CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo como principio ativo uma molécula sintetizada análoga da coronaridina . A presente invenção refere-se ainda ao uso da dita composição farmacêutica na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças causadas por protozoários, particularmente as negligenciadas, tais como a leishmaniose .

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

A utilização de produtos de origem vegetal para fins curativos cresceu e se desenvolveu ao longo da história da humanidade. O uso de produtos vegetais na forma de fitoterápicos ganhou destaque devido ao aproveitamento racional da grande biodiversidade existente, que pode levar à descoberta de fármacos quimicamente puros e definidos, com atividades farmacológicas determinadas, que possam ser utilizados diretamente na clinica ou se tornarem ponto de partida para síntese de análogos mais ativos e menos tóxicos .

A classe Dycotiledoneae pertencente ao reino vegetal, abriga famílias vegetais ricas em alcalóides, compostos nitrogenados, usualmente utilizados na medicina popular de diversos povos na forma de drogas brutas, como anti- espasmódico, para hipertensão, como analgésico e antidiarréico, entre outros.

Entretanto, os alcalóides não são restritos apenas às plantas, ocorrendo, também, em animais e microorganismos, e são moléculas bastante promissoras para o uso farmacológico ou, ainda, como esqueleto inicial para a síntese de novas moléculas com elevada eficácia e ausência ou redução de efeitos tóxicos. Um exemplo clássico são os derivados da quina, como a cloroquina, um anti-malárico mais potente do que o alcalóide que lhe deu origem.

Mais especificamente, é feita referência aos alcalóides indólicos . Nesse grupo, encontramos os alcalóides ibogainicos, particularmente encontrados em diversos géneros da família Apocynaceae como Voacanga, Ervatamia, Tabernaemontana e outros.

Em estudos farmacológicos preliminares realizados com a ibogaína isolada, observaram-se efeitos excitatórios em ratos (LAMBERT, 1902 apud POPIK, P & SKOLNICK, P. (1999) . Pharmacology of ibogaine and ibogaine-related alkaloids. The Alkaloids, 52: 197-231.), além de efeitos alucinógenos em cães. Outros estudos demonstraram que a ibogaína poderia ser utilizada como bloqueador na dependência química de narcóticos (morfina e heroína), cocaína, anfetaminas, álcool, nicotina e síndrome de poli-dependência a drogas (Patente US 4.499.096; Patente US 4.587.243; Patente US 4.857.523; Patente US 5.026.697; Patente US 5.152.994).

Entretanto, a ibogaína apresenta efeitos colaterais relevantes, tais como, estimulante, alucinógeno e tremorigênico, que podem limitar o seu uso clínico (LAYER RT, et al. P. Structurally modified ibogaine analogs exhibit differing affinities for NMDA receptors . Eur J Pharmacol. 1996 Aug 8;309 (2) : 159-65. ) Além disso, foi demonstrado que a ibogaína atua no sistema cardiovascular, reduzindo o ritmo dos batimentos cardíacos, produzindo bradicardia (POPIK, P & SKOLNICK, P. (1999) . Pharmacology of ibogaine and ibogaine-related alkaloids. The Alkaloids, 52: 197-231.)

A coronaridina, um outro tipo de alcalóide natural, pertencente ao grupo dos alcalóides indólicos ibogainicos, apresenta efeitos menos tóxicos que a ibogaina, e também possui propriedades farmacológicas relevantes, em especial, anti-tumoral (HENRIQUES AT, et al. Ervatamia coronária: chemical constituents and some pharmacological activities . J Ethnopharmacol . 1995 Jan; 50 ( 1) : 19-25.) , antiinflamatória (RATES, S.M.K.; SCHAPOVAL, E.E.S.; SOUZA, I.A.; & HENRIQUES, A.T. (1993) . Chemical constituents and pharmacological activities of Peschiera australis., Int. J. Pharmacog. 31 (4): 288-294) e bactericida (SHARMA, P. & CORDELL, G. A. (1988). Heyneanine hidroxyindolenine, a new indole alkaloid from Ervatamia coronária var. plena., J. Nat. Prod. 51 (3): 528-531). Ela é encontrada em espécies de Tabernaemontana .

Nos últimos anos, também foi investigado o papel da coronaridina como estimuladora do sistema nervoso central. Já se encontra revelado na técnica que este alcalóide é capaz de diminuir a administração espontânea de morfina, cocaína, etanol e nicotina, por animais de laboratório (GLICK, S. D.; KUEHNE, M. E . ; RAUCCI, J. et al (1994). Effects of iboga alkaloids on morphine and cocaine self- administration in rats: relationship to tremorigenic effects and to dopamine release in nucleus accumbens and striatum. Brain Research. 657: 14-22).

Além disso, mostra-se interessante a possibilidade de desenvolvimento de composições à base de alcalóides indólicos visando tratar e/ou erradicar doenças causadas por protozoários, em especial aquelas negligenciadas, que se tornam um grave problema de saúde pública de prevalência mundial .

Nesse aspecto, o tratamento de doenças causadas por protozoários, particularmente as negligenciadas, tais como a leishmaniose é uma necessidade urgente e premente de interesse público. Um aspecto relevante da epidemiologia das leishmanioses se deve ao fato do inseto vetor da doença apresentar uma grande capacidade de adaptação a áreas com características diferentes. Outro aspecto relacionado consiste no fato de que nos últimos anos, há uma real incidência da doença em regiões metropolitanas. Isto pode estar relacionado ao fato de que o vetor deste patógeno está em franca domiciliação (PETERSON AT, PEREIRA RS, NEVES VF. Using epidemiological survey data to infer geographic distributions of leishmaniasis vector species. Rev Soe Bras Med Trop. 2004 Jan-Feb; 37 ( 1 ) : 10- ) , bem como a grande incidência em cães domésticos que, no ambiente urbano, se comporta como reservatório do parasito (MARGONARI C, FREITAS CR, RIBEIRO RC, MOURA AC, TIMBÓ M, GRIPP AH, PESSANHA JE, DIAS ES. Epidemiology of visceral leishmaniasis through spatial analysis, in Belo Horizonte municipality, state of Minas Gerais, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz. 2006 Feb; 101 ( 1 ): 31-8. Epub 2006 May 12).

