PATHOLOGIES ORTHOPEDIQUES

Domaine de l'invention

La présente invention concerne la prévention et le traitement des pathologies orthopédiques.

Arrière-plan technique

On considère que la prévalence des pathologies ostéoarticulaires est de l'ordre de 25% de la population des pays industrialisés. Les pathologies orthopédiques, et notamment les pathologies ostéoarticulaires, ciblent les tissus musculo-squelettiques, tels que les os, le cartilage et les membranes synoviales, les ligaments, les tendons et les muscles, qui sont dégradés dans ces pathologies. Les causes de dégradation sont multiples et peuvent impliquer des traumatismes, le vieillissement, une usure mécanique, ou encore une inflammation. A titre d'exemples de pathologies orthopédiques, on peut notamment citer l'ostéoarthrite et la polyarthrite rhumatoïde.

Parmi les différentes stratégies envisagées pour le traitement des pathologies orthopédiques, la thérapie cellulaire apparaît comme un domaine d'avenir.

Ainsi, les cellules souches mésenchymateuses (CSM), des cellules progénitrices non-hématopoïétiques que l'on peut trouver dans différents tissus adultes, tels que la moelle osseuse, le tissu adipeux ou le derme, et qui peuvent donner naissance à certains tissus conjonctifs du squelette, tels que les os et le cartilage, ont été utilisées dans le cadre du traitement de pathologies orthopédiques. En particulier, des tentatives de traitement de maladies arthritiques ont été effectuées à l'aide de CSM (Chen & Tuan (2008) Arthritis Research & Therapy 10:223-234).

Toutefois, il semble que les CSM se greffent de manière relativement inefficace au cartilage articulaire dans le cadre du traitement de l'ostéoarthrite (Chen & Tuan (2008) Arthritis Research & Therapy 10:223-234). Par ailleurs, des résultats contradictoires ont été rapportés pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde, certains auteurs indiquant que les CSM ne permettraient pas d'améliorer l'état des patients (Djouad et al. (2005) Arthritis and Rheumatism 52:1595-1603). Il a été suggéré que ces résultats contradictoires pourraient provenir de l'absence d'une définition claire des CSM ainsi que de leur hétérogénéité.

De ce fait, il y a un besoin pour une alternative aux CSM permettant une prise en charge efficace des pathologies orthopédiques. Les fibroblastes gingivaux sont des cellules adultes d'origine mésenchymateuse, qui sont capables de migrer, d'adhérer et de proliférer dans les tissus connectifs mous de la gencive. Ils maintiennent ainsi l'intégrité du tissu gingival qui est exposé à de nombreuses agressions, telles que les stress mécaniques, les infections bactériennes, ou les variations de pH et de température. Les fibroblastes gingivaux sont notamment décrits dans Gogly et al., (1997) Clin. Oral Invest. 1 :147-152; Gogly et al. (1998) Biochem. Pharmacol. 56:1447-1454; and Ejeil et al. (2003) J. Periodontol. 74:188-195.

Selon les conditions environnementales, les fibroblastes gingivaux sont capables de moduler leur phénotype, et de répondre en proliférant, en migrant et en synthétisant ou en dégradant des composants de la matrice extracellulaire ou des enzymes en lien avec la matrice extracellulaire.

Les fibroblastes gingivaux synthétisent du collagène (par exemple de type I, III, V, VI, VII, XII), des fibres élastiques (de l'oxytalane, de l'élaunine et de l'élastine), des protéoglycanes et des glycosaminoglycanes (par exemple décorine et biglycane), et des glycoprotéines (par exemple la fibronectine et la ténascine). Parallèlement, selon le contexte, les fibroblastes gingivaux synthétisent des enzymes qui sont capables de dégrader les composés macromoléculaires de la matrice (métalloprotéinases matricielles ; MMP), mais également des enzymes inhibant les formes actives des MMP (inhibiteurs de métalloprotéinases ; TIMP). Les fibroblastes gingivaux sont donc des acteurs importants du remodelage de la matrice extracellulaire.

