствору при перемешивании до достижения однородности получаемого добавлением глицерина раствора и последующим постепенным добавлением воды до заданного объема при перемешивании. Перемешивание при этом может быть интенсивным, т.е. таким перемешиванием, которое обеспечивало бы получение однородного раствора. Добавление глицерина к полученному перемешиванием раствору может осуществляться, в частности, при перемешивании в течение не более чем 30 минут. После постепенного добавления воды до заданного объема при этом может быть осуществлена фильтрация, в частности, через сито, например, капроновое. В свою очередь рецептуры а 10-12, содержащие пропифеназон, получали путем растворения пропифеназона в пропиленгликоле при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения и растворения артикаина и бензалкония хлорида в воде при температуре 30-45 °С при перемешивании до полного растворения, после чего полученные растворы пропифеназона с пропиленгликолем и артикаина с бензалкония хлоридом и водой смешивали при перемешивании до достижения однородности получаемого смешиванием раствора, после чего осуществляли добавление глицерина к полученному смешиванием раствору при перемешивании до достижения однородности получаемого добавлением глицерина раствора и после этого осуществляли постепенное добавление воды до заданного объема так же при перемешивании. Для обеспечения однородности получаемого смешиванием раствора, перемешивание может осуществляться интенсивно. Смешивание полученного раствора пропифеназона и пропиленгликоля с полученным раствором артикаина, бензалкония хлорида и воды при этом может осуществляться при перемешивании в течение не более чем 30 минут. Добавление глицерина к полученному смешиванием раствору так же может осуществляться при перемешивании в течение не более чем 30 минут. После постепенного добавления воды до заданного объема при этом может быть осуществлена фильтрация, в частности, через сито, например, капроновое.