As leishmanioses formam uma síndrome clínica que pode se manifestar de várias maneiras, dependendo da espécie do parasito que está causando a infecção e do sistema imunológico do hospedeiro. Estas formas clínicas podem ser divididas em dois grupos principais: a forma tegumentar e a forma visceral.

A leishmaniose cutânea localizada é uma variação da leishmaiose tegumentar e é causada pelas espécies L. major, L. trópica, L. mexicana, L. amazonensis, L. pifanoi, L.venezuelensis, L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis entre outras. As lesões cutâneas são ricas em parasitas e podem apresentar-se como placas endurecidas, nódulos ou pápulas localizadas em qualquer parte do corpo do paciente, mais especificamente, nas áreas de mucosas, como a nasal e a oral. As ulcerações podem ser rasas ou profundas podendo progredir para cura após 1 a 18 meses. Em casos avançados, as lesões mucosas são ulcerativas e indolores, com destruição do septo nasal e do dorso do nariz e da orelha.

A leishmaniose visceral ou Kala-azar (febre negra), é causada por L. donovani , L. infantum e L. chagasi (BERMAN, J.D. (1997). Human leishmaniasis : Clinicai, diagnostic and chemotherapeutic developments in the last 10 years., Clin. Infect. Dis. 24: 684-703). Esta é a forma mais grave da doença, evoluindo para o óbito em quase 100% dos casos não tratados, principalmente em crianças.

O controle das leishmanioses está baseado em medidas profiláticas de combate ao vetor e ao extermínio de cães infectados, bem como, no tratamento dos indivíduos infectados com diversos fármacos disponíveis no mercado.

Os fármacos que estão no mercado apresentam uma série de problemas, como resistência do parasito, alta toxicidade com consequente indução de efeitos colaterais (tosse, dor no peito e depressão) , que limitam a sua utilização e, principalmente, sua eficácia.

Além disso, todos os fármacos disponíveis na maior parte dos países atingidos pela doença são de administração parenteral, o que exige colaboração do paciente; e, infelizmente, muitos abandonam o tratamento, fato que favorece o aparecimento de cepas resistentes.

O fármaco mais utilizado para o tratamento das leishmanioses é o Antimoniato de N-Metil-Glucamina . Na tentativa de reduzir os efeitos tóxicos/colaterias e melhorar a biodisponibilidade do fármaco, foi introduzido uma modificação farmacotécnica, que é a forma lipossomal do Glucantime (BERMAN, J.D. Chemotherapy for leishmaniasis: biochemical mechanisms, clinicai efficacy and future strategies .Rev. Infect. Dis., v.10, p. 560-586,1988). Em geral, tais antimoniais pentavalentes são bem tolerados, mas ainda são perceptíveis reações colaterais como dores no local da injeção, disfunção gastrointestinal, dores musculares difusas, enrij ecimento das articulações e arritmias. Também foi observada elevação das transaminases hepáticas, muito embora de uma maneira reversível com o fim do tratamento (TRACY, J.W. & WEBSTER Jr . , L.T. Drugs used in the chemotherapy of protozoal infections : Trypasonomiasis , Leishmaniasis, Amebiasis, Giardiasis, Trichomoniaisis and other protozoal infections. In: Hardman, J.G.; Gilman, A.G. & Limbird, L.E., ed. Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics - 9th edition. McGraw-Hill Companies, Inc. ( Publishers ) . 1996: 987-1008) . Além disso, Gasser e colaboradores (1994) relataram casos de pancreatite em pacientes com leishmaniose cutânea tratados com Pentostan® e Glucantime®.

Outro problema em relação à utilização de antimoniais é o aparecimento de cepas resistentes, o que limita a utilização desta droga e facilita ainda mais o agravamento dessa endemia (HADIGHI, R; BOUCHER, P; KHAMESIPOUR, A et al. (2007). Glucantime-resistant Leishmania trópica isolated from Iranian patients with cutaneous leishmaniasis are sensitive to alternative antileishmania drugs. Parasitol Res. 101 ( 5 ) : 1319-22 ) .

Alternativamente, ainda no âmbito dos fármacos químicos sintetizados, encontra-se a Anfotericina B (deoxicolato) . Antibiótico poliênico com atividade anti- fúngica e leishmanicida .

O uso clínico de Anfotericina B é recomendado para os casos severos de leishmaniose não-responsiva ao tratamento convencional, com ameaça de vida para o paciente. Seu uso é bastante restrito devido aos inúmeros efeitos tóxicos que apresenta, como febre, calafrio, hipotensão ou hipertensão, diminuição da função renal e dos níveis séricos de potássio (SINGODIA, D. et al. Development and performance evaluation of Anphotericim B transferosomes against resistant and sensitive clinicai isolates of visceral leishmaniasis . J. Biomed. Nanothecnol . , 2010, 6 (3) :293-302) .

Visando diminuir a toxicidade das drogas até então conhecidas, com a respectiva redução dos efeitos colaterais, foram desenvolvidas algumas novas composições farmacêuticas. Entretanto, embora tais drogas apresentem redução de efeitos colaterais, possuem um elevado custo, o que constitui um fator limitante para sua utilização, em especial em países pobres .