Résumé de l'invention

La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que des fibroblastes gingivaux cultivés avec des chondrocytes, des myocytes, ou des ostéoblastes humains, stimulés par une cytokine pro-inflammatoires, pouvaient inhiber l'activité MMP sécrétés par ces cellules, ce qui démontre que les fibroblastes gingivaux sont capables d'inhiber l'activité MMP dans un environnement semblable à celui d'une pathologie orthopédique, notamment inflammatoire.

Ainsi, la présente invention concerne une méthode de prévention ou de traitement de pathologies orthopédiques d'un individu, dans laquelle on administre à l'individu une quantité prophylactiquement ou thérapeutiquement effective d'un produit dérivé de fibroblaste gingival.

La présente invention concerne également un produit dérivé de fibroblaste gingival pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de pathologies orthopédiques d'un individu. La présente invention concerne également l'utilisation d'un produit dérivé de fibroblaste gingival pour son utilisation dans la préparation d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement de pathologies orthopédiques d'un individu. Description détaillée de l'invention

Comme on l'entend ici, une pathologie orthopédique selon l'invention est une pathologie ciblant les tissus musculo-squelettiques, à savoir, notamment, les os, le cartilage, les membranes synoviales, les ligaments, les tendons, et les muscles, qui peuvent notamment être dégradés. Ainsi, la pathologie orthopédique selon l'invention est de préférence sélectionnée dans le groupe constitué d'une pathologie orthopédique ostéoarticulaire, d'une pathologie orthopédique musculaire, d'une pathologie orthopédique ligamentaire et d'une pathologie orthopédique tendineuse.

La pathologie orthopédique selon l'invention peut notamment provenir de traumatismes, d'un vieillissement, d'une usure mécanique, ou d'une inflammation d'un tissu musculo-squelettique tel que défini ci-dessus.

En particulier, la pathologie orthopédique selon l'invention est une pathologie ostéoarticulaire, plus particulièrement articulaire, notamment inflammatoire. De manière particulièrement préférée, la pathologie orthopédique selon l'invention est la polyarthrite rhumatoïde ou l'ostéoarthrite.

De préférence, l'individu selon l'invention est un mammifère, plus préférablement il s'agit d'un humain.

Dans un mode de réalisation spécifique, les fibroblastes gingivaux selon l'invention comprennent au moins 75, 80, 90, 95, ou 100% de fibroblastes gingivaux en tant que tels, c'est-à-dire des fibroblastes gingivaux n'ayant subit aucune différenciation, notamment en cellules ayant un phénotype ostéogénique.

Les fibroblastes gingivaux peuvent en outre comprendre des cellules progénitrices, de préférence moins de 25, 20, 15, ou 5 %.

Dans un autre mode de réalisation spécifique, les fibroblastes gingivaux peuvent par exemple être ceux décrits dans Fournier BP et al. (2010) Tissue Eng Part A. 16(9):2891 -9.

Les procédures pour prélever, cultiver, et conserver les fibroblastes gingivaux sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans Naveau et al. (2006) J. Periodontol. 77:238-47 et dans Gogly et al. (2007) Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 27:1984-90. Avantageusement, les fibroblastes gingivaux sont aisément prélevables et cultivables. En outre, les fibroblastes gingivaux présentent une vitesse de croissance importante.

De préférence, les fibroblastes gingivaux utilisés selon l'invention sont autologues, c'est-à-dire qu'ils sont prélevés chez l'individu à qui le produit dérivé de fibroblaste doit être administré. Avantageusement, les fibroblastes gingivaux sont une source quasi illimitée de cellules autologues à administrer. Cependant, les fibroblastes gingivaux peuvent également être allogènes, c'est à dire obtenus à partir d'un autre individu de la même espèce, ou encore hétérologues, c'est-à-dire obtenus à partir d'un individu d'une autre espèce.