Em vista do cenário acima mencionado, mostra-se premente a busca por drogas que conciliem a eficácia com um custo acessível à população, sendo que os fitoterápicos apresentam-se como uma alternativa promissora.

Encontram-se na literatura alguns poucos documentos que remetem ao uso in vitro de alcalóides indólicos para o tratamento da leishmaniose.

O documento BR PI9804032-4 é um exemplo e descreve a obtenção de um extrato bruto a partir de uma espécie vegetal da família das Apocynaceae, sendo a espécie vegetal a Peschiera australis . Particularmente, o referido documento menciona o uso de alcalóides indólicos como, por exemplo, a coronaridina e a voacangina para o tratamento da leishmaniose. Mais especificamente, o presente documento BR PI9804032 revela uma composição farmacêutica para uso no tratamento da leishmaniose em mamíferos, compreendendo uma fração alcaloídica extraída de P. australis em uma concentração de até 600mg/g, aditivos e um veículo farmaceuticamente aceitável. Porém, é sabido que o rendimento dos alcalóides quando extraídos do extrato bruto é bastante reduzido, o que limita a sua utilização in natura. Embora a fração enriquecida do extrato, como no caso do documento BR PI 9804032-4, venha a reduzir a dificuldade com o rendimento, a citotoxidade dessa fração enriquecida é muito elevada, comprometendo o seu uso in vivo.

Outra referência é encontrada no pedido de patente WO 2006/029523, no qual são reveladas composições anti- parasitárias (incluindo contra leishmaniose), anti-virais e anti-microbianas contendo extrato de P. fuchsiaefolia ou voacamina e/ou seus derivados sintéticos e naturais, que incluiriam a coronaridina .

Aqueles com conhecimento na técnica irão perceber que em relação à leishmaniose, somente há exemplos com os resultados de testes in vitro e apenas do extrato de P. fuchsiaefolia e de voacamina purificada, contra formas promastigotas de Leishmania infantum.

Em vista dos grandes obstáculos apontados pelos fármacos comerciais para o tratamento da leishmaniose, bem como, pelos problemas ainda não solucionados pelo uso da técnica alternativa acima descrita, é possível identificar ainda uma necessidade de se buscar uma droga que supere tais problemas.

Uma alternativa encontrada foi sintetizar e usar um análogo da coronaridina que apresentasse as características farmacológicas e toxicológicas desejadas, com a apresentação de efeitos surpreendentes e inesperados in vivo.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se à obtenção de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmacologicamente ativa de uma substância sintetizada em laboratório, modificada a partir de um alcalóide obtido a partir de uma espécie vegetal ou, ainda, obtido sinteticamente em laboratório, e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável. A presente invenção refere-se ainda ao uso da dita composição farmacêutica na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças causadas por protozoários, particularmente para o tratamento da leishmaniose .

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a histologia de baço e fígado de animais controle infectados. Características: Coloração Hematoxilina-Eosina. (100X e 200X)

A Figura 2A mostra um corte histológico de baço e a

Figura 2B mostra o corte histológico do fígado de animais infectados e tratados com 20mg/Kg/dia de 18-MC. Características: Coloração Hematoxilina-Eosina. Aumento: A: 50X e B: 200X.

A Figura 3A mostra a histologia de coração de animais infectados apenas e a Figura 3B mostra a histologia de coração de animais e infectados e tratados com 18-MC (B) . Características: Coloração: Hematoxilina-Eosina. Aumento: 20X.

A Figura 4A mostra a análise histológica da região cortical do rim de animais infectados não tratados (CTRL) e a Figura 4B mostra a análise histológica da região medular do rim de animais infectados não tratados (CTRL) . Características: Coloração Hematoxilina-Eosina. Aumento: 200X.

A Figura 5A mostra a análise histológica região cortical do rim de animais infectados e tratados com 18-MC e a Figura 5B mostra a análise histológica da região medular do rim de animais infectados tratados com 18-MC Características: Coloração Hematoxilina-Eosina . Aumento: 200X.

A Figura 6 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via oral. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo específico. O to corresponde ao sangue coletado 30 minutos após a administração oral do fármaco, pois os mesmos foram anestesiados após 15 minutos de ingestão oral deste para realizar a canulação da artéria e da veia femurais . Dessa forma, tis corresponde a 45 minutos após a administração, t3o a 60 minutos, t6o 90 minutos, tgo a 120 minutos e t ₁₂ o a 180 minutos após administração do fármaco. p<_ 0.05

A Figura 7 é a apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na Figura 6. p< 0,01.

A Figura 8 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via intravenosa. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo específico. O to corresponde ao sangue coletado antes da administração do fármaco. As coletas foram realizadas 15 minutos após a administração do fármaco e a cada 30 minutos subsequente até 120 minutos. p< 0.05.

A Figura 9 é apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na Figura 8. p< 0,01.

A Figura 10 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via oral. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo específico. O to corresponde ao sangue coletado 30 minutos após a administração oral do fármaco, pois os mesmos foram anestesiados após 15 minutos de ingestão oral do fármaco para realizar a canulação da artéria e da veia femurais . Dessa forma, tis corresponde a 45 minutos após a administração, t3o a 60 minutos, tço 90 minutos, t9 ₀ 120 minutos e ti2o a 180 minutos após administração do fármaco. P< 0.01.

A Figura 11 é apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 10. P< 0,01.

A Figura 12 representa o tratamento de cinco Ratos

Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via intravenosa. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado antes da administração do fármaco. As coletas foram realizadas 15 minutos após a administração do fármaco e a cada 30 minutos subsequente até 120 minutos. P< 0.01.