Comme on l'entend ici, l'expression "produit dérivé de fibroblaste gingival" se réfère à n'importe quel produit susceptible d'être obtenu à partir de fibroblastes gingivaux en eux-mêmes ou qui contient des sécrétions de fibroblastes gingivaux.

On préfère ainsi que le produit dérivé de fibroblaste gingival selon l'invention soit sélectionné dans le groupe constitué de cellules entières de fibroblastes gingivaux, notamment vivantes, d'une culture de fibroblastes gingivaux, d'un extrait de fibroblaste gingival, et d'un milieu conditionné par des fibroblastes gingivaux.

L'extrait de fibroblaste gingival selon l'invention peut être obtenu par n'importe quelle méthode de fragmentation cellulaire connue de l'homme du métier. En particulier, l'extrait de fibroblaste gingival selon l'invention peut être un extrait membranaire, un extrait cytoplasmique ou un extrait nucléaire.

Le milieu conditionné par des fibroblastes gingivaux selon l'invention se réfère à n'importe quel milieu, tel qu'un milieu liquide de culture de cellule (par exemple le milieu « Dulbecco's Modified Eagle Médium », ou un milieu de culture sans sérum), qui a été mis en contact avec des fibroblastes gingivaux, notamment pour une durée suffisante pour que les fibroblastes gingivaux aient pu sécréter des composés dans le milieu.

L'administration à un individu tel que défini ci-dessus d'un produit dérivé de fibroblaste gingival selon l'invention, de préférence à proximité ou au niveau d'un site corporel à traiter, peut être effectuée par n'importe quelle méthode connue de l'homme du métier. On préférera toutefois, que le produit dérivé de fibroblaste soit administré par injection à un site de défaut orthopédique. Comme on l'entend ici, un site de défaut orthopédique se réfère à toute zone pathologique d'un tissu musculo-squelettique tel que défini ci-dessus.

De préférence, la méthode de prévention ou de traitement d'un individu selon l'invention comprend ou consiste en les étapes suivantes :

- prélever des fibroblastes gingivaux d'un individu ; - cultiver les fibroblastes gingivaux;

- obtenir un produit dérivé de fibroblaste gingival tel que défini ci-dessus à partir des fibroblastes gingivaux cultivés ;

- administrer le produit dérivé de fibroblaste gingival à l'individu.

Lorsque le produit dérivé de fibroblaste gingival est constitué ou comprend des cellules entières, ces cellules peuvent être administrées dans le cadre d'une thérapie cellulaire.

Description des Figures

Figure 1 : Quantification par ELISA de MMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + ΙΙ_1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 )) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL1 )+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par ΓΙΙ_1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 2 : Quantification par ELISA de MMP3 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 )) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par l'IL1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 3 : Quantification par ELISA de MMP7 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par l'IL1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 β)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 4 : Quantification par ELISA de MMP9 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par ΓΙΙ_1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 5 : Quantification par ELISA de TIMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + ΙΙ_1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par ΓΙΙ_1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 6 : Quantification par ELISA du complexe MMP1 /TIMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + ΙΙ_1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 β)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par ΓΙΙ_1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 7 : Quantification par ELISA du complexe MMP3/TIMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 β)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par Γ I L1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 8 : Quantification par ELISA du complexe MMP7/TIMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL1 β)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par Γ I L1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 β)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

Figure 9 : Quantification par ELISA du complexe MMP9/TIMP1 (en ng/ml) dans les fibroblastes gingivaux (hGF), les chondroblastes (Ch), les ostéoblastes (Os), les cellules musculaires striées (CMs), les chondroblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) seuls (Ch(TNFa/IL13)) ou en coculture avec les hGF (Ch(TNFa/IL13)+hGF), les ostéoblastes stimulés par le TNFa (10 ng/ml) seuls (Os(TNFa)) ou en coculture avec les hGF (Os(TNFa)+hGF) et les cellules musculaires striées stimulées par ΓΙΙ_1 β (5 ng/ml) seules (CMs(IL1 3)) ou en coculture avec les hGF (CMs(IL13)+hGF).

EXEMPLE

Cet exemple vise à déterminer si le fibroblaste gingival humain inhibe l'activité de

4 MMP (MMP1 , MMP3, MMP7, MMP9) surexprimées par trois cellules clé du remodelage ostéoarticulaire et des pathologies orthopédiques, notamment ostéoarticulaires et musculaires, à savoir : les cellules cartilagineuses (chondroblastes), les ostéoblastes, et les cellules musculaires (cellules musculaires striées).

Matériel et méthodes

Des cellules clés du remodelage ostéoarticulaire ont été utilisées et mise en culture dans des conditions inflammatoires in vitro :

Chondrocytes humains (c-12710 Promocell)

- Ostéoblaste humains (c-12760 Promocell)

Cellules Musculaires Striées humaines (c-12580 Promocell)

Ces cellules ont été cultivées dans des milieux spécifiques (Promocell) pour chondroblastes, ostéoblastes et cellules musculaires striées. Les cellules ont été cultivées dans la partie inférieure de transwell (Greiner bio-one, réf : 657 641 ). A confluence les cellules ont été stimulées par une cytokine pro-inflammatoire : TNFa (10 ng/ml) pour les ostéoblastes, IL1 β (5 ng/ml) pour les cellules musculaires striées ou l'association de TNFa (10 ng/ml) + IL1 β (5 ng/ml) pour les chondroblastes pendant 24h (Pretzel et al. (2009) Arthritis, Res. Ther. 1 1 :R25 ; Moran et al (2009) Arthritis Res. Ther. 1 1 :R1 13), pour simuler un environnement inflammatoire et permettre l'expression des MMP 1 , 3, 7 et 9 comme dans les tissus pathologiques.

Après cette stimulation, les cellules ont ensuite été mises en cocultures dans un milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium) avec des fibroblastes gingivaux à confluence (partie supérieure du transwell), ou ont été cultivées seules (témoin) pendant 24h. Les surnageants de culture ont été analysés au bout de 24h par ELISA pour quantifier l'effet anti-inflammatoire induit par les fibroblastes gingivaux humains (hGF) sur les chondroblastes (Ch), ostéoblastes (Os) et cellules musculaires striées (CMs). Les quantités de MMPs, de TIMP1 (inhibiteur tissulaire de toutes ces MMPs) ainsi que des complexes MMP/TIMP1 ont été quantifiées par ELISA (R&D). Résultats

La stimulation des ostéoblastes, des cellules musculaires striées et des chondroblastes par les cytokines a entraîné une augmentation de la sécrétion de toutes les MMPs (Figures 1 à 4). La stimulation de ces trois types cellulaires par les cytokines a donc permis de simuler un environnement inflammatoire comme dans les tissus pathologiques.

En coculture avec les hGF, il a été observé que les concentrations de MMP1 , 3, 7, 9 étaient inférieures à celles des cellules cultivées seules après stimulation, et ce pour les trois types cellulaires (ostéoblastes, chondroblastes et cellules musculaires striées) (Figures 1 à 4).

La quantification de TIMP1 dans les hGF a également permis de montrer que TIMP1 est fortement surexprimé dans les hGF (Figure 5).

Il a été observé que les concentrations des complexes TIMP1 /MMP1 , TIMP1 /MMP3, TIMP1/MMP7 et TIMP1/MMP9 étaient plus élevées dans les cocultures avec les hGF que dans les surnageants de culture de cellules témoins. Ces résultats ont donc permis de montrer que le fibroblaste gingival, en surexprimant le TIMP1 , inhibe l'activité des MMP 1 , 3, 7 et 9 sécrétées par les chondroblastes, ostéoblastes et les cellules musculaires striées stimulées par des cytokines pro-inflammatoires.

Ces résultats démontrent donc que les fibroblastes gingivaux sont capables d'inhiber l'activité des MMPs dans un environnement semblable à celui d'une pathologie orthopédique, et qu'ils conviennent donc au traitement d'une telle pathologie.