A Figura 13 é a _o apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 12. p< 0,01.

A Figura 14 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via oral. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O t ₀ corresponde ao sangue coletado 30 minutos após a administração oral do fármaco, pois os mesmos foram anestesiados após 15 minutos de ingestão oral do fármaco para realizar a canulação da artéria e da veia femurais. Dessa forma, tis corresponde a 45 minutos após a administração, t ₃₀ a 60 minutos, t6o 90 minutos, tgo a 120 minutos e ti2o 180 minutos após administração do fármaco. p< 0.01.

A Figura 15 é a apresentação da Média +_ Erro Padrão dos dados mostrados na figura 14. p< 0,01.

A Figura 16 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via intravenosa. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado antes da administração do fármaco. As coletas foram realizadas 15 minutos após a administração do fármaco e a cada 30 minutos subsequente até 120 minutos. p< 0.01. A Figura 17 é a apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 16. p< 0,01.

A Figura 18 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via oral. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado 30 minutos após a administração oral do fármaco, pois os mesmos foram anestesiados após 15 minutos de ingestão oral do fármaco para realizar a canulação da artéria e da veia femural. Dessa forma, tis corresponde a 45 minutos após a administração, t3o a 60 minutos, t6o a 90 minutos, tgo a 120 minutos e ti2o a 180 minutos após administração do fármaco. p< 0.05.

A Figura 19 é a apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 18. p< 0,01.

A Figura 20 representa o tratamento de cinco Ratos Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via intravenosa. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado antes da administração do fármaco. As coletas foram realizadas 15 minutos após a administração do fármaco e a cada 30 minutos subsequente até 120 minutos. p< 0.01.

A Figura 21 é apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 20. p< 0,01.

A Figura 22 representa o tratamento de cinco Ratos

Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via oral. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado 30 minutos após a administração oral do fármaco, pois os mesmos foram anestesiados após 15 minutos de ingestão oral do fármaco para realizar a canulação da artéria e da veia femurais . Dessa forma, tis corresponde · a- 45 minutos após a administração, t3o a 60 minutos, t6o a 90 minutos, tgo a 120 minutos e t^o a 180 minutos após administração do fármaco. p< 0.05.

A Figura 23 é apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 22. p< 0,05.

A Figura 24 representa o tratamento de cinco Ratos

Wistar com 10mg/kg de 18-MC por via intravenosa. Cada ponto corresponde a um animal tratado no tempo especifico. O to corresponde ao sangue coletado antes da administração do fármaco. As coletas foram realizadas 15 minutos após a administração do fármaco e a cada 30 minutos subsequente até 120 minutos. p< 0.01.

A Figura 25 é apresentação da Média + Erro Padrão dos dados mostrados na figura 24. p< 0,01.

A Figura 26A mostra a análise histológica do cérebro e a Figura 26B mostra a análise histológica do baço de animais tratados com 200mg/Kg de 18-MC, não evidenciando alterações morfológicas quando esses animais foram tratados com doses tóxicas de 18-MC. (A) Aumento: 100X. (B) Aumento: 50X. Coloração: Hematoxilina-Eosina .

A Figura 27A mostra os cortes histológicos de Rim de animais CTRL. A Figura 27B mostra os cortes histológicos de Rim de animais tratados com 200mg/Kg de 18-MC e a Figura 27C mostra os cortes histológicos de Rim de animais tratados com 300mg/Kg de 18-MC. É possível observar o colabamento das cápsulas de Bowman nos animais tratados, o que poderia justificar alguns dos efeitos tóxicos observados nessas concentrações. Coloração: Hematoxilina- Eosina. Aumento: 200X.

A Figura 28 mostra o corte histológico de fígado de animal tratado com 200mg/Kg de 18-MC. As setas finas sugerem aumento do núcleo e possível condensação da cromatina e a seta larga indica possível retração celular, uma vez que o parênquima hepático se caracteriza por um tecido homogênio. Coloração: Hematoxilina-Eosina . Aumento:

200X.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmacologicamente ativa de uma substância sintetizada, modificada de um alcalóide obtido a partir de um extrato de uma espécie vegetal e pelo menos um veiculo farmaceuticamente aceitável. Especificamente o alcalóide natural pertence ao grupo dos alcalóides ibogaínicos .

Para uma concretização preferencial da presente invenção, a fração alcaloidica é enriquecida de alcalóides do grupo dos alcalóides indólicos, e encontrado em espécies da família Apocynaceae, mais especificamente em espécies do género Tabernaemontana _r especificamente a T. australis, também conhecida como Peschiera australis e em T. catharínensis e, ainda mais preferencialmente, referido alcalóide é uma coronaridina ou seu análogo. Ainda mais preferencialmente, o seu análogo é a 18-metoxicoronaridina (18-MC) .

Adicionalmente, as espécies que podem fornecer material de partida para síntese de análogos de coronaridina são as espécies selecionadas do género Tabernaemontana . Mais especificamente, as espécies T. australis, T. hilariana e T. von hurkii, T. affinis, T. fuchsifolia além de Ervatamia coronária.

Para a composição farmacêutica objeto da presente concretização, os veículos farmaceuticamente aceitáveis para associação com o referido princípio ativo são selecionados dentre o grupo das substâncias excipientes não tóxicas e inativas, tais como substâncias diluentes, solubilizantes , espessantes, lubrificante, conservantes, corantes, tampões, edulcorantes , corantes, flavorizantes , agentes de redução, agentes espessantes, agentes sequestrantes, tensoativos, componentes para o ajuste de pH, etc . ) .

A seleção dos excipientes será feita de acordo com a forma farmacêutica de apresentação da referida composição.

No caso de a forma farmacêutica da composição da invenção ser cápsula, ela pode incluir um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindo de: diluente (tal como amido, maltodextrina, lactose ou outros), absorvente (tal como dióxido de silício coloidal, trióxido de silício coloidal ou outros) e lubrificante (estearato de magnésio, laurilsulfato de sódio ou outros).

No caso de a forma farmacêutica da composição da invenção ser uma solução ou suspensão de administração oral, o veículo farmaceuticamente aceitável pode incluir solventes e co-solventes , tampões, conservantes, edulcorantes, corantes, flavorizantes , adoçantes, agentes de redução, agentes espessantes, agentes sequestrantes, tensoativos, componentes para o ajuste de pH (por exemplo, ácido cítrico, ácido clorídrico, hidróxido de sódio) , agentes de suspensão, antioxidantes, dentre outros.

Para a presente concretização, os solventes ou meios de suspensão podem ser: água purificada e/ou outros solventes hidrofílicos (por exemplo, etanol, DMSO, propileno glicol, PEG) ou hidrofóbicos (por exemplo, óleos ) .

Para a presente concretização, os co-solventes podem ser: etanol, propileno glicol, glicerol, sorbitol dentre outros. Os conservantes podem ser: fenóis, parabenos, ácido benzóico, hidantoína. Para a presente concretização, os agentes redutores podem ser: vitamina E, ácido ascórbico, ácido cítrico etc. Quanto aos agentes tensoativos podem-se usar os polisorbatos ; para os agentes espessantes podem-se usar propilenoglicol, sorbitol e glicerina; para os agentes edulcorantes podem-se usar sucralose, ciclamato ou aspartame .

No caso de a forma farmacêutica da composição da invenção ser comprimido, ela pode incluir um ou mais excipientes selecionados do grupo consistindo de: diluentes (Celulose microcristalina, amido, amido pré-gelatinizado, maltodextrina, lactose, carbonato de cálcio, fosfato dibásico de cálcio, fosfato tribásico de cálcio, sulfato de cálcio, celulose microcristalina) , absorventes (dióxido de silício coloidal, trióxido de silício coloidal) ; aglutinantes (Polivinilpirrolidona, celulose microcristalina, metilcelulose , hidroxipropilcelulose , hidroxipropil metilcelulose, goma arábica) ; desintegrantes ( croascarmelose sódica, crospovidona, amido, lactose, carboxi metil amido, manitol, sorbitol, amidoglicolato) ; aromatizantes (aromas naturais e sintéticos), flavorizantes (sacarina, aspartame, sucralose); molhantes (lauril sulfato de sódio) , tampões (Carbonato de cálcio, fosfatos alcalinos), moduladores de dissolução (ciclodextrinas, sorbitol, PVP, manitol) e lubrificante (talco, estearato de magnésio) .

Cabe salientar que a presente invenção não está limitada às substâncias acima descritas. Uma pessoa com conhecimento na técnica é capaz de substituir qualquer uma das substâncias acima descritas, por outra equivalente, desde que essa substância apresente características funcionais semelhantes àquela que vai substituir, e ainda, que cada excipiente e/ou aditivo escolhido esteja dentro das exigências de qualidade para uso humano e veterinário estabelecidas pelas autoridades competentes.

De uma maneira genérica, para a presente invenção, o principio ativo da referida composição farmacêutica compreende um fármaco sintético, preferencialmente produzido/administrado na forma de um sal, possibilitando uma maior solubilidade em água e proporcionando uma maior facilidade no processo de produção do medicamento, ora também objeto da presente concretização.

Especificamente, os sais que podem ser utilizados na presente invenção são os sais combinados, dentre os quais citamos os sais de cloro, bromo, iodo, fósforo dentre outros. Particularmente, para uma das concretizações da presente invenção, o sal selecionado para ser utilizado foi o cloridrato.

A composição farmacêutica objeto da presente concretização é destinada ao uso no tratamento de diferentes formas clínicas das leishmanioses , causadas pelas diferentes espécies implicadas como agentes etiológicos tanto no Velho Mundo quanto no Novo Mundo, tanto para as formas tegumentares (cutânea localizada, cutânea difusa, mucocutânea, disseminada) quanto viscerais.

Particularmente, em relação às formas de leishmaniose causadas pelas espécies Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis, Leishmania infantum, Leishmania chagasi Leishmania mexicana , Leishmania major, Leishmania panamensis, Leishmania guyanensis, Leishmania donovani , Leishmania trópica, Leishmania pifanoi, Leishmania aethiopica , Leishmania lainsoni , Leishmania venezuelensis , Leishmania shawi, Leishmania naffi, Leishmania lindenberg, dentre outras. A presente invenção refere-se, ainda, ao uso da dita composição farmacêutica na preparação de um medicamento para o tratamento de leishmaniose.

O efeito leishmanicida da 18-metoxicoronaridina (18-MC) foi observado, em particular, para a espécie Leishmania amazonensis, espécie causadora da leishmania tegumentar americana (LTA) . Entretanto, é possível estender sua ação para todas as outras espécies do parasito, especialmente L. braziliensis e L. chagasi, uma vez que o fármaco parece atuar em uma via metabólica comum a todas as espécies do patógeno.

A avaliação da 18-metoxicoronaridina mostrou resultados satisfatórios e superiores ao uso do fármaco padrão, Glucantine (GLU) e a atividade leishmanicida da 18-metoxicoronaridina foi surpreendentemente superior ao da coronaridina natural e sintética. Outro aspecto importante e, que demonstra a vantagem do uso da 18-metoxicoronaridina como princípio ativo da composição farmacêutica objeto da presente invenção, é o fato desta apresentar menor grau de toxicidade frente à coronaridina.

Como já antecipado, um segundo objetivo da presente concretização consiste no uso da composição farmacêutica compreendendo como princípio ativo a 18-metoxicoronaridina na preparação de medicamento para tratar infecções causadas por protozoários. Particularmente, a 18-metoxicoronaridina pode ser usada para tratar doenças causadas pelo género Leishmania. Mais particularmente, referido medicamento apresenta eficácia de aproximadamente 99% no tratamento das leishmanioses , em especial da leishmaniose tegumentar americana (LTA) .

Em relação ao referido medicamento, esse é indicado para aplicação humana e/ou veterinária. A forma farmacêutica do referido medicamento pode ser selecionada dentre as formas sólidas e/ou liquidas. Particularmente no caso de forma sólida, referido medicamento pode estar na forma de comprimidos (revestidos ou não), cápsulas, drágeas, grânulos, hóstias, pós ou pílulas. Quando na forma farmacêutica líquida, referido medicamento pode estar nas formas de soluções, emulsões, suspensões, xaropes, colutórios e etc.

Particularmente para a presente invenção, uma forma farmacêutica de uso oral é a forma farmacêutica preferencial de apresentação do referido medicamento.

A amostra da molécula de 18-MC foi obtida por meio de métodos usuais da técnica, conforme protocolo ^■ de obtenção aprimorado da empresa Obiter Research, LLC e que por esse motivo não será aqui detalhado. Entretanto, de forma geral, a referida empresa desenvolveu uma metodologia de síntese que reduz as diferentes etapas do processo usual proposto por Kuehne et al (1999), sendo que a proposição inicial era uma síntese compreendendo mais de duas dezenas de etapas, sendo reduzida para pouco mais de 10, reduzindo custo e tempo de produção. Além disso, a empresa conseguiu obter um composto mais estável na forma de cloridrato.

A referida molécula 18-MC ora obtida pelo protocolo da empresa Obiter Research, LLC, apresenta como particularidade um maior grau de pureza, o que possibilitou a redução da concentração do fármaco durante os experimentos .

Os seguintes exemplos são ilustrativos da presente invenção e representam concretizações preferidas. Aqueles versados na técnica saberão ou estarão aptos a encontrar, usando não mais do que experimentação de rotina, outros materiais, métodos e concentrações apropriados. Exemplo 1: Atividade Leishmanicida

O modelo de infecção e tratamento utilizado nessa análise da atividade leishmanicida in vivo é conhecido da técnica conforme proposto por Le Fichoux et al (1998), e reflete o tratamento de uma infecção recente, após uma semana de infecção, ou seja, inoculação da forma promastigota de L. amazonensis (1.10 ⁷ ) no hospedeiro.

De uma forma geral, o medicamento ora objeto da presente concretização, pode ser administrado por via oral, em doses únicas diárias durante um período mínimo de 5 dias. Entretanto, conforme a necessidade, referido medicamento pode ter seu uso estendido para o tempo máximo recomendado pelo Ministério da Saúde para os Antimoniais que é de 35 dias.

A posologia administrada poderá ser prescrita de acordo com o peso do indivíduo a ser tratado ou ainda levando em consideração a idade do indivíduo. Mais especificamente, o tratamento prescrito pode variar entre cerca de 0.4 - 60 mg/kg da composição farmacêutica a base de 18-MC. Mais especificamente, inicialmente a dosagem preferencial a ser fornecida ao indivíduo sobre tratamento é de cerca de 0.6 - 30 mg/kg; mais particularmente, de cerca de 0.8 - 20 mg/kg; mais particularmente, de cerca de 1.0 - 10 mg/kg. Para uma concretização preferencial da presente invenção, a dosagem inicial preferencial a ser fornecida ao indivíduo sobre tratamento é de cerca de 1.6 mg/kg .

Especificamente, para uma concretização preferencial da presente invenção, camundongos BALB/C foram infectados com 10 ⁷ promastigotas de L. amazonensis em fase metacíclica e o tratamento ocorreu 7 dias após a infecção, com a administração de cerca de 15 - 35 mg/Kg/dia da composição farmacêutica à base de 18-MC, tendo sido o tratamento realizado por 5 dias consecutivos. Mais particularmente, os camundongos foram tratados com cerca de 10 - 30 mg/Kg/dia da composição farmacêutica à base de 18-MC e, ainda mais preferencialmente, a dose administrada aos camundongos foi de cerca de 20mg/Kg/dia.

A via de administração da composição de 18- MC é preferencialmente oral (VO) , podendo também ser utilizada a via intraperitoneal (IP) e intralesional (IL) . Ao grupo controle positivo foi administrada cerca de 400 mg/Kg/dia de GLUCANTIME (GLU) , o qual foi administrado somente por via intraperitoneal (IP), uma vez que GLU perde sua atividade quando administrado por VO.

O estudo foi realizado por meio da divisão em 3 grupos, cada um compreendendo 4 animais infectados, conforme a seguir:

O Grupo I compreendendo animais infectados foi tratado com DMSO 5%. O Grupo II compreendendo os animais infectados foi tratado com a forma insolúvel em água de 18- MC (18- MC I) e o Grupo III compreendendo os animais infectados foi tratado com a forma solúvel em água de 18 - MC (18- MC (S) . Na Tabela I são apresentados os resultados representativos obtidos em um primeiro experimento realizado. Neste experimento os resultados não foram comparados ao Glucantime .

Tabela I - Avaliação da atividade leishmanicida de 18-MC

TRATAMENTO N° PARASITOS (IO ⁴ ) % INIBIÇÃO

CTRL DMSO 5% 40

18-MC I 20mg/Kg 7,6 81

18-MC S 20mg/Kg 3,6 91

Durante o experimento foi avaliada também se haveria alguma diferença na utilização de 18-MC na forma de base livre e de sal, sendo dessa forma, 18-MC. HC1 (solúvel em água) . De forma surpreendente e inesperada, a atividade leishmanicida foi pronunciada e em níveis melhores do que os conhecidos no estado da técnica, uma vez que a concentração do fármaco foi reduzida à metade. A forma não salina de 18-MC foi menos ativa e esse efeito é associado às dificuldades no transporte pelo trato digestivo.

Além disso, embora tenha sido observada uma expressiva redução da carga parasitária dos animais tratados, o fármaco foi incapaz de produzir cura estéril.

Quando a atividade leishmanicida de 18-MC foi determinada em modelo de infecção estabelecida (crónica) , os resultados observados foram ainda mais relevantes.

Nessa concretização, os camundongos BALB/C foram infectados com 5.10 ⁶ promastigotas/animal de L. amazonensis em fase estacionária de crescimento e o tratamento foi iniciado no trigésimo dia (D30) após a infecção. Neste caso, cerca de 20mg/Kg/dia de 18-MC. HC1 foi administrado por meio da via oral a um primeiro grupo de animais durante o período de cinco dias consecutivos, enquanto dois outros grupos receberam tratamento pela administração de 200mg/kg/dia de GLU por meio da via intraperitonial e/ou 200mg/kg/dia de água corrente por meio da via intraperitonial (Grupo controle negativo) . Os resultados de redução da carga parasitária podem ser observados na Tabela II, onde os resultados estão expressos em relação aos controles negativos (não tratados) que receberam apenas água corrente.

Tabela II - Avaliação da atividade leishmanicida de 18-MC

Redução Carga Parasitária

Tratamento

Fármaco Pata Linfonodo

[mg/kg . dia] CTRL 54,6 0 65, 5 0

GLU 200 IP 0, 55* 99 0,13* 99, 8

18-MC 20 VO 0, 15* 99,7 0, 12* 99, 9

* p < 0,001 para os testes de Tukey, Dunnett e Student

É importante destacar que este modelo de infecção estabelecida (crónica) é o que melhor mimetiza o que acontece no ser humano, uma vez que somente com a infecção estabelecida e com o aparecimento das lesões é que o individuo busca assistência médica e o tratamento adequado.

Com o intuito de observar o aparecimento de cura estéril nos animais infectados no modelo crónico, o tratamento com 18-MC foi duplicado, ou seja, os animais foram tratados com cerca de 10 ou 20mg/Kg/dia, por meio da administração por via oral por um período preferencial de 10 dias consecutivos. Os resultados podem ser observados na Tabela III.

Tabela III - Avaliação da atividade leishmanicida de 18-MC

Tratamento Fármaco [mg/kg. dia] Pata

N° Parasitos

(x IO ⁴ ) o.

o

CTRL 423 0

GLU 200 IP 2,43* 99, 40

18-MC 10 VO 0,34* 99, 91

18-MC 20 VO 0,074* 99, 98

* p < 0,05 pelos testes Tukey e Dunnett

Após a eutanásia, os órgãos de animais infectados e tratados com 18-MC foram coletados para análise de possíveis alterações histopatológicas induzidas pelo fármaco na dose terapêutica, ou seja, 20mg/Kg/dia.

Os órgãos coletados foram: baço, cérebro, coração, fígado, pulmão e rim. As Figuras 1 e 2 mostram cortes histológicos de baço e fígado de animais controle e tratados com o fármaco à base da molécula de 18-MC, respectivamente . Por meio da análise das referidas Figuras, aqueles com conhecimento na técnica percebem que, em dose terapêutica, o fármaco não provocou qualquer alteração macroestrutural destes órgãos, bem como na arquitetura tecidual, revelando um tecido homogéneo, com suas características histológicas preservadas quando comparadas com os animais controle.

Na histografia do baço, pode-se perceber que, tanto a polpa branca quanto a vermelha são bem visualizadas, e não apresentam sinais de indução de resposta imunológica diferentes entre animais tratados e controle.

Da mesma maneira, outros órgãos de animais infectados e tratados com o medicamento/ fármaco à base da molécula 18- C foram avaliados do ponto de vista histológico e não apresentaram qualquer alteração morfológica que possa ser atribuída aos fármacos .

Na Figura 3 é possível observar a morfologia típica do coração de um animal controle (A) com suas fibras cardíacas bem preservadas e de um animal tratado com 20mg/Kg/dia de 18-MC (B) apresentando a mesma morfologia típica do tecido do animal controle.

Nas Figuras 4 e 5 é possível observar a morfologia típica das estruturas renais dos animais infectados, não tratados (CTRL) e tratados com 18-MC, respectivamente. Quando comparados com os controles, os tecidos dos animais tratados não apresentaram qualquer alteração, tanto na região cortical quanto medular, evidenciando, que na dose em que o efeito leishmanicida é observado não há toxicidade para esse órgão.

Para a avaliação bioquímica em soro de ratos tratados com 18-MC nas doses terapêuticas, ratos Wistar foram submetidos à cirurgia (livre de sofrimento e dor) para colocação de cateter na veia e artéria femurais para administração de 18-MC endovenoso (veia) e coleta de sangue em diversos tempos (artéria) .

Os experimentos foram conduzidos usando uma única dose de 18-MC na concentração de 10mg/Kg. A vias de administração foram endovenosa e oral (nesse caso, 18-MC foi administrada 30 minutos antes de iniciar o processo de coleta de sangue, ou seja, no tratamento por via oral, o To correspondeu a 30 minutos após o tratamento) . O sangue desses animais foi coletado em diferentes tempos e submetido a dosagens bioquímicas de AST, ALT, Glicose, Colesterol e Triglicerídeos .

Alterações nesses parâmetros poderiam ser sugestivas de alguma toxidade, mesmo em doses baixas do fármaco. Nenhuma alteração significativa foi observada nas dosagens realizadas. Nas Figuras 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 os resultados são expressos em dispersão de pontos em que cada ponto refere-se a um animal e é evidenciada a mediana dos dados. Por outro lado, nas Figuras 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e 21, os dados de cada parâmetro administrado por via oral ou endovenosa são expressos em média + erro padrão dos animais tratados .

A única alteração nos dados bioquímicos que teve maior relevância foi a elevação da concentração de glicose logo após o tratamento. Essa elevação atingiu seu ponto máximo em 60 (IV) e 90 minutos (VO) do tratamento com o fármaco, retornando aos níveis normais nos últimos tempos avaliados. O retorno de tais níveis para os níveis anteriores ao tratamento é indicativo de que o fármaco pode ser usado com segurança .

Desta forma, em doses usadas para o tratamento dos animais infectados (dita terapêutica) não foram observadas qualquer alteração morfológica em órgãos vitais ou em parâmetros bioquímicos importantes . Ά avaliação da toxicidade aguda em animais tratados com 18-MC obedeceu ao protocolo usual da técnica, proposto pela OECD - Organization for Economic Co-operation and Development - e recomendado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) , usando machos e fêmeas de camundongos BALB/c de mesma ninhada em cada experimento (ANVISA, 2010 e OECD, 2001).

O fármaco apresentou toxidade variada e óbito nas doses mais elevadas. Entretanto, essas doses foram, pelo menos, 10 vezes maior do que a terapêutica.

No Quadro 1 é possível observar as informações oriundas do tratamento em doses elevadas de 18-MC.

Quadro 1 - Avaliação temporal dos animais tratados com 18-MC em doses elevadas. 18-MC foi administrada em dose única nas concentrações de 50, 100, 200 e 300mg/Kg VO. m - machos e f - fêmeas. Aos animais do Grupo Controle foi administrada água potável pela mesma via de administração.

18-MC 200mg/Kg (n=7 3 f Fêmeas

fêmeas e 4 machos) 4 m I ^a hora: Animais prostrados;

dois apresentaram diarréia; aumento da ingesta de água. Um dos animais em ¹ estágio de caquexia .

A partir da 2 ^a hora: um dos animais apresentou quadro convulsivo e evoluiu para o óbito 2:30 após o tratamento. O segundo e terceiro animais estavam letárgicos e não responsivos a estímulos. Os outros estavam normais.

Após 2 dias: o segundo e terceiro animais foram a óbito, apresentando quadro de hemorragia interna. Após 7 dias : os animais que sobreviveram, estavam normais .

Machos

Apresentaram convulsão, tremor e descoordenação motora nas primeiras horas após o tratamento. Todos evoluíram para óbito após 180 minutos. Os sinais anteriores ao óbito foram tremores, prostração e convulsão. A necropsia dos animais não revelou alteração orgânica que justificasse a convulsão.

De acordo com os experimentos de toxicidade aguda, os animais machos foram mais susceptíveis do que fêmeas às doses mais altas de 18-MC.

Para a avaliação da toxicidade em doses repetidas (5 dias de tratamento) foram utilizados camundongos BALB/C machos com aproximadamente seis semanas de vida e 25 g. 18-MC foi administrada uma vez por dia, por cinco dias, nas concentrações de 20, 50 e 100 mg/Kg e.o grupo controle (os animais receberam apenas água) . Cada grupo possuía 4 animais.

Todos os animais estavam bastante agitados antes do início do tratamento, o que é considerado comportamento normal em machos de camundongos. Após o primeiro dia de tratamento, os grupos tratados adquiriram comportamento mais calmo. Nenhum sinal de convulsão ou descoordenação motora foi observado em qualquer dos grupos e não houve nenhum óbito.

Em cada dia de tratamento, os grupos foram acompanhados por 180 minutos após a gavagem. Após o fim do tratamento os animais foram acompanhados diariamente, por 120 minutos, por 25 dias. Nenhum sinal de toxicidade foi observado nesse período.

Estas observações contrapõem-se ao observado no protocolo agudo. Contudo, não foram utilizadas as concentrações em que ocorreram óbitos no protocolo agudo. Além disso, na dose de 100mg/Kg no primeiro dia de tratamento, alguns animais deste grupo mostraram-se sonolentos e letárgicos nas primeiras duas horas após o tratamento, fato não observado nos dias subsequentes, o que parece indicar uma possível atenuação de algum efeito central em altas doses após a primeira dose do fármaco.

As análises histológicas do baço e do cérebro de animais que evoluíram para o óbito após o tratamento agudo com 200mg/Kg de 18-MC não evidenciaram alterações morfológicas significativas, sendo comparáveis com os controles avaliados nos mesmos experimentos. A Figura 26 é representativa desta condição.

¾Por outro lado, as análises histopatológicas dos rins e fígado de animais tratados com uma única dose de 200 mg/kg ou 300mg/kg de 18-MC revelaram danos teciduais que poderiam ser implicados como co-responsáveis pelo óbito induzido pelo fármaco nesses animais. As Figuras 27 e 28 mostram cortes histológicos representativos dessa condição de fígado e rim respectivamente.